การระบุอย่างเป็นระบบและการเปรียบเทียบโปรไฟล์ที่แสดงออกของ MiRNA จากเอ็กโซโซมในสุกรที่ติดเชื้อ NADC30- เช่น สายพันธุ์ PRRSV

สรุปง่ายๆ:เอ็กโซโซมมีบทบาทพิเศษในการติดเชื้อไวรัส การแสดงแอนติเจน และการปราบปราม/ส่งเสริมภูมิคุ้มกันของร่างกาย ไวรัสกลุ่มอาการระบบสืบพันธุ์และทางเดินหายใจในสุกร (PRRSV) เป็นหนึ่งในเชื้อโรคที่สร้างความเสียหายมากที่สุดในอุตสาหกรรมสุกร ที่นี่ เราใช้สายพันธุ์ PRRSV NADC30-เช่น CHsx1401 ในการติดเชื้อเทียมในสุกรอายุหนึ่งวัน 42- แยกซีรัมเอ็กโซโซม และระบุ miRNA เอ็กโซโซมที่แสดงออกแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (DE) 33 รายการระหว่างการติดเชื้อและกลุ่มควบคุม และ 18 DE miRNAs ที่เกี่ยวข้องกับการติดเชื้อ PRRSV และภูมิคุ้มกันได้รับการคัดกรองว่าเป็นโมเลกุลเชิงหน้าที่ที่เกี่ยวข้องในการควบคุมการติดเชื้อไวรัส PRRSV โดย exosomes

เชิงนามธรรม:เอ็กโซโซมเป็นถุงทางชีวภาพที่ถูกหลั่งและปล่อยออกมาจากเซลล์ซึ่งทำหน้าที่เป็นสื่อกลางของการสื่อสารระหว่างเซลล์ และมีบทบาทพิเศษในการติดเชื้อไวรัส การนำเสนอแอนติเจน และการปราบปราม/ส่งเสริมภูมิคุ้มกันของร่างกาย ไวรัสกลุ่มอาการระบบสืบพันธุ์และทางเดินหายใจในสุกร (PRRSV) เป็นหนึ่งในเชื้อโรคที่สร้างความเสียหายมากที่สุดในอุตสาหกรรมสุกร และสามารถทำให้เกิดความผิดปกติของระบบสืบพันธุ์ในแม่สุกร โรคระบบทางเดินหายใจในสุกร ประสิทธิภาพการเจริญเติบโตลดลง และโรคอื่นๆ ที่นำไปสู่การตายของสุกร ในการศึกษานี้ เราใช้ PRRSV NADC30-เช่น สายพันธุ์ CHsx1401 เพื่อแพร่เชื้อในสุกรอายุ {2}} วันโดยเทียม และแยกซีรัมเอ็กโซโซม ด้วยเทคโนโลยีการหาลำดับปริมาณงานสูง มีการระบุ 305 miRNA ในซีรั่ม exosomes ก่อนและหลังการติดเชื้อ โดยในจำนวนนี้ 33 miRNA มีการแสดงออกที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่ม (13 ค่อนข้างควบคุมและ 20 ค่อนข้างควบคุมลดลง) การวิเคราะห์การอนุรักษ์ลำดับของจีโนม CHsx1401 ระบุ 8 ภูมิภาคที่ได้รับการอนุรักษ์ ซึ่งมีการคาดการณ์ miRNA ที่แสดงความแตกต่าง (DE) ทั้งหมด 16 รายการเพื่อผูกกับภูมิภาคอนุรักษ์ที่อยู่ใกล้กับ 3 มากที่สุด0 UTR ของจีโนม CHsx1401 รวมถึง DE miRNA 5 ตัวที่สามารถจับกับ CHsx1401 30 UTR (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486, ssc-miR-6529) การวิเคราะห์เพิ่มเติมเผยให้เห็นว่ายีนเป้าหมายของ miRNA ที่แสดงออกแตกต่างกันนั้นเกี่ยวข้องอย่างกว้างขวางในเส้นทางการส่งสัญญาณที่เกี่ยวข้องกับการทำงานของ exosomal และที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด และ 18 DE miRNA (ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 , ssc-miR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128 ฯลฯ) ที่เกี่ยวข้องกับการติดเชื้อ PRRSV และภูมิคุ้มกันได้รับการคัดกรอง เป็นโมเลกุลเชิงหน้าที่ที่เกี่ยวข้องในการควบคุมการติดเชื้อไวรัส PRRSV โดย exosomes

cistanche พืชเพิ่มระบบภูมิคุ้มกัน

คำสำคัญ:พีอาร์เอสวี; เซรั่ม exosome; miRNA

1. บทนำ

ไวรัสกลุ่มอาการระบบสืบพันธุ์และทางเดินหายใจของสุกร (PRRSV) เป็นไวรัส RNA สายบวกสายเดี่ยวที่มีโครงสร้างซองจดหมายอยู่ในอันดับ Nidovirales วงศ์ Arteriviridae สกุล Betaarterivirus [1,2] มันเป็นทรงกลมหรือทรงรีที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 50–65 นาโนเมตรภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนเยือกแข็ง [3,4] จีโนม PRRSV มีความยาวประมาณ 15 kb โดยมี 50 cap และ 30 polyA-tail และมีอย่างน้อย 10 open reading frame (ORF) ขนาบข้างด้วยขอบเขตที่ไม่ถูกแปล (UTR) ที่ทั้ง 50 และ 30 ปลายทาง [5,6] และ ถูกห่อหุ้มด้วยโปรตีนนิวคลีโอแคปซิด โดยมีการเคลือบลิพิด 2 ชั้นเพื่อสร้างอนุภาคไวรัส เอ็กโซโซมอยู่ในถุงที่มีโครงสร้างเมมเบรนชั้นเดียวและมีโครงสร้างทอพอโลยีเหมือนกับเซลล์ [7] รูปร่างเป็น "รูปถ้วย" หรือ "รูปดิสก์" ภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน [8,9] เอ็กโซโซมสามารถอยู่ในระบบไหลเวียนโลหิตเป็นเวลานาน และสารในเอ็กโซโซมสามารถถูกดูดซึมโดยเซลล์ที่อยู่ติดกันหรือเซลล์ตัวรับที่อยู่ห่างไกล จากนั้นควบคุมเซลล์ตัวรับให้มีส่วนร่วมในการแลกเปลี่ยนสารพันธุกรรมระหว่างเซลล์ [10,11] โดยส่วนใหญ่ประกอบด้วยสารที่พื้นผิวเมมเบรนและสารที่ขนส่ง รวมถึงตัวรับที่ผิวเซลล์ โปรตีนของเมมเบรน โปรตีนที่ละลายน้ำได้ ลิพิด RNA (mRNA, miRNA, lncRNA และ RNA ของไวรัส ฯลฯ) DNA ของจีโนม ดีเอ็นเอของไมโตคอนเดรีย [12–14 ] MicroRNAs (miRNAs) เป็นคลาสของนิวคลีโอไทด์ 18–25 นิวคลีโอไทด์ (nt) ที่ได้รับการอนุรักษ์เชิงวิวัฒนาการ RNA ขนาดเล็กแบบเกลียวเดี่ยวที่ไม่ได้เข้ารหัสภายนอก ซึ่งยับยั้งกระบวนการแปลโดยกระตุ้นการย่อยสลาย mRNA เป้าหมายหรือโดยการจับกับ 30 UTR ของ mRNA เป้าหมาย ซึ่งนำไปสู่ ไปจนถึงการปิดเสียงของยีนหลังการถอดความ จากนั้นควบคุมการแสดงออกของยีนในระดับหลังการถอดความ [15–17] เป็นที่คาดกันว่า miRNA ควบคุมยีนของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมมากกว่า 60% หลังการถอดรหัส [18,19] MiRNA มีบทบาทสำคัญในการสื่อสารระหว่างเซลล์ และยังสามารถใช้เป็นโมเลกุลที่มีศักยภาพในการติดเชื้อโรคและไวรัส การแพร่กระจาย และการป้องกัน [20] การศึกษาจำนวนมากขึ้นแสดงให้เห็นว่า miRNA สามารถอยู่ในของเหลวในร่างกาย เช่น น้ำลาย ปัสสาวะ น้ำนมแม่ และเลือด และออกฤทธิ์ผ่านระบบไหลเวียนของของเหลวในร่างกาย [21,22] miRNA ภายนอกถือเป็นตัวควบคุมภายนอกของการแสดงออกของยีนและเมแทบอลิซึมและสามารถบ่งบอกถึงสภาวะทางพยาธิวิทยาต่างๆ [23,24]

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

ในช่วงสองทศวรรษที่ผ่านมา มีการแสดงให้เห็นว่า miRNA มีบทบาทสำคัญในการควบคุมการพัฒนาเซลล์ภูมิคุ้มกัน การตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ และการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันที่ได้รับ miRNA อื่นๆ บางตัวได้รับการรายงานว่าทำให้การติดเชื้อ PRRSV ลดลงด้วยวิธีต่อไปนี้ กำหนดเป้าหมายจีโนม PRRSV หรือตัวรับ PRRSV โดยตรง หรือมีบทบาทโดยควบคุมการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติของโฮสต์ กลุ่ม miR-26 สามารถทำลายการจำลองแบบของไวรัสได้อย่างมาก และ miR-26a สามารถยับยั้งการจำลองแบบของสายพันธุ์ PRRSV ประเภท 1 และประเภท 2 ใน porcine alveolar macrophages (PAM) โดยการควบคุมอินเตอร์เฟอรอนประเภท I (IFN) ทางเดินซึ่งมีประสิทธิภาพมากกว่า miR-26b [25,26] miR-30c และ miR-125b ได้รับการระบุเพื่อปรับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดของโฮสต์โดยการกำหนดเป้าหมายวิถีทาง IFN ประเภท I และวิถีทาง NF-κB ตามลำดับ [27–29] MiR-23, miR-378 และ miR-505 เป็นปัจจัยโฮสต์ต้านไวรัสที่มุ่งเป้าไปที่ PRRSV และมีไซต์เป้าหมายแบบอนุรักษ์นิยมในสายพันธุ์ PRRSV ประเภท 2 [30] ในเวลาเดียวกัน มีการระบุโฮสต์ miR-506 เพื่อยับยั้งการจำลองแบบ PRRSV โดยการกำหนดเป้าหมาย PRRSV receptor CD151 โดยตรงในเซลล์ MARC-145 [31] miR-181 ยังสามารถยับยั้งการจำลองแบบ PRRSV โดยอ้อมโดยการลดการควบคุม PRRSV receptor CD163 ในโมโนไซต์ในเลือดและ PAMs [32] นอกจากนี้ miRNA ยังสามารถส่งเสริมการจำลองแบบ PRRSV ได้โดยรบกวนสรีรวิทยาของเซลล์ขั้นพื้นฐาน MiR-24-3p และ miR-22 กำหนดเป้าหมายโดยตรง 30 UTR ของ H O-1 ในระหว่างการติดเชื้อ PRRSV เพื่อหลีกเลี่ยงการยับยั้งของ heme oxygenase-1 (HO-1) โปรตีนช็อกความร้อน (หรือที่เรียกว่า HSP32) บน PRRSV [33,34] เป็นที่รู้กันว่าสุกรไวต่อ PRRSV มากกว่าและไม่สามารถป้องกันตัวเองจากการที่เชื้อโรคเข้าสู่ร่างกายได้น้อยกว่า [35] ในการศึกษาครั้งนี้ ได้ทำการศึกษาภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดและภูมิคุ้มกันที่ได้รับของสุกรที่ติดเชื้อไวรัสนี้ในระดับโมเลกุลโดยใช้สายพันธุ์ที่แพร่หลายในสนาม ชุดแยกซีรั่มเอ็กโซโซม กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM) การวิเคราะห์การติดตามอนุภาคนาโน (NTA) และเวสเทิร์นบล็อต (WB) ถูกนำมาใช้เพื่อแยกและระบุซีรั่มเอ็กโซโซมก่อนและหลังการติดเชื้อ PRRSV ตามด้วยการวิเคราะห์ลำดับ RNA ขนาดเล็ก การระบุ และการวิเคราะห์ผลลัพธ์การแสดงออกที่แตกต่างกันโดยใช้วิธีชีวสารสนเทศศาสตร์เพื่อให้ได้ miRNA ในซีรัม exosome ที่เกี่ยวข้องกับ PRRSV หลายตัว ตามด้วยการระบุผลลัพธ์ข้อมูลโดยใช้ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (qRT-PCR)

