ปัจจัยที่ทำให้เกิดภาวะขาดออกซิเจนในช่องปาก Prolyl Hydroxylase Inhibitor Enarodustat ตอบโต้การเปลี่ยนแปลงในการเผาผลาญพลังงานไตในระยะแรกของโรคไตจากเบาหวาน

ติดต่อ: emily.li@wecistanche.com

บทนำ

แผนกโรคไตและต่อมไร้ท่อ The University of Tokyo Graduate School of Medicine กรุงโตเกียว ประเทศญี่ปุ่น; ทุนวิจัยสำหรับนักวิทยาศาสตร์รุ่นเยาว์ Japan Society for the Promotion of Science, Tokyo, Japan; ห้องปฏิบัติการวิจัยทางชีววิทยาและเภสัชวิทยา

สถาบันวิจัยเภสัชกรรมกลาง Japan Tobacco Inc., Takatsuki, Japan; ภาควิชาเภสัชวิทยาระบบ The University of Tokyo Graduate School of Medicine กรุงโตเกียว ประเทศญี่ปุ่น; ห้องปฏิบัติการชีววิทยาสังเคราะห์ RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research เมืองซุอิตะ ประเทศญี่ปุ่น; และ WPI International Research Center for Neurointelligence, The University of Tokyo Institutes for Advanced Study (UTIAS), The University of Tokyo, Tokyo, Japan

Hypoxia-inducible factor (HIF) สารยับยั้ง prolyl hydroxylase หรือที่เรียกว่าสารเพิ่มความคงตัวของ HIF ช่วยเพิ่มการผลิต erythropoietin ภายนอกและทำหน้าที่เป็นยารักษาแบบใหม่สำหรับโรคโลหิตจางในเรื้อรังไตโรค. HIค้นหาการแสดงออกของยีนต่างๆ ที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญพลังงานเพื่อตอบสนองต่อภาวะขาดออกซิเจน อย่างไรก็ตาม ยังคงไม่ชัดเจนว่าโปรแกรมเมตาบอลิซึมของเนื้อเยื่อภายในโดยการรักษาเสถียรภาพของ HIF ส่งผลต่อพยาธิสรีรวิทยาของไต โรค. การศึกษาก่อนหน้านี้ชี้ให้เห็นว่าความผิดปกติของระบบเมตาบอลิซึม เช่น ภาวะน้ำตาลในเลือดสูง และภาวะไขมันในเลือดสูงผิดปกติ ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของการเผาผลาญของไต นำไปสู่ความผิดปกติของไตรวมถึงโรคไตจากเบาหวาน ที่นี่ เราวิเคราะห์ผลของ enarodustat (JTZ-951) สารทำให้คงตัว HIF ในช่องปาก ต่อการเผาผลาญพลังงานของไตในระยะแรกของโรคไตจากเบาหวาน โดยใช้หนูที่เป็นเบาหวานที่เกิดจากสเตรปโตโซโทซินและหนูที่เป็นเบาหวานที่เกิดจากอัลรอกซาน การวิเคราะห์ Transcriptome พบว่า enarodustat ต่อต้านการเปลี่ยนแปลงในการเผาผลาญของไตในผู้ป่วยเบาหวาน การวิเคราะห์ Transcriptome พบว่าการเผาผลาญของกรดไขมันและกรดอะมิโนถูกควบคุมในเนื้อเยื่อไตของเบาหวานและปรับลดโดย enarodustat ในขณะที่การเผาผลาญกลูโคสเพิ่มขึ้น การเปลี่ยนแปลงสมมาตรเหล่านี้ได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์เมตาบอลิซึม ในขณะที่ไกลโคไลซิสและเมแทบอลิซึมของวัฏจักรกรดไตรคาร์บอกซิลิกถูกสะสมและกรดอะมิโนลดลงในเนื้อเยื่อไตของสัตว์ที่เป็นโรคเบาหวาน นอกจากนี้ enarodustat ยังช่วยเพิ่มอัตราส่วนกลูตาไธโอนต่อกลูตาไธโอนไดซัลไฟด์และบรรเทาความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในเนื้อเยื่อไตของสัตว์ที่เป็นโรคเบาหวาน ดังนั้น การรักษาเสถียรภาพของ HIF จะต่อต้านการเปลี่ยนแปลงในการเผาผลาญพลังงานของไตที่เกิดขึ้นในระยะเริ่มต้นเบาหวานไตโรค.

Cistanche ดีมากสำหรับการทำงานของไต

คำชี้แจงการแปล

สารยับยั้งโปรลิลไฮดรอกซิเลสแฟกเตอร์ Hypoxia-inducible factor (HIF) (หรือที่รู้จักในชื่อ HIF stabilizers) ช่วยเพิ่มการผลิต erythropoietin ภายนอกและทำหน้าที่เป็นยารักษาแบบใหม่สำหรับโรคโลหิตจางในเรื้อรังไตโรค. การวิเคราะห์การถอดรหัสและเมตาบอลิซึมของเนื้อเยื่อไตในแบบจำลองเบาหวานในหนูและหนูพบว่า enarodustat (JTZ-951) ซึ่งเป็นสารทำให้คงตัว HIF ในช่องปาก ต่อต้านการเปลี่ยนแปลงเมตาบอลิซึมของพลังงานไตในระยะแรกของโรคไตจากเบาหวาน ผลลัพธ์ดังกล่าวให้ข้อมูลที่สำคัญสำหรับการคาดการณ์ผลกระทบของสารควบคุมความคงตัวของ HIF ต่อการเผาผลาญพลังงานของไตในการตั้งค่าทางคลินิก แม้ว่าจำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อชี้แจงว่าโปรแกรมเมตาบอลิซึมของไตใหม่โดยตัวปรับความคงตัวของ HIF ส่งผลต่อการลุกลามของเบาหวานไตโรค.

