ปริมาณสูงของ Ent-11 -hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic Acid ใน Adenostemma Lavenia (L.) O. Kuntze Leaf Extract: ด้วยการทดสอบเบื้องต้นใน Vivo Assay
Mar 23, 2022
ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com
Akie Hamamoto, Ryosuke Isogai, Miwa Maeda, Masumi Hayazaki, Eito Horiyama, Shigeo Takashima , Mamoru Koketsu และ Hiroshi Takemori *
เชิงนามธรรม:พื้นหลัง: Ent-11 -ไฮดรอกซี-15-oxo-Kaur-16-en-19-กรดโออิก(11 OH-KA) เป็นมัลติฟังก์ชันชีวเคมีที่พบในเฟิร์น Pteris semipinnata และสายพันธุ์เฉพาะของมัน แม้ว่าจะมีการเสนอการประยุกต์ใช้ OH-KA 11 ชนิดในการรักษาจำนวนหนึ่ง (เช่น ต้านมะเร็ง ต้านการอักเสบ และผิวขาวใส) ปริมาณ 11 OH-KA ในเฟิร์นเหล่านี้ไม่สูง Adenostemma lavenia (L.)O. Kuntze ซึ่งเป็นวงศ์ Asteraceae มีรายงานถึง 11 OH-KA ยาต้ม (สารสกัดจากน้ำร้อน) จากพืชทั้งต้นของ A. Lavenia ใช้เป็นยาพื้นบ้านสำหรับโรคเกี่ยวกับการอักเสบ เช่น โรคตับอักเสบและปอดบวม ซึ่งบ่งชี้ว่า 11 OH-KA อาจเป็นส่วนผสมที่รับผิดชอบต่อคุณสมบัติทางยาของพืชชนิดนี้ วิธีการ: ฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีของสารสกัดจากน้ำ A. เปรียบเทียบการลาเวเนียและเพเทอริสกำจัด Kunze (สายเลือดของ P. semipinnata) ในเซลล์เมลาโนมาของหนูเมาส์B16F10 ปริมาณของ11 OH-KAวัดโดยใช้โครมาโตกราฟีสเปกโตรเมทรีเหลว หนูเมาส์ C57BL/6J ถูกบำบัดด้วยสารสกัดจากน้ำของใบ A. Lavenia และวัดความเข้มข้นของเลือด 11 OH-KA ประสิทธิภาพในร่างกายของสารสกัดน้ำของ A. Lavenialeaf ได้รับการประเมินตามฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีโดยการตรวจสอบสีผม ผลลัพธ์:แม้ว่าสารสกัดทั้งสอง (A. Lavenia และ P. dispar Kunze) มีฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีสูง แต่มีเพียง A. Lavenia เท่านั้นที่มี 11 OH-KA ในปริมาณที่สูง หรือประมาณ 2.5 เปอร์เซ็นต์ของน้ำหนักใบแห้ง11 OH-KA สามารถทำให้บริสุทธิ์จากใบ A. Lavenia ในสองขั้นตอน: การสกัดน้ำตามด้วยการกระจายคลอโรฟอร์ม การรักษาหนูด้วยสารสกัดจากใบ A. Lavenia ยับยั้งการสร้างเม็ดสีในเส้นขน สรุป: แม้จะมีการตรวจสอบหนูจำนวนเล็กน้อย แต่ผลเบื้องต้นของการยับยั้งการสร้างเม็ดสีผมแสดงให้เห็นว่าสารสกัดจากน้ำของใบ A. Lavenia และส่วนผสมที่อาจรับผิดชอบต่อสิ่งนี้ — 11 OH-KA— เป็นวัสดุใหม่สำหรับเครื่องสำอางในช่องปาก ผลลัพธ์อาจเป็นประโยชน์ในการพัฒนาในอนาคตของอาหารที่มีประโยชน์และวิธีการรักษาผู้ป่วยที่ทุกข์ทรมานจากความผิดปกติของรอยดำ เช่น ฝ้า
คำสำคัญ: 11 -ไฮดรอกซี-15-oxo-kaur-16-en-19-กรดโออิก; ต่อต้านการสร้างเม็ดสี; ผิวขาวใส;อาหารที่มีประโยชน์; โรงงานทางการแพทย์ Adenostemma Lavenia; Pteris dispar Kunze;ไทโรซิเนส; B16F10 เมลาโนมา
Cistanche ยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนส
1. บทนำ
การศึกษาสารต่อต้านการสร้างเม็ดสีสำหรับผิวขาวใสและการต่อต้านริ้วรอยได้เกิดขึ้นบ่อยขึ้นโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับส่วนผสมในอาหาร (ผลไม้ ผัก และสมุนไพรทางการแพทย์) [1] โพลีฟีนอลและเทอร์พีนจำนวนหนึ่งและแหล่งที่มาได้รับการพัฒนาและจำหน่ายเป็นอาหารเสริมและอาหารเสริม
diterpene/kaurene ent-11 -hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic acid (11 OH-KA) ที่พบในใบเฟิร์น (Pteris semipinnata [2– 5], Pteris livida [6]) และ Compositae (Gochnatia decora [7]) เป็นตัวเลือกที่น่าสนใจสำหรับรีเอเจนต์ต่อต้านการสร้างเม็ดสี [5] แม้จะมีกิจกรรมทางสรีรวิทยาในวงกว้าง (เช่น ต้านมะเร็งและต้านการอักเสบ) [8–11] มีเพียงไม่กี่บันทึกเกี่ยวกับประสิทธิภาพของ OH-KA ในร่างกาย 11 ข้อ ซึ่งรวมถึงศักยภาพในการต่อต้านการสร้างเม็ดสี มีแนวโน้มว่าจะเนื่องมาจากหายาก และจำกัดจำนวนแหล่งที่มา
การศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างกับกิจกรรม ทั้งในหลอดทดลองและในเซลล์ที่เพาะเลี้ยง ได้ระบุความสัมพันธ์ใน 11 OH-KA ที่สำคัญสำหรับการทำกิจกรรมเชิงหน้าที่ (รูปที่ 1) การเปลี่ยนหมู่ thecarboxy ที่ตำแหน่งที่ 19 ใน11 OH-KAโดยหมู่เมทิลหรือไฮดรอกซีแปลงสารประกอบนี้เป็นสารประกอบที่มีฤทธิ์ต้านมะเร็งสูง ซึ่งบ่งชี้ว่า 19-หมู่คาร์บอกซิลทำให้ความเป็นพิษต่อเซลล์ของสารประกอบนี้อ่อนลง [5,10,12] ในทางตรงกันข้าม กลุ่มอัลคีนที่ตำแหน่งที่ 16 กลุ่มคีโตนที่ตำแหน่งที่ 15 และกลุ่มไฮดรอกซีที่ตำแหน่งที่ 11 เสริมการทำงานของกิจกรรม apoptotic โดยเปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ Caspase [10,12] อย่างไรก็ตาม มอยอิตีเหล่านี้ไม่จำเป็นสำหรับสัญญาณการตายของเซลล์ของเคารีน ข้อกำหนดเชิงโครงสร้างสำหรับฤทธิ์ต้านการอักเสบนั้นคล้ายคลึงกับข้อกำหนดสำหรับฤทธิ์ต้านมะเร็ง ซึ่งบ่งชี้ว่ามีการครอสทอล์คผ่านเป้าหมายระดับเซลล์ทั่วไป เช่น ปัจจัยนิวเคลียร์แคปปาบี (NF-κB) [12]
ไทโรซิเนสเป็นเอนไซม์จำกัดอัตราในการสังเคราะห์เมลานิน [13,14] เอนไซม์เร่งปฏิกิริยาตามลำดับปฏิกิริยา: การเปลี่ยนไทโรซีนเป็น l-3,4-ไดไฮดรอกซีฟีนิลอะลานีน, แอล-โดปา และโดปาควิโนน เราได้รายงานว่า 11 OH-KA ยับยั้งการแสดงออกของยีนไทโรซิเนสซึ่ง ส่งผลให้เกิดการปราบปรามของการสร้างเม็ดสีในเซลล์เมลาโนมาของหนูเมาส์ B16F10 [5] มอยอิตีของ 11 -ไฮดรอกซี,15-oxo และ 16-en ใน 11 OH-KA จำเป็นสำหรับต่อต้านการสร้างเม็ดสีกิจกรรมซึ่งเป็นลักษณะที่แตกต่างของข้อกำหนดโครงสร้างของ 11 OH-KA เมื่อเทียบกับกิจกรรมอื่น ๆ เช่นกิจกรรมต้านมะเร็งหรือต้านการอักเสบ
ดังนั้น ในแง่ของฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสี 11 OH-KA จึงเป็นสารประกอบที่มีเอกลักษณ์เฉพาะในหมู่คอเรนส์ น่าเสียดายที่ Pteris dispar Kunze แหล่งที่มาก่อนหน้าของเรา11 OH-KAมีสารประกอบนี้เพียงเล็กน้อย [5] และเฟิร์นนี้ เช่นเดียวกับ P. semipinnata (สายเลือดเดียวกัน) [4,15] ไม่มีประวัติการใช้ในมนุษย์ นอกจากนี้ ในการทดลองที่ผ่านมาทั้งหมด ตัวทำละลายอินทรีย์ (เมทิลหรือเอทิลแอลกอฮอล์ คลอโรฟอร์ม หรือเฮกเซน) ถูกใช้เพื่อสกัด 11 OH-KA โดยไม่มีการบันทึกการใช้การสกัดด้วยน้ำ
เกือบ 40 ปีที่แล้ว กลุ่มชาวอเมริกันค้นพบ 11 OH-KA และอนุพันธ์ของมันใน AdenostemmaLavenia (L.) O. Kuntze (a Asteraceae) [16] แม้ว่า A. Lavenia ยังไม่ได้ทำการศึกษาอย่างเพียงพอเกี่ยวกับความเสี่ยงของสารปนเปื้อนที่เป็นไปได้ (เช่น สารมลพิษอนินทรีย์ [17] และสารเมตาโบไลต์ทุติยภูมิที่เกิดจากเชื้อรา [18,19]) ในใบและส่วนอื่นๆ ผงทั้งพืช (ชื่อ Ma Zhi Hu) ขายใน ประเทศสหรัฐอเมริกา ภายใต้การอนุญาตของแพทย์ (สามารถรับผลิตภัณฑ์ได้จาก QualiHerb, Cerritos, CA, USA: วัสดุเสริม รูปที่ S1) ดังนั้น ในการศึกษานี้ โดยการวัดค่า11 OH-KAเนื้อหาและการประเมินประสิทธิภาพของกิจกรรมต่อต้านการสร้างเม็ดสีเราได้ตรวจสอบศักยภาพของสารสกัดน้ำของใบ A. Lavenia สำหรับใช้ในเครื่องสำอางภายใน เช่นเดียวกับอาหารฟังก์ชันประเภทใหม่ [20-22] ที่อาจใช้ในการรักษา ผู้ป่วยที่ทุกข์ทรมานจากความผิดปกติของรอยดำเช่นฝ้า จนถึงปัจจุบัน มีเพียงกรดทรานเน็กซามิก (ยาห้ามเลือด) เท่านั้นที่สามารถใช้เป็นยาภายในสำหรับความผิดปกติของรอยดำ [23,24]
เรารายงานที่นี่ว่าใบ A. Lavenia มี OH-KA 11 ตัวที่ระดับสูง (ประมาณ 2.5 เปอร์เซ็นต์ของน้ำหนักแห้งของใบ) สารสกัดน้ำของใบ A. Lavenia ยับยั้งได้อย่างมีประสิทธิภาพการสร้างเม็ดสีinB16F10 เซลล์ และ11 OH-KAอาจรับผิดชอบ 50 เปอร์เซ็นต์ของกิจกรรมต่อต้านการสร้างเม็ดสีของสารสกัดจากน้ำ การรักษาช่องปากของหนูด้วยสารสกัดจากน้ำของใบ A. Lavenia ส่งผลให้เกิดการยับยั้งการสร้างเม็ดสีผม