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. การทดลองกับสัตว์

แอนติเจน PRRSV และแอนติบอดี double-negative ของ PRRSV หกตัวที่มีสุขภาพดี 42- หมูขาวขนาดใหญ่อายุหนึ่งวันถูกวางไว้ในระบบการให้อาหารสุกรที่สะอาดเพื่อการแยกตัว การดูแลสุขภาพ และการปรับตัวต่อสิ่งแวดล้อม หมูทุกตัวสามารถกินและดื่มได้ฟรีโดยไม่มีข้อจำกัด เมื่อพวกเขาคุ้นเคยกับสภาวะในตัวแยกเชื้อ สุกรได้รับการฉีดวัคซีนทางจมูกด้วย PRRSV NADC 105 TCID50/มล. 2 มล.30- เช่นเดียวกับ CHsx1401 ซึ่งได้รับการกล่าวถึงโดยรุ่นก่อน ๆ [36,37] เลือดของสุกรก่อนหน้านี้ (กลุ่มควบคุม n=6) และ 7 วันหลังจากนั้น (กลุ่มบำบัด n=6) การฉีดวัคซีนไวรัสถูกรวบรวมจาก anterior vena cava เพื่อแยกซีรัม เศษเซลล์ในซีรัมถูกกำจัดออกโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 3000 กรัมเป็นเวลา 15 นาที การทดลองกับสัตว์ทั้งหมดในการศึกษาของเราได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมสัตว์ของสถาบันสัตวศาสตร์, Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS) (ปักกิ่ง จีน), IAS2022-130

2.2. การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของเซรั่ม Exosomes

การแยกและการทำให้บริสุทธิ์แบบ Exosome ดำเนินการโดยใช้ชุด exoEasy Maxi (QIAGEN, Hilden, Germany, cat. no. 76064) ตามระเบียบการของผู้ผลิต

2.3. กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM)

สารแขวนลอยเอกโซโซมที่ถูกแยกออกมาถูกพบบนตาข่ายทองแดงที่เคลือบด้วยคาร์โบฟอร์มวาร์ และเอ็กโซโซมถูกล้างด้วย PBS และถูกนำไปย้อมสียูรันิล อะซิเตตมาตรฐานเป็นเวลา 3 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากการอบแห้งเป็นเวลาหลายนาทีที่อุณหภูมิห้อง ตารางก็ถูกมองเห็นและถ่ายภาพที่ 100 กิโลโวลต์ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (HT-7700, บริษัท ฮิตาชิ-ไฮเทค, โตเกียว, ญี่ปุ่น)

2.4. การวิเคราะห์การติดตามอนุภาคนาโน (NTA)

เอ็กโซโซมที่ถูกสกัดถูกเจือจางด้วย 1 × PBS โดยการเปลี่ยนปริมาตรจาก 10 ถึง 30 ไมโครลิตร หลังจากทดสอบตัวอย่างแล้ว ความเข้มข้นและขนาดของซีรัมเอ็กโซโซมถูกวิเคราะห์โดยเครื่องวิเคราะห์นาโนแบบไหล N30E ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (NanoFCM, เซียะเหมิน, จีน)

2.5. เวสเทิร์นบล็อท

ตัวอย่าง exosome ที่สกัดได้จะถูกเติมลงใน RIPA lysate ผสมกับตัวยับยั้งโปรตีเอส (Invitrogen, Waltham, MA, USA) และ phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) เพื่อสกัดโปรตีน exosome ซึ่งถูก lysed บนน้ำแข็งเป็นเวลา 30 นาที จากนั้น ตามคำแนะนำของชุดอุปกรณ์แบรดฟอร์ด เราได้วัดปริมาณความเข้มข้นของโปรตีนเอโซโซมในซีรั่ม โปรตีน Exosome ได้รับการเปลี่ยนสภาพจากความร้อน โปรตีนในปริมาณเท่ากันถูกแยกออกจากเจล SDS-PAGE 12% จากนั้นถ่ายโอนไปยังเมมเบรนโพลีไวนิลิดีนฟลูออไรด์ (PVDF) (มิลลิพอร์, เบอร์ลิงตัน, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) แช่ใน TBST ที่มีนมผงพร่องมันเนย 5% และปิดผนึกเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง เราแช่เมมเบรนในแอนติบอดีปฐมภูมิที่เจือจาง (แอนติบอดีต่อต้าน CD9, Abcam, บอสตัน, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา, #ab92726; แอนติบอดีต่อต้าน CD81, Abcam, บอสตัน, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา, #ab109201) ข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4 ◦C และฟื้นตัว แอนติบอดีปฐมภูมิ เราแช่เมมเบรนในแอนติบอดีทุติยภูมิที่เจือจาง แล้วบ่มไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง และนำแอนติบอดีทุติยภูมิกลับคืนมา เราวางฟิล์ม PBST ที่ล้างแล้วบนฟิล์มเก็บความสด เติมสารละลายโครโมเจนิก ECL a/b ที่ผสมในปริมาตรเท่ากัน แล้ววางลงในเครื่องสร้างภาพเคมีเรืองแสง

ประโยชน์ของซิสตานช์สำหรับระบบภูมิคุ้มกันของผู้ชาย

คลิกที่นี่เพื่อดูผลิตภัณฑ์ Cistanche Enhance Immunity

【สอบถามเพิ่มเติม】 อีเมล:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.6. การจัดลำดับ RNA ขนาดเล็กแบบ Exosomal และการวิเคราะห์ข้อมูล

RNA ทั้งหมดจาก exosomes ถูกสกัดด้วย Trizol ตามคำแนะนำของผู้ผลิต จากนั้นเราตรวจพบความเข้มข้น RNA และค่าความหนาแน่นของแสง (OD) และตรวจพบการย่อยสลายและความบริสุทธิ์ของ RNA ด้วย agarose gel electrophoresis 1% ในขณะเดียวกัน Agilent Bioanalyzer 2100 ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจจับความสมบูรณ์ของ RNA เราใช้ RNA ทั้งหมดของ exosomes หลังจากการตรวจสอบคุณภาพ ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เราใช้ชุดเตรียมไลบรารี RNA ขนาดเล็ก NEB NEXT multiplex สำหรับ Illumina® (Illumina, San Diego, CA, USA) ชุดนี้ได้เตรียมไลบรารี RNA cDNA ขนาดเล็กและจัดลำดับเพื่อสร้างการอ่านปลายเดี่ยว 50 nt โดยแพลตฟอร์ม Illumina Novaseq 6000 ขั้นตอนทั้งหมดสำหรับการเตรียมห้องสมุด RNA ขนาดเล็กทำได้โดย Novogene (ปักกิ่ง, จีน) ข้อมูลหลังการควบคุมคุณภาพสอดคล้องกับจีโนมอ้างอิงของสุกร (Sus scrofa 11.1) โดยใช้หูกระต่าย miRNA ที่รู้จักถูกระบุโดยฐานข้อมูล miRbase (v22.0) [38] (https://www.mirbase.org เข้าถึงเมื่อวันที่ 14 มกราคม 2022), miRdeep2 (v0.0.5) [39] และ miRevo (v1.1 ) [40] และถูกนำมาใช้เพื่อทำนาย miRNA ใหม่ ในเวลาเดียวกัน การวิเคราะห์การแสดงออกที่แตกต่างสำหรับ miRNA ดำเนินการโดย DESeq (v1.24.0) [41] โดยต้องการ|การเปลี่ยนแปลงแบบพับ|> 1.6 และ p < 0.05 การจัดตำแหน่งดำเนินการโดยใช้ MEGA (V11) [42] ตามด้วยการให้คะแนนฐานเดียวโดยใช้ PHAST (v1.6.9) [43] และการประเมินบริเวณที่ได้รับการอนุรักษ์มากที่สุดของยีนไวรัส 10 ยีน รวมถึง WUH3 (หมายเลขภาคยานุวัติของ GenBank HM853973), VR2332 ( หมายเลขภาคยานุวัติ GenBank U87392), JXA1 (หมายเลขภาคยานุวัติ GenBank EF112445), CH-1a (หมายเลขภาคยานุวัติ GenBank AY032626), NADC30 (หมายเลขภาคยานุวัติ GenBank HN654459), HUN4 (หมายเลขภาคยานุวัติ GenBank EF635006), HLJZD 22-1812 (ภาคยานุวัติ GenBank หมายเลข MN648450), SC/DJY (ภาคยานุวัติ GenBank หมายเลข MT075480) และ Lelystad (ภาคยานุวัติ GenBank หมายเลข M96262.2) RNAhybrid (V2.0) [44] ใช้เพื่อทำนายการเชื่อมโยงของลำดับ miRNA ที่ระบุกับ 3 0 UTR ของจีโนมไวรัส CHsx1401 Miranda (v3.3a) และ RNAhybrid ถูกใช้เพื่อกำหนดเป้าหมายการทำนายยีน โปรไฟล์คลัสเตอร์ [45] แพ็คเกจ R ใช้สำหรับการวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าการทำงานของ GO (Gene Ontology) ของยีนเป้าหมายและการวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าวิถีทาง KEGG (สารานุกรมเกียวโตของยีนและจีโนม)

