วิธีที่โปรตีนซ่อมแซมเยื่อหุ้มเซลล์ควบคุมการส่งสัญญาณปัจจัยการถอดรหัสเพื่อควบคุมการเกิดพังผืดของไต

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

Haichang Li

ไตพังผืดสัมพันธ์กับความก้าวหน้าของเฉียบพลันไตการบาดเจ็บต่อโรคไตเรื้อรัง MG53 ซึ่งเป็นโปรตีนซ่อมแซมเยื่อหุ้มเซลล์ได้รับการแสดงเพื่อป้องกันการบาดเจ็บต่อเซลล์เยื่อบุผิวของไตและการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลัน ที่นี่ เราประเมินบทบาทของ MG53 ในการมอดูเลตของไตการเกิดพังผืดในหนูที่มีอายุมากและในหนูที่มีสิ่งกีดขวางท่อไตข้างเดียว (UUO) ซึ่งเป็นแบบจำลองที่ทราบกันดีของการเกิดพังผืดในไตแบบก้าวหน้า หนูเมาส์ที่มีการระเหยของ MG53 พัฒนาพังผืดคั่นระหว่างหน้าที่มีอายุมากกว่า MG53-หนูที่ไม่บุบสลายในวัยเดียวกัน ในทำนองเดียวกันในกรณีที่ไม่มี MG53ไตการเกิดพังผืดนั้นเกินจริงเมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่ยังไม่ถูกทำลาย MG53 ในไตที่ถูกอุดกั้นเมื่อเปรียบเทียบกับไตที่ไม่มีสิ่งกีดขวางที่ตรงกันข้ามหรือไตของหนูที่ได้รับการผ่าตัดหลอก ท่อไตอุดตันไตจากหนูทดลองที่บกพร่อง MG53 ยังแสดงอาการอักเสบมากกว่าไตที่อุดกั้นทางไตอย่างมีนัยสำคัญจากหนูที่ไม่บุบสลาย MG53 การทดลองในหลอดทดลองแสดงให้เห็นว่า MG53 สามารถเข้าสู่นิวเคลียสของเซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้เคียงและมีปฏิสัมพันธ์โดยตรงกับส่วนประกอบ p65 ของปัจจัยการถอดรหัส NF-kB ซึ่งให้คำอธิบายที่เป็นไปได้ของการอักเสบที่เพิ่มขึ้นในกรณีที่ไม่มี MG53 เพื่อทดสอบสิ่งนี้ การแสดงออกของ MG53 ที่ปรับปรุงให้ดีขึ้นผ่านเซลล์ที่ถูกทำวิศวกรรมหรือการนำส่งโปรตีนลูกผสมโดยตรงถูกมอบให้กับหนูเมาส์ที่อยู่ภายใต้ UUO การกระตุ้นและการอักเสบของ NF-kB ลดลง และลดการเกิดพังผืดในไต ดังนั้น MG53 อาจมีบทบาทในการรักษาโรคไตอักเสบเรื้อรังและด้วยเหตุนี้จึงให้การป้องกันพังผืดที่นำไปสู่โรคไตเรื้อรังฟีโนไทป์

Cistanche tubulosa ป้องกันโรคไต คลิกที่นี่เพื่อรับตัวอย่าง

คำชี้แจงการแปล การอักเสบเรื้อรังนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงรูปแบบไฟโบรติกที่อาจรองรับการเปลี่ยนแปลงจากการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง การกระตุ้นปัจจัยการถอดรหัสโปรตีนการอักเสบของนิวเคลียส-kB (NF-kB) เกี่ยวข้องกับการเกิดโรคของการอักเสบของไต ในที่นี้ เราแสดงหลักฐานว่า MG53 ซึ่งเป็นโปรตีนซ่อมแซมเยื่อหุ้มเซลล์ที่ระบุก่อนหน้านี้ มีปฏิสัมพันธ์โดยตรงกับ NF-kB และลดกิจกรรมการถอดรหัสของมัน ควบคู่ไปกับการบริหารให้ MG53 จากภายนอกสามารถลดการเปลี่ยนแปลงรูปแบบไฟโบรติกของไตที่อักเสบได้ การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นถึงการทำงานร่วมกันในการป้องกันระหว่าง MG53 และ NF-kB เพื่อลดทอนการพัฒนาของการเกิดพังผืดในไตที่เกิดจากการอักเสบ การบริหารทางเภสัชวิทยาของ MG53 อาจเป็นแนวทางที่มีแนวโน้มสำหรับการรักษาภาวะพังผืดในไตแบบก้าวหน้า

ความผิดปกติของไตซึ่งสามารถจำแนกได้ว่าเป็นอาการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลัน (AKI) หรือโรคไตเรื้อรัง (CKD) ได้เติบโตขึ้นเป็นโรคระบาดในประชากรสูงอายุ ในปี 2560 ความชุกของ CKD สูงถึง 14.5% ของผู้ที่มีอายุ 65 ปีขึ้นไป ส่งผลให้มีการใช้จ่าย Medicare กว่า 84 พันล้านดอลลาร์สำหรับการรักษา^1,2AKI และ CKD พบได้บ่อยในผู้สูงวัย สาเหตุหลักมาจากความไวต่อการบาดเจ็บที่เพิ่มขึ้น บวกกับความสามารถในการซ่อมแซมไตที่เสื่อมลง การศึกษาทางคลินิกแสดงให้เห็นว่า CKD เป็นปัจจัยเสี่ยงที่สำคัญสำหรับ AKI และในทางกลับกัน ตอนของ AKI สามารถเร่งการลุกลามของ CKD ไปสู่โรคไตระยะสุดท้ายได้ ในปัจจุบัน การรักษา AKI เป็นหลักสนับสนุน และการรักษา CKD ที่จัดตั้งขึ้นนั้นมุ่งเน้นไปที่การชะลอการลุกลามผ่านการยับยั้งระบบ renin-angiotensin-aldosterone และตอนนี้อาจผ่านการยับยั้งโซเดียม-กลูโคส^3,4

ขึ้นอยู่กับความรุนแรงของการบาดเจ็บ เซลล์ท่อส่วนต้น ซึ่งเป็นเป้าหมายหลักของการบาดเจ็บเฉียบพลัน อาจได้รับการเปลี่ยนแปลงในความก้าวหน้าของวัฏจักรเซลล์ เมแทบอลิซึม 5,6 การหลั่งของไซโตไคน์ที่มีการอักเสบของโปรตีนและโปรไฟโบรติก หรือการเปลี่ยนแปลงของเยื่อบุผิวบางส่วน-มีเซนไคม์บางส่วน 8 ซึ่งจะเป็นตัวกำหนดว่าการเปลี่ยนแปลง/ซ่อมแซมจะประสบความสำเร็จหรือปรับตัวไม่ได้และส่งผลให้เกิดพังผืดในไต ซึ่งเป็นลักษณะเด่นของ CKD.9,10 การเปลี่ยนแปลงนี้มักเกิดขึ้นบนพื้นหลังของการอักเสบของไต