2. วัสดุและวิธีการ
2.1. การขยายพันธุ์ของอ.ลาเวเนีย
เนื่องจาก A. lavenia ถูกระบุว่าเป็นสัตว์ใกล้สูญพันธุ์ในพื้นที่ส่วนใหญ่ของประเทศญี่ปุ่น เราจึงเพาะพันธุ์พืชชนิดนี้ในบริเวณใกล้กับห้องปฏิบัติการของเรา A. lavenia ได้รับการขยายพันธุ์โดยการแบ่งจากกล้าไม้ 10 ต้น และใช้ใบแห้งเกือบ 100 ใบที่เก็บเกี่ยวตั้งแต่เดือนมิถุนายนถึงกรกฎาคม 2019 ในการศึกษานี้
2.2. การทำให้บริสุทธิ์ 11 OH-KA จากสารสกัดจากน้ำและการวิเคราะห์
Pure 11 -OH KA (ของแท้) ซื้อมาจาก BioBioPha (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) ผงใบแห้ง (100 มก.) ที่ได้จากใบของ A. lavenia หรือ P. dispar Kunze ถูกแช่ในน้ำกลั่น 1 มล. (สำหรับ 10-การสกัดในปริมาณมาก) เป็นเวลา 12 ชั่วโมง และเศษที่เหลือถูกกำจัดออกโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 12 000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที สารสกัดที่เป็นผลลัพธ์ถูกวิเคราะห์โดย high-performance (HP) liquidchromatography (LC) โดยใช้คอลัมน์ C18 ODS (4.6 มม. × 50 มม.: RP-18 GP, Kanto Kagaku, Tokyo, Japan) ที่มีการไล่ระดับสีตั้งแต่ 40 เปอร์เซ็นต์ เมทานอล/น้ำ ถึง 100 เปอร์เซ็นต์เมทานอล มากกว่า 10 นาที การตรวจจับ 11 -OHKA ดำเนินการโดยกำหนดหาการดูดกลืนรังสีอัลตราไวโอเลต (UV) ที่ 245 นาโนเมตร (A245) สำหรับการสกัดโดยปริมาตร 20-,30- และ 50- ผงใบแห้ง 50 มก., 33 มก. และ 20 มก. ถูกสกัดด้วยน้ำกลั่น 1 มล.
เพื่อยืนยันโครงสร้างของ {{0}}OH KA ใน A. lavenia กรด kaurenoic ถูกทำให้บริสุทธิ์ในระดับกึ่งขนาดใหญ่ ใบ A. lavenia แห้งทั้งหมด 100 กรัมถูกสกัดสองครั้งจากน้ำ 20 ปริมาตร เติม CHCl3 ในปริมาณที่เท่ากันลงในน้ำสกัดของใบ และ 11 -OH KA ถูกนำออกจากเฟส CHCl3 ในระหว่างการระเหยของเฟส CHCl3 ที่กู้คืน 11 -OH KA ถูกตกตะกอนเป็นผลึกสีขาว คริสตัลเหล่านี้ถูกนำกลับมาใช้โดยตัวกรองกระดาษ ผลึกที่กู้คืนถูกวิเคราะห์โดยคลื่นสนามแม่เหล็กนิวเคลียร์ (NMR) (1H-NMR (CDCl3) δ 0.95 (3H, s), 1.28 (3H, s),1.05–2.22 (15H, m), 2.37 (1H, d, J { {27}}.9 Hz), 3.06 (1H, s กว้าง), 4.06 (1H, d, J=4.6 Hz), 5.27 (1H, s) และ 5.87 (1H, s)) สเปกตรัม 1H-NMR ของคริสตัลเกิดขึ้นพร้อมกันกับ 11 -OH KAspectrum ของแท้ (ดูวัสดุเสริม รูปที่ S2)
2.3. การวิเคราะห์ 11 OH-KA ในเซรั่มหนู
วิธีการสำหรับการวิเคราะห์ LC (UPLC) ที่มีสมรรถนะสูงเป็นพิเศษ (MS) ถูกดึงมาจากวิธีการต่างๆ ที่ใช้ใน [25,26] โดยย่อ เพื่อบำบัดหนูเมาส์ (C57BL/6J), ใบ A. lavenia ถูกสกัดด้วยน้ำ 30 ปริมาตร หลังจากการฆ่าเชื้อที่ 120 ◦C เป็นเวลา 20 นาที สารสกัดถูกเจือจางเพิ่มเติมด้วยน้ำ 2 ปริมาตรและทำหน้าที่เป็นน้ำดื่ม เพื่อตรวจสอบเภสัชจลนศาสตร์ของ 11 -OHKA 100 มก./กก. ของสารประกอบที่แขวนลอยใน 1 เปอร์เซ็นต์ Tween 80 (Kanto Kagaku, Tokyo, Japan) ให้รับประทาน เลือดถูกกู้คืนผ่านทางหลอดเลือดดำส่วนหางหลังการให้ยา 15–240 นาที