2.7. การตรวจสอบความถูกต้องของ miRNA Expression โดย RT-qPCR

Total RNA ถูกแยกได้จากซีรั่ม exosome โดยใช้ Trizol (Invitrogen, เซี่ยงไฮ้, จีน) ตามระเบียบการของผู้ผลิต RNA ที่แยกได้ได้รับการตรวจสอบโดย RT-qPCR ในตัวอย่าง (n=6 ต่อกลุ่ม) cDNA ถูกสังเคราะห์ตามคำแนะนำของชุดการสังเคราะห์ cDNA สายที่ 1 ของ miRNA (โดยสเตม-ลูป) (วาไซม์, หนานจิง, จีน) และดำเนินการหาปริมาณฟลูออเรสเซนซ์โดยใช้ ABI 7500 ตาม คำแนะนำของ miRNA universal SYBR qPCR มาสเตอร์มิกซ์ (Vazyme, หนานจิง, จีน) พารามิเตอร์รอบความร้อนที่ใช้มีดังนี้: ระยะแรก: 95 ◦C เป็นเวลา 30 วินาที; ขั้นที่ 2: 95 oC เป็นเวลา 5 วินาที, 60 oC เป็นเวลา 34 วินาที และ 40 รอบ; ขั้นที่ 3: 95 ◦C เป็นเวลา 15 วินาที, 60 ◦C เป็นเวลา 1 นาที และ 95 ◦C เป็นเวลา 15 วินาที ลำดับไพรเมอร์ของ miRNAs ซึ่งเป็นยีน U6 ถูกนำมาใช้เป็นข้อมูลอ้างอิง [46] และแสดงอยู่ในตารางเสริม S1 การตรวจสอบ qRT-PCR ทั้งหมดดำเนินการโดยใช้การจำลองทางชีวภาพสามรายการและมีการจำลองสามรายการสำหรับแต่ละตัวอย่าง ความสมบูรณ์ของการถอดเสียงคำนวณโดยวิธี 2- Ct และใช้ SPSS (v22.0) และ GraphPad Prism (v8.0) สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูลและการแมปตามลำดับ p < 0.05 หมายถึงความแตกต่างมีนัยสำคัญทางสถิติ

3. ผลลัพธ์

3.1. มูลค่าสัมพัทธ์ของแอนติเจนและแอนติบอดีหลังการฉีดวัคซีน

ผลลัพธ์ของการทดสอบแอนติเจนและแอนติบอดีของ PRRSV ก่อน (วันที่ 0) และหลังการทดสอบ (วันที่ 7) แสดงในตารางที่ 1 การตรวจหาแอนติเจนและแอนติบอดีของ PRRSV ก่อนการทดสอบนั้นเป็นลบ และแอนติเจนนั้น ผลบวกหลังจากการท้าทาย บ่งชี้ว่าสุกรติดเชื้อ CHsx1401 ได้สำเร็จ

3.2. การแยกและการจำแนกซีรัม Exosomes

TEM ค้นพบถุงที่แยกได้จากซีรั่ม ถุงส่วนใหญ่สามารถมองเห็นจานรองเว้าหรือรูปทรงดิสก์ที่อยู่ตรงกลาง ขอบเมมเบรนของเอ็กโซโซมมองเห็นได้ และสัณฐานวิทยาค่อนข้างสมบูรณ์ (รูปที่ 1A, B) การวิเคราะห์การติดตามอนุภาคนาโนแสดงให้เห็นว่า 95.73% ของเอ็กโซโซมมีเส้นผ่านศูนย์กลาง 30–150 นาโนเมตร ส่วนใหญ่อยู่ที่ประมาณ 72.25 นาโนเมตร โดยมีเส้นผ่านศูนย์กลางเฉลี่ย 76.22 นาโนเมตร ซึ่งสอดคล้องกับลักษณะขนาดของเอ็กโซโซม (รูปที่ 1C) ช่วงขนาดนี้คล้ายกับที่ตรวจพบโดย TEM และยืนยันเพิ่มเติมถึงเอกลักษณ์ของถุงเหล่านี้ว่าเป็น exosome การวิเคราะห์เวสเทิร์นบล็อตแสดงให้เห็นว่าถุงที่แยกได้จากตัวอย่างซีรัมมีผลบวกต่อโปรตีน CD9 และ CD81 (รูปที่ 1D) คุณลักษณะข้างต้นเป็นไปตามมาตรฐานการระบุ exosome ที่จัดทำโดย International Society for Extrace Vesicles (ISEV) ใน MISEV2018 [47]

ตารางที่ 1 แอนติเจนและแอนติบอดีของ (วันที่ 0) และ (วันที่ 7) ที่มีไวรัสท้าทาย

รูปที่ 1 ลักษณะสำคัญของซีรั่ม exosomes (A, B) แสดงลักษณะทางสัณฐานวิทยาของถุงโดย TEM สเกลบาร์คือ 500 นาโนเมตรและ 100 นาโนเมตร ตามลำดับ (C) NTA แสดงเส้นผ่านศูนย์กลางและความเข้มข้นของถุงส่วนใหญ่ ( D ) Western blot แสดงให้เห็นว่ามีเครื่องหมาย exosome CD81 และ CD9 ในซีรั่ม exosomes หมายเหตุ: ผลลัพธ์การผสมใน WB คือตัวอย่างสารแขวนลอยแบบผสมที่แยกได้จากชุด exoEasy Maxi

3.3. ลำดับ RNA ขนาดเล็กของเซรั่ม Exosomes

สำหรับแต่ละตัวอย่าง ข้อมูลที่ปลอดภัยถึง 0.5 Gb และเปอร์เซ็นต์ฐานของ Q30 สูงกว่า 96.20% การอ่านค่าที่สะอาดของแต่ละตัวอย่างนั้นสอดคล้องกับจีโนมอ้างอิงของพิก ในบรรดาตัวอย่าง 12 ตัวอย่าง กลุ่มควบคุมได้รับการอ่าน 10,920,887, 10,248,696, 10,109,117, 10,655,494, 9,217,285 และ 9,782,523 ครั้ง ตามลำดับ กลุ่มการรักษาได้รับการอ่าน 11,889,518, 10,593,504, 10,593,504, 12,846,080, 10,105,325, 11,729,451 และ 9,789,542 ครั้งตามลำดับ โดยเฉลี่ยแล้ว 77.96% ของการอ่านที่สะอาดทั้งหมดประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์ที่มีความยาว 19–22 นิวคลีโอไทด์ (nt) (รูปที่ 2A) การอ่านหลังการควบคุมคุณภาพคิดเป็นสัดส่วนมากกว่า 92.59% ของการอ่านทั้งหมด การอ่านสะอาดที่ประมวลผลนั้นสอดคล้องกับจีโนมอ้างอิงของสุกร และอัตราการแมปของไลบรารี 12 แห่งบนจีโนมนั้นมากกว่า 92.30% และอัตราการแมปคือ 94.98% (รูปที่ 2B) มันบ่งชี้ว่าไลบรารี่ exosomal miRNA ในซีรั่มที่สร้างขึ้นนั้นมีคุณภาพสูงและเหมาะสำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม รายละเอียดแสดงอยู่ในตารางเสริม S2

รูปที่ 2 ภาพรวมของข้อมูลการถอดเสียง RNA ขนาดเล็ก ( A ) การกระจายความยาวของจำนวนการอ่านของตัวอย่างซีรั่ม exosome (nt=นิวคลีโอไทด์); ( B ) อัตราของตัวอย่าง 12 ตัวอย่างที่แมปกับจีโนมอ้างอิง

3.4. การวิเคราะห์การแสดงออกที่แตกต่างกันของ miRNA

หลังจากการวิเคราะห์เชิงปริมาณของการแสดงออกของ miRNA ที่ระบุ miRNA จะถูกคัดกรองโดยเกณฑ์ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ในส่วน 2.6 ได้รับ miRNA ทั้งหมด 305 รายการก่อนและหลังการฉีดวัคซีนของสายพันธุ์ CHsx1401 (การควบคุม, n=6; การรักษา, n=6) มีการระบุ miRNA ที่แสดงความแตกต่าง (DE) ทั้งหมด 33 รายการระหว่างทั้งสองกลุ่ม, 13 DE miRNAs ได้รับการควบคุมและ 20 DE miRNAs ได้รับการควบคุมในกลุ่มการรักษา (รูปที่ 3 และตารางเสริม S3)

3.5. การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าการทำงานของยีนเป้าหมาย miRNA

ทำนายยีนเป้าหมายทั้งหมด 7283 ยีนโดย 33 DE miRNAs และหน้าที่ของยีนเป้าหมายส่วนใหญ่เข้มข้นในการควบคุมเชิงบวกของน้ำตก MAPK กระบวนการเมแทบอลิซึมของไขมัน การควบคุมการส่งสัญญาณในเซลล์ น้ำตก ERK1 และ ERK2 เป็นต้น (รูปที่ 4A ). ในแง่ของการทำงานของโมเลกุล ยีนเป้าหมาย miRNA ที่แสดงออกแตกต่างกันส่วนใหญ่จะมุ่งเน้นไปที่กิจกรรมการควบคุมเอนไซม์ GTP กิจกรรมไคเนส กิจกรรมการควบคุมนิวคลีโอไซด์ไตรฟอสฟาเตส และฟังก์ชั่นอื่น ๆ ที่เกี่ยวข้องกับการถ่ายโอนสัญญาณและการเผาผลาญพลังงาน (รูปที่ 4B) นอกจากนี้ ในบรรดาส่วนประกอบของเซลล์ ยีนเป้าหมายส่วนใหญ่มีส่วนร่วมในการทำงานทางชีววิทยาของซูปราโมเลคิวลาร์โพลีเมอร์, กอลกี, ออโตฟาโกโซม, ผิวเซลล์, เอนโดโซมระยะแรก ฯลฯ (รูปที่ 4C) หน้าที่ของส่วนประกอบเหล่านี้มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการก่อตัวของเอ็กโซโซม ซึ่งอธิบายความแม่นยำของการหาลำดับด้วย การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าของวิถี KEGG แสดงให้เห็นว่ายีนเป้าหมายได้รับการเสริมสมรรถนะอย่างมีนัยสำคัญในเอนโดไซโตซิส, เส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK, วิถีการส่งสัญญาณ Rap1, วิถีการส่งสัญญาณสฟิงโกลิพิด และวิถีการส่งสัญญาณ PI3K Akt (p < 0.05) (รูปที่ 5A ). ในขณะเดียวกัน เส้นทางที่ได้รับการเสริมสมรรถนะก็ได้รับการจำแนกและวิเคราะห์ ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าวิถีทาง KEGG ของยีนเป้าหมายส่วนใหญ่อุดมไปด้วยการประมวลผลข้อมูลด้านสิ่งแวดล้อม โรคของมนุษย์ และระบบทางชีวภาพ (รูปที่ 5B)

รูปที่ 3 การแสดงออกที่แตกต่างของ miRNA ใน exosomes ( A ) พล็อตภูเขาไฟของ miRNA ระหว่างกลุ่มควบคุมและกลุ่มบำบัด ( B ) แผนที่ความร้อนการจัดกลุ่มแบบลำดับชั้นของ DE miRNA ระหว่างกลุ่มควบคุมและกลุ่มการรักษา

