ประสิทธิผลของสารต้านอนุมูลอิสระผลพลอยได้จากอาหารต่อการแสดงออกของยีน CYP ที่ถูกกระตุ้นและการเปลี่ยนแปลงทางเนื้อเยื่อในตับและไตของลูกสุกรที่เลี้ยงด้วยอะฟลาทอกซิน บี1 และโอคราทอกซิน เอ

edmund.chen@wecistanche.com

เชิงนามธรรม:การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาศักยภาพของสารผสมผลพลอยได้จากอุตสาหกรรมน้ำมันเมล็ดองุ่นและน้ำมันทะเล buckthorn ในการบรรเทาความเสียหายที่เป็นอันตรายที่เกิดจาก ochratoxin A และ aflatoxin B1 ที่ตับและไตระดับของลูกสุกรหลังหย่านม ลูกสุกรลูกผสม TOPIGS-40 ลูกผสมสี่สิบตัวหลังหย่านมถูกกำหนดให้กับกลุ่มทดลองสามกลุ่ม (E1, E2, E3) และกลุ่มควบคุมหนึ่งกลุ่ม (C) และให้อาหารทดลองเป็นเวลา 30 วัน อาหารพื้นฐานทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมและมีอาหารผสมปกติสำหรับลูกสุกรเริ่มต้นที่ไม่มีสารพิษจากเชื้อรา กลุ่มทดลองได้รับอาหารดังนี้: E1—อาหารพื้นฐานบวกส่วนผสม (1:1) ของสองผลพลอยได้ (เมล็ดองุ่นและกากทะเล buckthorn); E2—อาหารพื้นฐานที่ทดลองปนเปื้อนด้วยสารพิษจากเชื้อรา (479 ppb OTA และ 62ppb AFB1); และ E3—อาหารพื้นฐานที่มีส่วนผสมของเมล็ดองุ่นและซีบัคธอร์น 5 เปอร์เซ็นต์ (1:1) และปนเปื้อนด้วยส่วนผสมของ OTA และ AFB1 หลังจาก 4 สัปดาห์ สัตว์เหล่านี้จะถูกฆ่า และเก็บตัวอย่างเนื้อเยื่อจากตับและ ไต เพื่อทำการแสดงออกของยีนและการวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อ การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนแสดงให้เห็นว่าเมื่อลูกสุกรหย่านมได้รับอาหารที่มีการปนเปื้อน การแสดงออกของยีนที่วิเคราะห์ส่วนใหญ่จะลดการควบคุมลง ในบรรดาตระกูล CYP450 CYP1A2 เป็นยีนที่มีการปรับลดต่ำที่สุด จากผลลัพธ์เหล่านี้ ในตับ เราพบว่าสารพิษจากเชื้อราทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางเนื้อเยื่อในตับและไตและมีผลกระทบต่อระดับการแสดงออกของ CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1 และ CYP3A29 แต่เราไม่พบการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในระดับการแสดงออกของยีน CY4A24, MRP2 และ GSTA1

คำสำคัญ: ลูกสุกร; ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ วัตถุเจือปนอาหาร สารพิษจากเชื้อรา; การแสดงออกของยีน CYPs ไต; ไต

บทนำ

สารพิษจากเชื้อราเป็นสารที่เป็นพิษทุติยภูมิที่เกิดจากเชื้อราเส้นใยบางสายพันธุ์ สารประกอบที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำเหล่านี้ (สูงถึง 500 Da) สามารถปนเปื้อนวัตถุดิบได้หลากหลาย และทำให้ความเสี่ยงต่อสุขภาพของมนุษย์และสัตว์เพิ่มขึ้น [1] จำนวนของสารพิษจากเชื้อราที่มีลักษณะเฉพาะและมีผลที่รู้จักกันดีนั้นค่อนข้างน้อย เนื่องจากมีสารเมตาโบไลต์จำนวนมากที่อาจเป็นพิษที่เกิดจากเชื้อรา [2 – 4 ] แบ่งออกเป็น 5 กลุ่ม โดยมีโครงสร้างทางเคมีเฉพาะที่เกิดขึ้นบ่อยในอาหารสัตว์และอาหาร ได้แก่ ไตรโคธีซีน ซีราลีโนน โอคราทอกซิน ฟูโมนิซิน และอะฟลาทอกซิน เชื้อราที่ผลิตสารพิษจากเชื้อราที่พบในอาหารและอาหารสัตว์แบ่งออกเป็นสองกลุ่ม: เชื้อราที่บุกรุกก่อนเก็บเกี่ยวเมล็ดพืช เรียกว่าเชื้อราในไร่ และเชื้อราที่เติบโตหลังการเก็บเกี่ยวเท่านั้น เรียกว่าเชื้อราสะสม [ 5 ] ในระดับยุโรป มีข้อบังคับและคำแนะนำเกี่ยวกับระดับที่ยอมรับสูงสุดสำหรับสารพิษจากเชื้อรา 6 ชนิดที่พบได้ทั่วไปในอาหารสุกร: อะฟลาทอกซิน ฟูโมนิซิน ออคราทอกซิน ดีออกซีนิวาเลนอล ทอกซิน T2 และซีราลีโนน [ 6 – 8] ในบรรดาสัตว์ในฟาร์ม หมูมีความไวต่อสารพิษจากเชื้อรามากเนื่องจากการสัมผัสกับอาหารสัตว์ที่มีธัญพืชเป็นส่วนประกอบ [9] เมแทบอลิซึมของสุกรไม่ได้ผลในการล้างพิษและขับสารพิษจากเชื้อรา ซึ่งเพิ่มความเสี่ยงของการเกิดพิษจากเชื้อรา ความอ่อนไหวนี้ยังแตกต่างกันไปตามอายุ ความเข้มข้นของสารพิษจากเชื้อราในอาหารสัตว์ และระยะเวลาในการสัมผัส ตับเป็นอวัยวะที่ได้รับผลกระทบมากที่สุดจากการกลืนกินสารพิษเหล่านี้ [10] นอกจากนี้ สารพิษเหล่านี้ยังเพิ่มการซึมผ่านของเยื่อบุผิวในลำไส้ในสุกรและสัตว์ปีก ซึ่งอาจทำให้เกิดอาการลำไส้แปรปรวนแบบเนื้อตายได้ [11] และภูมิคุ้มกันลดลงโดยกำเนิด

CISTANCHE จะปรับปรุงการทำงานของไต/ไต

อะฟลาทอกซินเป็นตัวแทนของสารพิษจากเชื้อราที่มีมากที่สุดที่พบในอาหาร เมล็ดพืชน้ำมัน ธัญพืช นม ดิน สัตว์ และมนุษย์ อะฟลาทอกซินทุกชนิดมาจากเชื้อราในสกุล Aspergillus และจัดว่าเป็นสารพิษจากเชื้อราที่เป็นอันตรายต่อสัตว์และมนุษย์มากที่สุด [4 , 10 – 17 ] ดังที่กล่าวไว้ข้างต้น ในลูกสุกรที่ดูดนมและสุกรที่กำลังเติบโต สุกร และสุกรผสมพันธุ์ ผลกระทบทางชีวภาพหลักของอะฟลาทอกซิน ได้แก่ การก่อมะเร็ง ภูมิคุ้มกันบกพร่อง . ผลกระทบที่รุนแรงในสุกรอาจนำไปสู่โรคตับอักเสบเฉียบพลัน อาการตกเลือดทั่วร่างกาย โรคไต และการเสียชีวิต [20] รวมทั้งความต้านทานต่อความเครียดลดลง [21] ผู้เขียนบางคนยังแสดงให้เห็นว่าสุกรที่เลี้ยงด้วยอะฟลาทอกซินในระดับต่ำแสดงสัญญาณของอาการบวมน้ำที่ปอด การบริโภคอาหารลดลงและการเพิ่มของน้ำหนักตัว และการลดลงของกิจกรรมของเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการออกซิเดชันดีคาร์บอกซิเลชัน เช่นเดียวกับโปรตีนในซีรัมทั้งหมด ความดันโลหิต และ จำนวนเม็ดเลือดขาวทั้งหมด [ 18 , 22 – 24 ]. ในบริบทนี้ ตาม European Commission Directive 2003/100/EC ระดับสูงสุดของอะฟลาทอกซิน B1 (AFB1) ที่ยอมรับสำหรับสุกรกำหนดไว้ที่ 0.02 มก./กก. Ochratoxins เป็นสารทุติยภูมิที่เกิดจากเชื้อราในสกุล Aspergillus และ Penicillium ความคิดเห็นที่แตกต่างกันเกี่ยวกับกลไกทางพันธุกรรมหรือ nongenotoxic ของความเป็นพิษของ ochratoxins ได้รับการตีพิมพ์ [ 25, 26 ] จากการศึกษาในหลอดทดลองและในร่างกายพบว่า DNA adducts จำเพาะของ guanine-OTA นั้นคงอยู่นานกว่า 16 วันที่ไตในขณะที่ตับและม้าม จะถูกลบออกหลังจาก 5 วัน [27] ด้วยเหตุนี้ พิษและสารก่อมะเร็งหลักจึงถูกกระทำในไต[28].

