นามธรรมกระทำ

พื้นหลัง: การศึกษาจำนวนมากขึ้นได้รายงานถึงผลการรักษาของเซลล์ต้นกำเนิดมีเซนไคมอล (MSC) ซึ่งได้มาจาก exosomes ซึ่งมีโปรตีนและ miRNA มีลักษณะเฉพาะ อย่างไรก็ตามโปรไฟล์โปรตีโอมิกส์และ miRNA ของ exosomes ที่ได้จากเซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อนมนุษย์ (hESCs) และเซลล์ต้นกำเนิด pluripotent ที่เกิดจากมนุษย์ (hiPSCs) ยังไม่ชัดเจน

Glycoside ของ cistanche ยังสามารถเพิ่มกิจกรรมของ SOD ในเนื้อเยื่อหัวใจและตับ และลดปริมาณของ lipofuscin และ MDA ในแต่ละเนื้อเยื่อได้อย่างมีประสิทธิภาพ กำจัดอนุมูลออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยาต่างๆ (OH-, H₂O₂ ฯลฯ) ได้อย่างมีประสิทธิภาพ และป้องกันความเสียหายของ DNA ที่เกิดขึ้น โดย OH-อนุมูล Cistanche phenylethanoid glycosides มีความสามารถในการกำจัดอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่ง ความสามารถในการลดที่สูงกว่าวิตามินซี ปรับปรุงกิจกรรมของ SOD ในการระงับสเปิร์ม ลดปริมาณของ MDA และมีผลป้องกันบางอย่างต่อการทำงานของเยื่อหุ้มสเปิร์ม โพลีแซคคาไรด์ของ Cistanche สามารถเสริมการทำงานของ SOD และ GSH-Px ในเม็ดเลือดแดงและเนื้อเยื่อปอดของหนูทดลองที่ชราภาพซึ่งเกิดจาก D-galactose รวมทั้งลดปริมาณ MDA และคอลลาเจนในปอดและพลาสมา และเพิ่มเนื้อหาของอีลาสติน ส่งผลดีต่อ DPPH, ยืดเวลาการขาดออกซิเจนในหนูชรา, ปรับปรุงกิจกรรมของ SOD ในซีรั่ม, และชะลอการเสื่อมทางสรีรวิทยาของปอดในหนูชราทดลองที่มีความเสื่อมทางสัณฐานวิทยาของเซลล์, การทดลองแสดงให้เห็นว่า Cistanche มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระที่ดี และมีศักยภาพในการเป็นยาป้องกันและรักษาโรคชราทางผิวหนัง ในขณะเดียวกัน echinacoside ใน Cistanche มีความสามารถที่สำคัญในการกำจัดอนุมูลอิสระ DPPH และสามารถกำจัดสายพันธุ์ออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยา ป้องกันการเสื่อมสลายของคอลลาเจนที่เกิดจากอนุมูลอิสระ และยังมีผลการซ่อมแซมที่ดีต่อความเสียหายของแอนไอออนจากอนุมูลอิสระของไทมีน

คลิกที่ Anti-aging Cistanche Powder Bulk

【สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

วิธีการ: ในการศึกษานี้ เราแยกเอกโซโซมจาก hESCs, hiPSCs และเซลล์ต้นกำเนิดมีเซนไคม์จากสายสะดือของมนุษย์ (hUC-MSCs) ผ่านการหมุนเหวี่ยงแบบคลาสสิกและตัวกรอง 0.22-μm ตามด้วยการระบุแบบอนุรักษ์นิยม การติดฉลากแบบแท็กมวลควบคู่กันและการวัดปริมาณเปปไทด์สัมพัทธ์แบบไม่มีฉลากร่วมกันกำหนดโปรตีโอมิกส์ของพวกมัน ดำเนินการจัดลำดับความเร็วสูงเพื่อกำหนดโปรไฟล์ miRNA จากนั้นเราได้ทำการวิเคราะห์ชีวสารสนเทศเพื่อระบุกระบวนการทางชีววิทยาที่โดดเด่นและวิถีทางที่มอดูเลตโดยเอ็กโซโซมคาร์โก้ ในที่สุด Western blot และ RT-qPCR ถูกดำเนินการเพื่อตรวจจับปริมาณโปรตีนและ miRNAs ที่เกิดขึ้นจริงใน exosomes สามประเภท

ผลลัพธ์: จากการศึกษาของเรา สินค้าจากเอ็กโซโซมสามชนิดมีส่วนทำให้เกิดกระบวนการทางชีววิทยาที่ซับซ้อน ในการเปรียบเทียบ hESC exosomes (hESC-Exos) เหนือกว่าในการควบคุมการพัฒนา เมแทบอลิซึม และการต่อต้านริ้วรอย และ exosomes hiPSC (hiPSC-Exos) มีหน้าที่ทางชีววิทยาที่คล้ายคลึงกันกับ hESC-Exos ในขณะที่ exosomes hUC-MSCs (hUC-MSC-Exos) มีส่วนช่วยในการควบคุมภูมิคุ้มกันมากขึ้น

ข้อสรุป: ข้อมูลที่นำเสนอในการศึกษาของเราช่วยกำหนดภูมิทัศน์ของโปรตีนและ miRNA ของ exosomes สามตัว ทำนายการทำงานทางชีวภาพของพวกมันผ่านการวิเคราะห์เครือข่ายอย่างเป็นระบบและครอบคลุมที่ระดับระบบ และเปิดเผยการใช้งานที่เป็นไปได้ตามลำดับในด้านต่างๆ เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการเลือก exosome ในพรีคลินิกและทางคลินิก การทดลอง