รูปที่ 4 การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าฟังก์ชัน GO ของยีนเป้าหมาย DE miRNA ( A ) กระบวนการทางชีวภาพของยีนเป้าหมาย DE miRNA; ( B ) หน้าที่ระดับโมเลกุลของยีนเป้าหมาย DE miRNAs; ( C ) ส่วนประกอบเซลล์ของยีนเป้าหมาย DE miRNA

รูปที่ 5 การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าวิถี KEGG ของยีนเป้าหมาย ( A ) วิถีทาง KEGG ที่ได้รับการเสริมสมรรถนะอย่างมีนัยสำคัญด้วยยีนเป้าหมายของ DE miRNAs; ( B ) การจำแนกประเภทของเส้นทาง KEGG ที่ได้รับการเสริมสมรรถนะอย่างมีนัยสำคัญ

3.6. การทำนายการกำหนดเป้าหมายของเซรั่ม Exosomal miRNA และ PRRSV CHsx1401 Genome

ตามคะแนน phastCons ของฐานเดียวหลังจากการจัดตำแหน่งโดย PHAST พบว่ามีทั้งหมดแปดส่วนที่ได้รับการอนุรักษ์มากที่สุด (แถบสีดำเหนือแผนที่จุดสูงสุด) ได้รับในจีโนมของไวรัส (รูปที่ 6) พบว่า DE miRNA ทั้งหมด 31 ตัวเชื่อมโยงกับส่วนที่อนุรักษ์โดยการทำนาย miRNA ที่เชื่อมโยงกับส่วนที่อนุรักษ์ ในหมู่พวกเขา ในภูมิภาคอนุรักษ์ (14,644–15,020 nt) ใกล้กับ 30 UTR (14,870–15,020) ของจีโนม CHsx1401 มากที่สุด 16 DE miRNAs ถูกคาดการณ์ว่าจะจับกับมัน รวมถึง 5 miRNAs (ssc-miR-34 c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 และ ssc-miR-6529) ที่สามารถผูกกับ 30 UTR ของ CHsx1401 ในบรรดา miRNA เหล่านี้ มีเพียง ssc-miR-223 เท่านั้นที่ได้รับการควบคุมหลังการติดเชื้อ และ miRNA อื่นๆ ถูกลดระดับลงหลังการติดเชื้อ ดูตารางเสริม S4 สำหรับรายละเอียด

รูปที่ 6 ส่วนที่ได้รับการอนุรักษ์ในจีโนมของสายพันธุ์ CHsx1401 ที่ทำนายโดย PHAST

3.7. การคัดกรอง DE miRNA ที่เกี่ยวข้องกับฟังก์ชัน Exosome และ PRRSV

miRNA ที่แสดงออกแตกต่างกันหลากหลายที่เกี่ยวข้องกับการทำงานของ exosomes และ PRRSV ถูกค้นพบโดยการวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าการทำงานของยีนเป้าหมาย ในหมู่พวกเขา DE miRNA 11 ตัว เช่น ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 และ ssc-miR-320 มีส่วนเกี่ยวข้องในการดูดซึมจากภายนอก และยีนเป้าหมายของพวกมันส่วนใหญ่กระจุกตัวอยู่ที่ ตระกูลยีน Ras, ตระกูล Annexin และตระกูลยีน ADP ribosylation DE miRNA สิบแปดตัว รวมถึง sscmiR-10b, ssc-miR-124a และ ssc-miR-128 มีส่วนร่วมในวิถีทางที่เกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกัน และยีนเป้าหมายของพวกมันส่วนใหญ่กระจุกตัวอยู่ใน MAPK ตระกูลยีน, ตระกูลยีน PIK3 และตระกูลยีนโปรตีนฟอสฟาเตส ในขณะที่ DE miRNA 11 ตัวเกี่ยวข้องกับการบุกรุกของไวรัส ยีนเป้าหมายที่เกี่ยวข้องส่วนใหญ่กระจุกตัวอยู่ในตระกูลยีน MAPK และตระกูลยีนโปรตีนฟอสฟาเตส นอกจากนี้ miRNA ที่แสดงออกแตกต่างกันหลายรายการ เช่น นวนิยาย_102 DE miRNA หกแห่ง รวมถึง ssc-miR-320, ssc-miR-423-5p, ssc-miR-4331-3p,ssc-miR-7137-3p และ ssc-miR{{ 25}} มีการแสดงออกร่วมกันในฟังก์ชัน exosome การบุกรุกของไวรัส PRRSV และเส้นทางที่เกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกัน ดังแสดงในรูปที่ 7 รายละเอียดแสดงอยู่ในตารางเสริม S5

รูปที่ 7 DE miRNA ที่เกี่ยวข้องกับการดูดซึมจากภายนอก การบุกรุกของ PRRSV และภูมิคุ้มกัน

3.8. QRT-PCR Assay ของ DE miRNAs ระหว่างสองกลุ่ม

สุ่มเลือก DE miRNA ห้ารายการเพื่อการตรวจสอบ ตามผลลัพธ์ของ qRT-PCR การแสดงออกของ ssc-miR-19a และ ssc-miR-32 เพิ่มขึ้นในกลุ่มการรักษา ในขณะที่ ssc-miR-124a, ssc-miR{ {8}} และ ssc-miR{-34c แสดงการแสดงออกที่สูงกว่าในกลุ่มควบคุม ซึ่งสอดคล้องกับข้อมูลการหาลำดับ (รูปที่ 8)

รูปที่ 8 DE miRNA ห้าตัวที่ตรวจสอบโดย qRT-PCR

4. การอภิปราย

PRRSV ยังคงเป็นเชื้อโรคที่ดื้อรั้นในอุตสาหกรรมสุกรทั่วโลก ซึ่งก่อให้เกิดความสูญเสียทางเศรษฐกิจอย่างมหาศาลในโลก ปัจจุบันการฉีดวัคซีนส่วนใหญ่จะใช้เพื่อป้องกันและควบคุม PRRSV โดยวัคซีนไวรัสที่มีชีวิตแบบดัดแปลง (MLV) มีการใช้กันอย่างแพร่หลายมากที่สุด [48] แม้ว่าวัคซีนนี้จะมีประสิทธิภาพในการลดการระบาดและอุบัติการณ์ของ PRRS แต่ยังเพิ่มความแปรปรวนทางพันธุกรรมและความหลากหลายของไวรัสอย่างมาก และนำไปสู่การรวมตัวกันของไวรัสอีกครั้งระหว่างไวรัสวัคซีนในป่าและไวรัสที่มีชีวิตในสนาม [49,50] ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา การแพร่กระจายและความชุกของไวรัสรีคอมบิแนนท์ NADC30- เช่น สายพันธุ์ PRRSV ทำให้เกิดการระบาดของโรคระบบสืบพันธุ์และระบบทางเดินหายใจของสุกรหลายครั้งในประเทศจีน ความคล้ายคลึงกันระหว่าง CHsx1401 และ NADC30 ที่ใช้ในการศึกษานี้ยังคงอยู่ที่ 92.2–99.1% ตั้งแต่นั้นมาก็กลายเป็นโรคระบาดในจีน Exosomes เป็นตัวกลางในการสื่อสารของเซลล์ พบได้ทั่วไปในของเหลวในร่างกายหลายชนิด และมีข้อได้เปรียบเฉพาะในการวินิจฉัยและการรักษาโรค [51,52] ตามรายงานก่อนหน้านี้ เอ็กโซโซมมีบทบาทสำคัญในการสื่อสารในการนำเสนอแอนติเจน [53] การตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน [53,54] การจำลองแบบของไวรัส [54] มะเร็ง [55] โรคเกี่ยวกับระบบประสาท [56] การสร้างเส้นเลือดใหม่ [57] เซลล์เนื้องอก การอพยพ [58] และการบุกรุก [59] และมีมูลค่าการวิจัยสูง

ในการศึกษานี้ใช้เทคโนโลยีการหาลำดับปริมาณงานสูงเพื่อสร้างโปรไฟล์การแสดงออกของ miRNA ของซีรั่มเอ็กโซโซม และระบุ DE miRNA 33 ตัว ดังที่เราทุกคนทราบ miRNA ที่เข้ารหัสโดยโฮสต์สามารถจับกับจีโนมของไวรัส จากนั้นควบคุมการจำลอง การสังเคราะห์ และการปล่อยไวรัสเพื่อจำกัดการติดเชื้อและส่งผลต่อกระบวนการทางพยาธิวิทยา [15] การศึกษา miRNA ที่กำหนดเป้าหมายไปที่จีโนมของไวรัสก็มีการรายงานซ้ำแล้วซ้ำอีกในสัตว์ gga-miR-454 และ gga-miR-130b ในโรคเบอร์ซาลที่ติดเชื้อในไก่สามารถกำหนดเป้าหมายจีโนมของไวรัสเพื่อยับยั้งการจำลองแบบของไวรัส ในขณะที่ gga-miR-21 กำหนดเป้าหมายโดยตรงไปที่โปรตีนของไวรัส VP1 เพื่อยับยั้ง การแปลโปรตีนของไวรัส [60,61] ในการศึกษา PRRSV นั้น ssc-miR-181 ผูกกับบริเวณปลายน้ำของไวรัส ORF4 ที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างสูง และยับยั้งการจำลองแบบ PRRSV อย่างรุนแรง [62] ในการศึกษานี้ ความแตกต่างการแสดงออกของ ssc-miR-181 ระหว่างทั้งสองกลุ่มไม่ถึงระดับที่มีนัยสำคัญ ในการศึกษาของเรา เปรียบเทียบจีโนมของไวรัส PRRSV เก้าชนิดที่แตกต่างกันกับจีโนมของสายพันธุ์ CHsx1401 และระบุแปดกลุ่มที่ได้รับการอนุรักษ์มากที่สุด คาดการณ์ว่า 31 DE miRNA สามารถผูกกับ 8 ส่วนที่ได้รับการอนุรักษ์มากที่สุดของ CHsx1401 และ 16 DE miRNA สามารถผูกกับลำดับที่อนุรักษ์ไว้ใกล้กับ 30 UTR ของ CHsx1401 ในจำนวนนั้น มี DE miRNA 5 ตัว (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 และ ssc-miR{{ 36}}) สามารถผูกกับ CHsx1401 30 UTR ได้พร้อมกัน นอกจากนี้ คาดว่าการแสดงออกที่ได้รับการควบคุมของ ssc-miR-223 จะเชื่อมโยงกับเป้าหมาย 30 UTR ของจีโนม PRRSV ผลการวิจัยพบว่าลำดับที่อนุรักษ์ไว้ของจีโนมของไวรัสอาจมีบทบาทสำคัญในการทำให้เกิดโรค และ miRNA ที่สามารถผูกกับลำดับที่สงวนไว้ระหว่างจีโนมของสายพันธุ์ PRRSV ที่แตกต่างกันอาจมีความสำคัญสำคัญในการควบคุมการทำให้เกิดโรคของไวรัส miRNA ที่แสดงออกแตกต่างกันบางตัวได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเกี่ยวข้องกับ PRRSV จากการศึกษาก่อนหน้านี้ และยังเกี่ยวข้องโดยตรงกับกฎระเบียบของ PRRSV รวมถึง ssc-miR-10b [63], ssc-miR-378 [30] , ssc-miR-124a [64], ให้-7f-5p [65], ssc-miR-744 [66] และ ssc-miR{{57 }}ก [67]