ปริมาณของหลอดเลือดลดลง และการผลิตโปรตีน extracellular matrix (ECM) และรวมถึงการสูญเสียเซลล์เยื่อบุผิวและการสะสมของคอลลาเจน แอกตินของกล้ามเนื้อเรียบ และไฟโบรเนกติน มีความสัมพันธ์สูงกับการทำงานของไตเสื่อมลง

การอักเสบเรื้อรังนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงรูปแบบไฟโบรติกซึ่งอาจรองรับการเปลี่ยนจาก AKI เป็น CKD.11–13 การวิจัยแบบสะสมชี้ให้เห็นถึงการมีส่วนร่วมของปัจจัยการถอดรหัสปัจจัยนิวเคลียร์-kB (NF-kB) ในการเกิดโรคของการอักเสบของไตที่เกิดจากการติดเชื้อ การบาดเจ็บ หรือการปลูกถ่าย11,12,14 การเปิดใช้งานวิถีทาง NF-kB แบบบัญญัติเริ่มต้นด้วยการกระตุ้นตัวยับยั้งไคเนส NF-kB (IkB) ซึ่งนำไปสู่ฟอสโฟรีเลชันและการเสื่อมสภาพของ IkBa และการโยกย้ายนิวเคลียร์ของเฮเทอโรไดเมอร์ NF-kB15 การกระตุ้นการส่งสัญญาณ NF-kB ในเซลล์เยื่อบุผิวของไตและการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกันสามารถกระตุ้นได้โดยการกระตุ้นทางพยาธิสรีรวิทยา เช่น การสัมผัสกับไลโปโพลีแซ็กคาไรด์ (LPSs) หรือการบาดเจ็บจากการขาดเลือดกลับคืนสู่สภาพเดิม 16 การศึกษาการทำโปรไฟล์ระดับโมเลกุลเปิดเผยว่า nfkb1 เป็นตัวขับเคลื่อนที่สำคัญของการเกิดพังผืดในไต¹⁷นอกจากเซลล์รูปท่อไตแล้ว เซลล์ภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด เช่น มาโครฟาจและเซลล์เดนไดรต์ ยังมีส่วนทำให้เกิดการบาดเจ็บที่ไต การอักเสบ และการเปลี่ยนแปลงรูปแบบไฟโบรติก^13,18–20

cistanche มีประสิทธิภาพในการรักษาความผิดปกติของไต

หลักฐานที่เพิ่มขึ้นแสดงให้เห็นว่าปัจจัยหลั่งจากกล้ามเนื้อ (เช่น myokines) ปรับเปลี่ยนสรีรวิทยาของระบบผ่านทางเนื้อเยื่อเกี่ยวพันเพื่อส่งผลต่อการลุกลามของโรคไต²¹MG53 (เรียกอีกอย่างว่า TRIM72) เป็นโปรตีนไตรภาคีที่เสริมด้วยกล้ามเนื้อ (TRIM) ที่มีหน้าที่สำคัญในการซ่อมแซมเยื่อหุ้มเซลล์ 22,23 โปรตีนในตระกูล TRIM มีหน้าที่ที่หลากหลายตั้งแต่การควบคุมการส่งสัญญาณภูมิคุ้มกันไปจนถึงการซ่อมแซมเนื้อเยื่อ²⁴การซ่อมแซมเยื่อหุ้มเซลล์ MG53-เกี่ยวข้องกับการบรรเทาการบาดเจ็บเฉียบพลันของกล้ามเนื้อโครงร่าง²⁵ไต²⁶หัวใจ,²⁷ ปอด 28 สมอง^29,30และผิวหนัง³¹การศึกษาก่อนหน้านี้ของเราระบุว่ามีการแสดงออกของ MG53 ในไตในระดับต่ำ ซึ่งเป็นองค์ประกอบสำคัญในการป้องกัน AKI และหนูที่ขาด MG53 (mg53 / ) มีความอ่อนไหวต่อ AKI ที่เกิดจากความเครียดมากขึ้น²⁶เรายังได้แสดงให้เห็นเมื่อเร็วๆ นี้ว่าการยกระดับอย่างต่อเนื่องของ MG53 ในการไหลเวียนช่วยเพิ่มการซ่อมแซมและฟื้นฟูการบาดเจ็บของเนื้อเยื่อ32 บทบาทที่เกี่ยวข้องของ MG53 ที่หมุนเวียนเฉพาะไตและภายนอกในการปรับภาวะพังผืดในไตระหว่าง CKD แบบลุกลามยังไม่ทราบ

เมื่อเร็วๆ นี้ บทบาทที่เกิดขึ้นใหม่ของ MG53 ในการปรับการป้องกันเนื้อเยื่อผ่านการยับยั้งการอักเสบ โดยเฉพาะอย่างยิ่งผ่านการมอดูเลตของการส่งสัญญาณ NF-kB ได้พัฒนาขึ้น ตัวอย่างเช่น MG53 ลดความเป็นพิษต่อระบบประสาทที่เกิดจาก LPS และการอักเสบของระบบประสาทโดยการยับยั้งวิถี TLR4/NF-kB 33 และการเต้นของหัวใจ MG53 ควบคุมการแสดงออกของ KChIP2 เพื่อควบคุมการเปลี่ยนแปลงทางไฟฟ้าระหว่างหัวใจโต34 นอกจากนี้ เรายังแสดงให้เห็นการทำงานคู่ของ MG53 ใน การป้องกันการตอบสนองการอักเสบที่มากเกินไปที่ไม่เหมาะสมในระหว่างการติดเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่ชนิดย่อย A ที่มีลักษณะเฉพาะโดยการผลิต interferon-b มากเกินไป ผ่านการปราบปรามของการกระตุ้น IRF3/NF-kB และการยับยั้งการส่งสัญญาณ Ca2þ ภายในเซลล์ที่ผิดปกติในมาโครฟาจ การติดเชื้อไวรัส MG53 แสดงเพื่อป้องกันการตายและความเสียหายของปอด ไม่ได้ส่งผลกระทบโดยตรงต่อระดับของไวรัสต่อตัว แต่โดยการบรรเทาพายุไซโตไคน์ (interferon-b, interleukin-6 และ interleukin-1b) ผ่านกฎระเบียบเชิงลบ ของ NLRP3 inflammasome และการป้องกัน pyroptosis ของปอด36 นอกจากนี้ การรักษาแบบเรื้อรังในขนาดสูงของ MG53 จากภายนอกยังเชื่อมโยงกับการปราบปรามของ NF-kB – การอักเสบที่เป็นสื่อกลางในหัวใจสูงวัย 37 การศึกษาเหล่านี้แนะนำว่า MG53 สามารถปรับเปลี่ยนสัญญาณ NF-kB ที่ผิดปกติระหว่างการอักเสบได้ แต่ยังไม่ได้มีการศึกษาว่าสิ่งนี้เกิดขึ้นในบริบทของการอักเสบของไตหรือไม่