สารเมแทบอไลต์ของ ochratoxins ส่วนใหญ่จากการดีท็อกซ์ระยะที่ 1 และระยะที่ 2 มีความเป็นพิษต่ำ ในกระเพาะอาหาร ส่วนหนึ่งของ ochratoxins จะถูกไฮโดรไลซ์เป็น ochratoxin โดยเอนไซม์โปรตีโอไลติก ความเป็นไปได้อีกประการหนึ่งสำหรับการไฮโดรไลซิสของพวกมันคือการเปิดของวงแหวนแลคโตนภายใต้สภาวะที่เป็นด่างของลำไส้ ซึ่งส่งผลให้เกิดสารประกอบที่มีความเป็นพิษสูง เนื่องจากมีผลผูกพันกับอัลบูมินอย่างมาก การกำจัด ochratoxins โดยการกรองไตจึงเป็นเรื่องเล็กน้อย โดยส่วนใหญ่การขับถ่ายจะผ่านการหลั่งของท่อ การสลายของท่อถือเป็นส่วนรับผิดชอบบางส่วนสำหรับการสะสมของ ochratoxins ภายในเซลล์ [29,30] โดยทั่วไปในสัตว์เลี้ยงในฟาร์ม ochratoxins จะถูกดูดซึมอย่างรวดเร็วหลังจากกลืนกินผ่านทางเดินอาหาร (กระเพาะอาหารและส่วนใกล้เคียงของ jejunum) ในลักษณะที่เฉยเมย ซึ่งชอบโดยความสัมพันธ์ที่สูงของการจับของ ochratoxins กับโปรตีนในพลาสมา และในรูปแบบที่ไม่มีไอออน ซึ่งอธิบายการคงอยู่ของพวกมันในร่างกาย ในซีรัมของสุกร ochratoxins จะจับกับโปรตีนที่มีมวลโมเลกุลน้อยกว่า 20 kDa โดยจำเพาะเจาะจงมากขึ้น ทำให้พวกมันสามารถผ่านเยื่อหุ้มชั้นใต้ดินของไตและขับพิษต่อไตได้ Ochratoxins ยังสะสมอยู่ในตับและกล้ามเนื้อ อย่างไรก็ตาม,ไตเป็นพื้นที่หลักในการจัดเก็บออคราทอกซิน โดยมีการดูดซึมกลับที่ท่อส่วนปลายและส่วนปลาย ส่งผลให้ร่างกายคงอยู่และเป็นพิษต่อไตเพิ่มขึ้น [27,31] ในทางกลับกัน เมื่อ AFB1 ถูกดูดซึมที่ระดับลำไส้ มันจะไปถึงตับซึ่งจะถูกเปลี่ยนโดยเอนไซม์ Phase I metabolizing enzyme โดย hydroxylation, Hydration, demethylation และ epoxidation ปฏิกิริยาสามปฏิกิริยาแรกสร้างสารเมแทบอไลต์ที่ไม่เป็นพิษ ในขณะที่ปฏิกิริยาที่สี่สร้าง AFB1-8,9 อีพอกไซด์ที่สร้าง adducts กับ DNA ที่ตำแหน่ง N7 ของกวานีน [32] นอกจากนี้ AFB1 สามารถคอนจูเกตกับกลูตาไธโอนที่รีดิวซ์ได้ในปฏิกิริยาที่เร่งปฏิกิริยาโดยกลูตาไธโอน-เอส-ทรานสเฟอเรส [33] และกรดกลูโคโรนิก [34] การขับถ่ายของ AFB1 เกิดขึ้นโดยหลักผ่านทางทางเดินน้ำดี ตามด้วยทางเดินปัสสาวะ [35]

ปัญหาหลักประการหนึ่งที่พบในการควบคุมสารพิษจากเชื้อราคือมีสารพิษจากเชื้อรามากกว่าหนึ่งชนิดอยู่ในชุดอาหารสัตว์หรือซีเรียลในเวลาเดียวกัน ดังนั้น การให้อาหารลูกสุกรและสุกรที่ปนเปื้อนด้วยสารพิษจากเชื้อราหลายชนิด แม้ว่าจะมีความเข้มข้นต่ำสุดก็ตาม อาจทำให้เกิดผลกระทบด้านลบมากมายอันเนื่องมาจากผลเสริมฤทธิ์กัน [ 36 – 40 ] ในบริบทนี้ การลดและขจัดผลกระทบด้านลบของสารพิษจากเชื้อราที่พบในอาหารสุกรสามารถลดต้นทุนการผลิตและความสูญเสียในอุตสาหกรรมสุกรได้ จนถึงปัจจุบัน มีการพัฒนากลยุทธ์มากมายเพื่อป้องกัน ลด หรือแม้แต่กำจัดการปนเปื้อนสารพิษจากเชื้อราจากอาหารสัตว์ด้วยวิธีการล้างพิษทางชีวภาพ เคมี และกายภาพ วิธีการเหล่านี้ทำให้การสลายตัวของสารพิษจากเชื้อราและสารที่เกี่ยวข้องของพวกมัน และรักษาคุณค่าทางโภชนาการของอาหารโดยไม่นำสารอื่นๆ ที่อาจเป็นพิษเข้าสู่ระบบชีวภาพ [6,14,41] การปนเปื้อนทางชีวภาพของสารพิษจากเชื้อราโดยใช้การยับยั้งการแข่งขันโดยสายพันธุ์เชื้อราอื่นๆ หรือการเพิ่มสารต้านอนุมูลอิสระในอาหารสัตว์ เพื่อลดผลกระทบที่เป็นพิษของสารพิษจากเชื้อราและ/หรือเพื่อยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อราที่ผลิตสารพิษจากเชื้อราจะเป็นทางออกที่ดี วิธีที่ใช้บ่อยที่สุดในการแก้ปัญหาผลกระทบด้านลบของสารพิษจากเชื้อราในสัตว์เลี้ยงในฟาร์มคือการเพิ่ม "สารยึดเกาะจากเชื้อรา" หรือ "สารปรับเปลี่ยนสารพิษจากเชื้อรา" ซึ่งเป็นอะลูมิโนซิลิเกตที่มีโครงสร้างเป็นรูพรุนที่สามารถดูดซับและดักจับสารพิษจากเชื้อรา (42 – 44 ) พวกมันมีประสิทธิภาพมากสำหรับอะฟลาทอกซินและมีฤทธิ์จำกัดต่อมัยโคทอกซินชนิดอื่น อย่างไรก็ตาม เนื่องจากไม่จำเพาะเจาะจง พวกมันยังจับวิตามินและธาตุต่างๆ ทำให้เกิดข้อบกพร่อง [45 – 47] การเพิ่มสารต้านอนุมูลอิสระจากพืชบางชนิดลงในอาหารสัตว์อาจเป็นวิธีแก้ปัญหาที่ดีกว่า [48] เพื่อลดผลกระทบที่เป็นอันตรายของสารพิษจากเชื้อราต่อสุขภาพของสัตว์

เอนไซม์ไซโตโครม P450 ส่วนใหญ่มีอยู่ในตับ ลำไส้ และไต,มีบทบาทสำคัญในการเปลี่ยนรูปทางชีวภาพของซีโนไบโอติกในระยะที่ 1 โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกลุ่มที่ 1 และ 3 [49] สารพิษจากเชื้อราอาจเป็นสารตั้งต้น สารยับยั้ง หรือตัวเหนี่ยวนำของเอนไซม์เผาผลาญเหล่านี้ การเปลี่ยนแปลงในกิจกรรมเฉพาะและการเหนี่ยวนำของไซโตโครม P450 จะเป็นตัวกำหนดการเปลี่ยนแปลงสัมพัทธ์ในการเผาผลาญของซีโนไบโอติกในที่สุด สารพิษจากเชื้อราอาจเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนของโปรตีนเหล่านี้ นำไปสู่การเปลี่ยนแปลงการดูดซึมและการเปลี่ยนรูปทางชีวภาพของสารอาหารและยาตั้งต้นอื่นๆ จากอาหารสัตว์ ด้วยเหตุนี้ จุดมุ่งหมายของการศึกษาครั้งนี้คือเพื่อตรวจสอบศักยภาพของส่วนผสมที่เป็นผลพลอยได้ที่ได้จากอุตสาหกรรมน้ำมัน Vitis vinifera (องุ่น) และ Hippophae rhamnoides (sea buckthorn) เพื่อลดความเสียหายที่เกิดจากการรวมตัวของ ochratoxin A (OTA) และอะฟลาทอกซินบี1 (AFB1) ในอาหารที่ตับและไตระดับของลูกสุกรหลังหย่านม

ผลลัพธ์

องค์ประกอบของอาหารองค์ประกอบทางเคมีของกากผลพลอยได้แสดงให้เห็นว่าสาหร่ายทะเล buckthorn อุดมไปด้วยโปรตีน (บวก 38.4 เปอร์เซ็นต์) ไขมัน (บวก 66.6 เปอร์เซ็นต์) และคาร์โบไฮเดรตและมีเถ้าต่ำกว่ากากเมล็ดองุ่น (ตารางที่ 1)

การวิเคราะห์ทางเคมียังแสดงให้เห็นโพรไฟล์ที่แตกต่างกันของผลพลอยได้ทั้งสองในกรดไขมัน ฟลาโวนอยด์ กรดฟีนอลิก และแร่ธาตุ ดังนั้น ซีบัคธอร์นป่นจึงมีกรดไขมันอิ่มตัว (palmitic และ palmitoleic), กรดโอเมก้า-9 (cis oleic acid) ในปริมาณที่สูงกว่า และกรดโอเมก้า-3 ( -linolenic acid) มากกว่ากากเมล็ดองุ่น . ในทางตรงกันข้าม เมล็ดองุ่นมีปริมาณกรดโอเมก้า-6 (กรดไลโนเลอิก) สูงมาก (67.35 เปอร์เซ็นต์ เทียบกับ 18.59 เปอร์เซ็นต์ในอาหารทะเล buckthorn) (ตารางที่ 2)

ผลพลอยได้จากทั้งสองอย่างมีฟลาโวนอยด์และกรดฟีนอลิก ซึ่งเป็นสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่รู้จักกันในด้านสารต้านอนุมูลอิสระ ฤทธิ์ต้านการอักเสบและภูมิคุ้มกัน [50, 51] ดังนั้นความเข้มข้นรวมของโพลีฟีนอลจึงสูงกว่าในเมล็ดองุ่นป่นถึง 74.8 เปอร์เซ็นต์ (133.84 มก. GAE/L) มากกว่าในทะเลบัคธอร์น (76.57 มก. GAE/L) เกี่ยวกับโพลีฟีนอลประเภทต่างๆ เมล็ดองุ่นมีความเข้มข้นของคาเทชินและกรดวานิลลิกสูงกว่าซีบัคธอร์น ในขณะที่ซีบัคธอร์นมีรูติน เคอร์ซิทริน ลูเทโอลิน กรดพี-คูมาริก และกรดเฟรูลิกที่เข้มข้นกว่า (ตารางที่ 3) ในส่วนของแร่ธาตุนั้น สาหร่ายทะเล buckthorn มีปริมาณ K, Mg, Fe, Mn และ Zn สูงกว่าเมล็ดองุ่น ในทางตรงกันข้าม เมล็ดองุ่นป่นมีทองแดงมากเป็นสองเท่าของอาหารทะเล buckthorn สิ่งที่ควรทราบคือความเข้มข้นสูงของธาตุเหล็กจากสาหร่ายทะเล buckthorn (ตารางที่ 4)