PRRSV สามารถหลบเลี่ยงการป้องกันโฮสต์ได้โดยการแทรกแซงการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ กระบวนการนี้ถูกควบคุมโดยเส้นทางการส่งสัญญาณมากมาย รวมถึงเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK, เส้นทางการส่งสัญญาณ PI3K Akt, การดูดเลือดอัตโนมัติ, เคมีบำบัด และวิถีการส่งสัญญาณ TNF ปัจจุบัน เส้นทางการส่งสัญญาณของ MAPK ประกอบด้วยเส้นทางหลักสามเส้นทาง: เส้นทาง ERK1/2, JNK และ p38 การเปิดใช้งาน MAPK cascade สามารถส่งเสริมการตายของเซลล์โฮสต์ ช่วยให้ไวรัสหลบหนีการตอบสนองการป้องกันระบบภูมิคุ้มกันของโฮสต์ และส่งเสริมการจำลองแบบ PRRSV [68] นอกจากนี้ การเปิดใช้งานไคเนสของ c-Jun N-terminal kinase (JNKs) และ p38 ยังสามารถส่งเสริมการปลดปล่อยปัจจัยการอักเสบ IL -10 [68–70] และเพิ่มผลการอักเสบ นอกเหนือจากการกระตุ้นการตายของเซลล์แล้ว PRRSV ยังสามารถกระตุ้น autophagy ซึ่งสามารถส่งเสริมการจำลองแบบ PRRSV การเปิดใช้งาน PI3K/Akt เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการเข้าสู่ไวรัสและการส่งเสริมการจำลองแบบของไวรัส และ Akt ที่กระตุ้นด้วย PRRSV จะยับยั้งการตายของเซลล์โฮสต์โดยการควบคุมวิถีทางลบของ JNK [71] TNF สามารถมีบทบาทสำคัญในการเหนี่ยวนำและการควบคุมการตอบสนองต่อการอักเสบร่วมกับปัจจัยการอักเสบอื่นๆ แต่การแสดงออกของ TNF ได้รับผลกระทบจากการควบคุมเชิงลบของการจำลองแบบ PRRSV [72] ในการศึกษานี้ miRNA (ssc-miR-10b, ssc-miR-122-5p, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, ssc-miR{ {24}}a-5p ฯลฯ) ที่เพิ่มขึ้นในวิถีเหล่านี้เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ การกินอัตโนมัติ และการอักเสบที่เกิดจาก PRRSV และเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันของไวรัส การหลีกเลี่ยงของระบบภูมิคุ้มกัน และการจำลองแบบ

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

เมมเบรนพลาสมาของเซลล์อุดมไปด้วยลิพิดแพตหลากหลายชนิด และสฟิงโกลิพิดที่อุดมด้วยโคเลสเตอรอลและสฟิงโกไลปิด (สฟิงโกไมอีลินและไกลโคสฟิงโกลิพิด) เป็นโมเลกุลสำคัญของแพลิพิด การรับรู้ไขมันโดยโปรตีนบางชนิดของไวรัสอาจเป็นเงื่อนไขที่จำเป็นสำหรับการเข้ามาของไวรัส [73] ไวรัสแบบซองจดหมายจะใส่ไกลโคโปรตีนแบบซองของไวรัสลงในแพลิพิดในระยะที่ไวรัสเข้ามา ทำปฏิกิริยากับตัวรับที่อยู่ในแพลตลิพิด หรือเปลี่ยนจากสถานะตามธรรมชาติเป็นรูปแบบที่กระตุ้นเพื่อเริ่มต้นหรือส่งเสริมการทำให้เป็นภายใน/ฟิวชั่นของไวรัส เช่น HSV, โคโรนาไวรัสซาร์ส และ ไวรัสโรคอุจจาระร่วงระบาดลูกสุกร [73,74]. การศึกษาก่อนหน้านี้พบว่าการกำจัดโคเลสเตอรอลออกจากพื้นผิวเซลล์ MARC-145 ช่วยลดการติดเชื้อ PRRSV ได้อย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการยับยั้งการติดเชื้อ PRRSV ได้รับการสื่อกลางโดยการกำจัดโคเลสเตอรอลในเซลล์โดยเฉพาะ การลดลงของคอเลสเตอรอลในเยื่อหุ้มเซลล์ยับยั้งการเข้ามาของไวรัสอย่างมีนัยสำคัญ โดยเฉพาะอย่างยิ่งการเกาะติดของไวรัสและการปลดปล่อย [75] เมแทบอลิซึมของสฟิงโกไลปิดสามารถควบคุมโครงสร้างเมมเบรนและการยึดเกาะ ซึ่งมีความสำคัญอย่างยิ่งในการบุกรุกของไวรัส PRRSV ภาวะเอนโดโทซิสเป็นส่วนเสริมที่สำคัญที่สุดในการศึกษานี้ Endocytosis เป็นกลไกสำคัญของการดูดซึม exosome โดยเซลล์เป้าหมาย การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการดูดซึม exosome เป็นกระบวนการที่ต้องการพลังงานและขึ้นอยู่กับโครงร่างโครงกระดูก ซึ่งเน้นถึงบทบาทที่เป็นไปได้ของ endocytosis ในกระบวนการนี้ [76] ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าหลายวิธีสามารถเป็นสื่อกลางของกระบวนการนี้ได้ รวมถึง phagocytosis, macropinocytosis, clathrin เป็นต้น [77,78] ซึ่งนำไปสู่การจำแนกประเภทและบทบาทของสาร endocytosed ที่แตกต่างกัน การเพิ่มคุณค่าของ miRNAs exosomal ที่แสดงออกแตกต่างกันในวิถีทางนี้บ่งชี้ว่า exosomes มีบทบาทสำคัญในการติดเชื้อ PRRSV และการควบคุมการขนส่งเนื้อหาและการดูดซึมใน exosomes อาจนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงทางพยาธิสรีรวิทยาในเซลล์และอวัยวะเป้าหมาย

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

5. สรุปผลการวิจัย

จากการระบุและการวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศศาสตร์ของ miRNA ในซีรั่มจากสุกรที่ติดเชื้อ PRRSV วิถีทางที่เกี่ยวข้องกับ PRRSV ที่หลากหลายและ miRNA ที่แสดงออกแตกต่างกันได้รับในการศึกษานี้ เช่น ssc-miR-4331-3p, ssc-miR{{ 5}}, sscmiR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128 ฯลฯ ซึ่งมีบทบาทหน้าที่ที่เป็นไปได้ใน PRRSV - กระตุ้นให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน การบุกรุก และการดูดซึมจากภายนอก นอกจากนี้ เนื่องจาก miRNA เดี่ยวสามารถกำหนดเป้าหมายยีนได้หลายยีน และยีนตัวเดียวยังถูกควบคุมโดย miRNA หลายตัวด้วย miRNA หลายตัวจึงทำหน้าที่หลายอย่างในวิถีทางข้างต้น miRNA บางตัวได้รับการตรวจสอบเพื่อควบคุมการติดเชื้อ PRRSV โดยออกฤทธิ์ต่อตัวรับหลักหรือกำหนดเป้าหมายโดยตรงไปที่จีโนมของไวรัส เช่น ssc-miR-10b, ssc-miR-378, miR-124a Let-7f-5p, ssc-miR-744, ssc-miR-19a ฯลฯ ขณะเดียวกัน การศึกษาครั้งนี้ยังได้ทำนาย miRNA หลากหลายชนิดที่สามารถผูกกับ ส่วนที่ได้รับการอนุรักษ์มากที่สุดของ 30 UTR ของจีโนมไวรัส CHX1401 รวมถึง ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR{{34} } และ ssc-miR-6529 ซึ่งอาจมีความสำคัญในการควบคุมการเกิดโรคของไวรัส

อ้างอิง

1. สไนจ์เดอร์, อีเจ; คิกเคิร์ต ม.; Fang, Y. Arterivirus อณูชีววิทยาและการเกิดโรค เจ. พล. วิโรล. 2013, 94 พอยต์ 10, 2141–2163. [CrossRef] [PubMed]

2. ลู ย.; จาง ย.; เซียง เอ็กซ์.; ชาร์มา ม.; หลิวเค; เหว่ย เจ.; เชา ด.; หลี่ บ.; ตอง ก.; ออลสซิฟสกี้, แมสซาชูเซตส์; และคณะ การส่งสัญญาณรอยบากมีส่วนช่วยในการแสดงออกของไซโตไคน์อักเสบที่เกิดจากการติดเชื้อไวรัสระบบสืบพันธุ์และโรคระบบทางเดินหายใจของหมูที่ทำให้เกิดโรคสูง (HP-PRRSV) ในแมคโครฟาจของถุงหมู นักพัฒนา คอมพ์ อิมมูนอล. 2020, 108, 103690. [CrossRef] [PubMed]

3. เดีย ส.; ซอว์เยอร์ น.; อแลง อาร์.; Athanassious, R. ลักษณะโครงสร้างพิเศษและการสร้างสัณฐานวิทยาของไวรัสกลุ่มอาการระบบทางเดินหายใจและสืบพันธุ์ของสุกรแพร่กระจายในโคลนเซลล์ MARC-145 ที่อนุญาตสูง โฆษณา ประสบการณ์ ยา ไบโอล 1995, 380, 95–98. [ผับเมด]

4. Dokland, T. ชีววิทยาโครงสร้างของ PRRSV. ไวรัส Res 2010, 154, 86–97. [CrossRef] [PubMed]

5. จอห์นสัน, CR; กริกส์, TF; กันนันดาราชา เจ.; Murtaugh, MP Novel โปรตีนโครงสร้างในไวรัสระบบสืบพันธุ์และโรคระบบทางเดินหายใจของสุกรที่เข้ารหัสโดย ORF5 ทางเลือกที่มีอยู่ใน arteriviruses ทั้งหมด เจ. พล. วิโรล. 2011, 92 พอยต์ 5, 1107–1116. [CrossRef] [PubMed]