การแนะนำตัว

สารยับยั้ง prolyl hydroxylase ปัจจัยที่ก่อให้เกิดภาวะขาดออกซิเจน (HIF) ช่วยเพิ่มการผลิต erythropoietin ภายนอกและทำหน้าที่เป็นยารักษาโรคแบบใหม่สำหรับโรคโลหิตจางเรื้อรังไตโรค. เซลล์มีกลไกป้องกันการขาดออกซิเจน และ HIF เป็นผู้ควบคุมหลักของการป้องกันนี้ ไตมีการสัมผัสทางสรีรวิทยาต่อภาวะขาดออกซิเจน และภาวะขาดออกซิเจนเรื้อรังถือเป็นทางเดินร่วมขั้นสุดท้ายที่นำไปสู่โรคไตระยะสุดท้าย เมื่อพิจารณาว่า HIF กระตุ้นการแสดงออกของยีนต่างๆ ที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองของภาวะขาดออกซิเจน สารเพิ่มความคงตัวของ HIF อาจมีผล pleiotropic ต่อความก้าวหน้าของไตโรคภาวะโลหิตจางในเรื้อรังดีขึ้นด้วยไตโรค. ที่น่าสนใจคือ HIF กระตุ้นการแสดงออกของยีนไกลโคไลติกและไพรูเวต ดีไฮโดรจีเนส ไคเนส ซึ่งยับยั้งไพรูเวต ดีไฮโดรจีเนสจากการใช้ไพรูเวตเพื่อเติมเชื้อเพลิงให้กับวัฏจักรของกรดไตรคาร์บอกซิลิก (TCA) ของไมโตคอนเดรีย สำหรับการปรับตัวของเซลล์ที่สัมผัสกับสภาพแวดล้อมที่ขาดออกซิเจน อย่างไรก็ตาม ยังคงไม่ชัดเจนว่าโปรแกรมเมแทบอลิซึมของเนื้อเยื่อไตโดยการรักษาเสถียรภาพของ HIF ส่งผลต่อพยาธิสรีรวิทยาของไต โรค. โรคไตจากเบาหวาน (DKD) เป็นสาเหตุสำคัญของโรคไตระยะสุดท้าย ความผิดปกติของระบบเมตาบอลิซึม เช่น น้ำตาลในเลือดสูงและภาวะไขมันในเลือดสูงผิดปกติ ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญของไต นำไปสู่ความผิดปกติของไตรวมถึง DKD การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นฟลักซ์เมตาบอลิซึมที่เพิ่มขึ้นและการสะสมของกลูโคสและเมแทบอไลต์ของวัฏจักร TCA ในเนื้อเยื่อเปลือกนอกของไตที่เป็นโรคเบาหวาน ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับความผิดปกติของไมโตคอนเดรียและความก้าวหน้าของ DKD เราตั้งสมมติฐานว่าสารควบคุมความคงตัวของ HIF อาจย้อนกลับการเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญในเนื้อเยื่อเปลือกนอกของไตที่เป็นเบาหวาน โดยพิจารณาว่า HIF เป็นการตอบสนองต่อภาวะขาดออกซิเจนแบบปรับตัวได้ จะลดการไหลของเมตาบอลิซึมในเซลล์เพื่อยับยั้งการใช้ออกซิเจน ดังนั้น โดยใช้การวิเคราะห์การถอดรหัสและเมตาบอลิซึม เราจึงทำการศึกษาพิสูจน์แนวคิดเพื่อทำความเข้าใจอย่างครอบคลุมว่า enarodustat (JTZ-951) ซึ่งเป็นสารทำให้คงตัว HIF ในช่องปาก ส่งผลต่อการเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญของไตที่เกิดขึ้นในระยะแรกของ DKD อย่างไร

ผลลัพธ์: Enarodustat กระตุ้นการตั้งโปรแกรมเมตาบอลิซึมใหม่จากวัฏจักร TCA ไปจนถึงไกลโคไลซิสในเซลล์ท่อไตใกล้เคียง

เนื่องจากเยื่อหุ้มสมองของไตส่วนใหญ่ประกอบด้วยท่อใกล้เคียง เราจึงตรวจสอบผลกระทบของอีนาโรดัสแตทต่อการไหลของเมแทบอลิซึมของเซลล์ท่อไตใกล้เคียงในหลอดทดลองก่อน อย่างแรก Mito Stress Test (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) และ Glycolytic Rate Assay (Agilent) ถูกดำเนินการในเซลล์ HK-2 ที่เพาะเลี้ยง สายเซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้เคียงของมนุษย์ (รูปที่ 1a) Enarodustat ลดการหายใจของไมโตคอนเดรีย (รอบ TCA) อย่างมีนัยสำคัญและเพิ่มไกลโคไลซิสพื้นฐาน ซึ่งบ่งชี้ว่าโปรแกรมเมตาบอลิซึมใหม่จากวัฏจักร TCA เป็นไกลโคไลซิส (รูปที่ 1; รูปที่ S1) เรายังทำการทดลองโดยใช้ RNA ที่รบกวนขนาดเล็ก (siRNA) สำหรับ HIF-1 (รูปที่ 2; รูปที่ S2) HIF-1 ล้มลงโดย siRNA กลับการเปลี่ยนแปลงเมตาบอลิซึม (การหายใจพื้นฐาน การหายใจสูงสุด ความสามารถในการหายใจสำรอง และการผลิตอะดีโนซีน ไตรฟอสเฟต [ATP]) ที่เกิดจากอีนาโรดัสแตท ซึ่งแสดงให้เห็นว่าโปรแกรมเมตาบอลิซึมใหม่ส่วนใหญ่ผ่าน HIF-1 การรักษาเสถียรภาพ (รูปที่ 2; รูปที่ S2) กิจกรรมของไพรูเวตดีไฮโดรจีเนสซึ่งเป็นปัจจัยสำคัญสำหรับเซลล์ที่ใช้ไพรูเวตเพื่อกระตุ้นวงจร TCA ก็ถูกทำให้ลดลงเช่นกันโดยอีนาโรดัสแตท (รูปที่ 2f) ซึ่งเข้ากันได้กับการสังเกตที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้