การแสดงของสัตว์

การได้รับลูกสุกรจากกลุ่ม E2 ต่อส่วนผสมของ ochratoxin ร่วมกับ aflatoxin B1 ไม่มีผลเสียต่อน้ำหนักตัว น้ำหนักที่เพิ่มขึ้น และการกินอาหาร เนื่องจากความแตกต่างไม่มีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม ในทางตรงกันข้าม การบริหารอาหารที่มีส่วนผสมของผลพลอยได้เพียงอย่างเดียว (E1) จะเพิ่มน้ำหนักตัวของลูกสุกรที่เลี้ยงด้วยอาหารนี้อย่างมีนัยสำคัญ เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (32.14 ± 1.63 เทียบกับ 27.09 ± 1.31) และกลุ่ม E2 ซึ่งได้รับอาหารปนเปื้อน อาหาร (32.14 ± 1.63 เทียบกับ 28.72 ± 1.07) ควรสังเกตว่ากลุ่มลูกสุกรที่ได้รับอาหารปนเปื้อนและส่วนผสมของผลพลอยได้มีแนวโน้มที่จะเพิ่มน้ำหนักเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มลูกสุกรที่เป็นพิษจากเชื้อรา แม้ว่าความแตกต่างจะไม่มีนัยสำคัญ การวิเคราะห์พารามิเตอร์ทางชีวเคมี ซึ่งกำหนดลักษณะทั่วไปของสุขภาพสัตว์และการทำงานของตับและไต, ค่าปกติสำหรับหมวดอายุและน้ำหนักของลูกสุกรหย่านม ไม่พบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มสำหรับส่วนใหญ่ (ตารางที่ 5) อย่างไรก็ตาม ส่วนผสมของสารพิษจากเชื้อราเพิ่มกิจกรรมของ ALP และแกมมา GT เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมและฤทธิ์ที่ลดลงในระดับการควบคุมในกลุ่ม E3 ที่ได้รับส่วนผสมจากผลพลอยได้

จุลพยาธิวิทยาของตับและไตการวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์แสงของตับจากกลุ่ม E2 ที่เลี้ยงด้วยอาหารพื้นฐานที่ปนเปื้อนด้วยส่วนผสมของ OTA และ AFB1 แสดงให้เห็นบริเวณโฟกัสของเนื้อร้าย การขยายตัวของไซนูซอยด์ และการแทรกซึมของเนื้อเยื่ออักเสบ บริเวณพอร์ทัลเผยให้เห็นการแทรกซึมของเซลล์ที่มีนิวเคลียสเดียวและการเกิดพังผืดในช่องท้อง ยังสังเกตเห็นผนังกั้นไฟโบรติกในเยื่อหุ้มปอด (รูปที่ 1)

การบริหาร Mycotoxin ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างในไตที่ส่งผลกระทบทั้งคอร์เทกซ์และเมดัลลา พบการฝ่อของกระจุกไตและการเปลี่ยนแปลงของแคปซูลของโบว์มันน์ (รูปที่ 2) หลอดแสดงให้เห็นเนื้อร้ายของเซลล์เยื่อบุผิวที่เป็นเยื่อบุที่มีการแทรกซึมของเซลล์อักเสบในระหว่าง พบการรวมตัวของเซลล์อักเสบระหว่างโกลเมอรูไลและทูบูล โดยสัมพันธ์กับบริเวณโฟกัสของความแออัดในหลอดเลือด โดยเฉพาะอย่างยิ่งในบริเวณไขกระดูก เห็นได้ชัดว่ามีการเพิ่มจำนวนคอลลาเจนในบริเวณที่มีอาการบาดเจ็บที่ท่อ นอกจากนี้,ไตส่วนจากกลุ่ม E3 กลุ่มที่เลี้ยงด้วยอาหารพื้นฐานที่มีส่วนผสมของเมล็ดองุ่นและสาหร่ายทะเลป่นและปนเปื้อนด้วยส่วนผสมของ OTA และ AFB1 เผยให้เห็นการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาเล็กน้อยซึ่งเกือบจะคล้ายกับกลุ่มควบคุม

ในตับ การแสดงออกของยีนสำหรับ CYP1A2 ลดลง 18 เปอร์เซ็นต์สำหรับ E2 และ 44 เปอร์เซ็นต์สำหรับ E3 ตามลำดับ เมื่อเทียบกับกลุ่ม E1 การแสดงออกของยีน CYP2A19 นั้นไม่ได้รับการแก้ไขในกลุ่ม E1 และ E2 ในขณะที่ในกลุ่ม E3 นั้นลดลงเกือบ 62 เปอร์เซ็นต์ การแสดงออกของยีน CYP2E1 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญถึง 29 เปอร์เซ็นต์ในกลุ่ม E1 ที่เลี้ยงด้วยอาหารพื้นฐานที่เสริมด้วยส่วนผสมของเมล็ดองุ่นและทะเล buckthorn ป่นเมื่อเทียบกับกลุ่ม E2 ในทางตรงกันข้าม การบริหารอาหารพื้นฐานที่เสริมด้วยส่วนผสมของเมล็ดองุ่นและสาหร่ายทะเล buckthorn (กลุ่ม E1) ปรับลดการแสดงออกของยีน CYP3A29 ลง 24 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเทียบกับระดับกลุ่ม E2 พบความแตกต่างอีกประการหนึ่งในการแสดงออกของยีน CYP4A24 โดยลดลง 33 เปอร์เซ็นต์สำหรับกลุ่ม E1 และลดลง 24 เปอร์เซ็นต์สำหรับกลุ่ม E3 และเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ 41 เปอร์เซ็นต์ในกลุ่ม E2 ที่เลี้ยงด้วยอาหารพื้นฐานที่เสริมด้วยส่วนผสมของ AFB1 และ OTA เมื่อเปรียบเทียบกับระดับการควบคุม ในกรณีของ MRP2 รูปแบบการแสดงออกของยีนมีความคล้ายคลึงกับยีน CYP4A24 โดยลดลงไม่มีนัยสำคัญ 35 เปอร์เซ็นต์สำหรับกลุ่ม E1 และลดลง 24 เปอร์เซ็นต์สำหรับกลุ่ม E3 และเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ 28 เปอร์เซ็นต์ในกลุ่ม E2 เมื่อเปรียบเทียบ จนถึงระดับการควบคุม ในทำนองเดียวกันกับการแสดงออกของยีน CYP4A24 การแสดงออกของยีน GSTA1 แสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ 14 เปอร์เซ็นต์ในกลุ่ม E2 เพิ่มขึ้น 9 เปอร์เซ็นต์ในกลุ่ม E1 และลดลง 30 เปอร์เซ็นต์สำหรับกลุ่ม E3 เห็นได้ชัดว่าการใช้ส่วนผสมของเมล็ดองุ่นและทะเล buckthorn และ OTA และ AFB1 ร่วมกันทำให้การแสดงออกของยีนที่วิเคราะห์ในตับลดลงเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม เกี่ยวกับระดับการแสดงออกของยีนเหล่านี้ในไตเมื่อเทียบกับตัวอย่างตับ ไม่พบการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญทางสถิติ (รูปที่ 4) อย่างไรก็ตาม สามารถสังเกตการเปลี่ยนแปลงในการควบคุมระดับการแสดงออกของยีนได้

จากการวิเคราะห์รูปที่ 4 จะเห็นได้ว่าส่วนผสมของเมล็ดองุ่นและถั่ว buckthorn ป่นควบคุมการแสดงออกของยีน CYP1A2 และควบคุมการแสดงออกของยีน CYP2A19, CYP2E1, CYP3A29 และ CYP4A24 อย่างไม่มีนัยสำคัญ ในขณะที่การแสดงออกของยีน MRP2 และ GSTA1 ยังคงไม่เปลี่ยนแปลง . นอกจากนี้ การมีอยู่ของ OTA และ AFB1 ในลูกสุกรยังป้อนการแสดงออกของยีน CYP1A2 และ CYP2A19 ที่ลดลงในลักษณะที่ไม่มีนัยสำคัญ ในขณะที่ MRP2 และ GSTA1 ไม่ได้ถูกดัดแปลง การบริหารร่วมกันของส่วนผสมของเมล็ดองุ่นและสาหร่ายทะเล buckthorn และ OTA และ AFB1 กำหนดระดับการกลับมาของระดับการแสดงออกของยีนทั้งหมดเพื่อควบคุมระดับยกเว้น GSTA1 ซึ่งแสดงการเพิ่มขึ้นที่สำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่ม E1

