สถานะปัจจุบันของการป้องกันระบบประสาทในโรคหัวใจพิการแต่กำเนิด ตอนที่ 2

จากนั้นนำภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์ไปคำนวณภาพโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ (สถาบันสุขภาพแห่งชาติ, Bethesda, MD, USA) สัญญาณของ Hsp60 คูณด้วย "x"

Hsp60 เป็นโมเลกุลโปรตีนที่สำคัญที่มีบทบาททางชีวภาพที่สำคัญในร่างกายมนุษย์ การวิจัยในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาแสดงให้เห็นว่าการมีอยู่ของ Hsp60 มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับความทรงจำของมนุษย์

Hsp60 เป็นโปรตีนโมเลกุลโมเลกุลที่ส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับการพับโปรตีน การแฉ การคงตัว และการย่อยสลาย กระบวนการเหล่านี้มีความสำคัญมากสำหรับการเผาผลาญปกติและการทำงานของเซลล์ในร่างกายมนุษย์ ในเวลาเดียวกัน Hsp60 ยังมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ และควบคุมภูมิคุ้มกัน และมีบทบาทสำคัญในการรักษาสุขภาพของมนุษย์และความสมดุลของระบบภูมิคุ้มกัน

การวิจัยพบว่า Hsp60 มีบทบาทสำคัญในการสร้างและบำรุงรักษาหน่วยความจำ ในระหว่างกระบวนการเรียนรู้และความจำ เซลล์สมองจะผลิตโมเลกุล Hsp60 จำนวนมาก โมเลกุลเหล่านี้สามารถปกป้องเซลล์จากการรบกวนและความเสียหายจากสภาพแวดล้อมภายนอก เพื่อให้การเรียนรู้และความทรงจำดำเนินไปอย่างราบรื่น นอกจากนี้ Hsp60 ยังสามารถส่งผลต่อการคิดและพฤติกรรมของมนุษย์โดยการเปลี่ยนการส่งสัญญาณของเซลล์สมองและการพัฒนาของเซลล์ประสาท และมีผลกระทบเชิงบวกต่อการรับรู้และการต้านทานความเครียด

แม้ว่าบทบาทของ Hsp60 แสดงให้เห็นถึงผลเชิงบวกต่อร่างกายมนุษย์ แต่ผู้คนก็ต้องตระหนักด้วยว่าทั้งส่วนเกินและการขาด Hsp60 อาจส่งผลเสียต่อสุขภาพของมนุษย์ ดังนั้นเราจึงควรสำรวจและศึกษากลไกของ Hsp60 ในสภาพทางสรีรวิทยาและพยาธิวิทยาต่างๆ ของร่างกายมนุษย์อย่างแข็งขัน เพื่อทำความเข้าใจตำแหน่งและบทบาทของ Hsp60 ต่อสุขภาพของมนุษย์ให้ดียิ่งขึ้น จะเห็นได้ว่าเราต้องปรับปรุงความจำ และ Cistanche Deserticola สามารถปรับปรุงความจำได้อย่างมีนัยสำคัญ เนื่องจาก Cistanche Deserticola มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ และต่อต้านวัย ซึ่งสามารถช่วยลดปฏิกิริยาออกซิเดชันและการอักเสบในสมอง จึงช่วยปกป้อง สุขภาพของระบบประสาท นอกจากนี้ Cistanche Deserticola ยังสามารถส่งเสริมการเจริญเติบโตและการซ่อมแซมเซลล์ประสาท ซึ่งจะช่วยปรับปรุงการเชื่อมต่อและการทำงานของโครงข่ายประสาทเทียม ผลกระทบเหล่านี้สามารถช่วยปรับปรุงความจำ ความสามารถในการเรียนรู้ และความเร็วในการคิด และยังอาจป้องกันการพัฒนาของความผิดปกติทางสติปัญญาและโรคเกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาทอีกด้วย