ข้อมูลความเป็นมาของหนูเบาหวานที่เกิดจากสเตรปโตโซโตซิน

จากผลการทดลองในหลอดทดลอง เราตั้งสมมติฐานว่าสารเพิ่มความคงตัวของ HIF อาจบรรเทาการเปลี่ยนแปลงเมตาบอลิซึมในเนื้อเยื่อเปลือกนอกของไตที่เป็นเบาหวานผ่านโปรแกรมเมตาบอลิซึมใหม่จากวัฏจักร TCA ไปจนถึงไกลโคไลซิส ก่อนอื่นเราเลือกหนูที่เป็นเบาหวานที่เกิดจากสเตรปโตโซโทซิน (STZ) เป็นแบบจำลองสำหรับการทดลองพิสูจน์แนวคิดเพื่อทดสอบสมมติฐานที่กล่าวถึงข้างต้น ในรูปแบบนี้ โรคเบาหวานเกิดขึ้นอย่างรวดเร็ว ทำให้เราสังเกตเห็นผลกระทบสุทธิของโรคเบาหวานและความคงตัวของ HIF ต่อการเผาผลาญพลังงานในเนื้อเยื่อไตภายในระยะเวลาอันสั้น โปรโตคอลการศึกษาและข้อมูลพื้นฐานจากการทดลองในหนูเบาหวานที่เกิดจาก STZ แสดงไว้ในรูปที่ 3a เราแบ่งหนูออกเป็น 3 กลุ่ม: กลุ่ม A (หลอก) กลุ่ม B (DKD) และกลุ่ม C (DKD þ enarodustat) ระดับน้ำตาลในเลือด, glycosylated hemoglobin HbA1c, ไตรกลีเซอไรด์ และระดับคอเลสเตอรอลรวมในวันที่ 14 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มผู้ป่วยโรคเบาหวานเมื่อเทียบกับกลุ่ม A ในขณะที่ไม่มีความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่างกลุ่ม B และ C (รูปที่ 3d–g) แม้ว่าระดับครีเอตินีนในพลาสมาจะไม่แตกต่างกันระหว่างกลุ่ม แต่การขับอัลบูมินในปัสสาวะก็เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ และโกลเมอรูโลเมกาลีก็สังเกตเห็นได้ในกลุ่ม B เมื่อเทียบกับกลุ่ม A และ enarodustat มีแนวโน้มที่จะย้อนกลับการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ (รูปที่ 4) ระดับยูเรียไนโตรเจนในเลือดสูงขึ้นในกลุ่มผู้ป่วยเบาหวาน ซึ่งสะท้อนถึงภาวะขาดน้ำเนื่องจากโรคเบาหวาน โดยสรุป ไตของหนูที่ได้รับการรักษาด้วย STZ ในการศึกษาของเราแสดงถึงระยะเริ่มต้นของ DKD การวิเคราะห์ Transcriptome และ metabolome ดำเนินการโดยใช้เนื้อเยื่อเปลือกนอกของไตของหนูเหล่านี้

การวิเคราะห์ Transcriptome ของเนื้อเยื่อเปลือกนอกของไต

ผลลัพธ์ของการวิเคราะห์ทรานสคริปโทมของเนื้อเยื่อคอร์เทกซ์ของไตแสดงไว้ในรูปที่ 5 และ 6 การวิเคราะห์องค์ประกอบหลักและการวิเคราะห์การจัดกลุ่มแบบลำดับชั้นบ่งชี้ว่ากลุ่ม A, B และ C ถูกแยกออกเป็นกลุ่มต่างๆ ตามลำดับ (รูปที่ 5a และ b) ยีนที่แสดงออกอย่างแตกต่างถูกเลือกโดย │log2 fold-change (FC) │ มากกว่าหรือเท่ากับ 0.5 และค่า Q < 0.05="" ยีน="" ontology="" และการวิเคราะห์วิถีทางบัญญัติเปิดเผยว่ายีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญกรดไขมันถูกควบคุมในกลุ่ม="" b="" เมื่อเทียบกับกลุ่ม="" a="" ในทางตรงกันข้าม="" ยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญกลูโคสและการตอบสนองต่อการขาดออกซิเจน="" ซึ่งรวมถึงเครือข่าย="" hif-1="" ได้รับการควบคุมในกลุ่ม="" c="" เมื่อเปรียบเทียบ="" กับกลุ่ม="" b="" (รูปที่="" 5c="" และ="" d)="" เรายังทำการวิเคราะห์ชุดยีน="" (gsea)="" โดยใช้ข้อมูลการถอดรหัส="" (รูปที่="" 6="" ตารางที่="" 1="" และ="" 2)="" ชุดยีนของการเผาผลาญกรดไขมันและกรดอะมิโนถูกควบคุมในกลุ่ม="" b="" เมื่อเทียบกับกลุ่ม="" a="" (รูปที่="" 6)="" ในทางตรงกันข้าม="" ชุดยีนเหล่านี้ถูกปรับลด="" และชุดยีนของการเผาผลาญกลูโคสถูกควบคุมในกลุ่ม="" c="" เมื่อเทียบกับกลุ่ม="" b="" ซึ่งแสดงให้เห็นว่าอีนาโรดัสแตทกลับการเปลี่ยนแปลงเมตาบอลิซึมที่เกิดจากโรคเบาหวาน="" (รูปที่="" 6)="" นอกจากนี้="" ชุดยีนของวัฏจักร="" tca="" ยังถูกปรับลดลงในกลุ่ม="" c="" เมื่อเทียบกับกลุ่ม="" b="" (ตารางที่="" 2)="" ซึ่งเข้ากันได้กับแนวคิดของโปรแกรมเมตาบอลิซึมที่เกิดจากอีนาโรดัสแตทในหลอดทดลองที่สังเกตพบในการศึกษาในหลอดทดลองของเรา="" โดยสรุป="" enarodustat="">