เราตั้งสมมติฐานว่า MG53 ควบคุมการอักเสบของไตโดยการปรับกิจกรรมการถอดรหัสของ NF-kB และด้วยเหตุนี้ การทำเช่นนี้สามารถลดทอนการเกิดพังผืดในไตที่เกิดขึ้นอันเป็นผลมาจากการอักเสบเรื้อรังได้ การศึกษานี้ดำเนินการเพื่อแก้ไขสมมติฐานนี้

cistanche มีประสิทธิภาพในการรักษาโรคไต

วิธีการ

การศึกษาสัตว์

การทดลองกับสัตว์ทั้งหมดเป็นไปตาม National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals และปฏิบัติตามโปรโตคอลที่ได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบัน Ohio State University ประเภทไวด์ที่ตรงกับอายุ (WT) หรือ mg53^-/-nonlittermates ของสายพันธุ์ 129S1/SvImJ ถูกใช้ 22 เพื่อสร้างบทบาทของ MG53 ในการปรับภาวะพังผืดของไตที่เหนี่ยวนำโดยขึ้นกับอายุและข้างเดียว (UUO) หนูเมาส์ C57B6/J (9–10 สัปดาห์) ถูกซื้อจาก Jackson Labs

สำหรับการศึกษาอาการบาดเจ็บที่ไต หนูเมาส์ (9–12 สัปดาห์) ได้รับยา UUO เพื่อกระตุ้นให้เกิดพังผืดในไต หนูได้รับยาสลบด้วยไอโซฟลูเรน (1.5 เปอร์เซ็นต์ –2.0 เปอร์เซ็นต์ ) เพื่อให้แน่ใจว่ามีการดมยาสลบในระดับลึก ขั้นตอน UUO ดำเนินการโดยผูกมัดท่อไตด้านซ้ายด้วยไหมผ่าตัด 5-0 ครั้งสองครั้งตามโปรโตคอลที่เผยแพร่ 38 หนูหลอกมีเพียงแผลที่ผิวหนังบริเวณหน้าท้องเท่านั้น เพื่อประเมินผลของ rhMG53 ต่อการบาดเจ็บที่ไตอุดกั้น หนูเมาส์ UUO 1 กลุ่มได้รับ rhMG53 (2 มก./กก.) ผ่านการฉีดหลอดเลือดดำหางโดยเริ่มทันทีหลังการผ่าตัด UUO (วันที่ 0) และให้ทุกวันเป็นเวลา 7 วัน โดย 2 วัน ปริมาณเพิ่มเติมในวันที่ 9 และ 11 กลุ่มควบคุมของหนู UUO ได้รับการฉีดน้ำเกลือตามกำหนดการเดียวกัน หนูถูกฆ่าในวันที่ 12 หลังการผ่าตัด UUO ไตถูกทำให้บริสุทธิ์ในแหล่งกำเนิดด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต และเก็บตัวอย่างเนื้อเยื่อจากไต UUO และไตที่ตรงกันข้ามเพื่อตรวจเนื้อเยื่อวิทยาและการวิเคราะห์ Western blot

ในการศึกษาแยกกัน WT และ mg53^-/-หนูได้รับการผ่าตัด UUO หรือหลอกและเสียชีวิตในวันที่ 7 หลังการผ่าตัด MG53 ถูกให้กับหนูเมาส์โดยใช้วิธีการบำบัดที่อาศัยเซลล์39 มาโครฟาจ RAW 264.7 ติดเชื้อด้วยอนุภาคไวรัสของเชอรี่ Ad tPA-MG53-ที่ขึ้นกับด็อกซีไซคลิน (DOX) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ที่ติดเชื้อ (ที่ความเข้มข้น {0}} /10{0 มล. น้ำเกลือต่อหนูเมาส์) ถูกฉีดหลอดเลือดดำหางเข้าไปในหนูทันทีหลังการผ่าตัด (วันที่ 0) หนูได้รับการฉีด Ad-tPA-MG53 ที่ทรานส์ดิวซ์เซลล์ RAW 4 ครั้งในวันที่ 0, 1, 3 และ 6 ทันทีหลังจากวันที่ 0 การฉีดเซลล์ หนูจะถูกสุ่มในกลุ่มที่ได้รับและกลุ่มที่ไม่ได้รับ DOX (2 มก./มล. ในสารละลายซูโครส 5 เปอร์เซ็นต์) ในน้ำดื่มเป็นเวลา 7 วัน แล้วจึงฆ่า เก็บตัวอย่างเนื้อเยื่อจากไต UUO และไตที่ตรงกันข้ามเพื่อวิเคราะห์เนื้อเยื่อวิทยา RNA และโปรตีน

การวิเคราะห์ทางสถิติ ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย -SD การเปรียบเทียบภายในกลุ่มดำเนินการโดยใช้การทดสอบ t ของนักเรียนเมื่อเปรียบเทียบการวิจัยพื้นฐานเชิงทดลอง 2 รายการ H Li et al.: MG53 ปรับ NF-kB ในการเกิดพังผืดในไต 2 Kidney International (2021) -, --groups และ 1-การวิเคราะห์ความแปรปรวนมากกว่า 2 กลุ่ม (Graphpad Prism 8.2; GraphPad) ตามด้วย Bonferroni หรือ Holm-Sidak การทดสอบเปรียบเทียบหลายรายการเฉพาะกิจ ค่า P <0.05>

วิธีการเสริม วิธีการทั้งหมดรวมถึงการประเมินทางจุลพยาธิวิทยา การวัดค่าครีเอตินินในเลือด การสร้างพลาสมิด การเพาะเลี้ยงเซลล์และการแยกเซลล์เยื่อบุผิวท่อปฐมภูมิ การเตรียมอะดีโนไวรัสและการติดเชื้อในเซลล์ การทดสอบการเคลื่อนตัวของนิวเคลียส NF kB p65 อิมมูโนฮิสโตเคมีและภาพคอนโฟคอล การทดสอบ NF-kB luciferase รีพอร์ต ไซโตไคน์ การทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ การแยกส่วนเนื้อเยื่อ การทำให้อิมมูโนบล็อตติง การตกตะกอนร่วม ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (ตารางเสริม S1) และการผลิต rhMG53 อยู่ในวิธีการเสริม

สารสกัดจาก cistanche tubulosa: รักษาโรคไต

ผลลัพธ์

หนูที่มี MG53 ระเหยจะทำให้เกิดพังผืดในไตตามอายุ

เราเปรียบเทียบผลของอายุที่มีต่อการทำงานของไตและการเกิดพังผืดใน mg53^-/-และหนู WT เรายืนยันการสังเกตครั้งก่อนของเราว่าแม้ว่าระดับครีเอตินีนในซีรัมของหนูเมาส์อายุน้อย (2 เดือน) ที่มีและไม่มี MG53 จะไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ แต่ที่มีอายุมากกว่า (16–20 เดือน) มก.53-/-หนูเมาส์แสดงครีเอตินีนในซีรัมที่สูงกว่ากลุ่มควบคุม WT ที่จับคู่ตามอายุอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1a) จากการย้อมสีไตรโครม เราพบว่า mg53-/-หนูเมาส์มีพังผืดในไตมากกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับหนูเมาส์ WT โดยเริ่มตั้งแต่อายุ 5 เดือนและต่อเนื่องไปจนถึงอายุ 20 เดือน (รูปที่ 1b และ c) การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีคอลถูกใช้เพื่อประเมินผลกระทบของการระเหยของ MG53 ต่อการแทรกซึมของเม็ดเลือดขาว, โมโนไซต์ และมาโครฟาจในไตของหนูเมาส์อายุ 2-เดือนและ 5-เดือน (รูปที่ 1d และ e) ไตจาก WT และ mg ในหนูน้อยมีระดับเม็ดเลือดขาวในไตใกล้เคียงกัน แต่พบเซลล์ที่มีการอักเสบใน mg53 / ไตมากกว่าไต WT ในหนูอายุ 5- เดือน