เพื่อวัดค่า {{0}}OH KA ในเลือดของหนูเมาส์ ซีรัม (20 ไมโครลิตร) ถูกสกัดด้วย 200 ไมโครลิตรของโออะซีโตไนไตรล์ เพื่อปรับประสิทธิภาพการสกัดให้เป็นมาตรฐาน ให้เติม 18 -กรดไกลซีร์เรตินิก (คันโตคางากุ) 10 นาโนโมลลงในซีรัมก่อนการสกัด หลังจากการกำจัดอะซีโตไนไทรล์ออกโดยการระเหย สารประกอบถูกละลายใน 5 ไมโครลิตรของเมทานอลตามด้วยการเติม H2O 5 ไมโครลิตร จากนั้น สารละลาย 1 µLof ถูกใช้สำหรับ LC-MS spectrometry (MS: Waters Xevo G2-XS QTof, Waters, Milford, MA)เพื่อแยก 11 -OH KA, คอลัมน์ C18 ODS (3.0 มม.) × 150 มม. (5 µm): RP-18 GP, Kanto Kagaku) และเกรเดียนต์ตั้งแต่ 35 เปอร์เซ็นต์อะซีโตไนไตรล์/น้ำถึง 100 เปอร์เซ็นต์อะซีโตไนไตรล์ตลอด 10 นาที MSconditions มีดังนี้: capillary (kV), 2.20; แกนสุ่มตัวอย่าง 45; กรวยสกัด 4.0. เนื่องจากเราไม่สามารถตรวจจับชิ้นส่วนของ 11 -OH KA ผ่านการวิเคราะห์ MS/MS (รูปวัสดุเสริม S3A) ได้11 -OH KA ถูกหาปริมาณด้วยสัญญาณ MS เท่านั้นโดยการตรวจสอบอัตราส่วนมวลต่อประจุ (m/ z) จาก 331.1879 ด้วยเส้นทาง 0.01 Da (รูปวัสดุเสริม S3B) เส้นโค้งมาตรฐานถูกเตรียมโดยการเติม 11 -OH KA (ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 0.1–3 µM) ถึง 50 เปอร์เซ็นต์ของเมทานอล/น้ำที่เตรียมจากซีรัมของหนูเมาส์ปกติโดยใช้ขั้นตอนเดียวกันสำหรับ 11 -OH การสกัดด้วย KA กรดกลีซีเรตินิก 18 -ถูกวัดโดยใช้ LC-UV ภายใต้สภาวะเดียวกันกับที่ใช้สำหรับ11 -การวัด OH KA การทดลองกับสัตว์เหล่านี้ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการทดลองสัตว์แห่งมหาวิทยาลัยกิฟุ (H30-041) เราใช้หนูจำนวนขั้นต่ำเพื่อให้เป็นไปตามข้อกำหนดด้านสวัสดิภาพสัตว์
2.4. การทดสอบการสร้างเม็ดสี
เซลล์มะเร็งผิวหนังชนิดเมลาโนมา B16F10 ของหนูเมาส์จาก American Type Culture Collection (RIKEN, Tsukuba, Japan) ถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลางของ Eagle ดัดแปลงของ Dulbecco (DMEM- กลูโคสสูง (4.5 g/L d-glucose), WAKO, Kyoto, Japan) และเสริมด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ เซรั่มวัวในครรภ์และยาปฏิชีวนะ เซลล์ถูกบ่มในบรรยากาศที่ทำให้ชื้นด้วย CO2 5 เปอร์เซ็นต์ที่ 37 ◦C และถูกถ่ายโอนทุก ๆ สองวันด้วยไวอาทริปซิไนเซชันไปยังเพลตเพาะเลี้ยงใหม่
เซลล์ (2 × 105) ถูกเคลือบบนจาน 6-หลุมและบ่มเป็นเวลา 12–16 ชั่วโมงก่อนการเหนี่ยวนำของการสร้างเม็ดสี. การสร้างเมลาโนเจเนซิสถูกเหนี่ยวนำโดย 20 ไมโครโมลาร์ forskolin (Fsk) ร่วมกับสารสกัด A. laveniawater หรือ 11 -OH KA เป็นเวลา 48 ชั่วโมง การวัดเมลานินดำเนินการตามวรรณกรรม [5] โดยย่อ เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วยน้ำเกลือที่บัฟเฟอร์ด้วยฟอสเฟตและนำกลับคืนมาในหลอดรวบรวม 2 มล. ที่ตามด้วยการหมุนเหวี่ยงที่ 8000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 1.5 นาที แต่ละเซลล์เม็ดถูกแขวนลอยในน้ำกลั่น 200 ไมโครลิตร และใช้ 50 ไมโครลิตรสำหรับการวัดปริมาณโปรตีน ส่วนที่เหลือ 150 ไมโครลิตรถูกผสมกับ 150 ไมโครลิตรของ NaOH 2 โมลาร์ และจากนั้น ไลซ์โดยการบ่มที่ 45 ◦ซเป็นเวลา 2 ชั่วโมง เมลานินถูกสกัดด้วยส่วนผสมของคลอโรฟอร์ม-เมทานอล 2:1 และวัดด้วยเครื่องวัดความยาวคลื่น (Glomax Multi, Promega, Madison, WI, USA) ที่ 405 นาโนเมตร ความเข้มข้นของโปรตีนของเม็ดเซลล์ถูกกำหนดโดยใช้รีเอเจนต์ของ Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) และใช้สำหรับการปรับปริมาณเมลานินให้เป็นมาตรฐาน
ฤทธิ์ของสารสกัดซิสแทนเช่ : ยับยั้งการสร้างเม็ดสีเมลานินและปรับสีผิวให้ขาวขึ้น
2.5. การวิเคราะห์ทางสถิติ
การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้การทดสอบ t ของนักเรียน เมื่อได้ข้อมูลระหว่างการทดลองเดียวกัน เราไม่ได้ใช้การวิเคราะห์ทางสถิติหากทำการทดลองในวันที่ต่างกัน หรือหากจำนวนตัวอย่างมีเพียงสอง
3. ผลลัพธ์
3.1. A. Lavenia มีปริมาณ OH-KA . สูง 11