การวิเคราะห์เมตาโบโลมของเนื้อเยื่อเปลือกนอกของไต

เราวัดความเข้มข้นสัมบูรณ์ของเมแทบอไลต์ที่เกี่ยวข้องกับพลังงาน 116 รายการในเนื้อเยื่อเปลือกนอกของไตของหนู (n =4 สำหรับแต่ละกลุ่ม) สุ่มเลือกจากแต่ละกลุ่ม (ตารางเสริม S1; รูปที่ S3) การวิเคราะห์จำแนกประเภทกำลังสองน้อยที่สุดบางส่วน (PLS-DA) ถูกดำเนินการเพื่อประเมินความสำคัญของการเลือกปฏิบัติในชั้นเรียน (รูปที่ 7) เราทำการวิเคราะห์ชุดเมแทบอไลต์ (MSEA) โดยใช้เมแทบอไลต์ที่มีความสำคัญตัวแปร PLS-DA ในคะแนนการฉายภาพ (VIP) $ 1 ความแตกต่างในการเผาผลาญกรดอะมิโน เช่น ไกลซีน ซีรีน เมไทโอนีน แอสพาเทต กลูตาเมต อาร์จินีน โพรลีน และ b-alanine ระหว่างกลุ่ม A และ B ถูกบันทึกไว้ ความแตกต่างของเมแทบอลิซึมของกรดอะมิโนระหว่างกลุ่ม B และ C ยังสังเกตพบ นอกจากนี้ กระบวนการเมแทบอลิซึมของกลูโคส เช่น glycolysis และ gluconeogenesis มีแนวโน้มที่แตกต่างกันระหว่างกลุ่ม B และ C (รูปที่ 7)

การแสดงข้อมูลการถอดรหัสและเมตาบอลิซึมบนแผนที่เส้นทางการเผาผลาญพลังงาน

เราแสดงภาพข้อมูลการถอดรหัสและเมตาบอลิซึมเพื่อความเข้าใจอย่างครอบคลุมเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญพลังงาน (รูปที่ 8) Glycolysis และ TCA cycle metabolites ถูกสะสมในกลุ่ม B เมื่อเทียบกับกลุ่ม A ซึ่งอาจเนื่องมาจากการไหลเข้าของกลูโคสที่มากเกินไปและการควบคุมเมตาบอลิซึมของกรดไขมันใน DKD เพิ่มขึ้น ความเข้มข้นของกรดอะมิโนลดลงในกลุ่ม B เมื่อเทียบกับกลุ่ม A ซึ่งสะท้อนถึงการปรับเพิ่มของเมแทบอลิซึมของกรดอะมิโน (รูปที่ 8a) ในทางตรงกันข้าม การสะสมของสารเมตาโบไลต์ของไกลโคไลซิสนั้นบรรเทาลงโดย enarodustat เนื่องจากการไหลของไกลโคไลซิสนั้นสะดวก นอกจากนี้ Enarodustat ยังย้อนกลับการเปลี่ยนแปลงที่เกิดจากโรคเบาหวานในเมแทบอไลต์ของวัฏจักร TCA และกรดอะมิโน (รูปที่ 8b) นอกจากนี้ enarodustat ยังช่วยลดการสะสมของกลูตาไธโอนไดซัลไฟด์ (GSSG) ในเนื้อเยื่อไตของผู้ป่วยเบาหวาน ดังนั้นจึงแสดงอัตราส่วนกลูตาไธโอน/GSSG ที่สูงขึ้น ซึ่งแนะนำว่า enarodustat บรรเทาความเครียดออกซิเดชันใน DKD (รูปที่ 8a และ b) การลดลงของความเครียดออกซิเดชันได้รับการยืนยันโดยระดับของ malondialdehyde เครื่องหมาย lipid peroxidation ในเนื้อเยื่อเยื่อหุ้มสมองของไต: enarodustat ย้อนกลับการสะสมของ malondialdehyde ในเนื้อเยื่อเยื่อหุ้มสมองของไตที่เป็นโรคเบาหวาน (รูปที่ S4) โดยสรุป การรวมข้อมูลทรานสคริปโทมและเมตาโบโลมได้แสดงให้เห็นว่าอีนาโรดัสแตทต่อต้านการเปลี่ยนแปลงเมตาบอลิซึมของพลังงานไตที่เกิดขึ้นในระยะแรกของ DKD

การเปลี่ยนแปลงเมแทบอลิซึมสมมาตร (เบาหวานกับอีนาโรดัสแตท) ได้รับการยืนยันในรูปแบบอื่น

เราทำการวิเคราะห์การถอดรหัสในหนูที่เป็นโรคเบาหวานที่เกิดจาก alloxan ซึ่งเป็นแบบจำลองสัตว์อีกตัวหนึ่งของโรคเบาหวาน เพื่อยืนยันการค้นพบของเราในแบบจำลองหนู โปรโตคอลการศึกษาและข้อมูลเบื้องหลังสำหรับแบบจำลองเมาส์แสดงไว้ในรูปที่ 9 การขับอัลบูมินในปัสสาวะเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม B เมื่อเทียบกับกลุ่ม A ซึ่งกลับรายการโดย enarodustat (รูปที่ 9d) นอกจากนี้ เรายังใช้3-การวิเคราะห์เชิงมิติอย่างครอบคลุม (Clear, Unblocked Brain/ Body Imaging Cocktails และ Computational analysis [CUBIC]–kidney)16 เพื่อให้เห็นภาพของโกลเมอรูไลในไต โกลเมอรูโลเมกาลีสังเกตได้ในกลุ่ม B เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม A ซึ่งกลับกันโดยอีนาโรดัสแตท (รูปที่ 9e) การวิเคราะห์ Transcriptome ของเนื้อเยื่อไตในหนูทดลองที่เป็นเบาหวานที่เกิดจาก alloxan แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงเมตาบอลิซึมที่สมมาตร (เบาหวาน เทียบกับ enarodustat) ในลักษณะเดียวกับแบบจำลองหนูเบาหวานที่เกิดจาก STZ (รูปที่ 10): เมแทบอลิซึมของกรดไขมันถูกควบคุมโดยโรคเบาหวาน ในขณะที่กลูโคส เมแทบอลิซึมถูกควบคุมโดย enarodustat นอกจากนี้ เมแทบอลิซึมของกรดอะมิโนถูกควบคุมโดยโรคเบาหวานและลดระดับโดยอีนาโรดัสแตท ดังนั้น enarodustat ต่อต้านการเปลี่ยนแปลงเมแทบอลิซึมของพลังงานไตที่เกิดขึ้นในระยะแรกของ DKD ในแบบจำลองหนูเมาส์ที่เป็นเบาหวานที่เหนี่ยวนำโดย alloxan เช่นเดียวกับในแบบจำลองหนูที่เป็นเบาหวานที่เหนี่ยวนำโดย STZ