นอกจากนี้ อิมมูโนฮิสโตเคมีสำหรับแอคตินของกล้ามเนื้อเรียบและไฟโบรเนกติน ซึ่งเป็นโปรตีนเมทริกซ์นอกเซลล์ 2 ชนิดที่พบได้ทั่วไปในบริเวณที่เป็นพังผืดในไต แสดงให้เห็นการย้อมสีที่เพิ่มขึ้น (3- ถึง 8-เท่า) ในโกลเมอรูไลและทูบูโลอินเทอร์สตีเชียมของไตจาก { {4}}มก.อายุหนึ่งเดือน53-/- หนูเมาส์เปรียบเทียบกับ 10-หนู WT อายุเดือน (รูปที่ S1) เสริม

UUO ทำให้เกิดการอักเสบของไตที่รุนแรงขึ้นและการเกิดพังผืดในมก.53-/- ระดับไต MG53 ในหนูเมาส์ที่ตรวจพบโดย immunoblotting เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ 7 วันหลังจาก UUO (รูปที่ 2a) ไต mg53- /- UUO แสดงการเกิดพังผืดที่เกินจริง โดยมีพื้นที่ที่ย้อมด้วยไตรโครมเพิ่มขึ้น 30 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเทียบกับไต WT UUO (รูปที่ 2b)

MG53 ปรับการเปิดใช้งาน NF-kB และการแปลตำแหน่งนิวเคลียร์ p65

กิจกรรมของ NF-kB (p65) ถูกประเมินในแบบจำลอง UUO จำนวน p65 ทั้งหมด (t-p65) เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในไต UUO จาก WT และ mg53 / หนู แต่การกระตุ้น NF-kB ซึ่งประเมินว่าเป็น phosphorylation ของ p65 นั้นมากกว่า (16- เท่า) ใน mg53 / UUO ไตมากกว่าไต WT UUO (2-เท่า) เมื่อเปรียบเทียบกับสัตว์ที่ทำเลียนแบบ (รูปที่ 3a) เราวิเคราะห์ระดับ RNA สัมพัทธ์ของการเปลี่ยนแปลงปัจจัยการเจริญเติบโต b1 (TGF-b1) ตัวยับยั้งการกระตุ้นพลาสมิโนเจน-1 (PAI-1) และคอลลาเจนชนิดที่ 1 อัลฟา 1 (Col1a1) ในไตที่อุดตัน 40 เรา ตรวจพบการแสดงออกของยีนในระดับต่ำในสัตว์หลอกลวงและการชักนำที่คล้ายกัน (TGF-b1, w10 เท่า; PAI-1, w40 เท่า; Col1a1, w40 เท่า) ในไต UUO จาก WT และ mg53 / (รูปที่ 3b) เพื่อตรวจสอบการกระจายเชิงพื้นที่ของ MG53 ในเยื่อหุ้มสมองไตภายใต้สภาวะปกติ ได้ทำการวิเคราะห์เศษส่วนของเนื้อเยื่อไต เราได้รับโปรตีน cytosol ทั้งหมด 10- เท่ามากกว่าโปรตีนนิวเคลียร์ที่สกัดได้ทั้งหมดเป็นประจำ ระดับ t-p65 สามารถเปรียบเทียบกันได้ในเศษส่วนของเซลล์ระหว่าง WT และ mg53-/- หนูเมาส์ แต่มีค่ามากกว่าในส่วนเศษนิวเคลียร์ของ mg53-/- หนูเมาส์ (รูปที่ 3c) ตรวจพบ MG53 ในส่วนของไซโตซอล (โดยมีทูบูลินเป็นตัวบ่งชี้ไซโตซอล) โดยไม่คาดคิด ตรวจพบ MG53 จำนวนมากที่เศษนิวเคลียร์ (โดยมีฮิสโตน H3 เป็นเครื่องหมายเศษส่วนนิวเคลียร์) โดยไม่คาดคิด

เพื่อยืนยันการค้นพบนี้ เรายังตรวจสอบการแปล MG53 ในเศษส่วนของกล้ามเนื้อโครงร่าง (รูปที่ S2) เพิ่มเติม เราทำซ้ำการศึกษาก่อนหน้านี้ของเราซึ่ง MG53 แปลเป็นภาษาท้องถิ่นไปยังไซโทซอลและเยื่อหุ้มเซลล์ซาร์โคเลมมาล (โซเดียม-โพแทสเซียมอะดีโนซีน ทริปฟอสฟาเตสเป็นเครื่องหมายของเศษส่วนของเมมเบรน)22,23,25 แต่ยังตรวจพบ MG53 นิวเคลียร์ที่เสริมสมรรถนะจากกล้ามเนื้อโครงร่าง

MG53 ทำปฏิกิริยากับ p65 เพื่อควบคุมกิจกรรมการถอดรหัสที่เหนี่ยวนำโดยปัจจัยการตายของเนื้องอก เพื่อยืนยันผลการแยกส่วนเนื้อเยื่อของเรา เราได้ทำการศึกษาอิมมูโนฮิสโตเคมีต่อไปนี้ ในเซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้เคียง WT ที่เพาะเลี้ยง พบ p65 ส่วนใหญ่ในไซโทซอลแต่ถูกจำกัดตำแหน่งเป็นนิวเคลียสในกรณีที่ไม่มี MG53 (รูปที่ 4a) เมื่อเซลล์เหล่านี้ได้รับการบำบัดด้วย LPS (5 มก.) เป็นเวลา 8 ชั่วโมง การหลั่งไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน mg53 / เซลล์มากกว่าเซลล์ WT (รูปที่ 4b)