6. ลี เซาท์แคโรไลนา; ลี ส.; ยู GW; ชอย, HW; โนห์ ยงฮวา; พาร์ค, ซีอี; ชิน เจเอช; ยุน ไอเจ; คัง SY; Lee, C. การวิเคราะห์ฟีโนไทป์และจีโนไทป์ของสายพันธุ์ไวรัสกลุ่มอาการระบบสืบพันธุ์และระบบทางเดินหายใจของสุกรที่ถูกลดทอนหลังจากข้อความต่อเนื่องในแมคโครฟาจถุงขนาดใหญ่ของสุกรที่เพาะเลี้ยง เจ.สัตวแพทย์. วิทยาศาสตร์ 2018, 19, 358–367. [CrossRef] [PubMed]

7. เซโบรสกา อ.; สโคว์โรเน็ค, อ.; โวยาคอฟสกา อ.; วิฑลักษณ์ ป.; Pietrowska, M. Metabolome ของ exosomes: มุ่งเน้นไปที่ถุงที่ปล่อยออกมาจากเซลล์มะเร็งและมีอยู่ในของเหลวในร่างกายมนุษย์ นานาชาติ เจ. โมล. วิทยาศาสตร์ 2019, 20, 3461. [CrossRef]

8. เบเบลแมน ส.ส.; สมิท, เอ็มเจ; เพกเทล, DM; Baglio, SR Biogenesis และการทำงานของถุงนอกเซลล์ในมะเร็ง เภสัช เธอ. 2018, 188, 1–11. [ครอสอ้างอิง]

9. ซาโบรอฟสกี้ ส.ส.; บาลาจ, ล.; เบรคฟิลด์, XO; ลาย ถุงนอกเซลล์ CP: องค์ประกอบ ความเกี่ยวข้องทางชีวภาพ และวิธีการศึกษา วิทยาศาสตร์ชีวภาพ 2015, 65, 783–797 [ครอสอ้างอิง]

10. อัลมูห์ลิค, FB; เกาะ YQ; เพอริส, HN; วาสวานี, ก.; ฮอลแลนด์ โอ.; ไมเออร์ ส.; โรช เจอาร์; เบิร์ค, CR; ครุกเคนเดน, แมสซาชูเซตส์; อารัคชิเก, บีเจ; และคณะ การหมุนเวียนของเอ็กโซโซมอาจระบุตัวชี้วัดทางชีวภาพของวัวที่มีความเสี่ยงต่อความผิดปกติของการเผาผลาญ วิทยาศาสตร์ ตัวแทน 2019, 9, 13879. [CrossRef]

11. จาง RC; ตู้ WQ; จาง เจวาย; หยู SX; ลู เอฟแซด; ติง HM; เฉิง วายบี; เรน, ซี.; Geng, DQ Mesenchymal การรักษาด้วยเซลล์ต้นกำเนิดสำหรับการบาดเจ็บของเส้นประสาทส่วนปลาย: การทบทวนคำบรรยาย การฟื้นฟูระบบประสาท ความละเอียด 2021, 16, 2170–2176. [ผับเมด]

12. บริซกูโนวา OE; ซาริปอฟ, MM; สควอร์ตโซวา, เตหะราน; เลคชอฟ, อีเอ; กริกอร์อีวา, AE; ซาโปโรจเชนโก ไอโอวา; โมรอซคิน, อีเอส; เรียบชิโควา, อีไอ; ยูร์เชนโก, YB; วอยซิตสกี เวฟ; และคณะ การศึกษาเปรียบเทียบถุงน้ำนอกเซลล์จากปัสสาวะของบุคคลที่มีสุขภาพดีและผู้ป่วยมะเร็งต่อมลูกหมาก โปรดหนึ่ง 2016, 11, e0157566 [CrossRef] [PubMed]

13. กามูซี ก.; เดเรจิบัส พิธีกร; บรูโน ส.; เกรนจ์ ค.; ฟอนซาโต วี.; Tetta, C. การเขียนโปรแกรมเซลล์ epigenetic ใหม่โดยใช้ Exosome/microvesicle เช้า. เจ. มะเร็ง Res. 2011, 1, 98–110. [ผับเมด]

14. ทัมโควิช SN; ตูทานอฟ OS; Laktionov, PP Exosomes: การสร้าง โครงสร้าง การขนส่ง กิจกรรมทางชีวภาพ และการประยุกต์ใช้ในการวินิจฉัย ไบโอเคม มอส. อุปทาน เซอร์ สมาชิก. เซลล์ไบโอล 2016, 10, 163–173. [ครอสอ้างอิง]

15. Bartel, DP MicroRNAs: จีโนม, การสร้างทางชีวภาพ, กลไกและการทำงาน เซลล์ 2004, 116, 281–297 [ครอสอ้างอิง]

16. กอร์ดิโน ก.; คอสตา-เปเรรา ส.; กอร์เรเดรา, ป.; อัลเวส ป.; คอสตา ล.; โกเมส, เอคิว; ซิลวา-ซานโตส บ.; Ribot, JC MicroRNA-181จำกัดการสร้างความแตกต่างของเซลล์ δ ทีเซลล์ของมนุษย์โดยการกำหนดเป้าหมาย Map3k2 และ Notch2 ตัวแทน EMBO 2022, 23, e52234 [ครอสอ้างอิง]

17. หลิว บ.; ยัน ล.; จิย.; ซัน ย.; Yang, X. RNA AFAP แบบไม่เข้ารหัสแบบยาว1-AS1 ช่วยอำนวยความสะดวกในการลุกลามของมะเร็งรังไข่โดยควบคุมแกน miR-107/PDK4 เจ. รังไข่ Res. 14, 60. 2021. [CrossRef]

18. คิม ย.; ลี ดีเอช; พาร์ค, เซาท์แคโรไลนา; จอน, TI; Jung, CH การทำงานร่วมกันของ microRNA และปัจจัยการถอดรหัสในการควบคุมการกินอัตโนมัติในโรคตับไขมันที่ไม่มีแอลกอฮอล์ ประสบการณ์ โมล ยา 2021, 53, 548–559. [ครอสอ้างอิง]

19. ด.ช.คาซเมียร์แชค; โจเปค, เค.; สเตอร์ซินสกา, เค.; โนวิกิ ม.; รูซินสกี้ ม.; Januchowski, R. รายละเอียดของการแสดงออกของ microRNA และบทบาทที่เป็นไปได้ในการควบคุมยีนที่ดื้อยาในเซลล์มะเร็งรังไข่ที่ดื้อต่อซิสพลาตินและแพ็กลิทาเซล นานาชาติ เจ. โมล. วิทยาศาสตร์ 2022, 23, 526. [CrossRef]

20. กง ย.; เหว่ย เอ็กซ์.; ซัน, ว.; เร็น เอ็กซ์.; เฉินเจ.; อเวยา เจเจ; แม่ฮ.; ชาน, เคจี; จาง ย.; Li, S. Exosomal miR-224 มีส่วนทำให้เกิดภาวะสมดุลของจุลินทรีย์ในเม็ดเลือดแดงในระหว่างการติดเชื้อแบคทีเรียในสัตว์จำพวกครัสเตเชียน PLoS Pathog. 2021, 17, e1009837. [ครอสอ้างอิง]

21. เฉิง ย.; คูว.; จู้ ด.; ยูเอ็กซ์.; Zhu, Y. ทิศทางในอนาคตในการวินิจฉัย การพยากรณ์โรค และการติดตามโรคของมะเร็งต่อมหมวกไต: ไบโอมาร์คเกอร์ชนิดไม่รุกรานแบบใหม่ ด้านหน้า. เอ็นโดคริโนล 2022, 12, 811293. [CrossRef] [PubMed]

22. กัลโล อ.; แทนดอน ม.; อเลวิโซส, I.; Illei, GG microRNA ส่วนใหญ่ที่ตรวจพบได้ในซีรั่มและน้ำลายนั้นมีความเข้มข้นในเอ็กโซโซม โปรดหนึ่ง 2012, 7, e30679 [CrossRef] [PubMed]

23. แฟน บ.; ชอปป์ ม.; จาง, ZG; Liu, XS บทบาทใหม่ของ microRNAs ในฐานะไบโอมาร์คเกอร์และเป้าหมายในการรักษาโรคระบบประสาทเบาหวาน ด้านหน้า. นิวรอล. 2020, 11, 558758 [CrossRef] [PubMed]

24. เหว่ย เอช.; เฉินคิว.; ลิน ล.; ชาค.; หลี่ ต.; หลิวย.; หยิน เอ็กซ์.; ซูย.; เฉิน, ล.; เกาว.; และคณะ การควบคุมการผลิตและการคัดแยกสินค้าที่แปลกใหม่ นานาชาติ เจ. ไบโอล. วิทยาศาสตร์ 2021, 17, 163–177. [ครอสอ้างอิง]

25. เจีย เอ็กซ์.; บี, ย.; หลี่ เจ.; เสีย คิว.; หยาง เอช.; Liu, W. Cellular microRNA miR-26a ยับยั้งการจำลองแบบของไวรัสกลุ่มอาการระบบสืบพันธุ์และทางเดินหายใจของสุกรโดยการกระตุ้นภูมิคุ้มกันต้านไวรัสโดยกำเนิด วิทยาศาสตร์ ตัวแทน 2015, 5, 10651. [CrossRef]

26. หลี่ ล.; เหว่ย ซ.; โจว ย.; เจียงย.; หยู ล.; เจิ้ง เอช.; ตองว.; หยาง ส.; เจิ้ง เอช.; ฉาน ต.; และคณะ Host miR-26ยับยั้งการจำลองแบบของไวรัสกลุ่มอาการระบบสืบพันธุ์และทางเดินหายใจของสุกรโดยการควบคุมอินเตอร์เฟอรอนประเภท I ไวรัส Res 2015, 195, 86–94. [ครอสอ้างอิง]

27. หลิว เอฟ.; วัง, เอช.; ดู่ ล.; เหว่ย ซ.; จางคิว.; Feng, WH MicroRNA-30c กำหนดเป้าหมายสายเบต้าของตัวรับอินเตอร์เฟอรอน–อัลฟา/เบต้าเพื่อส่งเสริมการติดเชื้อ PRRSV ประเภท 2 เจ. พล. วิโรล. 2018, 99, 1671–1680. [ครอสอ้างอิง]

28. จาง คิว.; หวาง ค.; หยางคิว.; เกา ล.; หลิว HC; ถังเจ.; Feng, WH MicroRNA-30c ปรับการตอบสนอง IFN ประเภท 1 เพื่ออำนวยความสะดวกในการติดเชื้อไวรัสกลุ่มอาการระบบทางเดินหายใจและสืบพันธุ์ของสุกรโดยกำหนดเป้าหมายไปที่ JAK1 เจ. อิมมูนอล. 2016, 196, 2272–2282. [ครอสอ้างอิง]

29. ด. วัง; เฉา, ล.; ซู่ซ.; ฝาง ล.; จงย.; เฉินคิว.; หลัวร.; เฉิน เอช.; หลี่เค.; Xiao, S. MiR-125b ลดการจำลองแบบของไวรัสกลุ่มอาการระบบสืบพันธุ์และทางเดินหายใจของสุกรโดยควบคุมวิถีทาง NF-κB ในทางลบ โปรดหนึ่ง 2013, 8, e55838 [ครอสอ้างอิง]