อภิปรายผล

ในการศึกษานี้ เราได้แสดงให้เห็นว่า enarodustat (JTZ-951) ซึ่งเป็นสารทำให้คงตัว HIF ในช่องปาก ต่อต้านการเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญพลังงานของไตที่เกิดขึ้นในระยะเริ่มต้นของ DKD ในแบบจำลองหนูและหนูที่เป็นโรคเบาหวาน การวิเคราะห์การถอดรหัสและเมตาบอลิซึมแสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงเมตาบอลิซึมที่สมมาตรในเนื้อเยื่อไต (เบาหวาน เทียบกับ enarodustat): เมแทบอลิซึมของกรดไขมันและกรดอะมิโนถูกควบคุมใน DKD ในขณะที่ enarodustat ปรับลดเส้นทางเหล่านี้และเพิ่มการเผาผลาญกลูโคสเพิ่มเติม (รูปที่ 5-10)

ยังไม่เป็นที่แน่ชัดว่าการรักษาเสถียรภาพของ HIF มีผลในการป้องกันพยาธิสรีรวิทยาของ DKD หรือไม่ การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าเนื้อเยื่อไตของผู้ป่วยเบาหวานมีภาวะขาดออกซิเจน 17 และการแสดงออกของ HIF ในเนื้อเยื่อไตของผู้ป่วยเบาหวานไม่เพียงพอต่อการตอบสนองต่อภาวะขาดออกซิเจน ซึ่งส่วนหนึ่งเกิดจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน18 การรักษาเสถียรภาพของ HIF โดยโคบอลต์คลอไรด์ช่วยปรับปรุงสถานะความเครียดออกซิเดชันและลดปริมาณโปรตีนในปัสสาวะและ ความเสียหายของ tubulointerstitial ใน DKD.19 ที่เกิดจาก STZ ผลการศึกษาในสัตว์ทดลองยังระบุว่าการรักษาเสถียรภาพของ HIF ช่วยป้องกันการพัฒนาของโรคอ้วน 20 ความไวของอินซูลินที่ดีขึ้น 20 และลดระดับคอเลสเตอรอลในซีรัม 21 ผลลัพธ์เหล่านี้แนะนำผลการป้องกันของการรักษาเสถียรภาพ HIF ในการพัฒนา ดีเคดี. ในทางตรงกันข้าม การรักษาเสถียรภาพของ HIF แบบ supraphysiologic โดยการลบ von Hippel-Lindau ทำให้เกิดการพังผืดของไต 22 บทบาทของการรักษาเสถียรภาพของ HIF ในการลุกลามของ DKD อาจขึ้นอยู่กับบริบทเมื่อพิจารณาจากผลกระทบของ pleiotropic ของ HIF และการมีอยู่ของฟีโนไทป์ DKD ที่หลากหลาย จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้คือเพื่อชี้แจงผลกระทบสุทธิของการรักษาเสถียรภาพของ HIF ต่อการเผาผลาญพลังงานในไตที่เป็นเบาหวาน รายงานก่อนหน้านี้ระบุว่าการเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญพลังงานเกิดขึ้นใน DKD Sas et al.10 แสดงการไหลของพลังงานที่เพิ่มขึ้นและการสะสมของสารกลูโคสในเนื้อเยื่อเยื่อหุ้มสมองของไตที่เป็นเบาหวาน ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับความผิดปกติของไมโตคอนเดรีย คุณและคณะ 23 รายงานว่า fumarate ซึ่งเป็นเมแทบอไลต์ของวัฏจักร TCA ถูกสะสมในเนื้อเยื่อไตที่เป็นเบาหวานและมีส่วนโดยตรงต่อความก้าวหน้าของ DKD ก่อนหน้านี้เราได้แสดงให้เห็นแล้วว่าเมแทบอไลต์ของวัฏจักร TCA ที่สะสมในเนื้อเยื่อไตที่เป็นเบาหวาน ซึ่งถูกย้อนกลับโดยการยับยั้งโซเดียม-กลูโคสโคทรานสพอร์ตเตอร์ 2 หรือการจำกัดแคลอรี่11 นอกจากนี้ Qi et al.24 แสดงให้เห็นว่าเอ็นไซม์ในวิถีไกลโคไลติกรวมถึงไพรูเวตไคเนส M2 (PKM2) ได้รับการควบคุมในผู้ป่วยเบาหวานชนิดที่ 1 ที่ไม่มี DKD เทียบกับผู้ป่วย DKD การเปิดใช้งาน PKM2 ย้อนกลับการสะสมของสารเมแทบอลิซึมของไกลโคไลซิสและการทำงานของไมโทคอนเดรียที่กลับคืนมา ส่วนหนึ่งโดยการเพิ่มฟลักซ์ของไกลโคไลติก 24,25 รายงานก่อนหน้านี้ชี้ให้เห็นว่าการสะสมของไกลโคไลซิสและเมแทบอไลต์ของวัฏจักร TCA อาจส่งผลต่อการลุกลามของ DKD ซึ่งสามารถบรรเทาได้ด้วยการอำนวยความสะดวกไกลโคไลซิสรวมถึง PKM2 การเปิดใช้งาน ในการศึกษาของเรา การรักษาเสถียรภาพของ HIF โดย enarodustat ย้อนกลับการเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญพลังงาน และลดการสะสมของไกลโคไลซิสและเมแทบอไลต์ของวงจร TCA ในเนื้อเยื่อเปลือกนอกของไตที่เป็นโรคเบาหวาน (รูปที่ 8) การแสดงออกของเอนไซม์ไกลโคไลติกซึ่งรวมถึง PKM2 ยังถูกเพิ่มการควบคุมโดยอีนาโรดัสแตท (รูปที่ S4B เสริม) นอกจากนี้ enarodustat ช่วยลดการสะสม GSSG และเพิ่มอัตราส่วนกลูตาไธโอน/GSSG ซึ่งแสดงให้เห็นว่า enarodustat ช่วยบรรเทาความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันใน DKD (รูปที่ 8) การลดลงของความเครียดออกซิเดชันที่เกิดจากอีนาโรดัสแตทนี้ยังได้รับการยืนยันโดยการเปลี่ยนแปลงของระดับมาลอนไดอัลดีไฮด์ในเนื้อเยื่อเปลือกนอกของไต (รูปที่ S4A เสริม) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการรักษาเสถียรภาพของ HIF ควรมีบทบาทในการป้องกันพยาธิสรีรวิทยาของ DKD อย่างน้อยจากมุมมองของการเผาผลาญ เป็นที่แน่ชัดว่าเราไม่สามารถตรวจสอบได้ว่าโปรแกรมเมตาบอลิซึมใหม่โดยการรักษาเสถียรภาพของ HIF มีผลโดยตรงต่อการลุกลามของ DKD หรือไม่ เนื่องจากอาจเป็นไปไม่ได้ที่จะแยกแยะผลสุทธิของการเปลี่ยนแปลงเมตาบอลิซึมต่อผลลัพธ์ของไตอันเนื่องมาจากบทบาท pleiotropic ของ HIF อย่างไรก็ตาม