เนื่องจากข้อมูลเหล่านี้แนะนำว่า MG53 อาจโต้ตอบกับ p65 เพื่อควบคุมการแสดงออกของไซโตไคน์ที่ทำให้เกิดการอักเสบ อันตรกิริยาโดยตรงระหว่าง p65 และ MG53 ถูกประเมินโดยการสอบวิเคราะห์ coimmunoprecipitation โดยใช้เซลล์ HEK293 ที่ทรานส์เฟกร่วมกับ Flag-p65 และ HA-MG53 เราแสดงให้เห็นถึงปฏิสัมพันธ์ที่อ่อนแอ (รูปที่ 4c) โคทรานส์เฟกชันของพลาสมิด GFP-p65 และ RFP-MG53 และการวิเคราะห์คอนโฟคอลยืนยันการโคโลคัลไลเซชันของ p65 และ MG53 (รูปที่ 4d) จากนั้นเราหาปริมาณว่า MG53 ส่งผลต่อกิจกรรมการถอดรหัส NF-kB (p65) หรือไม่หลังการกระตุ้น TNF โดยการวัดกิจกรรมของลูซิเฟอเรสจาก NF-kB/293-สายเซลล์รายงานการถอดรหัส GFP-Luc ที่เสถียรซึ่งถูกทรานส์เฟกชั่วคราวด้วยเวกเตอร์ pHM6 หรือ HA-MG53 เซลล์ผู้รายงานประกอบด้วยการแสดงออกของ lentivirus ที่แปลงสัญญาณแล้ว นักข่าว luciferase หิ่งห้อย ขับเคลื่อนโดยโปรโมเตอร์ cytomegalovirus ที่น้อยที่สุดร่วมกับสำเนา 4 สำเนาขององค์ประกอบการตอบสนองการถอดรหัส NF-kB (ไซต์ kB) ที่เป็นเอกฉันท์ ในกรณีที่ไม่มี TNF-a มีกิจกรรมของลูซิเฟอเรสภายในที่ต่ำมากที่ตรวจพบในเซลล์ผู้รายงานซึ่งแสดงออกโปรตีน MG53 MG53 ยับยั้งกิจกรรมการถอดรหัส TNF-a–elicited NF-kB (p65) โดยประมาณ 40 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 4e)

การแสดงออกของ MG53 มากเกินไปทำให้ NF-kB p65 เกิดการเคลื่อนตัวของนิวเคลียสเมื่อทำการบำบัดด้วย TNF-a NF-kB p65 ถูกย้ายไปยังนิวเคลียสตามการบำบัดด้วย TNF-a ในเยื่อบุผิวของท่อไตใกล้เคียง 41 เพื่อสำรวจว่าการรักษาด้วย MG53 สามารถลดทอน NF-kB p65 การเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ได้หรือไม่ เมื่อกระตุ้น TNF-a เราแสดงออก MG53 มากเกินไปในเซลล์ HKC-8 ผ่านการถ่ายทอดไวรัส Ad-tPA-MG53 ที่ขึ้นกับ DOX หรือผ่านการบำบัดด้วย MG53 ของมนุษย์ลูกผสม (rhMG53) การใช้โมโนโคลนัลแอนติบอดีจำเพาะ MG53- หลังจากการเหนี่ยวนำ MG53 ที่ขึ้นกับ DOX ถูกตรวจพบโดยอิมมูโนบล็อตติง MG53 มีอยู่ในระดับที่สูงมากในเซลล์ Ad-tPA-MG53 ที่ทรานส์ดิวซ์ HKC-8

เทียบเท่ากับ 1 ng rhMG53/mg เซลลูลาร์ไลเสต ในทางตรงกันข้าม HKC-8 ใช้และแสดงปริมาณ rhMG53 ที่น้อยกว่ามาก (รูปที่ 5a) การดูดซึมของ rhMG53 ที่ติดฉลากเรืองแสง FL โดย HKC-8 ได้รับการยืนยันโดยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล (รูปที่ S3) เสริม หลังการบำบัด TNF-a เวลาในการกระตุ้น p65 สูงสุดคือ 15 ถึง 30 นาที (รูปที่ 5b) ภายใต้สภาวะที่เป็นเบส NF-kB p65 ส่วนใหญ่อยู่ในไซโทซอล และการแสดงออกที่มากเกินไปของ MG53 ไม่ได้เปลี่ยนแปลงสิ่งนี้ (รูปที่ 5c และ d) อย่างไรก็ตาม หลังการกระตุ้น TNF-a, p65 ถูกย้ายไปยังนิวเคลียสในเซลล์ HKC-8 ที่ไม่แสดงออก MG53 มากเกินไป ในการเปรียบเทียบ การเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ของ p65 ลดลง 33 เปอร์เซ็นต์ (เซลล์ที่กำหนด rhMG53) เป็น 50 เปอร์เซ็นต์ (เซลล์ที่ทรานส์ดิวซ์ให้ DOX) ในเซลล์ที่แสดงการแสดงออกของ MG53 มากเกินไป (รูปที่ 5c และ d)

การถ่ายโอนเซลล์ RAW ที่ออกแบบทางวิศวกรรมมาใช้ในแบบจำลอง UUOmouse ได้ดำเนินการด้วยเซลล์ 1 - 106 เซลล์ที่บริหารผ่านการฉีดหลอดเลือดดำส่วนหางทันทีหลังการผ่าตัด UUO หนูถูกสุ่มแบ่งออกเป็นกลุ่มที่ได้รับน้ำดื่มปกติ (-DOX) และกลุ่มที่ได้รับ DOX (2 มก./มล.) ในน้ำดื่ม หนู UUO ได้รับ RAW วันเว้นวัน รวมเป็น 4 เข็มฉีดยา ไตถูกเก็บเกี่ยว 7 วันหลังการผ่าตัด

หนูที่ผสม RAW ทางวิศวกรรมตามด้วยการเหนี่ยวนำ DOX แสดงผลการเกิดพังผืดในไตลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (ร้อยละ 30) เมื่อเทียบกับกลุ่มที่ไม่ได้รับเซลล์หรือเซลล์ที่ผสมด้วยเซลล์ RAW ที่ออกแบบ แต่ไม่มีการกระตุ้น Dox (พื้นที่ไฟโบรติกร้อยละ 66; รูปที่ 6a และ b)

RAW/Ad-tPA-MG53 มีประชากรเพียงเล็กน้อยเท่านั้นที่รอดชีวิตจากการเฝ้าระวังระบบ reticuloendothelial เมื่อสิ้นสุดการทดลอง การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมียืนยันว่าการแสดงออกของ MG53 ที่อาศัย RAW ที่เหนี่ยวนำด้วยการบำบัด DOX ในไต (รูปที่ 6c) ที่น่าสนใจคือ ไต UUO จากหนูที่ผสม RAW และ MG53 ที่เกิดจาก DOX มีอัตราส่วน p-65/t-p65 ที่ต่ำกว่า (ประมาณ 40 เปอร์เซ็นต์) เมื่อเทียบกับผู้ที่ไม่ได้รับ RAW หรือผู้ที่ได้รับ RAW โดยไม่มี DOX (รูปที่ 6d และ e) ระดับ p-p65 ที่ลดลงได้รับการยืนยันด้วยการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมี p-p65 (S536) ของไต UUO (รูปที่ 6f) เราคิดว่าการหมุนเวียน MG53 ที่ส่งโดย Raw/Ad-tPA-MG53/þDOX และการดูดซึมโดยเซลล์ท่อไตใกล้เคียงอาจมีส่วนร่วมในการลด p-p65 (S536) และลดการอักเสบของไต UUO เมื่อเทียบกับไต UUO เท่านั้น การแสดงออกของ TGF-b1, PAI- 1 และ Col1a1 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในไต UUO จากหนูเมาส์ที่ผสม RAW โดยไม่มี DOX (ไม่มีการเหนี่ยวนำ MG53) การเพิ่มขึ้นของยีน profibrotic เหล่านี้อาจเกิดจากการชักนำให้เกิดปฏิกิริยา allograft ที่รุนแรงจากเซลล์ที่ผสมเข้าไปในหนูที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง อย่างไรก็ตาม ไต UUO จากหนูที่ผสม RAW และให้ DOX (การเหนี่ยวนำ MG53) แสดง PAI-1 ที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (ลดลง 60 เปอร์เซ็นต์ –72 เปอร์เซ็นต์) และระดับ TGF-b1 และ Col1a1 ที่ค่อนข้างต่ำกว่าในหนูที่ไม่ได้รับการรักษาด้วย DOX (รูปที่ 6g).