คำหลัก: สเต็มเซลล์จากตัวอ่อนมนุษย์, สเต็มเซลล์ที่มี pluripotent จากมนุษย์, สเต็มเซลล์มีเซนไคม์จากสายสะดือของมนุษย์, เอ็กโซโซม, โปรตีโอมิกส์, miRNA

การแนะนำ

Extracellular vesicles (EVs) คือ vesicles ขนาดเล็กที่เซลล์หลั่งออกมาอย่างแข็งขัน ส่วนใหญ่ประกอบด้วย exosomes, microvesicles (MVs) และ apoptotic body [40, 56, 57] กระจายอยู่ทั่วไปในของเหลวในร่างกายหลายชนิด เช่น น้ำลาย น้ำนมแม่ เลือด น้ำไขสันหลัง น้ำดี และปัสสาวะ [57] ในบรรดาพวกมัน exosomes มี lipid bilayer ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 40–200 นาโนเมตร ความหนาแน่นลอยตัวที่ 1.13–1.18 g/ml ในการไล่ระดับน้ำตาลซูโครส และมีรูปร่างคล้ายถ้วยภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน [21, 53] สารออกฤทธิ์ทางชีวภาพต่างๆ รวมทั้งโปรตีน กรดนิวคลีอิก และลิพิด ทำให้ฟังก์ชันการสื่อสารระหว่างเซลล์ของเอกโซโซมระหว่างเซลล์ดีขึ้น [16, 17] bilayer ไขมันเป็นเกราะป้องกันที่ละเอียดอ่อนที่ปกป้องเนื้อหาของ exosomes จากการเสื่อมสภาพของเอนไซม์ของเหลวในร่างกาย [49] เอ็กโซโซมที่เสถียรสามารถเป็นสื่อกลางในกระบวนการทางสรีรวิทยาและพยาธิวิทยาที่ซับซ้อนผ่านกิจกรรมพาราไครน์ รวมถึงการพัฒนาอวัยวะและการสืบพันธุ์ การนำเสนอแอนติเจน การสื่อสารของเซลล์ประสาท การตอบสนองของภูมิคุ้มกัน การควบคุมความชรา และการเพิ่มจำนวนเซลล์ [57, 62]

การก่อตัวและการปลดปล่อยเอ็กโซโซมเป็นกระบวนการที่ได้รับการควบคุมอย่างเต็มที่ และการจัดเรียงของเนื้อหาที่ห่อหุ้มเอ็กโซโซมเกิดขึ้นจากการระดมโปรตีนต่างๆ [22, 47] โปรตีนหลายชนิดมีความสำคัญต่อการสร้าง exosome ซึ่งประกอบด้วย endosomal sorting complex ที่จำเป็นสำหรับการขนส่ง (ESCRT), tetraspanins (CD9, CD63 และ CD81), apoptosis-linked gene 2-อันตรกิริยากับโปรตีน X (Alix) และความไวของเนื้องอก ยีน 101 (TSG101) [38, 55]. การค้าภายในเซลล์ของ exosomes นั้นขับเคลื่อนโดยกิจกรรมร่วมกันของชุดของโปรตีน รวมทั้งการสลับโมเลกุล RAB GTPases และโปรตีนไซโตสเกเลทัล เช่น แอกตินและทูบูลิน [24] ต่อจากนั้น การหลั่ง exosome เสริมด้วย SNARE complex และ synaptotagmin family [22] การวิจัยระบุว่าการแตกหน่อและการหลุดออกของ exosomes นั้นขึ้นอยู่กับกิจกรรมของแคลเซียมและการสรรหา ESCRT [15] ในฐานะผู้ส่งสาร การปลดปล่อย exosome เกี่ยวข้องกับการข้ามทอล์คของเซลล์เพื่อตอบสนองต่อสรีรวิทยาของเซลล์และการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยา เช่น การกระตุ้น การเปลี่ยนแปลงค่า pH การขาดออกซิเจน ความเสียหายจากรังสี หรือความเครียดของเซลล์ [61]

ในการเปิดเผยส่วนประกอบของเอกโซโซมและการทำงานทางสรีรวิทยาและพยาธิวิทยาที่เป็นไปได้ เทคนิคโปรตีโอมิก การถอดเสียง และเทคนิคอื่นๆ มักถูกใช้เพื่อศึกษาเอ็กโซโซมอาร์เอ็นเอและโปรตีนจากสปีชีส์ เนื้อเยื่อ และเซลล์ต่างๆ [44] การวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ของเอ็กโซโซมโดยทั่วไปประกอบด้วยสามขั้นตอน ได้แก่ การแยก การทำให้บริสุทธิ์ และการกำหนดคุณลักษณะของเอ็กโซโซม การระบุส่วนประกอบของโปรตีนโดยใช้แมสสเปกโตรเมตรี และการวิเคราะห์ข้อมูลดิบ [14] สถานะของเซลล์มีผลอย่างมากต่อองค์ประกอบโปรตีนและความอุดมสมบูรณ์ของ exosomes ในปัจจุบัน เทคนิคเชิงปริมาณของโปรตีโอมิกสำหรับการวิเคราะห์ลักษณะเฉพาะของโปรตีนและความอุดมสมบูรณ์ถูกนำมาใช้เพื่ออธิบายกลไกที่อยู่เบื้องหลังการผลิตเอกโซโซม และทำให้เราเข้าใจบทบาททางสรีรวิทยาและพยาธิสภาพของเอ็กโซโซมในเซลล์อย่างลึกซึ้งยิ่งขึ้น [39] ในบรรดาเทคโนโลยีเหล่านั้น เทคโนโลยีโปรตีโอมิกส์เชิงปริมาณที่ใช้แมสสเปกโตรเมทรีใช้กันอย่างแพร่หลาย โดยส่วนใหญ่รวมถึงวิธีการติดฉลากไอโซโทปที่เสถียรและไม่มีฉลาก [13, 42] miRNAs เป็นโมเลกุลที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพขนาดเล็กที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับกิจกรรมต่างๆ ของชีวิต เทคนิคการหาลำดับปริมาณงานสูงนั้นโดดเด่นด้วยความไวและความแม่นยำสูง และมีการใช้งานอย่างกว้างขวางในการจัดลำดับ miRNA (18–30 nt) [6] จากการพัฒนาของเทคโนโลยีในปัจจุบัน จึงไม่มีอุปสรรคในการแยกโปรตีนและโปรไฟล์ miRNA ของ exosomes