ในการศึกษาของเรา การขับอัลบูมินในปัสสาวะเล็กน้อยและความผิดปกติทางพยาธิสภาพของไต (glomerulomegaly และความหนาของเยื่อหุ้มชั้นใต้ดินของไต) ที่เกิดจากโรคเบาหวานได้รับการบรรเทาโดย enarodustat ร่วมกับการทำให้การเผาผลาญพลังงานของไตเป็นปกติ เราคัดแยกยีนที่การแสดงออกเปลี่ยนแปลงสัมพันธ์กับระดับอัลบูมินในปัสสาวะ (257 โพรบ; 232 ยีน) จากข้อมูลไมโครเรย์ในแบบจำลองเมาส์ที่เป็นเบาหวานที่เกิดจาก alloxan และทำการวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะทางเดิน (รูปที่ S5 เพิ่มเติม) ด้วยเหตุนี้ เส้นทางที่เกี่ยวข้องกับเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียและการขนส่งอิเล็กตรอนในระบบทางเดินหายใจจึงสัมพันธ์กับระดับอัลบูมินในปัสสาวะ ซึ่งบ่งชี้ว่าภาระของไมโตคอนเดรียนั้นสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการขับอัลบูมินในปัสสาวะ ดังนั้นจึงมีความเป็นไปได้ที่เมแทบอลิซึมของเมแทบอลิซึมของเนื้อเยื่อไตที่เป็นเบาหวานโดยสารเพิ่มความคงตัวของ HIF อาจลดภาระของไมโตคอนเดรียและบรรเทาการลุกลามของ DKD ข้อมูลของเราแนะนำพยาธิสรีรวิทยาของ DKD จากมุมมองของการเผาผลาญดังนี้: น้ำตาลในเลือดสูงสร้างความต้องการพลังงานสำหรับการดูดซึมกลูโคสกลับคืนในท่อไตใกล้เคียง ดังนั้น วงจร TCA ในไมโตคอนเดรียจึงถูกบังคับให้กระตุ้นเพื่อตอบสนองความต้องการพลังงานในระยะเริ่มต้นของ DKD (การควบคุมการเผาผลาญของกรดไขมันและกรดอะมิโน) และความคงตัวของ HIF อาจลดภาระของไมโตคอนเดรียด้วยโปรแกรมเมตาบอลิซึมใหม่จากวัฏจักร TCA ไปจนถึงไกลโคไลซิส (การปรับลดการเผาผลาญของกรดไขมันและกรดอะมิโนและการปรับไกลโคไลซิส) ซึ่งอาจมีบทบาทในการป้องกันความก้าวหน้าของ DKD จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมรวมถึง omics เซลล์เดียวเพื่อชี้แจงว่าภาระยลในเนื้อเยื่อไตส่งผลโดยตรงต่อพยาธิสรีรวิทยาของ DKD อย่างไร คำถามที่น่าสนใจอีกข้อหนึ่งคือว่าสารเพิ่มความคงตัวของ HIF ส่งผลโดยตรงต่อการดูดซึมกลูโคสในท่อใกล้เคียงหรือไม่ ข้อมูลในหลอดทดลองของเราแสดงให้เห็นว่าการผลิต ATP ลดลงอย่างมีนัยสำคัญโดย enarodustat ผ่านการตั้งโปรแกรมเมตาบอลิซึมใหม่จากวัฏจักร TCA ไปเป็นไกลโคไลซิส (รูปที่ 1 และ 2) เมื่อพิจารณาว่า ATP จำเป็นสำหรับการดูดซึมกลับกลูโคสโดยโซเดียม-กลูโคสโคทรานสพอร์ตเตอร์ 2 อันดับแรก เราตั้งสมมติฐานว่า enarodustat อาจหยุดการดูดซึมกลูโคสอีกครั้ง อย่างไรก็ตาม ระดับกลูโคสในปัสสาวะไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่ม B และกลุ่ม C ในสัตว์ทั้งสองแบบ (รูปที่ S6) เสริม อาจเป็นไปได้ว่าการลดลงของการผลิตเอทีพีโดย enarodustat นั้นรุนแรงกว่ามากในสถานการณ์ทางสรีรวิทยาเมื่อเทียบกับผลในหลอดทดลอง ดังนั้นการรักษาเสถียรภาพของ HIF จึงไม่ส่งผลต่อการดูดซึมกลูโคสผ่านโซเดียม-กลูโคสโคทรานสพอร์ตเตอร์ 2 อย่างน้อยก็ในการทดลองกับสัตว์ของเรา การศึกษาของเรามีข้อจำกัด 2 ประการ อันดับแรก เราใช้หนูที่เป็นเบาหวานที่เหนี่ยวนำโดย STZ และหนูที่เป็นเบาหวานที่เหนี่ยวนำโดย alloxan เป็นแบบจำลอง DKD ระยะเริ่มต้น และสังเกตผลกระทบในระยะสั้นของภาวะเบาหวาน อย่างไรก็ตาม ในการตั้งค่าทางคลินิก ยารักษาความคงตัว HIF จะถูกจ่ายให้กับผู้ป่วยที่มีภาวะโลหิตจางใน DKD ระยะสุดท้าย จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อทำความเข้าใจผลของการรักษาเสถียรภาพของ HIF ต่อการเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญของไตใน DKD ระยะสุดท้าย ประการที่สอง การศึกษาขาดอำนาจทางสถิติที่เพียงพอเกี่ยวกับการกระจายตัวของความเข้มข้นของสารเมตาโบไลต์ในข้อมูลเมตาบอลิซึม ในขณะที่ข้อมูลการถอดรหัสมีพลังทางสถิติมากพอที่จะอธิบายภาพรวมของเมแทบอลิซึมของพลังงานได้ชัดเจน เนื่องจากไม่มีสารเมตาโบไลต์จำนวนมากที่แสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่ม เราจึงทำ PLS-DA และเลือกเมตาโบไลต์ที่มีคะแนน PLS-DA VIP มากกว่าหรือเท่ากับ 1 สำหรับ MSEA แม้ว่าจะเป็นเรื่องยากที่จะตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงทางเมตาบอลิซึมโดยใช้ข้อมูลเมตาบอลิซึมเพียงอย่างเดียว แต่ผลของการวิเคราะห์เมตาโบโลมนั้นเข้ากันได้กับข้อมูลการถอดรหัส (รูปที่ 7 และ 8) ซึ่งให้การสนับสนุนเพิ่มเติมสำหรับผลที่สังเกตได้จากการเปลี่ยนแปลงการถอดรหัสต่อการเผาผลาญพลังงานของไต โดยสรุป enarodustat (JTZ-951) ซึ่งเป็นสารทำให้คงตัว HIF ในช่องปาก ต่อต้านการเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญพลังงานของไตในระยะเริ่มต้นของ DKD การศึกษาของเราชี้ให้เห็นว่าการรักษาเสถียรภาพของ HIF อาจทำหน้าที่เป็นการแทรกแซงที่อาจเกิดขึ้นซึ่งมุ่งเป้าไปที่การเผาผลาญพลังงานไตที่ผิดปกติใน DKD