30. จาง คิว.; กัว XK; เกา ล.; หวาง ค.; หลี่ น.; เจียเอ็กซ์.; หลิวว.; Feng, WH MicroRNA-23 ยับยั้งการจำลองแบบ PRRSV โดยการกำหนดเป้าหมาย PRRSV RNA โดยตรง และอาจเป็นไปได้โดยการควบคุมอินเตอร์เฟอรอนประเภท I ไวรัสวิทยา 2014, 450–451, 182–195 [ครอสอ้างอิง]

31. วู เจ.; เป็ง เอ็กซ์.; โจว อ.; เฉียว ม.; วู, เอช.; เซียว เอช.; หลิว ก.; เจิ้งเอ็กซ์.; จาง ส.; Mei, S. MiR-506 ยับยั้งการจำลองแบบ PRRSV ในเซลล์ MARC-145 ผ่านทาง CD151 โมล เซลล์ ไบโอเคม 2014, 394, 275–281. [ครอสอ้างอิง]

32. เกา ล.; กัว XK; วัง, ล.; จางคิว.; หลี่ น.; เฉิน XX; วังย.; Feng, WH MicroRNA 181 ยับยั้งการติดเชื้อไวรัสกลุ่มอาการระบบสืบพันธุ์และทางเดินหายใจ (PRRSV) ของสุกรโดยกำหนดเป้าหมายไปที่ CD163 ตัวรับ PRRSV เจ. วิโรล. 2013, 87, 8808–8812. [ครอสอ้างอิง]

33. เซียว ส.; ดู่ ต.; วังเอ็กซ์.; NIH.; ยัน, ย.; หลี่ น.; จาง ค.; จางอ.; เกา เจ.; หลิวเอช.; และคณะ MiR-22 ส่งเสริมการจำลองแบบของไวรัสกลุ่มอาการระบบสืบพันธุ์และทางเดินหายใจของสุกรโดยกำหนดเป้าหมายปัจจัยโฮสต์ HO-1 สัตวแพทย์ ไมโครไบโอล 2016, 192, 226–230. [ครอสอ้างอิง]

34. เซียว ส.; วังเอ็กซ์.; NIH.; หลี่ น.; จางอ.; หลิวเอช.; ปู่ ฟ.; ซู ล.; เกา เจ.; จ้าวคิว.; และคณะ MicroRNA miR-24-3p ส่งเสริมการจำลองแบบของไวรัสกลุ่มอาการระบบทางเดินหายใจและการสืบพันธุ์ของสุกร ผ่านการยับยั้งการแสดงออกของฮีมออกซิเนส-1 เจ. วิโรล. 2015, 89, 4494–4503. [ครอสอ้างอิง]

35. บัตเลอร์ เจอี; ซินกอรา ม.; วังก.; สเตปาโนวา, เค.; หลี่ย.; Cai, X. การก่อกวนของการพัฒนา thymocyte เป็นเหตุให้เกิดการระบาดใหญ่ของ PRRS: สมมติฐานที่ทดสอบได้ ด้านหน้า. อิมมูนอล. 2019, 10, 1077. [CrossRef]

36. โจว ล.; วังซ.; ติ๊ง ย.; สเตปาโนวา, เค.; หลี่ย.; Cai, X. NADC30-เหมือนกับสายพันธุ์ไวรัสกลุ่มอาการระบบสืบพันธุ์และทางเดินหายใจของสุกร ประเทศจีน โผล่ออกมา ติดเชื้อ โรค 2015, 21, 2256–2257. [ครอสอ้างอิง]

37. โจว ล.; หยาง บ.; ซู ล.; จิน เอช.; จีอีเอ็กซ์.; กัว เอ็กซ์.; ฮันเจ.; Yang, H. การประเมินประสิทธิภาพของวัคซีนไวรัสมีชีวิตดัดแปลง 3 ชนิดต่อสายพันธุ์ไวรัสระบบสืบพันธุ์และกลุ่มอาการทางเดินหายใจของสุกร NADC30- สัตวแพทย์ ไมโครไบโอล 2017, 207, 108–116. [ครอสอ้างอิง]

38. หว่อง น.; Wang, X. miRDB: แหล่งข้อมูลออนไลน์สำหรับการทำนายเป้าหมาย microRNA และคำอธิบายประกอบการทำงาน กรดนิวคลีอิก Res 2015, 43, D146–D152. [ครอสอ้างอิง]

39. ฟรีดลันเดอร์ ม.ร.ว.; แมคโคเวียค, เซาท์ดาโกตา; หลี่ น.; เฉิน ว.; Rajewsky, N. miRDeep2 ระบุยีน microRNA ที่เป็นที่รู้จักและแปลกใหม่หลายร้อยยีนใน clades สัตว์เจ็ดชนิดได้อย่างแม่นยำ กรดนิวคลีอิก Res 2012, 40, 37–52. [ครอสอ้างอิง]

40. เหวิน ม.; เซินย.; ชิ ส.; Tang, T. miREvo: แพลตฟอร์มการวิเคราะห์วิวัฒนาการ microRNA แบบบูรณาการสำหรับการทดลองหาลำดับยุคถัดไป บีเอ็มซี ไบโออินฟอร์ม 2012, 13, 140. [CrossRef]

41. แอนเดอร์ส ส.; Huber, W. การวิเคราะห์นิพจน์เชิงอนุพันธ์สำหรับข้อมูลการนับลำดับ จีโนมไบโอล 2010, 11, R106. [CrossRef] [PubMed]

42. ทามูระ ค.; สเตเชอร์, ก.; Kumar, S. MEGA11: การวิเคราะห์อณูพันธุศาสตร์วิวัฒนาการระดับโมเลกุล เวอร์ชัน 11 โมล ไบโอล อีโวล 2021, 38, 3022–3027. [CrossRef] [PubMed]

43. ฮูบิสซ์, เอ็มเจ; พอลลาร์ด, แคนซัส; Siepel, A. PHAST และ RPHAST: การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการด้วยแบบจำลองอวกาศ/เวลา รวบรัด. ไบโออินฟอร์ม 2554, 12, 41–51. [CrossRef] [PubMed]

44. ครูเกอร์ เจ.; Rehmsmeier, M. RNAhybrid: การทำนายเป้าหมาย microRNA ง่าย รวดเร็ว และยืดหยุ่น กรดนิวคลีอิก Res 2006, 34, ส451–W454. [ครอสอ้างอิง]

45. ยู ก.; วัง, แอลจี; ฮัน ย.; เขา QY ClusterProfiler: แพ็คเกจ R สำหรับการเปรียบเทียบธีมทางชีววิทยาระหว่างกลุ่มยีน โอมิกส์ 2012, 16, 284–287. [ครอสอ้างอิง]

46. ​​คิว ร.; ติง ก.; เฉินเจ.; Cao, L. การวิเคราะห์ microRNAs exosomal ในซีรั่มและคุณสมบัติทางคลินิกของผู้ป่วยมะเร็งตับอ่อน เวิลด์ เจ. เซอร์ก. อองคอล. 2013, 11, 219. [CrossRef]

47. เธรี ค.; วิทเวอร์, กิโลวัตต์; ไอคาวะ อี.; อัลคาราซ, เอ็มเจ; แอนเดอร์สัน เจดี; อันเดรียนซิโตไฮนา, ร.; อันโตนิโออู, อ.; อาหรับ ต.; อาร์เชอร์ เอฟ.; แอตคิน-สมิธ, จีเค; และคณะ ข้อมูลขั้นต่ำสำหรับการศึกษาถุงนอกเซลล์ปี 2018 (MISEV2018): คำแถลงจุดยืนของสมาคมระหว่างประเทศสำหรับถุงนอกเซลล์และการอัปเดตแนวทาง MISEV2014 เจ. เอ็กซ์ตร้าเซลล์. ถุง 2018, 7, 1535750. [CrossRef]

48. ลยู ก.-ส.; ชอย เจวาย; ฮาห์น ไต้หวัน; พาร์ก, KT; Kim, HK ผลของการฉีดวัคซีนด้วยวัคซีนไวรัสระบบสืบพันธุ์และโรคทางเดินหายใจของสุกรมีชีวิตที่ได้รับการดัดแปลงต่อประสิทธิภาพการเจริญเติบโตในสุกรขุนภายใต้สภาพสนาม เจ.สัตวแพทย์. ยา วิทยาศาสตร์ 2016, 78, 1533–1536. [ครอสอ้างอิง]

49. เบียน ต.; ซัน ย.; เฮา ม.; โจว ล.; จีอีเอ็กซ์.; กัว เอ็กซ์.; ฮันเจ.; Yang, H. ไวรัสกลุ่มอาการระบบสืบพันธุ์และทางเดินหายใจของสุกรชนิดรีคอมบิแนนท์ชนิดที่ 2 ระหว่าง NADC30- และลักษณะคล้าย MLV: ลักษณะทางพันธุกรรมและการเกิดโรคของลูกสุกร ติดเชื้อ เจเนท. อีโวล 2017, 54, 279–286. [ครอสอ้างอิง]

50. หลี่ย.; จีจี.; วังเจ.; ตาล ฟ.; จ้วง เจ.; หลี่เอ็กซ์.; Tian, ​​K. ลำดับจีโนมที่สมบูรณ์ของ NADC30- เช่นเดียวกับไวรัสกลุ่มอาการระบบสืบพันธุ์และทางเดินหายใจของสุกร ซึ่งมีคุณลักษณะเฉพาะคือการรวมตัวกันอีกครั้งกับสายพันธุ์อื่นๆ ประกาศจีโนม 2016, 4, จ00330-16 [ครอสอ้างอิง]

51. คัลลูรี ร.; Lebleu, VS ชีววิทยา การทำงาน และการประยุกต์ใช้ทางชีวการแพทย์ของเอ็กโซโซม วิทยาศาสตร์ 2020, 367, eaau6977. [CrossRef] [PubMed]

52. Miao, XY ความก้าวหน้าล่าสุดในการทำความเข้าใจบทบาทของ miRNA ใน exosomes และศักยภาพในการรักษา เจ. อินทิเกรต. เกษตร. 2017, 16, 753–761. [ครอสอ้างอิง]

53. เชโนดา บีบี; Ajit, SK การปรับการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันโดย exosomes ที่ได้มาจากเซลล์ที่สร้างแอนติเจน คลินิก. ยา ข้อมูลเชิงลึกปทุม. 2016, 9 (อาหารเสริม S1), CPath-S39925. [CrossRef] [PubMed]

54. หลี่ ส.; หลี่ ส.; วู ส.; Chen, L. Exosomes ปรับการจำลองแบบของไวรัสและโฮสต์การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในการติดเชื้อ HBV ไบโอเมด เรส นานาชาติ 2019, 2019, 2103943. [CrossRef]