การอภิปราย

Mycotoxins เช่น AFB1 และ OTA เป็นสารพิษจากธรรมชาติที่ปนเปื้อนผลิตภัณฑ์จากพืชหลากหลายชนิด ผลที่ตามมาก็คือ AFB1, OTA และเมแทบอไลต์ของพวกมันมีอยู่ในอาหารและอาหารสัตว์ เช่นเดียวกับในผลิตภัณฑ์จากสัตว์ [52] การศึกษาทางพิษวิทยาส่วนใหญ่เกี่ยวกับผลกระทบของสารพิษจากเชื้อราได้พิจารณาถึงการสัมผัสกับสารพิษจากเชื้อราชนิดเดียว โดยไม่คำนึงถึงการรวมกันและปฏิกิริยาระหว่างกัน ตามลำดับ เป็นผลเสริมฤทธิ์กันหรือเป็นปฏิปักษ์ซึ่งมักเกิดขึ้นในธรรมชาติ ข้อมูลเกี่ยวกับผลกระทบที่เป็นพิษของสารพิษจากเชื้อรามีจำกัด ดังนั้นจึงยังไม่ทราบความเสี่ยงของการได้รับสารพิษหลายชนิด การเกิดสารพิษจากเชื้อรา เช่น AFB1, DON, ZEA, OTA, FB1 และ FB2 ในธัญพืช ผลิตภัณฑ์จากธัญพืช และอาหารเสริมสำหรับสุกร [ 16 ] เกี่ยวข้องกับที่ตั้งทางภูมิศาสตร์และการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศ ซึ่งเพิ่มความเสี่ยงที่เกี่ยวข้อง มีการปนเปื้อนสารพิษจากเชื้อราระหว่างการเก็บรักษาและการแปรรูปผลิตภัณฑ์อาหารสัตว์สำหรับสุกร [ 53 ] การปนเปื้อนร่วมของซีเรียลและวัตถุดิบอื่นๆ เกิดขึ้นในชีวิตจริงบ่อยกว่าการปนเปื้อนสารพิษจากเชื้อราเพียงครั้งเดียว [ 7 ] ตัวอย่างเช่น พบการเกิดร่วมกันของอะฟลาทอกซิน บี1 และออคราทอกซิน เอ ในอาหารหรือส่วนผสมของอาหารสัตว์ที่แตกต่างกัน เช่น ข้าวสาลี [ 54 ] ข้าวบาร์เลย์ [ 55 ] แป้งธัญพืช [ 56 ] เครื่องเทศ [ 57 ] เป็นต้น สัดส่วน ระหว่าง AFB1 และ OTA ในฟีดพบว่าประมาณ 1 ถึง 6 [37] นอกจากนี้ เนื้อหาฟีดทั่วโลกใน AFB1 และ OTA อยู่ในช่วงระหว่าง ไม่ได้กำหนด และ 100 ppb และ ไม่ได้กำหนด และ 211 ppb ตามลำดับ [ 58 ] ในบริบทนี้ เพื่อเลียนแบบสภาพสนาม เราศึกษาผลกระทบของสารพิษจากเชื้อราเหล่านี้ร่วมกัน และเพื่อประเมินประสิทธิภาพของส่วนผสมผลพลอยได้ในการต่อต้านผลกระทบของสารพิษจากเชื้อรา สารเติมแต่งจากธรรมชาติ (ผลพลอยได้จากเมล็ดองุ่นและทะเล buckthorn) ได้รับการคัดเลือกโดยพิจารณาจากความสามารถในการทำให้พิษจากเชื้อราดีขึ้นเมื่อได้รับอาหารเสริม [59,60]

ในการศึกษานี้ การที่ลูกสุกรได้รับสารผสมจากเชื้อรา (กลุ่ม E2) ไม่ได้ส่งผลต่อประสิทธิภาพของสัตว์ (27.83 ± 1.1 เทียบกับ 27.09 ± 1.3 สำหรับน้ำหนักตัวและ 1.48 ± 0 .9 เทียบกับ 1.40 ± 0.8 สำหรับการป้อนเข้า) และพารามิเตอร์ทางชีวเคมีเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ในทำนองเดียวกัน Balogh และคณะ [ 61 ] รายงานว่าลูกสุกรที่เลี้ยงด้วย OTA ประมาณ 0.4 มก./กก. ในช่วงเริ่มต้น (0–28 วัน) และระยะเวลาของผู้ปลูก (29–49 วัน) ไม่ได้ลงทะเบียนการเปลี่ยนแปลงลักษณะการผลิตและอาการแสดงทางคลินิกของความเป็นพิษในผู้ปลูกอย่างมีนัยสำคัญ เฟส. ในทางตรงกันข้าม พบว่าน้ำหนักตัวเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดในช่วงเริ่มต้นเมื่อสัตว์มีความรู้สึกไวมากขึ้น ในการศึกษานี้ การรวมอาหารของส่วนผสมผลพลอยได้เพียงอย่างเดียวมีอิทธิพลอย่างมากต่อประสิทธิภาพของสัตว์ (กลุ่ม E1) และมีแนวโน้มที่จะเพิ่มน้ำหนักของลูกสุกรเมื่อส่วนผสมเกี่ยวข้องกับอาหารที่มีการปนเปื้อน (กลุ่ม E3)

จากมุมมองทางพิษวิทยา OTA ถูกจัดประเภทโดย IARC (International Agency for Research on Cancer) ในกลุ่มเดียวกัน (2B) ของสารก่อมะเร็งในมนุษย์ โดยมีความเป็นพิษใกล้เคียงกับ AFB1 [ 62 ] รูปแบบการดูดซึม การกระจาย และการกำจัดสารพิษจากเชื้อราเหล่านี้โดยส่วนใหญ่แล้ว รูปแบบที่เป็นพิษ ในทางตรงกันข้าม แม้จะมีความคืบหน้าเมื่อเร็วๆ นี้ ความรู้ของเราเกี่ยวกับขั้นตอนการเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพที่เป็นพิษยังไม่ได้รับการอธิบายอย่างละเอียด ผลการศึกษาจำนวนหนึ่งแสดงให้เห็นว่า AFB1 และ OTA ถูกเผาผลาญโดยไมโครโซมของตับจากมนุษย์ สุกร และหนู ไปเป็นอีพิเมอร์หลายตัว [63] การเปลี่ยนแปลงในกิจกรรมเฉพาะและการเหนี่ยวนำของไซโตโครม P450 ท้ายที่สุดแล้วจะเป็นตัวกำหนดการเปลี่ยนแปลงสัมพัทธ์ในการเผาผลาญของซีโนไบโอติกใดๆ

พบว่าการสัมผัสกับ AFB1 และ OTA ลดการแสดงออกของยีน CYP1A2, CYP2E1, CYP3A29 และ MRP2 ในตับของสุกร ส่งผลให้มีการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างในเนื้อเยื่อตับและโครงสร้างพื้นฐาน รวมทั้งบริเวณโฟกัสของเนื้อร้าย การขยายตัวของไซนัสอยด์ เนื้อเยื่ออักเสบ การแทรกซึมและการเกิดพังผืดในช่องท้อง เกี่ยวกับระดับการแสดงออกของยีนของไอโซฟอร์ม CYP450 ในสุกรไต,ไม่มีข้อมูลในวรรณคดีทางวิทยาศาสตร์ ยีน CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1, CYP3A29, CYP4A24, MRP2 และ GSTA1 ได้รับการคัดเลือกสำหรับการศึกษานี้เนื่องจากเข้ารหัสโปรตีนที่มีฤทธิ์ของเอนไซม์หรือการทำงานของตัวขนส่งที่เกี่ยวข้องกับระยะที่ 1 และระยะที่ 2 ของการเปลี่ยนรูปทางชีวภาพและการล้างพิษของซีโนไบโอติกเพื่อสร้างปฏิกิริยาอิเล็กโตรฟิลลิก เมแทบอลิซึม [64] จากผลลัพธ์เหล่านี้ ปรากฏว่าการบริหารผลพลอยได้กำหนดการแสดงออกของยีน CYP1A2 ที่ลดลงและการแสดงออกของยีน GSTA1 ที่เพิ่มขึ้น พบผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันในเซลล์มะเร็งลำไส้ของมนุษย์ HT-29 ที่ได้รับการรักษาด้วยสารสกัด Salicornia freitagii ซึ่งเป็นที่รู้จักสำหรับสารต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ต้านการอักเสบ ในกรณีนี้ เนื่องจากเนื้อหาในฟีนอลที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพ การปรับลด CYP1A2 mRNA และการเพิ่มการควบคุม GSTA1 mRNA เกิดขึ้น [ 65 ] ตรงกันข้ามกับผลลัพธ์ของเรา mRNA และการแสดงออกของโปรตีนของ CYP1A2 เพิ่มขึ้นในตับของสุกรที่เลี้ยงด้วยชิโครี [ 66 ] ผลลัพธ์ที่แตกต่างกันเหล่านี้อาจเกิดจากสารประกอบธรรมชาติต่างๆ ที่มีอยู่ในชิกโครี เมื่อเทียบกับผลพลอยได้ที่ใช้ในการศึกษานี้ ส่วนใหญ่เป็นกรดคลอโรจีนิก คาเฟอีน และพี-คูมาริก [67]

ในทางกลับกัน OTA และ AFB1 อาจโต้ตอบและกระตุ้นตัวรับอะโรมาติกไฮโดรคาร์บอน ซึ่งนำไปสู่การเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ หลังจากการเฮเทอโรไดเมอไรเซชัน OTA และ AFB1 อาจมีปฏิสัมพันธ์กับตัวรับส่งสัญญาณนิวเคลียร์ของตัวรับไฮโดรคาร์บอน เฮเทอโรไดเมอร์ ที่จับกับองค์ประกอบที่ตอบสนองต่อซีโนไบโอติกและยีนที่กระตุ้นปฏิกิริยา เช่น CYP1A1, CYP1A2 และ GST [ 68 ] องค์ประกอบที่ตอบสนองต่อซีโนไบโอติกนี้ใช้ร่วมกันระหว่างยีน CYP1A1 และ CYP1A2 [ 69 ] และเอ็นไซม์ทั้งสองที่ประมวลโดยพวกมันมีความจำเพาะของซับสเตรตที่ทับซ้อนกัน [70] ในตับหมู มีเพียงกิจกรรม CYP1A2 เท่านั้น และปริมาณสัมพัทธ์ของ CYP450 ที่ตรวจพบทั้งหมดคือ 4 เปอร์เซ็นต์ [ 71 ] ในตับของมนุษย์ AFB1 และ OTA เป็นตัวกระตุ้นสำหรับ CYP1A1, 1A2, 2B6, 2C9, 3A4 และ 3A5 [ 72 ] AFB1 และการสัมผัส OTA ทำให้เกิดความผิดปกติของไมโตคอนเดรียโดยการเพิ่มขึ้นของการผลิต ROS [14] ที่อาจเพิ่มการแสดงออกของ TGF- 1 หรือกระตุ้น TGF ที่แฝงอยู่- 1 [ 73 ] เมื่อพิจารณาจากหลักฐานก่อนหน้านี้ว่า TGF- 1 ลดการแสดงออกของ CYP1 ในมนุษย์และหนู เป็นไปได้ว่ากลไกเดียวกัน [ 74 ] เกิดขึ้นภายใต้เงื่อนไขของเรา ผลกระทบของการได้รับสารพิษจากเชื้อราและเมล็ดองุ่นและผลพลอยได้จากทะเล buckthorn ร่วมกันอาจเป็นผลเสริมฤทธิ์กัน และการแสดงออกของ CYP1A2 ลดลงใน E3 เมื่อเทียบกับ E1, E2 และกลุ่มควบคุม CYP1A2 แสดงในระดับที่ต่ำกว่าในเนื้อเยื่อนอกตับ [ 75 ]