hESCs และ hiPSCs มีศักยภาพในการสร้างความแตกต่างสูง [36] อย่างไรก็ตาม การนำไปใช้โดยตรงกับการรักษามีข้อจำกัดเนื่องจากความเสี่ยงของมะเร็งและปัญหาด้านจริยธรรม [31] ในทางตรงกันข้าม mesenchymal stem cells (MSCs) มีการใช้งานที่กว้างกว่าสำหรับการแทรกแซงในโรคต่างๆ ในสถานพยาบาล [8] อย่างไรก็ตาม การใช้โดยตรงยังคงมีข้อจำกัดหลายประการ รวมถึงอัตราการรอดชีวิตต่ำ การปฏิเสธทางภูมิคุ้มกัน และปัญหาด้านความปลอดภัย [8, 43] ปัจจุบัน exosomes ได้รับความสนใจอย่างมากเนื่องจากความปลอดภัยทางชีวภาพ ความเสถียร ไม่เกิด aneuploidy และภูมิคุ้มกันต่ำ [51] การศึกษาก่อนหน้านี้ได้บันทึกการเปรียบเทียบส่วนประกอบของ MSCs ที่ได้มาจากเนื้อเยื่อต่างๆ และ exosomes ที่มีโปรไฟล์โปรตีโอมิกและ miRNA [59] ฆ้อง และคณะ ยังแสดงภาพเครือข่ายการกำกับดูแลของถุงนอกเซลล์ hESC (EVs) ในแง่ของโปรตีโอม แต่เฉพาะในเส้นทางที่เกี่ยวข้องกับการแก่ชราโดยไม่เน้นที่ส่วนอื่น [19] Questa และคณะ ทอ EV proteomic atlas ของ hiPSCs ที่ได้มาจากเซลล์ไฟโบรบลาสต์ของหนังหุ้มปลาย (HFFs) [45] แม้ว่าการศึกษาเหล่านี้จะรายงานส่วนประกอบโปรตีนของ EV บางส่วน แต่พวกเขาไม่ได้มุ่งเน้นไปที่ exosomes เพียงอย่างเดียว และการวิเคราะห์โปรตีโอมิกที่ครอบคลุมนั้นไม่ได้ระบุอย่างชัดเจน โดยเฉพาะอย่างยิ่ง โปรไฟล์ miRNA ยังไม่ได้รับการอธิบาย เพื่อจัดการกับปัญหานี้ exosomes ที่แยกได้จาก hESCs, hiPSCs และ hUC-MSCs ได้รับเลือกในการศึกษาปัจจุบันสำหรับการตรวจสอบเพิ่มเติมที่กำหนดเป้าหมายโปรไฟล์ proteome และ miRNA เพื่อรับข้อมูลเชิงลึกใหม่สำหรับการวิจัยและการประยุกต์ใช้ทางคลินิก

วิธีการ

การเตรียมและลักษณะของ exosomes

hESCs และ hiPSCs ถูกเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ ncTarget (cat. no. RP01020; Nuwacell. Ltd, China) ในขณะที่ hUC-MSCs รุ่นที่ 3 ถูกเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ hMSC ที่ปราศจากซีรั่ม (cat. no. RP02010; Nuwacell. Ltd, จีน). ถัดไป 350 มล. ของส่วนเหนือตะกอนของเซลล์ในระยะการเจริญเติบโตแบบลอการิทึม (การไหลมารวมกันประมาณ 80 เปอร์เซ็นต์) ถูกรวบรวมสำหรับการทำให้บริสุทธิ์จากภายนอก เอ็กโซโซมถูกสกัดโดยชุดการหมุนเหวี่ยงและการหมุนเหวี่ยงแบบอุลตร้าที่รู้จักตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [34, 52] โดยสังเขป สื่อปรับอากาศ (CM) ถูกรวบรวมและอยู่ภายใต้การหมุนเหวี่ยงแบบไล่ระดับสี (300×g เป็นเวลา 10 นาที, 2000×g เป็นเวลา 15 นาที, 10, 000}×g เป็นเวลา 30 นาที) เพื่อแยกออกจากกัน เศษเซลล์ Exosomes ถูกอัดเม็ดจากส่วนเหนือตะกอนที่รวบรวมได้ที่ 100, 000×g เป็นเวลา 70 นาทีโดยใช้โรเตอร์ Ti45 (Beckman Coulter, USA) จากนั้นจึงแขวนลอยใหม่ใน PBS สำหรับการกรองครั้งต่อไปโดยใช้ตัวกรองเมมเบรน MF-Millipore™ 0.22-μm (Sigma สหรัฐอเมริกา) ตัวกรองถูกนำไปปั่นเหวี่ยงด้วยอุลตร้าที่ 100, 000×g เป็นเวลา 70 นาที เม็ด exosome สุดท้ายถูกแขวนลอยใหม่ใน PBS สำหรับการวิเคราะห์ครั้งต่อไป ระบบกระจายแสงแบบไดนามิก (DLS) (ไวแอตต์ เทคโนโลยี สหรัฐอเมริกา) ถูกนำมาใช้เพื่อวัดความเข้มข้นและขนาดของเอ็กโซโซมที่แยกได้