ก่อนหน้านี้เรารายงานว่าสารสกัดเอทานอลของใบ P. disper Kunze ที่เตรียมด้วยเอทานอลน้ำหนักแห้ง (v/w) 10 ปริมาตร ยับยั้งได้อย่างมีประสิทธิภาพการสร้างเม็ดสีในเซลล์ B16F10 แม้หลังจาก 1/1000 เจือจาง [5] เพื่อเปรียบเทียบประสิทธิภาพของสารสกัดน้ำของใบแห้ง A. lavenia กับสารสกัดน้ำของ P. disper ใบ Kunze เราได้เตรียมสารสกัด (น้ำ 20 ปริมาตร (ใบแห้งใบแห้ง)) และใส่ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อร่วมกัน ด้วย forskolin (ตัวกระตุ้นการสร้างเม็ดสี—ตัวเอก acAMP) สารสกัดทั้งสองยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินได้อย่างมีประสิทธิภาพแม้ในการเจือจาง 1/1000 เมื่อประเมินเนื้อหาของธีมลานินด้วยสายตา (รูปที่ 2A) ปริมาณเมลานินถูกวัดหลังจากการสกัด NaOH (รูปที่ 2B) ที่การเจือจาง 1/3000 สารสกัด A. lavenia ลดปริมาณเมลานินลง 69 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (Fsk เท่านั้น) และสารสกัด P. disper Kunze ลดปริมาณเมลานินลง 41 เปอร์เซ็นต์ ที่การเจือจาง 1/1000 สารสกัด A. lavenia จะลดปริมาณเมลานินลงอย่างสมบูรณ์ ในขณะที่สารสกัด P. disperKunze ลดปริมาณเมลานินลง 60 เปอร์เซ็นต์ ความแตกต่างนี้ไม่ถูกสังเกตเมื่อสารสกัดถูกเจือจางที่ 1/300
การวิเคราะห์ LC-UV แนะนำว่า11 OH-KAเป็นส่วนประกอบหลักในสารสกัด A. laveniawater (รูปที่ 2C, ซ้าย) ในทางตรงกันข้าม ไม่พบจุดสูงสุดที่ชัดเจนสำหรับ 11 OH-KA เมื่อตรวจพบค่า P สารสกัด Kunze ของสารกระจายตัวถูกวิเคราะห์ (รูปที่ 2C, ขวา) การวิเคราะห์ LC-MS ชี้ให้เห็นว่าจุดสูงสุดที่ระบุโดยลูกศรสอดคล้องกับ 11 OH-KA (ไม่แสดงข้อมูล) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า 11 OH-KA อาจเป็นองค์ประกอบหลักที่รับผิดชอบการสร้างเม็ดสีการยับยั้งในสารสกัด A. lavenia ในขณะที่อนุพันธ์เช่นรูปแบบไกลโคซิเลต [5] อาจมีส่วนช่วยในการยับยั้งเมลานินในP สารสกัด Kunze กระจาย
ต่อไปเราพยายามทำให้บริสุทธิ์11 OH-KAโดยการกระจาย CHCl3 สามารถสกัด 11 OH-KA จากสารสกัดน้ำ A. lavenia ด้านบนที่มีความบริสุทธิ์สูง (มากกว่า 87 เปอร์เซ็นต์ ) (รูปที่ 2D, ซ้าย) สเปกตรัมของการวิเคราะห์ NMR ของสารตกผลึกใน CHCl3 เหมือนกันกับของจริง 11 OH-KA (ดูวัสดุและวิธีการ) ในทางตรงกันข้าม สารประกอบที่ไม่รู้จักจำนวนมากถูกสกัดจากสารสกัดจากน้ำ P. disper Kunze (รูปที่ 2D, ขวา) บทสรุปของการวิเคราะห์ LC แสดงไว้ในรูปที่ 2E ซึ่งบ่งชี้ว่า A. lavenia เป็นแหล่งที่น่าสนใจของ 11 OH-KA
3.2. การสกัด 11 OH-KA จาก A. lavenia . ที่เหมาะสม
ตามข้อมูลที่พบในอินเทอร์เน็ต ทุกส่วน (ใบ ก้าน และราก) ของ A. lavenia ใช้เป็นยาสมุนไพรในจีนและไต้หวัน เพื่อหาสภาวะที่ดีที่สุดสำหรับการสกัด OH-KA 11 ชนิดจาก A. lavenia เราตรวจสอบก่อนว่าส่วนใดของพืชอุดมไปด้วยสารประกอบนี้ สารสกัดน้ำถูกเตรียมจากใบเพียงอย่างเดียวหรือจากส่วนทางอากาศ ดิการสร้างเม็ดสีการทดสอบในเซลล์ B16F10 พบว่าสารสกัดที่เตรียมจากส่วนทางอากาศ (ลำต้นและใบ) มีฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีน้อยกว่าที่เตรียมจากใบเพียงอย่างเดียว (รูปที่ 3A, ซ้าย) นี่แสดงให้เห็นว่าลำต้น (ซึ่งคิดเป็นมากกว่าร้อยละ 90 ของน้ำหนักแห้ง) มีน้อยกว่า11 OH-KAซึ่งได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์ LC-UV (รูปที่ 3A, ขวา)
ต่อไป เราตรวจสอบปริมาณน้ำที่ควรใช้สำหรับการสกัด เห็นได้ชัดว่าน้ำปริมาณเล็กน้อย (10-เท่า) สามารถเพิ่มคุณค่าได้11 OH-KA(รูปที่ 3B). เราคาดการณ์ว่าความสามารถในการละลายต่ำของ 11 OH-KA ในน้ำอาจช่วยรักษาสารประกอบนี้ไว้ในสารตกค้าง มีการสังเกตการฟื้นตัวสูงสุดของ 11 OH-KA ในน้ำเมื่อใช้น้ำมากกว่า 30 ปริมาตร (รูปที่ 3C) ดังนั้น เมื่อพิจารณาการฟื้นตัวสูงสุดและการเพิ่มปริมาณ 11 OH-KA ในน้ำ เราใช้น้ำ 30 ปริมาณในการทดลองในภายหลัง