CISTANCHE จะปรับปรุงไต/ความล้มเหลวของไต

ดิไตเป็นอนินทรีย์ที่ได้รับประมาณร้อยละ 25 ของการเต้นของหัวใจและทำให้บริสุทธิ์สารตกค้างเมตาบอลิซึมและซีโนไบโอติกจากระบบไหลเวียนโลหิต ในระหว่างกระบวนการระบายนี้ สารพิษจะกระจุกตัวอยู่ในไต[ 76 ]. ในลูกหมูไตการเปลี่ยนแปลงของการแสดงออกของยีน CYP1A2 มีความคล้ายคลึงกับระดับการแสดงออกในตับสำหรับ E1 และ E2 ที่น่าสนใจคือ ในกลุ่ม E3 การแสดงออกของยีนนี้อยู่ในระดับที่สูงกว่ากลุ่มควบคุม นี่อาจเป็นเพราะการเปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณแบบ noncanonical สำหรับการถอดความ AhR ในไตเซลล์ [77]. ในตับหมู ปริมาณสัมพัทธ์ของ CYP2A19 และ CYP2E1 คิดเป็น 31 เปอร์เซ็นต์ตามลำดับ 13 เปอร์เซ็นต์ของ CYP450 ทั้งหมด [ 71 ] ยีน CYP2A19 และ CYP2E1 ของสุกรมีหน้าที่ในการเปลี่ยนรูปทางชีวภาพสำหรับสารประกอบภายใน (skatole, ฮอร์โมนเพศ) เช่นเดียวกับสารประกอบภายนอก (ส่วนประกอบอาหาร) สารประกอบทั้งสองชนิดแสดงออกอย่างมากในตับและน้อยกว่าในไตและเนื้อเยื่อไขมัน การถอดความ CYP2A19 ถูกควบคุมโดยปัจจัยการถอดรหัสของ CAR [ 78 ] orthologue ของมนุษย์ CYP2A6 ถูกควบคุมโดย CAR, PXR, glucocorticoid receptor (GR), estrogen receptor , HNF 4 และ PGC-1 [ 79 ] นอกจากนี้ การแสดงออกของตับที่เป็นส่วนประกอบของ CYP2A6 ในหนูเมาส์ยังถูกควบคุมโดยการทำงานร่วมกันระหว่าง HNF 4 , CCAAT-box/enhancer binding protein (C/EBP , C/EBP ) และปัจจัยการถอดรหัสออกตาเมอร์-1 (ต.ค.{{13} }) [ 80 ]. ก่อนหน้านี้ พบว่ามีความสัมพันธ์เชิงบวกระหว่าง mRNA และระดับโปรตีนสำหรับยีน CYP2A19 [ 81 ] ซึ่งแตกต่างจากยีน CYP 450 อื่นๆ CYP2A19 มีบทบาทสำคัญน้อยกว่าในการเผาผลาญของซีโนไบโอติก แต่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาของเซลล์ต่อความเครียด Nrf-2 ซึ่งเกี่ยวข้องกับการถอดรหัส CYP2A19 ด้วย [82] ยีน CYP2A19 อาจมีหลายรูปแบบมากเมื่อเทียบกับยีน CYP2A6 [ 83 ] และอาจเกิดการแปรผันระหว่างบุคคลอย่างกว้างขวางของผลิตภัณฑ์ได้ การศึกษาก่อนหน้านี้เปิดเผยว่า orthologues เป็ด P450 ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม CYP2A6 และ CYP3A4 เกี่ยวข้องกับการกระตุ้นทางชีวภาพของ AFB1 ในรูปแบบอีพอกไซด์ [84] แตกต่างจากผลลัพธ์เหล่านี้ ในการศึกษานี้ ไม่พบการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญของการแสดงออกของยีน CYP2A19 ในกลุ่ม E1 และ E2 ซึ่งอาจเนื่องมาจากการแสดงออกของยีนนี้ในตับของลูกสุกรในระดับสูง สำหรับตอนนี้ เป็นเรื่องยากที่จะอธิบายได้ว่าทำไมการสัมผัสร่วมกันของสารพิษจากเชื้อราและส่วนผสมของเมล็ดองุ่นและถั่ว buckthorn ป่นจึงลดการแสดงออกของ CYP2A19 อย่างไรก็ตาม การแสดงออกที่ลดลงนี้ช่วยลดความเสี่ยงของการสร้างสารที่เป็นพิษ

ในหมูไต,การแสดงออกของ CYP2A19 นั้นต่ำกว่าเมื่อเทียบกับที่พบในตับ [ 79 ] อาจเป็นเพราะการแสดงออกที่ต่ำกว่านี้ การที่สัตว์สัมผัสกับส่วนผสมของเมล็ดองุ่นและกากทะเล buckthorn ทำให้เกิดการควบคุมการแสดงออกของยีน CYP2A19 ที่เหนี่ยวนำโดย Nrf-2 เนื่องจากเนื้อหา luteolin [85] และกรด ferulic [86] . ในทางกลับกัน มีหลักฐานว่ามีเพียงสองปัจจัยการถอดรหัส ได้แก่ ปัจจัยการถอดรหัสโปรโมเตอร์ต้นน้ำของไข่ไก่ไข่ (COUP-TF1) และปัจจัยนิวเคลียร์ตับ (HNF-1) ที่เกี่ยวข้องในการควบคุมการถอดรหัส CYP2E1 ในสุกร [ 87 ]. CYP2E1 เช่นเดียวกับ P450s ที่เผาผลาญซีโนไบโอติกอื่น ๆ ส่วนใหญ่ตั้งอยู่ในเมมเบรนของเอนโดพลาสมิกเรติคิวลัม (ER) และสามารถเหนี่ยวนำได้ภายใต้สภาวะการเผาผลาญหรือโภชนาการที่หลากหลาย ความเครียด ER สามารถเกิดขึ้นได้จากความเครียดจากการเผาผลาญซึ่งเกิดจากการสังเคราะห์โปรตีน/ไขมันมากเกินไป และความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ซึ่งอาจกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณชีวจิตที่ซับซ้อนซึ่งอนุรักษ์วิวัฒนาการไว้ ซึ่งเรียกว่าการตอบสนองของโปรตีนที่กางออก (UPR) [88]

มีแนวโน้มว่าระดับของ CYP2E1 mRNA ใกล้เคียงกันในกลุ่ม E1 และกลุ่มควบคุมเนื่องจากการกระทำที่เป็นปฏิปักษ์ของกรดปาลมิติก [ 89 ] กรดไลโนเลอิก และ - ไลโนเลนิก [90 ] ที่เพิ่มการถอดรหัสยีนนี้และการกระทำที่วานิลและ กรด p-coumaric ซึ่งลดลง [65] เมื่อเร็ว ๆ นี้ ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าอาหารที่มี OTA ได้เปลี่ยนแปลงจุลินทรีย์ในลำไส้ในเป็ด ซึ่งส่งผลต่อความหลากหลายและองค์ประกอบของจุลินทรีย์ในลำไส้เล็ก รวมถึงสิ่งกีดขวางในลำไส้ เป็นผลให้ไลโปโพลีแซคคาไรด์ที่ได้จากแบคทีเรียแกรมลบเข้าสู่กระแสเลือดและตับ ทำให้เกิดการอักเสบของตับ [ 91 ] ในกรณีของการบาดเจ็บที่ตับที่เกิดจากภูมิคุ้มกัน การแสดงออกของ CYP2E1 ลดลง [ 92 ] สถานการณ์นี้อาจเกิดขึ้นในกลุ่ม E2 มีแนวโน้มว่าผลกระทบสะสมของสารพิษจากเชื้อราทั้งสองชนิดและผลพลอยได้จากอาหารลดการแสดงออกของ CYP2E1 ในตับของกลุ่ม E3 ในไต,กรดไขมันอิสระ เช่น Palmitate, oleate และ linoleate ถูกเก็บไว้ใน nephron [ 93 ] และกรดเหล่านี้อาจเพิ่มการแสดงออกของยีน CYP2E1 ในไตของกลุ่ม E1 เทียบกับระดับควบคุม อ้างอิงจากส Pfohl-Leszkowicz และ Manderville [25] OTA ก่อตัวเป็น adduct ด้วย DNA ทำให้เกิดไตความเป็นพิษต่อพันธุกรรมและการเกิดมะเร็ง มีแนวโน้มว่า OTA ในระดับสูงจะกระตุ้นการแสดงออกของยีน CYP2E1 ในไตของกลุ่ม E2 เมื่อเปรียบเทียบกับระดับการควบคุม ในกลุ่ม E3 ปรากฏว่าการใช้ยา mycotoxins และผลพลอยได้จากอาหาร 2 ชนิดร่วมกันมีผลที่เป็นปฏิปักษ์ โดยการแสดงออกของยีน CYP2E1 จะกลับสู่ระดับควบคุม นอกจากนี้ การประเมินทางจุลพยาธิวิทยาสำหรับกลุ่ม E3 พบว่าส่วนผสมผลพลอยได้จากเมล็ดองุ่นและน้ำมันทะเล buckthorn ช่วยลดความเสียหายที่เกิดจากอะฟลาทอกซิน บี1 และออคราทอกซินเอที่ตับและไตระดับของลูกสุกรหลังหย่านม CYP2E1 เช่นเดียวกับ P450s ที่เผาผลาญซีโนไบโอติกอื่น ๆ ส่วนใหญ่ตั้งอยู่ในเมมเบรนของ ER และสามารถเหนี่ยวนำได้ภายใต้สภาวะการเผาผลาญหรือโภชนาการที่หลากหลาย [ 89 ] การควบคุมยีน CYP2E1 ในกลุ่ม E1 อาจเกิดจากการไฮดรอกซิเลชันของสารประกอบที่ได้มาจากคูมารินซึ่งถูกเร่งด้วยเอนไซม์ CYP2A ซึ่งถือเป็นตัวบ่งชี้เฉพาะสำหรับการมีอยู่ของเอนไซม์ CYP2 [ 94 ] โดยมี p-coumaric กรดที่มีอยู่ในผลพลอยได้จากเมล็ดองุ่นและทะเล buckthorn