วิธีการ

การทดสอบความเครียดของ Mito และการทดสอบอัตราไกลโคไลติก

เซลล์ HK-2 ถูกเพาะลงบน 96-ไมโครเพลทที่ความหนาแน่น 1 * 10⁴เซลล์/กัน. ในวันถัดไป ฟลักซ์การเผาผลาญถูกวัดแบบเรียลไทม์โดย Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent) โดยใช้ Mito Stress Test Kit (103015-100; Agilent) หรือ Glycolytic Rate Assay Kit (103344- 100; Agilent) ความเข้มข้นของกลูโคส ไพรูเวท และกลูตามีนในอาหารเลี้ยงเชื้อเท่ากับ 10 มิลลิโมล/ลิตร 1 มิลลิโมล/ลิตร และ 2 มิลลิโมล/ลิตร ตามลำดับ

การถ่ายโอน siRNA

HIF-1 ล้มลงดำเนินการโดย Stealth RNAi สำหรับ HIF1A ของมนุษย์ (HSS104774 [#1] และ HSS104775 [#2]; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) Stealth RNAi siRNA การควบคุมเชิงลบ Med GC Duplex #2 (12935112; Thermo Fisher Scientific) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ

ซับตะวันตก

แอนติบอดีปฐมภูมิที่ใช้สำหรับการย้อมสีคือแอนติบอดีต่อต้าน HIF-1 ของมนุษย์ (rabbit polyclonal, 1:500; Novus Biologicals, Littleton, CO) และแอนติบอดีต้านแอกตินของมนุษย์ (rabbit polyclonal, 1:1000; Sigma-Aldrich, St . หลุยส์ มอ.). แอนติบอดีทุติยภูมิคือแอนติบอดีต่อต้านกระต่าย IgG ของแพะที่คอนจูเกตเปอร์ออกซิเดส (170-6515, 1:5000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)

การทดลองกับสัตว์

หนู Crl: CD (Sprague Dawley) และหนู Crl: CD1 (Institute of Cancer Research) ได้มาจาก Charles River Laboratories Japan Inc. (โยโกฮาม่า ประเทศญี่ปุ่น) การทดลองทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการพิจารณาสถาบันของมหาวิทยาลัยโตเกียว (การอนุมัติหมายเลข P17-110) ขั้นตอนสำหรับสัตว์ทั้งหมดได้ดำเนินการตามแนวทางของสถาบันสุขภาพแห่งชาติ (คู่มือสำหรับการดูแลและการใช้สัตว์ทดลอง) โปรโตคอลการศึกษาแสดงในรูปที่ 3 และ 9

การวิเคราะห์การถอดเสียง

RNA ทั้งหมดจากเนื้อเยื่อเยื่อหุ้มสมองของไตถูกแยกออกโดยใช้ GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit (RTN7{{10}}; Sigma-Aldrich) RNA ทั้งหมด (100 ng) ถูกติดฉลากโดยใช้ Low Input Quick Amp Labeling Kit (Agilent) จากนั้นจึงผสมพันธุ์กับ SurePrint G3 Rat GE v2 8x60K Microarray (สำหรับหนู; Agilent) และ SurePrint G3 Mouse GE v{{7 }}x60K Microarray (สำหรับเมาส์) ตามลำดับ การทดลอง microarray ทั้งหมดดำเนินการโดย DNA Chip Research Inc. (โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น) ข้อมูลดิบถูกประมวลผลด้วย R package limma ใน Bioconductor (http://www.bioconductor.org/) เพื่อทำการแก้ไขพื้นหลังและการทำให้ข้อมูลเป็นมาตรฐานโดยใช้วิธีการทำให้เป็นมาตรฐานของควอนไทล์ ComBat (Bioconductor) ลบเอฟเฟกต์แบทช์ในการทดลองของหนู ยีนที่แสดงออกอย่างแตกต่างถูกกำหนดโดย│log2 FC│ มากกว่าหรือเท่ากับ 0.5 และค่า Q < 0.05="" ยีน="" ontology="" และการวิเคราะห์เส้นทางตามรูปแบบบัญญัติดำเนินการโดยใช้="" basespace="" correlation="" engine="" (illumina,="" san="" diego,="" ca)="" ข้อมูล="" microarray="" ได้รับการฝากไว้ใน="" national="" center="" for="" biotechnology="" information="" gene="" expression="" omnibus="" เป็นซีรีส์="" gse131221="" (หนู)="" และ="" gse139317="">

การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าชุดยีน

GSEA เป็นวิธีการคำนวณที่กำหนดว่าชุดยีนที่กำหนดไว้ล่วงหน้าแสดงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติและสอดคล้องกันระหว่าง 2 สถานะทางชีววิทยาหรือไม่ GSEA ดำเนินการโดยใช้ GSEA v.3.0 (Broad Institute, Cambridge, MA) เส้นทางที่มีอัตราการค้นพบที่ผิดพลาด < 0.25="">

การวิเคราะห์เมตาบอลิซึม

การวัดเมตาโบโลมดำเนินการโดย Human Metabolome Technologies Inc. (สึรุโอกะ ประเทศญี่ปุ่น) ความเข้มข้นของเมตาโบไลต์คำนวณโดยการทำให้พื้นที่พีคของสารเมตาโบไลต์เป็นปกติตามพื้นที่ของมาตรฐานภายในและโดยการใช้กราฟมาตรฐาน ซึ่งได้มาจาก3-การสอบเทียบแบบจุด ดูวิธีการเสริมเพิ่มเติม

การวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะชุดเมตาโบไลต์

การวิเคราะห์ข้อมูลเมตาโบโลมิกส์ดำเนินการโดยใช้แพลตฟอร์มบนเว็บแบบบูรณาการ MetaboAnalyst 40 ดำเนินการ PLS-DA และคำนวณคะแนน VIP ที่เกี่ยวข้อง เมแทบอไลต์ที่มีคะแนน PLS-DA VIP มากกว่าหรือเท่ากับ 1 ถูกใช้สำหรับ MSEA

การหาปริมาณของบริเวณไตในโรคไต

เราสุ่มถ่ายภาพ 3 ภาพทางพยาธิวิทยาจากภาพการย้อมสีกรดเป็นระยะของตัวอย่างแต่ละตัวอย่าง และวัดทุกบริเวณของไตตามลำดับโดยใช้ฟิจิ (การกระจายของ ImageJ; National Institutes of Health, Bethesda, MD)

คิวบิก-ไต

การถ่ายภาพ3-มิติของโกลเมอรูไลในเนื้อเยื่อไตอย่างครอบคลุมถูกดำเนินการโดยใช้ CUBIC ตามเอกสารก่อนหน้าของเรา โดยสังเขป ไตของหนูเมาส์คงที่ถูกแช่ใน CUBIC-L สำหรับการขจัดไขมันออกและจากนั้นจึงนำไปย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ สุดท้าย ดัชนีการหักเหของแสงถูกจับคู่โดยการจัดวางตัวอย่างใน CUBIC-R plus ภาพสามมิติที่ครอบคลุมจากไตที่โปร่งใสนั้นได้มาโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงแบบแผ่นแสงที่สร้างขึ้นเอง (MVX10-LS; โอลิมปัส โตเกียว ญี่ปุ่น) แอนติบอดีหลักที่ใช้สำหรับการย้อมสีคือแอนติบอดีต้านโพโดซิน (rabbit polyclonal, 1:100, P0372; Sigma-Aldrich) แอนติบอดีทุติยภูมิคือ Alexa Flour 555- conjugated donkey anti-rabbit IgG (1:100, A-31572; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)

การวิเคราะห์ทางสถิติ

สำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการ จะใช้ {{0}}การวิเคราะห์ทางของความแปรปรวนตามด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการภายหลังกรณีเฉพาะ Tukey หากเหมาะสม การวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดดำเนินการด้วยซอฟต์แวร์ GraphPad Prism 7 (ซอฟต์แวร์ GraphPad, ซานดิเอโก, แคลิฟอร์เนีย) P <0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ="">

การเปิดเผยข้อมูล

MN ได้รับกิตติมศักดิ์ ค่าที่ปรึกษา หรือทุนวิจัยจาก KyowaHakko-Kirin, Akebia, Astellas, Chugai, GlaxoSmithKline, Japan Tobacco Inc. (JT), Torii, Tanabe-Mitsubishi, Daiichi-Sankyo, Takeda, Ono, Bayer, Boehringer Ingelheim และอเล็กซาน TT ได้รับทุนวิจัยจาก JT Enarodustat (JTZ-951) ให้บริการโดย JT โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น EAS และ HRU เป็นผู้ประดิษฐ์สิทธิบัตรของ RIKEN ส่วนหนึ่งของการศึกษานี้ดำเนินการร่วมกับ Olympus Corporation และซอฟต์แวร์ประเภทที่สนับสนุนโดย Bitplane ผู้เขียนอีกคนประกาศว่าไม่มีผลประโยชน์ที่แข่งขันกัน

กิตติกรรมประกาศ

เรารู้สึกขอบคุณ Dr. Shuhei Yao และ Dr. Shinji Tanaka สำหรับการสนทนาอันมีค่า เราขอขอบคุณ Dr. Tsuyoshi Inoue, Dr. Satoru Fukuda และคุณ Kahoru Amitani สำหรับการสนับสนุนด้านเทคนิค งานนี้ดำเนินการบางส่วนภายใต้การสนับสนุนของศูนย์วิทยาศาสตร์ไอโซโทป มหาวิทยาลัยโตเกียว งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดย Grant-in-Aid for Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Research Fellow (JSPS KAKENHI ให้ 19J11928 แก่ SH), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (JSPS KAKENHI ให้ 18H02824 แก่ MN ), Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI ให้ 17K09688 แก่ TT) และ Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (KAKENHI ให้ 26111003 แก่ MN)