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM)

ทำการสแกน TEM เพื่ออธิบายสัณฐานวิทยาของ exosomes ที่แยกได้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ Exosomes ที่แขวนลอยใหม่ (1 ug ใน 10 ul ของ PBS) ถูกปลูกบนตะแกรงทองแดงเคลือบคาร์บอน (200-ตาข่าย) และปล่อยให้ดูดซับไว้เป็นเวลา 2 นาที ตามด้วยการล้างสองครั้งด้วยน้ำกลั่นสองครั้ง จากนั้นกริดถูกย้อมด้วยสารละลายยูเรนิลอะซีเตต 2 เปอร์เซ็นต์ 8 ไมโครลิตรเป็นเวลา 1 นาที หลังจากการอบแห้งตามธรรมชาติ ตัวอย่างถูกตรวจสอบโดยใช้ระบบ Tecnai Spirit (Thermo Fisher, USA) ที่ 120 kV

การกระจายแสงแบบไดนามิก

การกระจายขนาดของเอ็กโซโซมได้รับการอธิบายผ่านการวิเคราะห์การติดตามอนุภาคนาโนโดยใช้ไดนามิกแสงกระจาย (ไวแอตต์เทคโนโลยี สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (271-DPN) ตามที่รายงานก่อนหน้านี้[23] โดยสังเขป เม็ด exosome ถูกแขวนลอยใหม่ใน 100 ไมโครลิตรของ PBS สิบ, 50 ไมโครลิตรของ exosomes ด้านบนถูกเติมลงใน 1,450 ไมโครลิตรของ PBS และหมุนวนเป็นเวลา 30 วินาที เอ็กโซโซม (1.5 มล.) ถูกถ่ายโอนไปยังคิวเวตต์แบบใช้แล้วทิ้งเพื่อการปรับสมดุลที่ 25 องศาเป็นเวลา 30 วินาที ค่าดัชนีหักเหของสารช่วยกระจายตัวคือ 1.37 และทั้ง Z-average และ polydispersity (PDI) กำหนดขนาดของอนุภาคเอกโซโซม วัดแบบไม่ขึ้นกับต้นไม้สำหรับแต่ละตัวอย่าง

การติดฉลากแบบ Tandem Mass Tag (TMT) และการวิเคราะห์ปริมาณเปปไทด์สัมพัทธ์ (LFQ) แบบไม่มีฉลาก

Total protein was extracted from exosomes, and the concentration was quantified using the Bradford method.  The samples were separated by 12.5% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).  The protein suspensions were digested with trypsin (cat.   no. 9002-07-7; Sigma, USA) in 40 μL of tetraethylammonium bromide (TEAB) buffer for 12  h at 37  °C and then labeled with TMTsixplex™ isobaric label reagent set (cat. no. 90061; Thermo Fisher, USA). TMT-labeled peptides were fractionated by reversed-phase chromatography using an Agilent 1260 Infinity II HPLC system  (Agilent Technology, USA). LC-MSC/MS analysis was performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. (Hangzhou,  China). Briefly, the analysis was completed using the combination of a Q Exactive Plus mass spectrometer and Easy nLC (Thermo Fisher, USA). Survey scans were acquired at a resolution of 70,000 at m/z 200. MS/MS   spectra were captured by the MASCOT engine using the built-in software Proteome Discoverer 2.4. Label-free relative peptide quantification analysis was also performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. as previously reported  [27]. Briefly, the digested proteins of exosomes were separated by HPLC and detected by mass spectrometry.  Raw files from technical and biological replicates were filtered, de novo sequenced, and assigned with protein ID   using PEAKS 8.0 by searching against the human SwissProt database. Tree-independent exosome samples were subjected to TMT or label-free assay. The final protein profiles of exosomes were determined by overlapping the data of TMT (mascot score>60, abundance>100 และพี<0.05) and label-free (at least two tests results>0 และ P<0.05).

Differentially expressed proteins (DEPs) were considered valid after the data were normalized by protein loading and differential p-value false discovery rates (FDR) corrected [30]. In particular, the proteins with log2|fold change|>1 (|log2FC|>1) เช่นเดียวกับนัยสำคัญทางสถิติ (P<0.05), were classified as enriched in exosomes.

การวิเคราะห์โปรไฟล์ miRNA

RNA ทั้งหมดสกัดจากเอกโซโซมที่แยกได้โดยใช้ mirVana™ miRNA Isolation Kit (cat. no. AM1560; Thermo Fisher, USA) ตัวอย่าง RNA ได้รับการตรวจสอบคุณภาพสำหรับการทดสอบ miRNA microarray ที่ดำเนินการโดย LC-Bio Technology Co., Ltd. การวิเคราะห์ข้อมูลดิบได้ดำเนินการตามที่รายงานก่อนหน้านี้ [9] miRNAs ที่แสดงออกแตกต่างกันถูกเลือกเป็น miRNAs ของผู้สมัครที่ค่า p<0.05 and |log2FC|>2. Data were omitted if they corresponded to questionable miRNAs, according to previous reports or in-house validated miRNAs [12]. The miRNA target genes were determined by the overlap of prediction of Targetscan and miRanda databases under the restriction of threshold value>90 (Targetscan) และพลังงานว่างสูงสุด<−10 (miRanda).