คลิกรู้เพื่อปรับปรุงหน่วยความจำระยะสั้น

ค่า "x" ถูกกำหนดดังนี้: การลบสัญญาณ Hsp60 แบบพับ "x" ออกจากสัญญาณ DNA ของไมโตคอนเดรียในกลุ่มควบคุมทำให้ค่า DNA ของไมโตคอนเดรียน้อยกว่าหรือเท่ากับศูนย์ สัญญาณของฮิสโตน H2B คูณด้วย "y"

ค่า "y" ถูกกำหนดดังนี้: การลบสัญญาณฮิสโตน-H2B แบบพับ "y" ออกจากสัญญาณนิวเคลียร์-DNA ในกลุ่มควบคุมทำให้ค่านิวเคลียร์-DNA น้อยกว่า ore เท่ากับศูนย์ หากสัญญาณพื้นหลังสูงจากการคูณ สามารถปรับคอนทราสต์ของภาพที่คูณได้ภายใต้เงื่อนไขเดียวกันในทุกตัวอย่าง

รูปภาพของการย้อมสี dsDNA ลบรูปภาพที่ปรับแล้วของ Hsp6 0 ที่คูณแล้ว และฮิสโตน H2B ถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์ในภายหลัง การใช้ฟังก์ชัน "Adjust-Threshold" ภาพเหล่านี้จะถูกไบนาไรซ์ เราเลือก dsDNA puncta ซึ่งมีขนาดตั้งแต่ 2 ถึง 20 µm2(ความเป็นวงกลม 0.1–1.0) และถูกนับโดยใช้ฟังก์ชัน "วิเคราะห์-วิเคราะห์อนุภาค"

2.3. กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน

หนึ่งวันก่อนการเปลี่ยนถ่าย เซลล์ HeLa ถูกชุบที่ความหนาแน่น 600 เซลล์/µL การแสดงออกของยีนที่สนใจถูกปิดเสียงในเซลล์ HeLa โดยใช้ Stealth RNAi siRNA(Thermo Fisher Scientific) ใน Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (ThermoFisher Scientific) ตาม คำแนะนำของผู้ผลิต (โดยมีความเข้มข้น RNA สุดท้ายคือ 10 นาโนโมลาร์)

สี่วันหลังจากการล้มลงของ siRNA เซลล์จะถูกตรึง ตัวอย่างการเพาะเลี้ยงเซลล์ได้รับการแก้ไขด้วย 2% PFA และกลูตาราลดีไฮด์ 2% ใน 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.4 ที่ 37 —C จากนั้นวางใน 4 ◦C ตู้เย็นเป็นเวลา 30 นาที ตัวอย่างถูกตรึงไว้ในกลูตาราลดีไฮด์ 2% ในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.1 โมลาร์ข้ามคืนที่ 4 °C ตัวอย่างถูกล้างสามครั้งด้วยบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.1 โมลาร์ เป็นเวลา 30 นาที และหลังการตรึงด้วยออสเมียมเตตรอกไซด์ 2% ในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.1 โมลาร์ ที่ 4 °C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง

ตัวอย่างคือสารละลายเอทานอลที่เติมน้ำให้แห้ง แล้วถ่ายโอนไปยังเรซิน (Quetol-812, Nisshin EM Co., โตเกียว, ญี่ปุ่น) และทำปฏิกิริยาโพลีเมอร์ที่ 60 ◦C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง เรซินโพลีเมอร์ถูกตัดเป็นส่วนบางเฉียบ 70- นาโนเมตรด้วยมีดเพชรโดยใช้เครื่องอัลตราไมโครโตม (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) จากนั้นจึงติดตั้งบนตะแกรงทองแดง

ส่วนต่างๆ ถูกย้อมด้วย uranyl acetate 2% ที่ RT เป็นเวลา 15 นาทีแล้วล้างด้วยน้ำกลั่น ตามด้วยการย้อมสีทุติยภูมิด้วยสารละลายย้อมสีตะกั่ว (Sigma-Aldrich, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ที่ RT เป็นเวลา 3 นาที

กริดถูกสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (JEM-1400Plus, JEOL Ltd.โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น) ที่แรงดันไฟฟ้าความเร่ง 80 kV (สมองของปลาม้าลาย) หรือ 100 kV (เซลล์) และภาพถูกบันทึกโดยใช้กล้อง charge-coupled-device (CCD) (EM-14830RUBY2,JEOL Ltd.) .