การบริหาร rhMG53 อย่างเป็นระบบช่วยลดการกระตุ้น NF-kB และการพัฒนาพังผืดในหนูที่ได้รับ UUO

เราทดสอบว่า rhMG53 แสดงผล antifibrotic ที่คล้ายกันกับการบำบัดด้วยเซลล์ RAW ที่ออกแบบตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้หรือไม่ ข้อมูลทางเภสัชจลนศาสตร์ก่อนหน้าของเราบ่งชี้ว่าครึ่งชีวิตที่สั้นและหมุนเวียนได้ (ประมาณ 90 นาทีในหนู) ของ rhMG53.42 หนูสามารถทนต่อการบริหารแบบเรื้อรังที่ 2 ถึง 6 มก./กก.

rhMG5326,37 ดังนั้นกลยุทธ์การบริหารให้ที่แสดงไว้ในรูปที่ 7a ถูกใช้ หนู UUO ถูกสุ่มให้กระสายยา (น้ำเกลือ) หรือ rhMG53 (2 มก./กก.) ทุกวันในช่วง 7 วันแรกหลังการผ่าตัด และวันเว้นวันจนกว่าพวกมันจะเสียชีวิตในวันที่ 12 ไตหลอกและไตข้างตรงข้ามแสดงค่า t-p65 ที่เทียบเท่าโดยประมาณ และระดับการแสดงออกของไฟโบรเนกติน โดยระดับ p-p65 เพิ่มขึ้นเล็กน้อยในไตที่ตรงกันข้ามกับไตเมื่อเปรียบเทียบกับไตปลอม หลังจาก UUO ไต t-p65 เพิ่มขึ้น เมื่อเทียบกับสัตว์ที่ได้รับน้ำเกลือ อัตราส่วน p-65/t-p65 ในไต UUO ของสัตว์ที่ได้รับ rhMG53- ลดลงประมาณ 37 เปอร์เซ็นต์ ในขณะที่ IkBa เพิ่มขึ้นประมาณ 27 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 7b และ ค). นอกจากนี้ ไฟโบรเนกตินลดลงประมาณ 33 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 7b และ c) อิมมูโนฮิสโตเคมียืนยันว่า rhMG53 มีอยู่ในไต UUO หลังการรักษา (รูปที่ 7d) การเกิดพังผืดทั้งหมดลดลงในไต UUO ที่บำบัด rhMG53- (รูปที่ 7e) อย่างไรก็ตาม การแสดงออกของ RNA ของ TGF-b1, PAI-1 และ Col1a1 มีความคล้ายคลึงกันในหนูที่บำบัดด้วยน้ำเกลือหรือ rhMG53 (รูปที่ 7f)

cistanche มีประสิทธิภาพในการรักษาความผิดปกติของไต

อภิปรายผล

MG53 เป็นโปรตีน TRIM ที่อุดมด้วยกล้ามเนื้อ ซึ่งแรกเริ่มระบุว่าเป็นส่วนประกอบที่โดดเด่นของเครื่องจักรซ่อมแซมเมมเบรนในพลาสมา22,26,42,43 อย่างไรก็ตาม การกระทำของ MG53 ไม่ได้จำกัดอยู่ที่กล้ามเนื้อโครงร่าง และ MG53 จะถูกปล่อยสู่กระแสเลือดในลักษณะ myokine.32 ก่อนหน้านี้ เราได้แสดงให้เห็นแล้วว่า MG53 สามารถควบคุมการอักเสบระหว่างความเสียหายของเนื้อเยื่อในอวัยวะที่อยู่ห่างไกลได้27,29,33,35–37 การตรวจสอบในปัจจุบันได้ขยายขอบเขตของการป้องกันอวัยวะที่เป็นสื่อกลางของ MG53-ไปยังไต เราสรุปได้ว่า MG53 สามารถลดการอักเสบในไตและการเกิดพังผืดของไตได้โดยการปิดกั้นการกระตุ้นที่เหนี่ยวนำโดยไซโตไคน์ของปัจจัยการถอดรหัสโปรไฟโบรติก NF-kB ข้อสรุปนี้ขึ้นอยู่กับข้อสังเกตต่อไปนี้: (i) การลบทางพันธุกรรมของ MG53 ในหนูปกติ

ส่งผลให้การทำงานของไตลดลงเมื่อหนูอายุมากขึ้นซึ่งมาพร้อมกับการเพิ่มขึ้นของการเกิดพังผืดในไตและการแทรกซึมของไตโดยเม็ดเลือดขาวและแมคโครฟาจ (ii) ในรูปแบบการบาดเจ็บที่ไตของ UUO ของหนู ไตที่อุดกั้นของ MG53-หนูที่บกพร่องแสดงการเกิดพังผืดและการอักเสบมากกว่า MG53-หนูที่ประกอบด้วยกัน; (iii) TNF-a และอินเตอร์ลิวคิน-6การผลิตโดยเซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้เคียงที่บำบัดด้วย LPS ถูกทำให้อ่อนฤทธิ์ในการมีอยู่ของ MG53; (iv) การบำบัดด้วยหรือการแสดงออกที่มากเกินไปของ MG53 ในเซลล์เยื่อบุผิวที่มีท่อใกล้เคียงทำให้การกระตุ้น NF-kB ที่เหนี่ยวนำโดย TNFa ลดลงโดยการปิดกั้นการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ของส่วนประกอบ p65 ของ-kB (พบว่า MG53 จับโดยตรงกับ p65 แม้ว่าจะอ่อนแอ); และ (v) phosphorylation ของ p65 ซึ่งเป็นขั้นตอนที่จำเป็นในการกระตุ้น NF-kB ลดลงในไตที่อุดตันของหนู UUO ที่ได้รับการรักษาด้วย recombinant MG53 ซึ่งกระตุ้นให้เกิดการแสดงออกของ MG53 มากเกินไปในมาโครฟาจ นอกจากนี้ IkBa ตัวยับยั้งการกระตุ้น NF-kB เพิ่มขึ้นในไตที่อุดตันของหนู UUO ที่ฉีดด้วย recombinantMG53