การวิเคราะห์ชีวสารสนเทศ

ข้อมูลดิบได้รับการวิเคราะห์โดยใช้แพ็คเกจซอฟต์แวร์ Maxquant (v1.6.0) และ Swiss-Prot_ข้อมูลมนุษย์ถูกตั้งค่าเป็นข้อมูลอ้างอิง (โปรตีน 20,600 รายการ) (Proteome ID: UP000005640) . โปรตีนที่ระบุถูกจับคู่กับ Gene Ontology (GO) และ Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ตามการวิเคราะห์ของ KOBAS [60] เพื่อกำหนดคุณสมบัติทางชีวภาพและหน้าที่ ซอฟต์แวร์ Cytoscape และแพ็คเกจ igraph ในซอฟต์แวร์ R (เวอร์ชัน 3.6.1) ถูกใช้เพื่อวาดเครือข่ายที่พันกันของโปรตีน exosome หรือ miRNAs ระหว่างเส้นทางการส่งสัญญาณ

การวิเคราะห์ทางสถิติ

การทดลองทั้งหมดดำเนินการเป็นสามเท่า ความสามารถในการทำซ้ำเชิงปริมาณของโปรตีนและ miRNAs เพิ่มขึ้นผ่านการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ และค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของเพียร์สัน ผลลัพธ์ถูกวิเคราะห์โดยใช้แบบทดสอบของนักเรียนที่ไม่จับคู่ ข้อมูลจะแสดงเป็นข้อผิดพลาดมาตรฐานเฉลี่ยของค่าเฉลี่ย (SEM) ค่า P ได้รับการพิจารณาว่ามีนัยสำคัญทางสถิติที่ * P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001.

ผลลัพธ์

การแยกและการจำแนก Exosome

มีการอธิบายวัฒนธรรมและการระบุเซลล์ต้นกำเนิดหลายเซลล์ของมนุษย์สามเซลล์ในไฟล์เพิ่มเติม 1 Exosomes ถูกแยกออกจากสื่อที่มีเงื่อนไขของเซลล์ต้นกำเนิดสามประเภท (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S1) และระบุตามลักษณะสัณฐานวิทยา ขนาดอนุภาค ความเข้มข้น และมาร์คเกอร์พื้นผิว [19] TEM เปิดเผยว่า exosomes เหล่านี้มีสัณฐานวิทยาเป็นรูปถ้วย (รูปที่ 1A) และ DLS เปิดเผยว่าการกระจายขนาดของพวกมันอยู่ในช่วง 50–200 นาโนเมตร (รูปที่ 1B) การซับแบบตะวันตกระบุว่า exosomes ที่แยกได้มีเครื่องหมายบวก CD63, TSG101 และ HSP70 แต่ไม่ใช่เครื่องหมายลบ calnexin (รูปที่ 1C) hESC แต่ละตัวมีผลผลิต exosome ใกล้เคียงกับของ hiPSCs และทั้งคู่สูงกว่าของ hUC-MSCs (รูปที่ 1D) ผลลัพธ์ Tese บ่งชี้ว่า exosomes ตัวแทนถูกจับโดยไม่มีความแตกต่างในรูปร่าง อย่างไรก็ตาม พบความแตกต่างระหว่างความเข้มข้นของ exosomes ที่แยกได้จากสเต็มเซลล์ทั้งสามชนิด

ชีวสารสนเทศศาสตร์ของโปรตีนที่ใช้ร่วมกันและโปรตีนที่มีโหลดสูงสุด

The SDS-PAGE and quantitative analyses revealed that while the protein concentrations of hESC-Exos and hiPSC-Exos were not different, they were both higher than those of hUC-MSC-Exos (Additional file 1: Fig.  S2A and B). The PCA plot indicated that exosomes had good uniformity within each group (Additional file 1:  Fig. S2C). The peptide fragments digested via enzymatic hydrolysis passed the quality inspection (Additional file 1: Fig. S2D–G) and then were subjected to the next bioinformatics analysis. Moreover, the proteins of three exosomes were mainly located in the extracellular region,   followed by the cytoplasm (Additional file 1: Fig. S2H).  To describe the protein profiles of the three types of exosomes, we integrated the TMT (Additional file 2) and label-free data (Additional file 3) under the conditions of mascot score>60 and abundance>100 (TMT assay)   and abundance of at least two repetitions>0 (การทดสอบแบบไม่มีฉลาก) ในที่สุด 554, 437 และ 911 เมล็ดถูกเลือกสำหรับการวิเคราะห์โปรไฟล์โปรตีนของ hESC-Exos, hiPSC-Exos และ hUC-MSC-Exos ตามลำดับ (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S3A) จากนั้นผู้สมัครเหล่านี้จะต้องผ่านการทดสอบไดอะแกรมเวนน์เพื่อเลือกโปรตีนที่ใช้ร่วมกัน (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S3B) การวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศพบว่าโปรตีนที่ใช้ร่วมกัน 303 ชนิดมีอิทธิพลเหนือการควบคุมในเส้นทางการส่งสัญญาณเหล่านี้ รวมถึงการควบคุมของโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างโครงร่างของเซลล์แอกติน, การยึดเกาะของโฟกัส, PI3K-AKT, เมแทบอลิซึมของคาร์บอน ฯลฯ (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S3C) การวิเคราะห์ GO ยังบ่งชี้ว่าโปรตีนที่ใช้ร่วมกันได้รับการเสริมคุณค่าใน exosome นอกเซลล์, เมมเบรน, การจับโปรตีนและบริเวณนอกเซลล์ (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S3D)