2.4. กล้องจุลทรรศน์อิมมูโนอิเล็กตรอน

ตัวอย่างบนแผ่นทองคำถูกแช่แข็งในโพรเพนเหลวที่อุณหภูมิ −175 ◦C หลังจากที่ตัวอย่างถูกแช่แข็ง พวกเขาจะถูกแทนที่ด้วยการแช่แข็งด้วยกรดแทนนิก 1% ในเอธานอลและน้ำกลั่น 2% ที่อุณหภูมิ −80 ◦C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง

จากนั้นเก็บตัวอย่างไว้ที่ −20 ◦C เป็นเวลา 4 ชั่วโมง ตามด้วยการฟักที่อุณหภูมิ 4 ◦C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ต่อไป ตัวอย่างถูกทำให้แห้งในเอทานอลแบบแอนไฮดรัส 3 ครั้งเป็นเวลา 30 นาที ในแต่ละครั้ง ตามด้วยการแทรกซึมด้วยส่วนผสมของเอทานอลแลนด์เรซิน 50:50 (LR สีขาว: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) ที่อุณหภูมิ 4 °C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตัวอย่างถูกถ่ายโอนไปยังเรซินสด 100% และบ่มที่ 4 ◦C เป็นเวลา 30 นาที และกระบวนการนี้ทำซ้ำสามครั้ง

ตัวอย่างถูกถ่ายโอนไปยังเรซินสด 100% และถูกทำให้เป็นโพลีเมอร์ที่ 50 ◦CO/N เรซินโพลีเมอร์นั้นถูกตัดส่วนที่บางเป็นพิเศษที่ 90 นาโนเมตรด้วยมีดเพชรโดยใช้ ultramicrotome (Ultracut UCT; Leica) และส่วนต่างๆถูกวางไว้บนตะแกรงนิกเกิล กริดถูกบ่มด้วยแอนติบอดีต่อต้าน dsDNA (35I9 DNA)(1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) ใน 1% BSA/PBS ที่ 4 ◦CO/N ตามด้วยการล้างสามครั้งด้วย 1% BSA/PBS ครั้งละ 1 นาที

ต่อมาพวกมันถูกบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ถูกคอนจูเกตกับอนุภาคทองคำ {{0}} นาโนเมตร (โพลีโคลนอลแอนติบอดี IgG ที่ต้านหนูเมาส์) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากการล้างด้วย PBS, กริดถูกใส่ไว้ในบัฟเฟอร์คาโคดีเลต 0.1 โมลาร์ของกลูตาราลดีไฮด์ 2%

หลังจากนั้น กริดถูกทำให้แห้งแล้วย้อมด้วย 2% uranyl acetate เป็นเวลา 15 นาที และด้วยสารละลายคราบตะกั่ว (Sigma-Aldrich) ที่อุณหภูมิ RT เป็นเวลา 3 นาที ตรวจดูกริดผ่านกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (JEM-1400 บวก; JEOLLtd.) ที่แรงดันไฟฟ้าเร่งความเร็ว 100 kV ภาพดิจิทัลได้มาจากกล้อง CCD (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.)