55. กรีนนิ่ง DW; โกปาล, SK; ซูร.; ซิมป์สัน อาร์เจ; Chen, W. Exosomes และบทบาทในการควบคุมระบบภูมิคุ้มกันและมะเร็ง ในการสัมมนาทางชีววิทยาเซลล์และพัฒนาการ; สื่อวิชาการ: Cambridge, MA, USA, 2015; เล่มที่ 40 หน้า 72–81

56. ฮาววิตต์ เจ.; Hill, AF Exosomes ในพยาธิวิทยาของโรคทางระบบประสาท เจ. ไบโอล. เคมี. 2016, 291, 26589–26597. [ครอสอ้างอิง]

57. ริเบโร่ MF; จู้ เอช.; มิลลาร์ด RW; Fan, G. Exosomes ทำหน้าที่ในการสร้างและต่อต้านการสร้างเส้นเลือดใหม่ สกุลเงิน การสร้างเส้นเลือดใหม่ 2013, 2, 54–59 [ครอสอ้างอิง]

58. แลน เจ.; ซัน, ล.; ซู ฟ.; หลิว ล.; หู่ฟ.; ซ่ง ด.; ฮูซ.; วูวว.; หลัว เอ็กซ์.; วังเจ.; และคณะ เอ็กโซโซมที่ได้มาจาก M2 มาโครฟาจส่งเสริมการย้ายเซลล์และการบุกรุกในมะเร็งลำไส้ใหญ่ มะเร็ง Res 2019, 79, 146–158. [ครอสอ้างอิง]

59. อากะ ม.; เบนซ์ จีแอล; ราฟฟา ส.; ทอร์ริซี นาย; คอนโด, ส.; วากิซากะ น.; โยชิซากิ ต.; ปากาโน, เจเอส; Shackelford, J. Exosomal HIF1 สนับสนุนศักยภาพการแพร่กระจายของ LMP เชิงบวกที่เกี่ยวข้องกับมะเร็งโพรงหลังจมูก1- อองโคยีน 2014, 33, 4613–4622 [ครอสอ้างอิง]

60. ฟู ม.; วัง บ.; เฉินเอ็กซ์.; เขาซ.; วังย.; หลี่เอ็กซ์.; เฉา, เอช.; เจิ้ง, SJ gga-miR-454 ยับยั้งการจำลองแบบของไวรัสโรคเบอร์ซาลติดเชื้อ (IBDV) ผ่านการกำหนดเป้าหมายโดยตรงไปยังส่วนจีโนม IBDV B และตัวยับยั้งเซลล์ของ Cytokine Signaling 6 (SOCS6) ไวรัส Res 2018, 252, 29–40. [ครอสอ้างอิง]

61. ฟู ม.; วัง บ.; เฉินเอ็กซ์.; เขาซ.; วังย.; หลี่เอ็กซ์.; เฉา, เอช.; เจิ้ง, SJ MicroRNA gga-miR-130b ยับยั้งการจำลองแบบของไวรัสโรคเบอร์ซัลที่ติดเชื้อผ่านการกำหนดเป้าหมายของจีโนมของไวรัสและตัวยับยั้งเซลล์ของการส่งสัญญาณไซโตไคน์ 5. J. Virol 2018, 92, จ01646-17 [ครอสอ้างอิง]

62. กัว XK; จางคิว.; เกา ล.; หลี่ น.; เฉิน XX; Feng, WH การเพิ่มการแสดงออกของ microRNA 181 ยับยั้งการจำลองแบบของไวรัสกลุ่มอาการระบบสืบพันธุ์และทางเดินหายใจของสุกร และมีผลกระทบในการควบคุมการติดเชื้อไวรัส เจ. วิโรล. 2013, 87, 1159–1171. [CrossRef] [PubMed]

63. คอง พ.; เซียว ส.; เฉิน ย.; วัง, ล.; เกา เจ.; หลี่ ม.; เขาซ.; กัว ย.; จ้าว ก.; จางเอ็กซ์.; และคณะ transcriptomes miRNA และ mRNA แบบบูรณาการของ macrophages ถุงหมู (เซลล์ PAM) ระบุลายเซ็นโมเลกุล miRNA เฉพาะสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องกับการติดเชื้อ H-PRRSV และ N-PRRSV โมล ไบโอล ตัวแทน 2014, 41, 5863–5875. [CrossRef] [PubMed]

64. หลี่ น.; หวง, ก.; เฉิน ย.; หวาง ซ.; จาง ย.; เล้ง ค.; หลิวย.; ชิเจ.; เซียว ส.; Yao, L. MicroRNA ssc-miR-124a แสดงฤทธิ์ต้านไวรัสต่อไวรัสระบบสืบพันธุ์และโรคระบบทางเดินหายใจของสุกร ผ่านการยับยั้งยีนโฮสต์ CD163 สัตวแพทย์ ไมโครไบโอล 2021, 261, 109216. [CrossRef] [PubMed]

65. หลี่ น.; ดู่ ต.; ยัน, ย.; จางอ.; เกา เจ.; ฮูก.; เซียว ส.; Zhou, EM MicroRNA ให้-7f-5p ยับยั้งไวรัสกลุ่มอาการระบบสืบพันธุ์และทางเดินหายใจของสุกรโดยกำหนดเป้าหมายไปที่ MYH9 วิทยาศาสตร์ ตัวแทน 2016, 6, 34332. [CrossRef]

66. เจินย.; วังเอฟ.; เหลียง, ว.; หลิว เจ.; เกา ก.; วังย.; ซู่ เอ็กซ์.; ซูคิว.; จางคิว.; Liu, B. การจำแนก RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัสที่แสดงออกแตกต่างกันในแมคโครฟาจของถุงหมูจาก Tongcheng และหมูขาวขนาดใหญ่ตอบสนองต่อ PRRSV วิทยาศาสตร์ ตัวแทน 2018, 8, 15621. [CrossRef]

67. โจว เอ็กซ์.; มิคาล เจเจ; เจียง ซ.; Liu, B. MicroRNA ทำโปรไฟล์การแสดงออกในถุงขนาดใหญ่ของหมูถงเฉิงจีนพื้นเมืองที่ติดเชื้อ PRRSV ในร่างกาย เจ. แอพพลิเคชั่น เจเนท. 2017, 58, 539–544. [ครอสอ้างอิง]

68. ลี วายเจ; Lee, C. การจำลองแบบของไวรัสกลุ่มอาการระบบสืบพันธุ์และทางเดินหายใจของสุกรถูกระงับโดยการยับยั้งเส้นทางการส่งสัญญาณไคเนสที่ควบคุมสัญญาณนอกเซลล์ (ERK) ไวรัส Res 2010, 152, 50–58. [ครอสอ้างอิง]

69. ซ่ง ส.; ไบ เจ.; วัง, ด.; ฝาง ล.; จาง ล.; หลี่ เอฟ.; เฉิน เอช.; การติดเชื้อไวรัสกลุ่มอาการระบบทางเดินหายใจและสืบพันธุ์ของหมู Xiao, S. กระตุ้นการผลิต IL-10 ผ่านทางวิถี NF-κB และ p38 MAPK ในมาโครฟาจของถุงลมหมู นักพัฒนา คอมพ์ อิมมูนอล. 2013, 39, 265–272. [ครอสอ้างอิง]

70. หยิน ส.; ฮั่ว ย.; ดงย.; แฟน ล.; หยาง เอช.; วัง, ล.; หนิง ย.; Hu, H. การเปิดใช้งาน c-Jun NH (2) - ไคเนสเทอร์มินัลเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการตายของเซลล์ที่เกิดจากไวรัสของระบบสืบพันธุ์และระบบทางเดินหายใจของสุกร แต่ไม่ใช่สำหรับการจำลองแบบของไวรัส ไวรัส Res 2012, 166, 103–108. [ครอสอ้างอิง]

71. Fan, L. เส้นทางการส่งสัญญาณที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมการเหนี่ยวนำการตายของเซลล์ในเซลล์เจ้าบ้านตามการติดเชื้อ PRRSV ยีนไวรัส 2019, 55, 433–439 [ครอสอ้างอิง]

72. โลเปซ-ฟูเอร์เตส, ล.; กัมโปส อี.; โดเมเน็ค น.; เอซเคอร์รา, อ.; คาสโตร, เจเอ็ม; โดมิงเกซ เจ.; Alonso, F. ไวรัส Porcine Reproductive and Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) ช่วยลดการผลิต TNF ใน Macrophages ที่ติดเชื้อ ไวรัส Res 2000, 69, 41–46. [ครอสอ้างอิง]

73. ไทสซิเยร์, É.; Pécheur, EI Lipids เป็นตัวปรับของฟิวชันเมมเบรนที่เป็นสื่อกลางโดยโปรตีนฟิวชันของไวรัส ยูโร ชีวฟิสิกส์ เจ. 2007, 36, 887–899. [ครอสอ้างอิง]

74. จอน เจเอช; Lee, C. จำเป็นต้องมีคอเลสเตอรอลในเซลล์สำหรับการติดเชื้อ nidovirus ในสุกร โค้ง. วิโรล. 2017, 162, 3753–3767. [ครอสอ้างอิง]

75. ซัน ย.; เซียว ส.; วัง, ด.; หลัวร.; หลี่ บ.; เฉิน เอช.; Fang, L. คอเลสเตอรอลจากเยื่อหุ้มเซลล์เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการเข้าและปล่อยไวรัสของระบบสืบพันธุ์และกลุ่มอาการระบบทางเดินหายใจของสุกรในเซลล์ MARC-145 วิทยาศาสตร์ ไชน่าไลฟ์วิทยาศาสตร์ 2011, 54, 1011–1018. [ครอสอ้างอิง]

76. เทียน ต.; จู้ วายแอล; โจว ใช่; เหลียง แฟนสาว; วัง ปป; หู FH; Xiao, ZD การดูดซึม Exosome ผ่านทางเอนโดไซโตซิสที่มีแคลทรินเป็นสื่อกลางและมาโครปิโนไซโตซิส และการนำส่ง miR{2}} ที่เป็นสื่อกลาง เจ. ไบโอล. เคมี. 2014, 289, 22258–22267. [ครอสอ้างอิง]

77. มัลคาฮี ลุยเซียนา; ชมพู RC; Carter, DRF เส้นทางและกลไกของการดูดซึมตุ่มนอกเซลล์ เจ. เอ็กซ์ตร้าเซลล์. ถุง 2014, 3, 24641. [CrossRef]

78. จาง ม.; แซงเอ็กซ์.; วัง ม.; หลี่ ซ.; เฉียว ม.; หู่ฮ.; Chen, D. ผู้ให้บริการนาโนที่ใช้ Exosome เป็นยานพาหนะที่ได้รับแรงบันดาลใจทางชีวภาพและใช้งานได้หลากหลายสำหรับการจัดส่งยา: ความก้าวหน้าและความท้าทายล่าสุด เจ. เมเตอร์. เคมี. บ 2019, 7, 2421–2433. [ครอสอ้างอิง]