ในประเทศจีนและไต้หวัน A. lavenia ถูกสกัดในน้ำร้อน โดยผ่านการตรวจสอบความคงตัวทางความร้อนของ 11 OH-KA น้ำสกัดถูกบ่มที่ 90 ◦C หรือ 120 ◦C เป็นเวลา 10 หรือ 20 นาที และปริมาณ OH-KA 11 รายการถูกวิเคราะห์โดย LC-UV การบำบัดด้วยความร้อนเหล่านี้ทำให้เกิดการตกตะกอนจำนวนมาก ซึ่งอาจประกอบด้วยโปรตีนที่ทำให้เสียสภาพ ดิ11 OH-KAเห็นได้ชัดว่าเนื้อหาในส่วนที่ละลายได้เพิ่มขึ้น (รูปที่ 3D) ซึ่งอาจเป็นผลมาจากการกำจัดวัสดุที่ตกตะกอนเหล่านี้
3.2.1. OH-KA เป็นสารประกอบในสารสกัดจากน้ำ A. Lavenia ที่ทำหน้าที่ต่อต้านการสร้างเม็ดสีในเซลล์ B16F10
เมื่อสกัด 1 กรัมของใบในน้ำ 30 ปริมาตร เนื้อหาของ 11 OH-KA คือประมาณ 0.6 มก./มล. (1.8 mM) เพื่อกำหนดระดับของการมีส่วนร่วมของ11 OH-KAในสารสกัดน้ำ A. lavenia เพื่อต่อต้านการสร้างเม็ดสี ความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ 11 OH-KA แท้จริงได้รับการทดสอบในเซลล์ B16F10 การตรวจด้วยสายตา (ภาพที่ 4A) และการวัดปริมาณเมลานิน (ภาพที่ 4B) เปิดเผยว่าสารสกัดจากน้ำ (รูปที่ 4A ชุดบน) มีประสิทธิภาพเท่ากันในแง่ของฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีเท่ากับ 11 OH-KA แท้จริงเพียงอย่างเดียว (ภาพที่ 4A, ชุดล่าง) มีเพียงครึ่งเดียวของ11 OH-KA. ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า 11 OH-KA ในสารสกัดมีส่วนทำให้ฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีของสารสกัดเกือบ 50 เปอร์เซ็นต์ อีก 50 เปอร์เซ็นต์อาจมาจากอนุพันธ์ OH-KA 11 ชนิด เช่น รูปแบบไกลโคไซด์ ซึ่งอาจอธิบายเนื้อหาที่ต่ำของ 11 OH-KA ใน theP กระจายสารสกัด Kunze แม้จะมีประสิทธิภาพสูงในแง่ของฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสี (รูปที่ 2)
ผลของสารสกัดจากซิสแทนเช่: ต่อต้านริ้วรอยและปรับสีผิวให้ขาวขึ้น
3.2.2. OH-KA เป็นสารประกอบในสารสกัด A. lavenia ที่ทำหน้าที่ต่อต้านการสร้างเม็ดสีในหนู
เพื่อให้ได้ผลลัพธ์เบื้องต้นสำหรับการพัฒนาในอนาคตของ A. lavenia เป็นวัสดุสำหรับเครื่องสำอาง,เราทำการวิเคราะห์ในร่างกายโดยใช้หนูจำนวนน้อย ก่อนอื่นเราตรวจสอบเภสัชจลนศาสตร์ของ 11 OH-KA ในหนูทดลอง การดื่มน้ำประมาณ 4 มล. ต่อวันในหนูที่มีน้ำหนักตัวประมาณ 25 กรัม ความสามารถในการละลายสูงสุดของ 11 OH-KA ในสารสกัดน้ำของ A. lavenia (ดูรูปที่ 3C, 20–30 ปริมาตรน้ำ: 0.6 มก./มล.) ในทางทฤษฎีสามารถให้ 100 มก./กก. ปริมาณกรด thiskaurenoic รายวัน (4 มล. 0.6 มก./มล. 11 OH-KA ทำ 2.4 มก./วัน การทำให้เป็นปกติ 2.4 มก. โดยน้ำหนักตัวเมาส์ (25 กรัม) ส่งผลให้ 96 มก./กก.) ดังนั้นเราจึงตัดสินใจรักษาหนูด้วย 100 มก./กก.11 OH-KA (ระงับใน 200 ไมโครลิตรที่ 1 เปอร์เซ็นต์ Tween 80)
รักษาช่องปากด้วย11 OH-KAส่งผลให้มีลักษณะอย่างรวดเร็ว (ภายใน 15 นาที) ในเลือด (รูปที่ 5A) ความเข้มข้นไปถึงและคงขนาดยาที่มีประสิทธิผลไว้ในเซลล์ B16F10 ผลลัพธ์นี้บ่งชี้ว่า 11 OH-KA สามารถดูดซึมผ่านทางเดินอาหารได้ อย่างไรก็ตาม ความจริงที่ว่าความเข้มข้นลดลงภายใน 60 นาที บ่งชี้ว่ามีการขับสารประกอบนี้ออกอย่างรวดเร็ว
ต่อไป เราตรวจสอบผลกระทบเรื้อรังของ 11 OH-KA ในหนู เนื่องจากแม้ 0.6 มก./มล. ของ 11 OH-KA ตกตะกอนในน้ำดื่มอย่างรวดเร็วถ้า11 OH-KAบริสุทธิ์ เราจึงตัดสินใจทดสอบสารสกัดจากน้ำ A. lavenia อย่างไรก็ตาม สารสกัดจากน้ำ A. lavenia อาจมีส่วนผสมที่ไม่รู้จักและมีรสขม ดังนั้น สารสกัดต้องเจือจางเพิ่มเติมด้วยน้ำสองปริมาตร (ด้วยค่าสุดท้ายที่0.3 มก./มล. สำหรับ 11 OH -KA ประมาณ 50 มก./กก./วัน) หนูเมาส์ถูกบำบัดด้วยสารสกัดจากน้ำเป็นเวลา 1 สัปดาห์ จากนั้นจึงเก็บตัวอย่างเลือดของพวกมัน (รูปที่ 5B) การวิเคราะห์ LC-MS ตรวจพบ 11 OH-KA ในเลือดที่ความเข้มข้นกึ่งประสิทธิผล ยังได้ตรวจสอบสารสกัดจากน้ำ P. dispar Kunze ที่เตรียมโดยขั้นตอนเดียวกับสารสกัดจากน้ำ A. lavenia ด้วย ปริมาณ 11 OH-KA ในเลือดของหนูที่ได้รับการรักษาด้วยสารสกัด P. dispar Kunze นั้นต่ำกว่าหนูที่ได้รับสารสกัดจาก A. lavenia ถึง 10 เท่า