ในกรณีของสุกร ไม่ค่อยมีใครรู้จักเกี่ยวกับการปรากฏตัวของเอนไซม์ CYP3As ในเนื้อเยื่อไตและไม่มีใครรู้เกี่ยวกับความดื้อรั้นของพวกเขา [ 95 ] มีการระบุยีนหลายชนิดในอนุวงศ์ CYP3A ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (เช่น มี 5 ตัวในหนูและ 4 ตัวในคน) แต่การแสดงออกของยีนเหล่านี้ในเนื้อเยื่อไตได้รับการตรวจสอบไม่ดี [ 96 ] ในแง่ของการแสดงออกของยีน Ayed-Boussema et al. (2012) [ 63 ] และ Gonzalez-Arias และคณะ [ 97 ] อธิบายการเพิ่มขึ้นของระดับการแสดงออกในไซโตโครมทั้งหมดที่ตรวจสอบ (CYP3A4, 2B6, 3A5 และ 2C9) ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ตับของมนุษย์ขั้นต้น การศึกษาก่อนหน้านี้ได้รายงานผลลัพธ์ต่างๆ เกี่ยวกับผลกระทบของ AFB1 และ OTA ในเซลล์ตับของมนุษย์ที่ได้รับการเพาะเลี้ยงขั้นต้น ซึ่งการเพิ่มความเข้มข้นของสารพิษจากเชื้อราเหล่านี้ทำให้เกิดระดับ mRNA CYP3A4 และ CYP2B6 mRNA อย่างชัดเจนในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา [63] ในทางตรงกันข้าม พบว่าเมื่อมี OTA และ AFB1 ในตับ (รูปที่ 3 กลุ่ม E2) CYP3A29expressionlevelis ลดลงเมื่อเทียบกับระดับควบคุม อาจเป็นเพราะการเปิดใช้งาน AhR [ 98 ] ข้อมูลเหล่านี้แตกต่างจากของ Zepnik et al [ 99 ] ผู้รายงานการเพิ่มขึ้นของ OTA hydrolysis โดยเอนไซม์ microsomal จากตับของหนู โดยเฉพาะสำหรับ P450 3A1/2 และ 3A4 ชี้ให้เห็นว่าการแสดงออกของยีนนี้ถูกปรับในลักษณะที่ขึ้นกับสปีชีส์ ในบางกรณี การยับยั้งเอนไซม์ P450 โดยโพลีฟีนอลอาจมีผลในการป้องกันเคมี เนื่องจากเอนไซม์ P450 อาจกระตุ้นสารก่อมะเร็งได้ในระหว่างกิจกรรมการเผาผลาญตามธรรมชาติ การยับยั้งเอนไซม์ Phase I ที่เผาผลาญด้วยซีโนไบโอติกอาจเป็นเป้าหมายหนึ่งของผลการป้องกันเคมีบำบัดของโพลีฟีนอลในวงแหวนที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติ การเพิ่มขึ้นของ CYP4A24 ในตับอาจเป็นการตอบสนองทางสรีรวิทยาในบริบทที่ผิดปกติของการสะสมไขมันที่ผิดปกติและไม่มีกิจกรรม CYP2E1 เนื่องจากข้อเท็จจริงที่ว่า CYP2E1 และ CYP4A เป็นไซโตโครม P-450 ในตับที่เหนี่ยวนำให้เกิดปฏิกิริยาไฮดรอกซิเลชันของไขมัน กรดและทั้งสองสามารถเริ่มต้นกระบวนการแพร่กระจายอัตโนมัติของลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน พวกมันอาจเป็นส่วนเสริม ซึ่งนำไปสู่ปฏิสัมพันธ์ในการควบคุมของเอนไซม์แต่ละตัว [ 100 ] ดังนั้นจึงเป็นที่ชัดเจนว่าโปรตีน CYP4A เป็นตัวกลางสำคัญในการตอบสนองต่อการรบกวนของการเผาผลาญไขมันในตับ [101] ระดับ CYP4A24 ที่ลดลงในไตอาจนำไปสู่ผลกระทบที่เป็นพิษที่เกิดขึ้นในตับเนื่องจากอาหารที่มีสารพิษจากเชื้อรา ซึ่งหมายความว่า CYP4A24 ควบคุมความเครียดจาก ER ของตับ [102,103]

CISTANCHE จะช่วยเพิ่มอาการปวดไต/ไต

ในการศึกษานี้ การเพิ่มส่วนผสมของผลพลอยได้จากเมล็ดองุ่นและทะเล buckthorn ช่วยเพิ่มระดับการแสดงออกในไต,ซึ่งคาดว่าจะสนับสนุนกระบวนการกำจัดและการรักษาสมดุลของสารภายในเซลล์ [104] นอกจากนี้ OTA ยังถูกดูดซึมในลำไส้โดยที่โปรตีนต้านทาน multidrug 2 (ยีน MRP2) มีบทบาทสำคัญ โดยทำหน้าที่เป็นผู้ขนส่งทางซีโนไบโอติกออกสู่ภายนอก เพื่อลดการดูดซึมทางปากและปริมาณสารพิษไปยังอวัยวะต่างๆ และทำให้เป็นพิษของ OTA เมื่อ OTA ไปถึงกระแสเลือด มันจะสามารถเข้าถึงอวัยวะอื่น ๆ เช่น ตับ และผู้ขนส่ง MRP2 ก็เป็นตัวขนส่งหลักที่สำคัญอีกครั้งที่เกี่ยวข้องกับคอนจูเกตประจุลบและการอัดขึ้นรูปซีโนไบโอติกเข้าไปในพื้นที่นอกเซลล์ซึ่งก่อให้เกิดการสร้างน้ำดีและการกำจัดสารพิษที่ตามมา [ 97 , 105 ]. นอกจากนี้ ตัวขนส่ง MRP2 ยังมีอยู่ในเยื่อหุ้มปลายของ enterocytesไต-หลอดใกล้เคียง และเซลล์อื่นๆ [ 105 ] ความเป็นพิษของ OTA เกิดจากมอยอิตีไอโซคูมารินของมัน และเป็นที่ทราบกันดีว่า OTA ถูกปิดใช้งานหรือถูกกระตุ้นทางชีวภาพโดยเอ็นไซม์ cytochrome P450 [29] ก่อนหน้านี้ การปรากฏตัวของ OTA ในอาหารสัตว์มีความเชื่อมโยงกับการพัฒนาของพิษต่อไต ซึ่งในหนูมีความเกี่ยวข้องกับไตเนื้องอกและไตเนื้องอก [ 97 ] ในการศึกษานี้ พบว่าการแสดงออกของ MRP2 ในตับลดลง ซึ่งบ่งชี้ถึงความบกพร่องของการหลั่ง mycotoxins ในกลุ่ม E2

ในหนูพบว่า OTA ถูกขับออกมาน้อยกว่า 15 เปอร์เซ็นต์ในท่อใกล้เคียงของไต,ในขณะที่การขนส่งกรดอะมิโนในท่อใกล้เคียงไม่บกพร่อง [ 97, 106 ] ดังนั้น การลดลงของ MRP2 ในตับที่พบในการศึกษาครั้งนี้อาจเป็นกลไกที่ทำให้สารพิษจากเชื้อราเข้าถึงเปอร์เซ็นต์การดูดซึมในร่างกายสูง ด้วยวิธีนี้ การเปิดรับ AFB1 และ OTA ของลูกสุกรจะถูกขยายให้ใหญ่ขึ้น ซึ่งมีส่วนทำให้เกิดพิษต่อตับ เมื่อพิจารณาถึงศักยภาพในการเป็นพิษต่อไตของ OTA และ AFB1 การลดลงของผลิตภัณฑ์ยีน MRP2 อาจส่งผลกระทบอย่างมากต่อท่อใกล้เคียง ส่งผลให้ความสามารถในการกำจัด OTA [ 97] ลดลง อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับกลไกการขนส่ง AFB1 และ OTA เพื่อสนับสนุนสมมติฐานนี้ ในระยะที่ 2 ของการล้างพิษจากการเผาผลาญ สารประกอบซีโนไบโอติกดั้งเดิมหรือสารเมตาโบไลต์ระดับกลางที่ดัดแปลงในระหว่างระยะที่ 1 จะถูกรวมเข้าด้วยกันเพื่อให้เหมาะสำหรับการขับถ่าย Glutathione S transferases (GSTs) และ UDP glycurosyltranferases (UGTs) มีส่วนช่วยในการประมวลผล Phase II [107]