3. ผลลัพธ์

3.1. TFAM หรือ GBA ที่ลดลงทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นของ DNA ไมโตคอนเดรียนอกมดลูก

อันดับแรก เราได้แสดงตัวอย่างของการตรวจหา cytoplasmicDNA ที่ได้มาจากไมโตคอนเดรียในเซลล์ HeLa โดยที่โปรตีน TFAM ถูกทำให้ล้มลงโดย siRNA (รูปที่ 1A) TFAM เป็นปัจจัยสำคัญในการถอดรหัสไมโตคอนเดรีย และยังทำหน้าที่ในการจำลองและซ่อมแซมไมโตคอนเดรีย DNA ด้วย [20] .

มีรายงานว่าความหลากหลายตามลำดับในยีนนี้มีความเกี่ยวข้องกับโรคพาร์กินสัน [21,22] หลังจากการล้มลงของโปรตีน TFAM เป็นเวลา 3 วัน จุด DNA ที่มีเกลียวคู่จำนวนมากถูกตรวจพบในไซโตพลาสซึมของเซลล์ HeLa

ฮิสโตนเป็นเครื่องหมายเชิงบวกของ DNA ต้นกำเนิดนิวเคลียร์ในไซโตพลาสซึม และเป็นเครื่องหมายเชิงลบของ DNA ของไมโตคอนเดรียและ DNA ของไมโตคอนเดรียในไซโตพลาสซึม [23] จุดเหล่านี้ไม่ได้แปลร่วมกับฮิสโตน บ่งบอกว่าพวกมันไม่ใช่ DNA ที่ได้มาจากนิวเคลียร์ นอกจากนี้ จุด DNA นอกมดลูกของไซโตพลาสซึมเหล่านี้บางส่วนไม่ได้แปลร่วมกับ Hsp60 ซึ่งเป็นเครื่องหมายของเมทริกซ์ไมโตคอนเดรีย ซึ่งบ่งชี้ว่าพวกมันอาศัยอยู่นอกไมโตคอนเดรีย (รูปที่ 1B, C)

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนยังแสดงให้เห็นว่า DNA นอกมดลูกรั่วไหลจากไมโตคอนเดรีย (รูปที่ 2A, B) โดยสรุป การเพิ่มขึ้นของ DNAdots นอกมดลูกในไซโตพลาสซึมโดยการล้มลงของ TFAM เกิดจากการที่ DNA ของไมโตคอนเดรียรั่วจากไมโตคอนเดรีย ประการที่สอง เราแสดงอีกตัวอย่างหนึ่งของการตรวจหา DNA ของไซโตพลาสซึมที่ได้มาจากไมโตคอนเดรียในเซลล์ HeLa ซึ่งโปรตีน GBA ถูกทำให้ล้มลงโดย siRNA (รูปที่ 1ก)

GBA เป็นยีนที่ก่อให้เกิดโรค Gaucher แต่การกลายพันธุ์แบบเฮเทอโรไซกัสของ GBA ก็เป็นปัจจัยเสี่ยงต่อโรคพาร์กินสันด้วย ตรวจพบจุด DNA ที่มีเกลียวคู่จำนวนมากในไซโตพลาสซึมของเซลล์ HeLa หลังจากการล้มลงของโปรตีน GBA เป็นเวลา 3 วัน จุด DNA บางจุดถูกแปลร่วมกับฮิสโตน ซึ่งบ่งบอกว่าเป็น DNA ที่ได้มาจากนิวเคลียร์

จุด DNA อื่นๆ ไม่ได้ถูกแปลร่วมกับฮิสโตน บ่งบอกว่าพวกมันไม่ใช่ DNA ที่ได้มาจากนิวเคลียร์ แต่เป็น DNA ที่ได้มาจากไมโตคอนเดรีย (รูปที่ 1D) โดยสรุป การเพิ่มขึ้นของจุด DNA นอกมดลูกในไซโตพลาสซึมจากการล้มลงของ GBA อย่างน้อยก็ส่วนหนึ่งเกิดจาก DNA ของไมโตคอนเดรียที่รั่วจากไมโตคอนเดรีย

For more information:1950477648nn@gmail.com