Furthermore, the top-loaded proteins were selected from the candidates with high FDR confidence (TMT   assay) and abundance of each repetition>0 (การทดสอบแบบไม่มีฉลาก) (รูปที่ 2A) จากผลลัพธ์เหล่านี้ โปรตีน 163, 187 และ 451 ถูกคัดกรองใน hESC-Exos, hiPSC-Exos และ hUC-MSC-Exos ตามลำดับ (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S3E) จากนั้นเราอธิบายเส้นโค้งความอุดมสมบูรณ์ของการแสดงออกของ exosomes ทั้งสามประเภทและระบุสัญลักษณ์ยีนสิบอันดับแรกของโปรตีนที่โหลดใน exosomes (รูปที่ 2B) ไทยe โปรตีนที่มีโหลดสูงอยู่ภายใต้ชีวสารสนเทศตามอัลกอริธึม KOBAS โปรตีโอมของเอ็กโซโซมทั้งสามประเภทล้วนเกี่ยวข้องกับเครือข่ายการกำกับดูแลเส้นทางการส่งสัญญาณที่ซับซ้อน จากนั้นเส้นทาง 20 อันดับแรกจะถูกจัดเรียงตามค่าของ -log10 (ค่า P) (รูปที่ 2C–E) โปรตีโอมทั้งหมดได้รับการเสริมประสิทธิภาพในเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) - ปฏิกิริยาระหว่างตัวรับและเส้นทางการส่งสัญญาณ PI3K-AKT การวิเคราะห์ปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนและโปรตีน (PPI) พบว่าโปรตีนที่โหลดสูงสุดในทั้ง hESC-Exos และ hiPSC-Exos นั้นอุดมไปด้วยวัฏจักรของเซลล์และวิถีเมแทบอลิซึม ในขณะที่โปรตีนที่โหลดสูงสุดใน hUC-MSC-Exos ได้รับการเสริมคุณค่าในวิถีที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมภูมิคุ้มกัน (รูปที่ 2F–H)

การเปรียบเทียบแบบคู่ของเอ็กโซโซมโปรตีโอมิกส์

ในการประเมินความแตกต่างระหว่างโปรตีโอมเอกโซโซมสองตัว เราสร้างไดอะแกรมเวนน์เพื่อจดจำกลุ่มยีนเข้ารหัสโปรตีนที่มีลักษณะเฉพาะและทับซ้อนกัน ยีนเข้ารหัสโปรตีนที่ใช้ร่วมกันนั้นถูกนำไปวิเคราะห์ภูเขาไฟและแผนที่ความร้อนและ GSEA และกรองโปรตีนที่แสดงออกแตกต่างกันที่ P<0.05 and  |log2FC|≥1. Comparison of hESC-Exos and hiPSC-Exos  (Additional file 1: Fig. S4A) revealed that their unique clusters were both enriched in ECM-receptor interaction and complement and coagulation cascades (Additional file 1: Fig. S4B and C) while overlapping clusters participated in multiple signaling pathways, including metabolic, cell cycle, and Hippo pathways (Fig. 3A). Significant differentially expressed protein-coding genes are presented in the volcano plot (Fig. 3 B). Heatmap analysis revealed that Cluster 1 proteins related to developmental biology, TGF-β signaling, and pluripotency regulation were enriched in hESC-Exos. Proteins in Cluster 2,   which were mainly enriched in hiPSC-Exos, were related to taurine and hypotaurine metabolism, RNA transport,   thiamine metabolism, and folate biosynthesis (Fig. 3 C).  GSEA further emphasized the more important role of hESC-Exos in developmental biology and cell cycle compared to hiPSC-Exos (Additional file 1: Fig. S5).

การเปรียบเทียบระหว่าง hESC-Exos และ hUC-MSC- 1: รูปที่ S4 D) เผยให้เห็นว่ากลุ่มยีนเข้ารหัสโปรตีนที่มีลักษณะเฉพาะของ hESC-Exos ส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับ EGFR, TGF-, วัฏจักรเซลล์, การควบคุมพหุอำนาจ และ Wnt การส่งสัญญาณ (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S4E) ในทางตรงกันข้าม คลัสเตอร์เฉพาะ hUC-MSC-Exos ได้รับการเสริมคุณค่าในเส้นทางการส่งสัญญาณที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมภูมิคุ้มกันหลายอย่าง เช่น ระบบคอมพลีเมนต์ การควบคุมการอักเสบ และการติดเชื้อจุลินทรีย์ (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S4F) กลุ่มที่ทับซ้อนกันนั้นได้รับการเสริมคุณค่าอย่างมากในการทำงานร่วมกันของตัวรับ ECM การเสริมและการแข็งตัวและการส่งสัญญาณ PI3K-AKT (รูปที่ 3 มิติ) โครงเรื่องภูเขาไฟแสดงให้เห็นความแตกต่างระหว่าง hESC-Exos และ hUC-MSC-Exos (รูปที่ 3E) โปรตีนที่ถูกควบคุมใน hUC-MSC-Exos (คลัสเตอร์ 1) ส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองส่วนเติมเต็ม กิจกรรมของเซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติ และการส่งสัญญาณ Rap1 และ PPAR ในทางตรงกันข้ามโปรตีนที่ควบคุมด้วย hESC-Exos ส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับการส่งสัญญาณ PI3K-AKT, MAPK และ AMPK (รูปที่ 3F) GSEA ยืนยันความสามารถในการควบคุมที่สูงขึ้นของ hiPSC-Exos ในด้าน pluripotency (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S6A และ D) และของ hESC-Exos ในการควบคุมภูมิคุ้มกัน รวมถึงความเป็นพิษต่อเซลล์ที่อาศัยเซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติ (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S6B และ E) และข้อบังคับของโควิด19-SARS-CoV2 (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S6C และ F)