ในหนูที่โตเต็มวัย การเจริญเติบโตของเส้นผมจะหยุดชั่วคราวระหว่างระยะเทโลเจนเป็นเวลาหลายเดือน และการเจริญเติบโตใหม่ (แอนาเจน) จะเกิดขึ้นแบบสุ่มในช่วงสองสามวันในพื้นที่ต่างๆ [27] ดังนั้น เพื่อตรวจสอบผลกระทบของการสร้างเม็ดสีสารยับยั้ง ระยะเวลาในการบำบัดด้วยสารประกอบ (สารยับยั้ง) ควรเป็น (เช่น หลายเดือน) ในทางตรงกันข้าม ขนอ่อนจะถูกแทนที่ด้วยขนของผู้ใหญ่พร้อมกันในช่วง 3–4-สัปดาห์ (W) ดังนั้น เมื่อหนูทดลอง 3W ได้รับการรักษาด้วยสารยับยั้งเป็นเวลา 2 สัปดาห์ ผลกระทบต่อการสร้างเม็ดสีสามารถประเมินได้จากการสร้างเม็ดสี (สี) ของผมที่ปลูกใหม่ (เช่น ผมผู้ใหญ่คนแรก) ที่ 5W-6W [28]
เมื่อหนูได้รับการรักษาด้วยสารสกัด A. lavenia ผ่านทางน้ำดื่มเป็นเวลาสองสัปดาห์ (3W–4W) เม็ดสีของพวกมันถูกระงับในเส้นขนที่งอกใหม่ (รูปที่ 5C) ในทางตรงกันข้าม สีคล้ำของดวงตาไม่ได้รับผลกระทบ ไม่พบการปราบปรามของเม็ดสีผมในหนูที่ได้รับการบำบัดด้วยสารสกัด P. dispar Kunze ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าสารสกัดจากใบ A. lavenia อาจมีสารต่อต้านการสร้างเม็ดสี อาจเป็น 11 OH-KA ที่มีประสิทธิภาพในร่างกาย ในขณะที่ P dispar สารสกัดจากใบ Kunze น่าจะอุดมไปด้วย11 OH-KAอนุพันธ์อาจไม่ได้ผลในร่างกาย
ประโยชน์ของ cistanche: ต่อต้านอนุมูลอิสระ
4. การอภิปราย
เราพบว่าใบ A. lavenia มีปริมาณ OH-KA 11 สูง (ประมาณ 2.5 เปอร์เซ็นต์ของน้ำหนักใบแห้ง) น้ำสกัดได้ 11 OH-KA อย่างมีประสิทธิภาพ แม้จะมีลักษณะไม่ชอบน้ำของสารประกอบนี้ เนื่องจาก OH-KA 11 ตัวในน้ำมีความคงตัวที่ 120 ◦C เป็นเวลา 20 นาที เราจึงฆ่าเชื้อสารสกัดน้ำของ A ใบลาเวเนียและให้หนู ผลยืนยันการมีอยู่ของ11 OH-KAในเลือดของ themice และความแรงของสารสกัดน้ำเป็นรีเอเจนต์ต่อต้าน melanogenic ในร่างกาย.
มีรายงานการมีอยู่ของ OH-KA 11 ชนิดและอนุพันธ์ของมันใน A. lavenia ในปี 1979 [16] และ 1990 [29] นับแต่นั้นมา มีงานวิจัยเพียงชิ้นเดียวจากอินโดนีเซียที่รายงานการวิเคราะห์อย่างครอบคลุมของส่วนผสมใน A. lavenia [30] อย่างไรก็ตาม ไม่พบ 11 OH-KA ในวัสดุเหล่านั้น นอกจากนี้ ยังไม่มีการศึกษาคุณสมบัติทางกายภาพของ 11 OH-KA ซึ่งสามารถสกัดได้ด้วยน้ำบริสุทธิ์จาก A. lavenia
บทความทบทวนเกี่ยวกับการเยียวยาพื้นบ้านในอินเดียกล่าวถึงสารสกัดจากน้ำ A. lavenia ว่าเป็นการรักษาความผิดปกติของระบบย่อยอาหาร [31] การค้นหาทางอินเทอร์เน็ตสำหรับ "A. lavenia" หรือชื่อภาษาจีนแนะนำการใช้ประโยชน์ของพืชชนิดนี้ในฐานะยาสมุนไพรต้านการอักเสบผ่านสารสกัดจากน้ำร้อน (เช่น เป็นยาระงับความรู้สึก) (เช่น สำหรับตับอักเสบ ปอดอักเสบ (ภูมิแพ้และอุดกั้นเรื้อรัง) โรคปอดบวม) และการอักเสบของผิวหนัง) อย่างไรก็ตาม ไม่พบรายงานอย่างเป็นทางการเกี่ยวกับกิจกรรมทางชีวภาพของสารสกัด A. lavenia หรือสถานะทางนิเวศวิทยาของพืชชนิดนี้ใน PubMed ในเมืองของเรา (กิฟุ ประเทศญี่ปุ่น) A. laveniais ระบุว่าเป็นสัตว์ใกล้สูญพันธุ์ ความหายากของ A. lavenia อาจทำให้ยากต่อการวิเคราะห์และพัฒนาศักยภาพในการเป็นยาสมุนไพรและอาหารที่มีประโยชน์
ในทางกลับกัน ศักยภาพที่เป็นประโยชน์ของ11 OH-KAบริสุทธิ์จาก P. semipinnata ได้รับการกำหนด ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย [8–11] แม้ว่าเราจะไม่ได้ตรวจสอบเนื้อหาของ 11 OH-KA ใน P.semipinnata เราเดาว่าเนื้อหานี้อาจไม่สูงมากเมื่อเทียบกับใน A. lavenia เพราะP. semipinnata มีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับ P. disper Kunze นอกจากนี้ ไม่มีบันทึกเกี่ยวกับการใช้สิ่งเหล่านี้เฟิร์นในมนุษย์แม้แต่บนอินเทอร์เน็ต ภูมิหลังนี้ชี้ให้เห็นว่า A. lavenia อาจมีศักยภาพทางยาสมุนไพรมากกว่าเฟิร์นเหล่านี้ ถ้า 11 OH-KA แสดงให้เห็นว่ามีศักยภาพทางคลินิก