การลบทางพันธุกรรมของ MG53 ในหนูปกตินั้นอนุญาตให้มีผลข้างเคียงจากอายุที่มากขึ้นในไต นี่แสดงให้เห็นว่าการปรากฏตัวของ MG53 ภายนอกนั้นให้การปกป้องในระดับพื้นฐานในช่วงอายุมากขึ้น ในทำนองเดียวกันการสูญเสีย MG53 ภายนอกทำให้ AKI เกิดการอุดตันที่แย่ลง ไตของ UUO สะสม MG53 ซึ่งอาจสะท้อนการทำงานของ myokine ระยะไกลจากกล้ามเนื้อโครงร่าง ยังคงไม่ชัดเจนว่าจะคัดเลือกกล้ามเนื้อ MG53 ไปที่ไตระหว่างการบาดเจ็บอย่างไร อย่างไรก็ตาม ไตที่เสียหายมักจะเกิดภาวะขาดออกซิเจนและเกิดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน^44,45สัญญาณที่สามารถใช้ในการรับสมัคร MG53 ถ้าเป็นเช่นนั้น แกน "เซลล์กล้ามเนื้อ-ไต-ภูมิคุ้มกัน" นี้สามารถใช้ประโยชน์เพื่อลดความเสียหายของไตได้46 อีกวิธีหนึ่ง เซลล์ไตแสดงระดับ MG53 ต่ำที่การตรวจวัดพื้นฐาน²⁶และในระหว่างการบาดเจ็บเฉียบพลันหรือเรื้อรัง การผลิต MG53 สามารถควบคุมได้

NF-kB เป็นตัวขับเคลื่อนการถอดรหัสที่โดดเด่นของการอักเสบและการเกิดพังผืดในการบาดเจ็บที่ไตและอายุ^14,17,47,48เราได้รับแจ้งให้ตรวจสอบว่าผลกระทบของ MG53 สามารถไกล่เกลี่ยผ่าน NF-kB ได้หรือไม่ เนื่องจากการมีอยู่ของ MG53 ในช่องนิวเคลียร์ของ homogenates ของไตชี้ให้เห็นถึงศักยภาพในการรบกวนการถอดรหัส การโลคัลไลซ์เซชั่นนิวเคลียร์ของ MG53 นั้นไม่เคยมีมาก่อน ในรูปแบบดัดแปลงพันธุกรรมที่แสดง MG53 ของกล้ามเนื้อหัวใจมากเกินไป นิวเคลียร์ MG53 ควบคุมการแสดงออกของตัวรับอัลฟาที่กระตุ้นด้วยเปอร์รอกซิโซม proliferator ที่ระดับการถอดรหัสและการเผาผลาญไขมันในหัวใจที่ได้รับผลกระทบ49 นอกจากนี้ เมื่อเร็ว ๆ นี้เราได้แสดงให้เห็น rhMG53 ยับยั้งการกระตุ้น NF-kB เพื่อลดภาวะหัวใจล้มเหลวที่เกี่ยวข้องกับอายุ โดยการลดไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบ อะพอพโทซิส และความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในคาร์ดิโอไมโอไซต์ที่มีอายุมาก³⁷

กลไกระดับโมเลกุลของวิธีที่ MG53 ปรับการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์/ไซโตพลาสมิก p65 ยังคงไม่ชัดเจน MG53 ไม่มีสัญญาณการโลคัลไลเซชันนิวเคลียร์ แต่มีสัญญาณการส่งออกนิวเคลียร์ที่อุดมด้วยลิวซีนที่ขั้ว N สมมุติฐาน 3 สัญญาณ ซึ่งเป็นบรรทัดฐานที่ได้รับการยอมรับจากการส่งออกโปรตีนส่งออกนิวเคลียร์⁵⁰อันตรกิริยาโดยตรงระหว่าง MG53 และ p65 ค่อนข้างอ่อนเนื่องจากมีผลรบกวนเพียงอย่างเดียวหรือที่สำคัญของ MG53 ต่อการเปิดใช้งาน NF-kB แม้ว่า MG53 ดูเหมือนจะส่งผลกระทบต่อการส่งนิวคลีโอไซโตพลาสมิกแบบไดนามิกของส่วนประกอบที่สำคัญของ NF-kB แต่กลไกที่แน่นอนยังคงต้องถูกหา

ผลลัพธ์ที่สำคัญของ MG53-renoprotection ที่อาศัยสื่อกลางดูเหมือนจะลดการเปลี่ยนแปลงรูปแบบไฟโบรติกผ่านการทำให้อ่อนฤทธิ์ของการอักเสบที่อาศัย NF-kB เป็นสื่อกลาง การเกิดพังผืดในไตเป็นกระบวนการที่ซับซ้อนซึ่งเกี่ยวข้องกับการสะสมทางพยาธิวิทยาของโปรตีน ECM ต่างๆ 51 MG53 ดูเหมือนจะมีผลชัดเจนต่อโปรตีน ECM ฟีโบรเนกติน Fibronectin เพิ่มขึ้นในไต UUO ที่ขาด MG53 และลดลงในหนู UUO ที่ได้รับ MG53 การแสดงออกของโปรตีน ECM อื่นๆ เมื่อมีและไม่มี MG53 นั้นยากที่จะเข้าใจ ก่อนหน้านี้เราแสดงให้เห็นแล้วว่า rhMG53 ควบคุมเชิงลบ TGF-b1/Smad การส่งสัญญาณและยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีน ECM ในการศึกษาในหลอดทดลอง31 ในร่างกาย TGF b1, PAI-1 และการถอดเสียง Col1a1 ไม่ได้เพิ่มขึ้นในไต UUO จาก mg53 / สัตว์ที่ขาดแคลน การถอดเสียงเหล่านี้ลดลงในสัตว์ UUO ที่ชักนำให้แสดงออก MG53 มากเกินไปผ่านการบริหารให้เมาส์ที่เหนี่ยวนำโดยไวรัส

มาโครฟาจ แต่เมื่อให้ MG53 ลูกผสม ไม่เห็นผลกระทบ นี่อาจเป็นกรณีของการให้ยาที่เพียงพอเนื่องจากระดับ MG53 ในไตที่ได้รับนั้นมากกว่ามากในสัตว์ที่ได้รับมาโครฟาจเวคเตอร์เมื่อเทียบกับรีคอมบิแนนท์ MG53 นอกจากนี้ ระดับโปรตีนไม่ได้ถูกวัด และเหตุการณ์หลังการถอดเสียงสามารถปรับเปลี่ยน ECM ใน UUO จำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่ออธิบายบทบาทที่เกิดขึ้นใหม่ของ MG53 ในการปรับโปรตีน ECM จำเพาะ โดยสรุป การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่า myokine อาจช่วยควบคุมการอักเสบที่เส้นพื้นฐานในอวัยวะที่อยู่ห่างไกล เช่น ไต และอาจช่วยในการลดทอนและควบคุมการอักเสบ รูปที่ 8 นำเสนอแบบจำลองการทำงานของบทบาทของ MG53 ในการป้องกันการฟื้นฟู ระหว่างรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับความเสียหาย (DAMP เช่น TNF-a) และรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับเชื้อโรค (PAMP เช่น LPS) และความเครียดจากการขาดเลือด สัญญาณ NF-kB จะถูกกระตุ้นในไต MG53 ปกป้องไตโดยการยับยั้งฟอสโฟรีเลชั่นและการกระตุ้นการส่งสัญญาณ NF-kB ทำให้ IkBa เสถียร และลดการเคลื่อนที่ของนิวเคลียร์ p65 ขัดขวางการเปิดใช้งานโปรแกรมกระตุ้นการอักเสบ แม้ว่า MG53 ภายนอกอาจเป็นสื่อกลางในผลกระทบเหล่านี้ แต่เราขอแนะนำว่าอาจมีการป้องกันที่แข็งแกร่งกว่านี้โดยใช้ MG53 ในการบำบัด ซึ่งเป็นไปได้โดยอิงตามความสามารถของ MG53 จากภายนอกเพื่อลดการบาดเจ็บใน UUO ควรมีการตรวจสอบเพิ่มเติมเพื่อทำความเข้าใจว่า myokine นี้สามารถใช้ประโยชน์ทางคลินิกได้อย่างไร