การเปรียบเทียบ hiPSC-Exos และ hUC-MSC-Exos (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S4G) เปิดเผยว่าชุดยีนการเข้ารหัสโปรตีน hiPSCExos ที่เป็นเอกลักษณ์นั้นมีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญกับการรวมปลายที่ไม่เหมือนกัน TGF- และการเผาผลาญวิตามินบี 6 (เพิ่มเติม ไฟล์ 1: รูปที่ S4H) ในขณะที่ hUC-MSC-Exos ส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับเส้นทางที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกัน (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S4I) โปรตีนที่ทับซ้อนกันของพวกมันยังมีส่วนร่วมในการควบคุมการโต้ตอบของตัวรับ ECM, การเสริมและการแข็งตัวของน้ำตกและการส่งสัญญาณ PI3K-AKT (รูปที่ 3G) แผนภาพของภูเขาไฟนำเสนอโปรตีนที่แสดงออกแตกต่างกัน (รูปที่ 3H) โปรตีนคลัสเตอร์ 1 ในแผนที่ความร้อนระบุว่า hUCMSC-Exos ส่วนใหญ่ควบคุมการตอบสนองของภูมิคุ้มกันและเส้นทางการส่งสัญญาณ AMPK ในขณะที่ hiPSC-Exos ควบคุมวัฏจักรของเซลล์และอินซูลิน, ฮิปโปและเส้นทางการส่งสัญญาณ mTOR เป็นหลัก (รูปที่ 3 I) GSEA ยังสนับสนุนบทบาทที่โดดเด่นของ hiPSC-Exos ในการควบคุมกระบวนการพัฒนา (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S7A และ D) และการบำรุงรักษาของ pluripotency (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S7B และ E) ในขณะที่ hUC-MSC-Exos ส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับกระบวนการควบคุมภูมิคุ้มกัน (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S7C และ F)

ชีวสารสนเทศของโปรตีโอมที่ทับซ้อนกัน

ต่อไป เราตรวจสอบโปรตีโอมที่ใช้ร่วมกันของ exosome ทั้งสามประเภท โดยรวมแล้วยีนเข้ารหัสโปรตีน 309 ยีน (รูปที่ 4A) ได้รับการวิเคราะห์ GO และ KEGG ผลลัพธ์บ่งชี้ว่าชุดของยีนเข้ารหัสโปรตีนที่ใช้ร่วมกันระหว่าง exosome ทั้งสามประเภทนั้นส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับกิจกรรมนอกเซลล์และกระบวนการทางชีววิทยารวมถึงกระบวนการเมตาบอลิซึมของโปรตีนในเซลล์, การจับตัวรับส่งสัญญาณ, การจับ ATP, การจับกับ NAD, การรักษาบาดแผล และกระบวนการเมแทบอลิซึมของไขมัน (รูปที่ 4B). พวกเขายังมีส่วนร่วมในการสร้างเครือข่ายการกำกับดูแลที่ซับซ้อนของเส้นทางการส่งสัญญาณ เช่น PI3K-AKT, glycolysis/gluconeogenesis, Hippo, Oxytocin, HIF-1, วัฏจักรของเซลล์ และเส้นทาง AMPK (รูปที่ 4C) มีความสัมพันธ์ด้านกฎระเบียบที่ซับซ้อนระหว่างเส้นทางการส่งสัญญาณแบบโปรตีโอมิกและแบบบัญญัติ (รูปที่ 4D) แผนภาพฟองสบู่แสดงให้เห็นถึงความอุดมสมบูรณ์ที่แตกต่างกันของแต่ละกลุ่มโปรตีนในเส้นทางการส่งสัญญาณที่เป็นที่ยอมรับ ในขณะที่ hESC-Exos และ hiPSC-Exos อาจมีความสามารถด้านกฎระเบียบที่แข็งแกร่งกว่า hUC-MSC-Exos ในแง่ของวัฏจักรของเซลล์และเส้นทางการส่งสัญญาณ AMPK แต่ hUC-MSC-Exos อาจมีผลด้านกฎระเบียบที่โดดเด่นต่อเส้นทางการส่งสัญญาณ VEGF และ NF-κB (เพิ่มเติม ไฟล์ 1: รูปที่ S8)

การวิเคราะห์แผนที่ความร้อนเผยให้เห็นความแตกต่างในการแสดงออกของโปรตีนที่ใช้ร่วมกัน (รูปที่ 4E) ในคลัสเตอร์ A โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับเส้นทางการส่งสัญญาณของตัวรับ PI3K-AKT, Hippo, VEGF และ B-cell ได้รับการเสริมคุณค่าใน hUC-MSCExos และ hESC-Exos โปรตีนในคลัสเตอร์ B ส่วนใหญ่มีส่วนร่วมในการควบคุมการส่งสัญญาณ PPAR เมแทบอลิซึมของคอเลสเตอรอล และการผลิต IgA และถูกทำให้หมดไปใน hESC-Exos hUC-MSC-Exos ส่วนใหญ่ประกอบด้วยโปรตีนคลัสเตอร์ C ซึ่งควบคุมการตอบสนองของคอมพลีเมนต์ การติดเชื้อจุลินทรีย์ การส่งสัญญาณ HIF-1 การส่งสัญญาณ MAPK เส้นทางเมตาบอลิซึม และเส้นทาง NF-κB โปรตีนใน Cluster d ซึ่งอุดมด้วย hiPSC-Exos มีส่วนร่วมในการควบคุมการส่งสัญญาณ Ras, oxidative phosphorylation และการส่งสัญญาณ mTOR โปรตีนใน Cluster e มีมากมายทั้งใน hiPSC-Exos และ hESC-Exos มากกว่าใน hUC-MSCExos และพวกมันมีส่วนร่วมในกระบวนการเผาผลาญหลายอย่าง เช่น วงจรซิเตรต วงจรเซลล์ การส่งสัญญาณอินซูลิน เมแทบอลิซึมของกรดไขมัน และการส่งสัญญาณ AMPK . โปรตีนในกลุ่ม f มีส่วนร่วมในการควบคุมการดูดซึมแคลเซียมกลับคืน, ไกลโคไลซิส/กลูโคโนเจเนซิส, การส่งสัญญาณ adrenergic และการเผาผลาญไพรูเวต และถูกทำให้หมดไปทั้งใน hUC-MSCExos และ hiPSC-Exos โปรตีนในกลุ่มต่างๆ แสดงอยู่ในไฟล์เพิ่มเติม 4