ในการปรากฏตัวของส่วนผสมของผลพลอยได้จากเมล็ดองุ่นและทะเล buckthorn ในอาหารสุกร ระดับการแสดงออกของ GSTA1 ในตับจะเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ อาจเกิดจากองค์ประกอบที่ตอบสนองต่อสารต้านอนุมูลอิสระ (ARE) และองค์ประกอบที่ตอบสนองต่อ -NF ( -NF-RE) ตามลำดับ ซึ่งในที่ที่มีสารต้านอนุมูลอิสระฟีนอล จะกระตุ้น GST isoforms โดยไม่ต้องใช้ตัวรับ aryl hydrocarbon (Ah) [ 108 ] น่าแปลกที่ในการศึกษาของ Ghadiri et al. (2019) [ 109 ] การปรับลด mRNA ที่เป็นสื่อกลางของ AFB1- ของ GSTA1 ถูกสังเกตพบในตับของวัวเมื่อมีสารต้านอนุมูลอิสระ การศึกษาก่อนหน้านี้ [ 110 ] แสดงให้เห็นว่า OTA และ AFB1 แข่งขันกันเพื่อชิงเอนไซม์ CYP450 เดียวกัน ซึ่งเป็นตัวแทนของเส้นทางการกระตุ้นทางชีวภาพของ AFB1 โดยมี AFB1-DNA adducts น้อยลง เนื่องจากการแข่งขันนี้ AFB1 อาจถูกคอนจูเกตกับกลูตาไธโอนที่ลดลงในปฏิกิริยาที่เร่งปฏิกิริยาโดยเอนไซม์ GST โดยมีการควบคุมยีนการเข้ารหัสของพวกมัน AFB1 อาจเกี่ยวข้องกับปฏิกิริยา Phase II ประเภทอื่น เช่น glucuronidation และ sulfatation ในขณะที่ OTA ถูกรวมเข้ากับกลูตาไธโอนที่ลดลงเป็นส่วนใหญ่ [ 72 ] นอกจากนี้ ในการตอบสนองต่อการบริหารร่วมกันในสุกร อาหารของสารพิษจากเชื้อรา (AFB1 และ OTA) ช่วยเพิ่มการสร้างไบโอมาร์คเกอร์ความเครียดออกซิเดชัน ดังนั้นกลไกการป้องกันจึงถูกกระตุ้น ส่งเสริมการปรับตัวและการอยู่รอดเพื่อตอบสนองต่อความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน [111] ตัวอย่างเช่น ROS และสารออกซิแดนท์สามารถกระตุ้นการถอดรหัส GST isoforms ผ่าน ARE [108] ตามที่สังเกตทั้งในตับและไตโดยการเพิ่มระดับการแสดงออกของยีน GSTA1

บทสรุป

ข้อมูลของเราเผยให้เห็นถึงการมีอยู่ของความแตกต่างระหว่างลูกสุกรไตและตับเกี่ยวกับปฏิกิริยาต่อสารพิษจากเชื้อราและผลพลอยได้ที่ใช้ในการศึกษานี้ โดยทั่วไป ผลพลอยได้ที่มีการออกฤทธิ์ของสารต้านอนุมูลอิสระลดการแสดงออกของ CYPs mRNA ที่วิเคราะห์ในตับและเพิ่มขึ้นในไต. นอกจากนี้ ในอวัยวะทั้งสอง การได้รับสัมผัสร่วมกันของลูกสุกรกับ OTA และ AFB1 ทำให้เกิดการแสดงออกของยีนเพิ่มขึ้นหรือลดลงขึ้นอยู่กับชนิดของยีน การรวมเมล็ดองุ่นและซีบัคธอร์นป่นในอาหารของสุกร OTA และ AFB1-ทำให้มึนเมาลดการแสดงออกของยีน CYP P450 ซึ่งบ่งชี้ว่าการออกฤทธิ์ทางชีวภาพของสารพิษจากเชื้อราลดลง ซึ่งอาจส่งผลให้ความเป็นพิษในอวัยวะทั้งสองลดลง เนื่องจาก การศึกษาทางเนื้อเยื่อวิทยาได้เปิดเผย การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าของเสียจากเมล็ดองุ่นและสาหร่าย buckthorn เป็นแหล่งที่มีแนวโน้มในการต่อต้านผลกระทบที่เป็นอันตรายของ ochratoxin A และ aflatoxin B1 แม้ว่าจำเป็นต้องมีการทำงานเพิ่มเติมเพื่อคลี่คลายกลไกที่ผลพลอยได้จากเมล็ดองุ่นและทะเล buckthorn ส่งผลต่อการเปลี่ยนรูปทางชีวภาพของ AFB1 และ OTA และด้วยเหตุนี้การสร้างสารที่เป็นพิษ ผลกระทบในการป้องกันดูเหมือนจะเป็นสื่อกลางอย่างน้อยบางส่วนโดยการเพิ่มประสิทธิภาพของการป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระที่ตับ และไตระดับ.

วัสดุและวิธีการ

การออกแบบทดลองและการเก็บตัวอย่างลูกผสม TOPIGS-40 ลูกผสมสี่สิบตัว (‍♀ Large White × Hybrid (Large White × Pietrain) ×♂ Talent ส่วนใหญ่เป็น Duroc) ลูกสุกรหลังหย่านมโดยมีน้ำหนักตัวเฉลี่ย 9.11 ± 0{{16 }}3 กก. ถูกกำหนดให้กับกลุ่มทดลองสามกลุ่ม (E1, E2, E3) และกลุ่มควบคุมหนึ่งกลุ่ม (C) ซึ่งอยู่ในคอก (สุกรสองตัวซ้ำกัน 5 ตัวต่อหนึ่งคอกต่อการรักษา) และให้อาหารทดลองเป็นเวลา 3{{19} } วัน ให้อาหารและน้ำโดยอิสระระหว่างการทดลอง อาหารพื้นฐานทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมและบรรจุอาหารผสมปกติสำหรับลูกสุกรเริ่มต้นที่ไม่มีสารพิษจากเชื้อรา (ข้าวโพด 68.46 เปอร์เซ็นต์ กากถั่วเหลือง 19 เปอร์เซ็นต์ กลูเตนข้าวโพด 4 เปอร์เซ็นต์ นมทดแทน 5 เปอร์เซ็นต์ แอล-ไลซีน 0.3 เปอร์เซ็นต์ , DL-methionine 0.1 เปอร์เซ็นต์ , หินปูน 1.57 เปอร์เซ็นต์ , โมโนแคลเซียมฟอสเฟต 0.35 เปอร์เซ็นต์ เกลือ 0.1 เปอร์เซ็นต์ , โคลีนพรีมิกซ์ 0.1 เปอร์เซ็นต์ และ 1 เปอร์เซ็นต์วิตามิน-แร่ธาตุพรีมิกซ์) กลุ่มทดลองได้รับอาหารดังนี้ E1—อาหารพื้นฐานบวกส่วนผสม (1:1) ของสองผลพลอยได้ (เมล็ดองุ่นและทะเล buckthorn ป่น) ในอัตราร้อยละ 5 โดยเปลี่ยนข้าวโพดและกากถั่วเหลือง E2—อาหารพื้นฐานที่ปนเปื้อนสารพิษจากเชื้อรา (ส่วนผสมของอะฟลาทอกซิน 62 ppb บี1- AFB1 และ 479 ppb ออคราทอกซิน A-OTA); และ E3—อาหารพื้นฐานที่มีส่วนผสมของเมล็ดองุ่นและซีบัคธอร์น 5 เปอร์เซ็นต์ (1:1) และปนเปื้อนด้วยส่วนผสมของ AFB1 และ OTA ส่วนผสมของสารพิษจากเชื้อรา OTA และ AFB1 ได้รับการจัดเตรียมโดย Dr. Boudra และ Dr. Morgavi จาก INR A, Center of Clermont Ferrand และผลิตโดยการเพาะปลูกของ Aspergillus flavus และ Aspergillus ochraceous บนข้าวสาลีตามที่ Boudra et al อธิบายไว้ [ 112 ]. วัสดุที่ปนเปื้อนที่ได้รับถูกรวมเข้าไปในอาหารสำหรับกลุ่ม E2 และ E3 ส่งผลให้มีความเข้มข้นสุดท้ายที่ 479 ppb OTA และ 62 ppb AFB1 สัตว์จากกลุ่มทดลองทั้งหมดสามารถเข้าถึงอาหารและน้ำบำบัดได้ฟรีทุกวันตลอดระยะเวลาทดลอง (30 วัน) เมล็ดองุ่นและสาหร่ายทะเล buckthorn จัดทำโดยโฆษณาท้องถิ่นสองชิ้นคือ SC OLEOMET-SRL และ BIOCATINA บูคาเรสต์ ประเทศโรมาเนีย หลังจาก 4 สัปดาห์ สัตว์เหล่านี้ถูกฆ่าโดยได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของสถาบันวิจัยพัฒนาโภชนาการสัตว์และชีววิทยาแห่งชาติ, Balote s, ti, โรมาเนีย (คณะกรรมการจริยธรรมหมายเลข 118/02.12.2019) และเป็นไปตาม กฎหมายโรมาเนีย 206/2004 และ EU Council Directive 98/58/EC สำหรับการจัดการและการปกป้องสัตว์ที่ใช้เพื่อการทดลอง เมื่อสิ้นสุดระยะเวลาทดลองของการศึกษานี้ พารามิเตอร์การผลิต น้ำหนัก และการบริโภคอาหารสัตว์จะถูกวัด ตับและไตตัวอย่างถูกเก็บจากสัตว์สี่ตัวต่อกลุ่มและผสมด้วยสารละลายน้ำเกลือเย็นเยือกแข็งเพื่อกำจัดเลือด เศษประมาณ 50 มก. จากกลีบตับด้านขวาและไตคอร์เทกซ์ (สามอันจากแต่ละอัน) ถูกรวบรวมใน RNAlater Stabilization Reagent (Qiagen, Germantown, Maryland) และเก็บไว้ที่ − 80 ◦ C จนกระทั่งขั้นตอนการแยก RNA เนื่องจากเหตุผลทางจริยธรรม การใช้สัตว์แต่ละตัวให้เกิดประโยชน์สูงสุด ลดการสูญเสียสัตว์ และการวิเคราะห์ทางสถิติ จำนวนบุคคลจึงลดลงมากที่สุดเท่าที่เป็นไปได้ในทางวิทยาศาสตร์ วิทยาศาสตร์ที่ดีและการออกแบบการทดลองที่ดีช่วยลดจำนวนสัตว์ที่ใช้ในการศึกษาวิจัยใดๆ ทำให้นักวิทยาศาสตร์สามารถรวบรวมข้อมูลโดยใช้จำนวนสัตว์ขั้นต่ำที่จำเป็น [113]

ลักษณะฟีดอาหารสัตว์ได้รับการวิเคราะห์สำหรับองค์ประกอบทางเคมีพื้นฐาน (วัตถุแห้ง โปรตีนหยาบ ไขมันดิบ เส้นใยหยาบ และเถ้า) ตามวิธีขององค์กรมาตรฐานสากล (SR ISO 6496/2001, Standardized Bulletin (2010) http://www. asro.ro (เข้าถึงเมื่อ 13 กุมภาพันธ์ 2021)). สารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากอาหารที่ได้จากผลพลอยได้ เช่น โพลีฟีนอล กรดไขมันไม่อิ่มตัวเชิงซ้อน (PUFA) และแร่ธาตุ ถูกกำหนดโดยปฏิกิริยา Folin-Ciocalteu, HPLC-UV-Vis และแก๊สโครมาโตกราฟีตามที่บรรยายโดยผู้เขียน [ 113 , 114 ] ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระถูกกำหนดโดยวิธี DPPH ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยผู้เขียน [115]