การศึกษาศักยภาพของ11 OH-KAได้รับการมุ่งเน้นไปที่กิจกรรมในฐานะตัวแทนต้านมะเร็ง [2,10,11,32] และสารต้านการอักเสบ [11,33] อย่างไรก็ตาม มันก็จริงเช่นกันที่ปริมาณ 11 OH-KA ที่จำเป็นสำหรับกิจกรรมเหล่านี้มากกว่า 20 µM ซึ่งค่อนข้างสูง ในทางตรงกันข้าม ที่ความเข้มข้นน้อยกว่า 1 µM kaurene ent-11 -hydroxy-16-Karen-15-หนึ่งซึ่งมีหมู่เมทิลอยู่ในตำแหน่ง19-แทนที่จะเป็นคาร์บอกซิล กลุ่มใน 11 OH-KA แสดงกิจกรรมการตายของเซลล์สูงต่อมนุษย์ HL-60 monocytes [12] ความแตกต่างเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าตำแหน่ง 19- อาจเป็นตัวกำหนดความเป็นพิษต่อเซลล์ [5]
แม้ว่ากิจกรรมต้านเนื้องอกและต้านการอักเสบจะพบในคอเรนหลายชนิด [7,34–36] แต่ลักษณะเฉพาะของ 11 OH-KA คือกิจกรรมต่อต้านการสร้างเม็ดสี [5] สารประกอบธรรมชาติหลายชนิด เช่น ฟลาโวนอยด์และเทอร์พีนอยด์ ถูกพบว่าปรับการสร้างเม็ดสีโดยการเปลี่ยนการแสดงออกของ microphthalmia transcription factor (MITF) ซึ่งจำเป็นสำหรับโปรแกรมสร้างเม็ดสี [13,14] ตรงกันข้ามกับสารประกอบเหล่านี้ ไม่พบโมดูเลเตอร์ของ MITF ในกรด kaurens orkaurenoic
11 OH-KAยับยั้งการแสดงออกของไทโรซิเนสยีนโดยการลดกิจกรรมโปรโมเตอร์ แม้ว่า 11 OH-KA จะไม่เปลี่ยนแปลงการแสดงออกหรือระดับกิจกรรมของ MITF แต่ 11 OH-KA ยับยั้งการทำงานของโปรโมเตอร์ยีนในลักษณะที่ขึ้นกับ MITF-binding-element [5] น่าสนใจ การแสดงออกของ MITF มากเกินไปในเซลล์ B16F10 ส่งผลให้เกิดการยกเลิก 11 OH-KA-mediatedsuppression ของกิจกรรมโปรโมเตอร์ไทโรซิเนส ซึ่งบ่งชี้ว่า 11 OH-KA อาจรับสมัครตัวยับยั้งที่ไม่รู้จักไปยังองค์ประกอบที่มีผลผูกพัน MITF นอกจากนี้ กลไกที่ 11 OH-KA ยับยั้งไทโรซิเนสการออกฤทธิ์ของโปรโมเตอร์อาจแตกต่างจากที่นำไปสู่ความเป็นพิษต่อเซลล์ เนื่องจากฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีถูกสังเกตพบแม้ว่าเซลล์ B16F10 จะได้รับการบำบัดด้วย 1.2 µM ของ 11 OH-KA (รูปที่ 4)
การวิจัยเกี่ยวกับแบบจำลองผิวหนังสามมิติของมนุษย์ซึ่งประกอบด้วย primary keratinocytes และ melanocytes ชี้ให้เห็นว่าการใช้เฉพาะที่ 1 mM ของ11 OH-KAยับยั้งการสร้างเม็ดสีผิวอย่างสมบูรณ์ [5] ในแง่ของฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสี 1 mM ของ 11 OH-KA เทียบเท่ากับประมาณ 6.6 มก./มล. (0.66 เปอร์เซ็นต์ ) ของใบ A. Lavenia แห้ง (รูปที่ 3) ในบริบทนี้ A. Lavenia เป็นแหล่งเครื่องสำอางที่น่าดึงดูดสำหรับผิวขาวใส. นอกจากนี้ A. Lavenia ยังใช้เป็นยาพื้นบ้านและ 11 OH-KA มีระยะขอบกว้างระหว่างปริมาณที่มีประสิทธิภาพ (ความเข้มข้น) สำหรับการต่อต้านการสร้างเม็ดสีและความเป็นพิษต่อเซลล์
ที่สำคัญ tranexamic acid (ยาห้ามเลือด) ถูกพบว่าไปกดทับการสร้างเม็ดสีเมลานินในผิวหนังมนุษย์ และใช้เป็นยารับประทานเพื่อรักษาฝ้า [23,24] ที่น่าสนใจคือ ขนของหนูที่ได้รับการบำบัดด้วยกรดทราเนซามิกเปลี่ยนสีจากสีดำเป็นสีน้ำตาล [37] ในการศึกษานี้ เรายังแสดงให้เห็นด้วยว่าสารสกัดจากใบ A. Lavenia สามารถยับยั้งการสร้างเม็ดสีผม (น้ำตาลดำถึงน้ำตาล) ในหนูได้อย่างมีประสิทธิภาพเมื่อให้ทางปาก บ่งบอกว่าใบ A. Lavenia สามารถพัฒนาเป็นเครื่องสำอางภายในและอาหารที่มีประโยชน์ได้ [20– 22] สำหรับผู้ป่วยที่เป็นฝ้า จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับเป้าหมายระดับเซลล์ของสารสกัด A. Lavenia และ11 OH-KAตลอดจนความปลอดภัยของพวกเขา
เม็ด cistancheสำหรับผิวขาวใส