โปรไฟล์ miRNA ของ exosome ทั้งสามประเภท

ในการตรวจสอบโปรไฟล์ miRNA ของ exosome ทั้งสามประเภท RNA ทั้งหมดถูกแยกออกจาก exosomes เพื่อจับคู่ปลาย 5 'และ 3' สำหรับการถอดความผกผันที่ตามมา cDNA ที่ได้รับใช้สำหรับการสร้างห้องสมุดและการทดสอบในวงกว้าง หมายเลขความสมบูรณ์ของ RNA (RIN) คือ 2.7, 2.6 และ 2.6 ใน hESC-Exos, hiPSC-Exos และ hUC-MSC-Exos ตามลำดับ (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S9A) การพิจารณาความเข้มข้นของ RNA พบว่า hESC-Exos ครอบงำโหลด RNA ตามด้วย hiPSC-Exos และ hUC-MSCExos (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S9B) ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของเพียร์สัน (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S9C) และ PCA (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S9D) ถูกนำมาใช้เพื่อประเมินความสามารถในการทำซ้ำของ miRNA ในเชิงปริมาณ แผนที่ความร้อนถูกใช้เพื่อแสดง miRNAs ที่แสดงออกแตกต่างกันใน exosome สามประเภท (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S9E) และจำนวนของ miRNA ที่แสดงออกต่างกันที่ P<0.05 or 0.01,   was evaluated between each two exosome types (Additional file 1: Fig. S9F). Based on the sequencing results, the top 20 miRNAs in each of the three exosome types were identified (Fig. 5 A–C). In hESC-Exos, has-miR-302 dominated the read counts and comprised has-miR-302b-3p,   has-miR-302a-5p, and has-miR-302d-3p (Fig.  5A). The three miRNAs with the highest read counts were has-miR- 372-3p, has-miR-371a, and has-miR-302a in hiPSC-Exos and has-miR-21-5p (Fig.  5B), has-miR-146a-5p, and hasmiR-320a-3p in hUC-MSC-Exos (Fig. 5C).

ในการตรวจสอบ miRNAs ที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการทางชีวภาพ miRNAs อันดับต้น ๆ จะถูกกรองที่ P<0.05 and read count>1,000 สำหรับการทำนายยีนเป้าหมายเพิ่มเติม จากนั้นยีนที่ได้รับการเสริมคุณค่าจะถูกนำไปวิเคราะห์ GO และ KEGG ผลลัพธ์ระบุว่า hESC-Exos miRNAs ส่งผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อกระบวนการต่อไปนี้: Rap1, PI3K-AKT, แคลเซียม, ฮิปโป, ค่าย, ErbB, Foxo, วัฏจักรของเซลล์, เส้นทางการส่งสัญญาณ AMPK ฯลฯ (การวิเคราะห์ KEGG) (รูปที่ 5D) และ วัฏจักรของเซลล์ การพัฒนาของสิ่งมีชีวิตหลายชนิด การถ่ายทอดสัญญาณภายในเซลล์ ความแตกต่างของเซลล์ การแก่ การส่งสัญญาณ Wnt และเมแทบอลิซึมของกรดไขมัน (กระบวนการทางชีวภาพ) (รูปที่ 5G) การเพิ่มคุณค่ายีนเป้าหมายของ hiPSC-Exos miRNAs บ่งชี้ว่ากระบวนการต่อไปนี้ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ: เส้นทางการส่งสัญญาณ PI3K-AKT, Rap1, Ras, Calcium, Hippo, cAMP และ cGMP-PKG เป็นต้น (การวิเคราะห์ KEGG) และวัฏจักรเซลล์ การพัฒนาของสิ่งมีชีวิตหลายชนิด ฟอสโฟรีเลชั่น การแยกเซลล์ การย้ายเซลล์ และการตอบสนองต่อภาวะขาดออกซิเจน (กระบวนการทางชีวภาพ) (รูปที่ 5H) ในเครือข่ายการกำกับดูแลของ hUC-MSC-Exos miRNAs กระบวนการทางชีววิทยาที่น่าเชื่อถือที่สุดคือ: Rap1, Ras, PI3K-AKT, แคลเซียม, แคมป์, ฮิปโป, วัฏจักรของเซลล์, JAK-STAT และ HIF-1 เส้นทางการส่งสัญญาณ . (การวิเคราะห์ KEGG) (รูปที่ 5F) และฟอสโฟรีเลชั่น, การส่งสัญญาณภายในเซลล์, การจับ ATP, การแบ่งเซลล์, เมแทบอลิซึมของไขมัน, การกระตุ้นร่วม T เซลล์, การรักษาบาดแผล, การจับ NF-κB และการตอบสนองต่อการอักเสบ (กระบวนการทางชีวภาพ) (รูปที่ 5 I) เครือข่ายของ miRNAs ห้าอันดับแรกและเส้นทางการกำกับดูแลของพวกเขาก็แสดงให้เห็นเช่นกัน (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S10)

【สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】