การวิเคราะห์พลาสมาไบโอมาร์คเกอร์ในวันที่ 30 ตัวอย่างเลือดถูกเก็บแบบปลอดเชื้อจากลูกสุกรที่อดอาหาร เครื่องหมายที่สะท้อนถึงการทำงานของตับ (aspartate transaminase-AST, alanine transaminase-ALT, gamma glutamyl transferase-GGT, โปรตีนทั้งหมด, อัลคาไลน์ฟอสฟาเตส-AKL) และไต (อัลบูมิน, ครีเอตินีน) ถูกกำหนดหลังจากการปั่นแยกเลือดโดยใช้ม้านั่งเคมีทางคลินิก เครื่องวิเคราะห์ Horiba Medical—ABX Pentra 400, (เออร์ไวน์, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา)

การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์แสงตับและไตการตรวจชิ้นเนื้อได้รับการแก้ไขในสารละลายฟอร์มาลดีไฮด์บัฟเฟอร์ฟอสเฟต 4 เปอร์เซ็นต์ อบแห้ง การทำให้กระจ่าง และรวมอยู่ในบล็อกพาราฟิน ส่วนขนาด 5 µ m ได้รับการประมวลผลเป็นประจำสำหรับการย้อมสี hematoxylin-eosin และ Gomori trichrome (Leica Biosystems, 38016SS1, Nussloch, Germany) ตามลำดับตามโปรโตคอลของ Leica วิเคราะห์ส่วนด้วยกล้องจุลทรรศน์ด้วยกล้องจุลทรรศน์โอลิมปัส BX43 ที่ติดตั้งกล้องดิจิตอลโอลิมปัส XC30 การเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาของตับและไตถูกจัดลำดับตามความรุนแรงของรอยโรคในระดับ 1-4 ตามที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 116 ] สำหรับตับ ระดับ 1: ด้านปกติ; ระดับ 2: เซลล์ตับปกติ, ไซนัสอยด์พองเล็กน้อยและความแออัด; ระดับ 3: Vacuolated hepatocytes, ไซนัสอยด์ขยายและความแออัด; การเพิ่มจำนวนคอลลาเจนในระดับปานกลาง เกรด 4: เนื้อร้าย, การอักเสบแทรกซึม, การเพิ่มจำนวนคอลลาเจน สำหรับไต ระดับ 1: ด้านปกติ; ระดับ 2: การบาดเจ็บที่ท่อ/ไตเล็กน้อย การอักเสบ และการเพิ่มจำนวนคอลลาเจน ระดับ 3: การบาดเจ็บที่ท่อ/ไตเล็กน้อย การอักเสบ และการเพิ่มจำนวนคอลลาเจน ระดับ 4 : มีรอยช้ำที่ท่อ/ไต การอักเสบ และการเพิ่มจำนวนคอลลาเจน "ค่าการประเมินเฉลี่ย" (MAV) คำนวณเป็นค่าเฉลี่ยของข้อมูลทั้งหมดต่อกลุ่มทดลอง

การแยกอาร์เอ็นเอการแยก RNA ทั้งหมดออกจากเนื้อเยื่อ 10 มก. โดยใช้ RNeasy Plus Universal Mini Kit (Qiagen) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต นอกจากนี้ยังรวมขั้นตอนการย่อย DNase ในคอลัมน์ด้วย หลังจากการแยกอาร์เอ็นเอแล้ว ส่วนของลิคอตถูกสร้างขึ้นเพื่อป้องกันการเสื่อมสลายที่เกิดจากวัฏจักรการแช่แข็ง-ละลาย ความเข้มข้นและความบริสุทธิ์ของ RNA ทั้งหมดถูกกำหนดโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ NanoDrop 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)

หมายเลขความสมบูรณ์ของ RNA (RIN)ค่า RIN ของตัวอย่าง RNA ถูกกำหนดโดยใช้ Agilent RNA 6000 NanoKit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) และ Agilent 2100 Bioanalyzer โดยใช้โปรโตคอลของผู้ผลิต ตัวอย่างที่มีค่า RIN น้อยกว่า 8 จะไม่รวมอยู่ในการวิเคราะห์เพิ่มเติม และขั้นตอนการแยกถูกทำซ้ำ

การถอดความย้อนกลับสำหรับการสังเคราะห์ cDNA นั้น 1,000 ng ของ RNA ทั้งหมดต้องผ่านการถอดรหัสแบบย้อนกลับโดยใช้ชุดการสังเคราะห์ iScript cDNA (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ของผสมปฏิกิริยา 4 µ L และ reverse transcriptase 1 µ L ถูกผสมกับตัวอย่าง RNA 1 µ L และทำให้สมบูรณ์ด้วยน้ำที่ปราศจาก RNase จนถึงปริมาตรรวม 20 µ L ความเข้มข้นสุดท้ายของ RNA คือ 1,000 ng ต่อปฏิกิริยา ปฏิกิริยาถูกดำเนินการโดยใช้ Veriti 96-Well thermal cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ด้วยโปรแกรมต่อไปนี้: หนึ่งรอบ 25◦ C เป็นเวลา 5 นาที, หนึ่งรอบของ 42◦ C เป็นเวลา 30 นาที และหนึ่งรอบ 85 ◦ C เป็นเวลา 5 นาที ความเข้มข้นและความบริสุทธิ์ของตัวอย่าง cDNA ถูกกำหนดโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ NanoDrop 8000 (Thermo Scientific)

การออกแบบรองพื้นเนื่องจากขาดข้อมูลเกี่ยวกับยีนที่เกี่ยวข้องกับความเป็นพิษต่อตับและไตในการได้รับสารพิษจากเชื้อราของสุกรหย่านม ลำดับไพรเมอร์ (ตารางที่ 7) ได้รับการออกแบบในซิลิโคโดยใช้ Primer3Plus [ 59 ] และตรวจสอบโดยโปรแกรม BLAST [ 117 ] ผู้ที่มีความจำเพาะสูงสุดสำหรับลำดับเป้าหมายได้รับการคัดเลือกเพื่อขยายยีน CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1, CYP3A29, CYP4A24, MRP2 และ GSTA1 และยีนอ้างอิงสามตัวที่เข้ารหัสสำหรับโปรตีนที่จับกับ TATA-box, โปรตีนไรโบโซม L4 และเบต้า{ {19}}ไมโครโกลบูลินใน Sus scrofa อุณหภูมิการหลอมของไพรเมอร์ถูกกำหนดโดย PCR ไล่ระดับอุณหภูมิ

PCR แบบเรียลไทม์ปฏิกิริยา PCR แบบเรียลไทม์ดำเนินการบนระบบตรวจจับ PCR แบบเรียลไทม์ของ iCycler iQ (Bio-Rad) โดยใช้ iQ SYBR Green SuperMix (Bio-Rad) ในจานหลุม 96-หลุม 1 µ L ของ 1{{10}}0 ng/ µ L cDNA, 12.5 µ L iQ SYBR Green SuperMix (Bio-Rad), 0.5 µ L ของ 20 pmol/ µ L forward primer, 0.5 µ L ของ 20 pmol/ µ L reverse primer และ 10.5 µ L ของน้ำ MilliQ ถูกเติม ปริมาตรรวมคือ 25 µ L โปรแกรมการขยายสัญญาณประกอบด้วย 1 รอบที่ 95 ◦ C เป็นเวลา 5 นาที 45 รอบที่ 95 ◦ C เป็นเวลา 30 วินาที 55/56 ◦ C เป็นเวลา 30 วินาที 72 ◦ C เป็นเวลา 45 วินาที และ 85 รอบ 55 ◦ C โดยเพิ่มอุณหภูมิจุดที่ตั้งไว้ 0.5 ◦ C ต่อรอบเป็นเวลา 10 วินาที ตัวอย่างถูกรัน และค่าขีดจำกัดรอบ (Ct) ถูกบันทึก เส้นโค้งหลอมเหลวยังถูกดำเนินการ

การวิเคราะห์ข้อมูลค่า Ct ได้รับการประมวลผลตามที่ระบุไว้ใน "แนวทาง MIQE: ข้อมูลขั้นต่ำสำหรับการเผยแพร่การทดลอง PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ" [ 118 ] โดยใช้ OpenOffice Calc ตามวิธี 2- ∆∆ Ct ที่อธิบายโดย Livak และ Schmittgen (2001 ) [ 119 ]. ยีนอ้างอิง (TBP, RPL4 และ B2M) ได้รับการคัดเลือกเพื่อให้แสดงออกอย่างเสถียรในเนื้อเยื่อประเภทต่างๆ และการรักษาในตัวอย่างสุกร [ 120 , 121 ] ค่าการแสดงออกสัมพัทธ์ (2 − ∆∆Ct ) ได้มาจากการทำให้เป็นมาตรฐาน โดยลบค่าเฉลี่ยเลขคณิตของยีนอ้างอิงออกจากแต่ละยีนที่สนใจ การจำลองทางเทคนิคถูกหาค่าเฉลี่ยก่อนการวิเคราะห์ทางสถิติ ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ยของกลุ่ม (n=4) ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย (STDEV) ข้อมูลทั้งหมดได้รับการวิเคราะห์ทางสถิติโดยใช้วิธี ANOVA ทางเดียวที่ดำเนินการกับซอฟต์แวร์ GraphPad Prism 3.03 (ซอฟต์แวร์ GraphPad, La Jolla, CA, USA) การเปรียบเทียบหลังเฉพาะกิจระหว่างกลุ่มทั้งหมดดำเนินการโดยใช้การทดสอบ Bonferroni นัยสำคัญทางสถิติ (ค่า p) ถูกนำเสนอสำหรับทุกกลุ่มในทางตรงกันข้ามกับกลุ่มควบคุม (C)