ประโยชน์ของ cistanche: ปกป้องตับและป้องกันไฟโบรซิส

การเปิดเผยข้อมูล

JM มีส่วนได้เสียใน TRIM-edicine, Inc. ซึ่งพัฒนา rhMG53 สำหรับการรักษาโรคของมนุษย์ สิทธิบัตรการใช้ MG53 จัดขึ้นโดย Rutgers University และ The Ohio State University ผู้เขียนคนอื่น ๆ ทั้งหมดประกาศว่าไม่มีผลประโยชน์ที่แข่งขันกัน

กิตติกรรมประกาศ

งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดยสถาบันสุขภาพแห่งชาติ (NIH) R01-DK106394 (JM, BHR และ P-HL) และ NIH R01-AG062896 (P-HL และBHR) โครงการนี้ยังได้รับการสนับสนุนบางส่วนโดยกองทุนล็อควูดภายในจากมหาวิทยาลัยแห่งรัฐโอไฮโอ (P-HL) และรางวัลจาก National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS; P-HL หมายเลขรางวัล UL1TR002733) เนื้อหาเป็นความรับผิดชอบของผู้เขียนแต่เพียงผู้เดียว และไม่จำเป็นต้องแสดงถึงความคิดเห็นอย่างเป็นทางการของ NCATS หรือ NIH

ผู้เขียนร่วมHL,

PD, P-HL, JM และ BHR คิดและ/หรือออกแบบการศึกษา HL, PD, P-HL, ZL และ XZ ดำเนินการทดลอง รับข้อมูล และทำการวิเคราะห์ข้อมูล PD, P-HL และ BHR ตีความผลลัพธ์ และ P-HL และ BHR ได้ร่าง แก้ไข และอนุมัติต้นฉบับ ผู้เขียนทุกคนอ่านและอนุมัติเวอร์ชันสุดท้าย

วัสดุเสริม

ไฟล์เสริม (PDF) วิธีการเสริม

ตาราง S1ลำดับไพรเมอร์ รูปที่ S1 มก.53-/- หนูเมาส์แสดงการสะสมโปรตีน ECM ที่เพิ่มขึ้น เนื้อเยื่อไตที่ตรงกับอายุ (อายุ 10 เดือน) ชนิดพันธุ์ป่า (WT) และมก.53- /- ย้อมด้วย 40 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; สีน้ำเงิน แผงด้านซ้าย), ก- กล้ามเนื้อเรียบ แอคติน (SMA; สีเขียว, แผงที่สอง), ไฟโบรเนกติน (แผงสีแดง, แผงที่สาม) และการรวม (แผงด้านขวา) แท่ง ¼ 25 มม. การหาปริมาณพื้นที่การเกิดพังผืดของไต (n ¼ 3 ต่อกลุ่ม) ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นวิธีการ -SD แบบทดสอบของนักเรียน ***ป <>

รูปที่ S2การกระจายตัวของกล้ามเนื้อโครงร่าง MG53 ระหว่างนิวเคลียสและไซโตพลาสซึม กล้ามเนื้อโครงร่างที่ได้มาจาก ormg ชนิดพันธุ์ป่า (WT) ormg53-/- หนูเมาส์ถูกแยกส่วนและอิมมูโนบล็อตด้วยแอนติบอดีต้าน MG53 ที่ผลิตขึ้นเอง (3 มก. ไลเสต) และเครื่องหมายการแบ่งเซลล์ (20 มก. ไลเซต) โซเดียมโพแทสเซียมอะดีโนซีน ทริปฟอสฟาเตสถูกใช้เป็นเครื่องหมายของเยื่อหุ้มเซลล์, ฮิสโตน H3 เป็นเครื่องหมายนิวเคลียร์ และทูบูลินเป็นเครื่องหมายของไซโตซอล

รูปที่ S3HKC-8 เซลล์หลอดไตส่วนต้นของไตดูดซับ rhMG53 ที่ติดฉลาก AlexaFluor 647 อย่างจำเพาะ rhMG53 (Trimedicine) และ bovine serum albumin (BSA; ThermoFisher Scientific) ติดฉลากด้วย Alexa Fluor(AF) Antibody Labelling kits (Life Technologies) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต เซลล์ HKC-8 ถูกเพาะเลี้ยงบนจานก้นแก้วของ Delta TPG (Bioptechs Inc.) ในตัวกลางของ Eagle (DMEM) ที่ดัดแปลงของ Dulbecco ด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (FBS) ต่อหน้าโปรตีนที่ติดฉลาก BSA-AF647 (ซ้าย) ) และ rhMG53-AF647 (ขวา) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ภาพ Z-stack ถ่ายจากกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล LSM780 (Zeiss) รูปภาพแสดงเซลล์ที่ด้านล่างของจาน แท่ง ¼ 25 มม.

รูปที่ S4วิศวกรรมเซลล์ RAW เพื่อไกล่เกลี่ย MG53secretion ที่เหนี่ยวนำไม่ได้ (A) เซลล์ RAW ติดเชื้อ Ad-tPA-MG53 เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและบำบัดโดยไม่มี (ด็อกซีไซคลิน [Dox]) หรือด้วย Dox (þDox, 1 มก./มล.) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงเพิ่มเติมเพื่อกระตุ้นการแสดงออกของ tPA-MG53 ภาพคอนโฟคอลแสดงการชักนำของการแสดงออกของ MG53 (แอนติบอดีต้าน MG53 ที่ผลิตขึ้นโดยเฉพาะ สีแดง แผงด้านล่าง) จากเซลล์ RAW ที่เหมือนมาโครฟาจ (การย้อมสี F4/80 สีเขียว แผงด้านบน) แท่ง ¼ 25 มม. (B, C) การวิเคราะห์ Western blot ของเซลล์ไลเซท (ในปริมาณ 0.6, 3 และ 6 มก.) สำหรับการแสดงออกที่เหนี่ยวนำของ tPA-MG53 และ MG53 จากเซลล์ RAW ที่ติดเชื้อ (B) และวัฒนธรรมที่เกี่ยวข้อง สารเข้มข้น (ในปริมาตร 2, 5 และ 10มล.) (C) ปริมาณต่างๆ ของ rhMG53 (ในปริมาณ 0.2, 1, 0.05 และ0.025 ng) ถูกบรรจุเป็นมาตรฐาน Mw เครื่องหมายแสดงน้ำหนักโมเลกุล