ภูมิคุ้มกันที่ทำงานร่วมกันและการป้องกันในหนูโดยการสร้างภูมิคุ้มกันร่วมกับวัคซีน DNA ที่เข้ารหัสโปรตีน Spike และโปรตีนโครงสร้างอื่นๆ ของ SARS-CoV-2

เชิงนามธรรม:การเกิดขึ้นของสายพันธุ์ใหม่ของกลุ่มอาการทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง โคโรนาไวรัส 2 (SARS CoV-2) ทำให้เกิดการระบาดของการติดเชื้อซ้ำไปทั่วโลก ตัวแปรที่มีการกลายพันธุ์สูงเหล่านี้จะลดประสิทธิภาพของวัคซีนโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 (โควิด-19) ในปัจจุบัน ซึ่งออกแบบมาเพื่อกำหนดเป้าหมายเฉพาะโปรตีนที่พุ่งสูงขึ้น (S) ของไวรัสดั้งเดิม ยกเว้น S ของ SARS-CoV-2 ศักยภาพในการป้องกันภูมิคุ้มกันของโปรตีนโครงสร้างอื่นๆ (นิวคลีโอแคปซิด, N; ซองจดหมาย, E; เมมเบรน, M) เนื่องจากแอนติเจนเป้าหมายของวัคซีนยังไม่ชัดเจนและสมควรที่จะตรวจสอบ ในการศึกษานี้ ได้มีการพัฒนาวัคซีน DNA สังเคราะห์ที่เข้ารหัสโปรตีนโครงสร้าง SARS-CoV-2 สี่ชนิด (pS, pN, pE และ pM) ได้รับการพัฒนา และหนูได้รับการสร้างภูมิคุ้มกันด้วยสามโดสผ่านการฉีดเข้ากล้ามและการใช้ไฟฟ้า โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การสร้างภูมิคุ้มกันร่วมกับวัคซีน DNA สองตัวที่แสดงโปรตีน S และ N ทำให้เกิดแอนติบอดีที่เป็นกลางที่สูงขึ้น และมีประสิทธิภาพในการลดปริมาณไวรัส SARS-CoV-2 ได้ดีกว่า S โปรตีนเพียงอย่างเดียวในหนู นอกจากนี้ การสร้างภูมิคุ้มกันร่วมกับ pN ด้วย pN หรือ pE + pM ทำให้เกิดภูมิคุ้มกันของเซลล์จำเพาะโปรตีน S ที่สูงขึ้นหลังจากการฉีดวัคซีนสามครั้ง และทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาที่รุนแรงกว่า pS เพียงอย่างเดียวหลังการท้าทาย บทบาทของโปรตีนโครงสร้างอนุรักษ์ของ SARS-CoV-2 รวมถึงโปรตีน N/E/M ควรได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติมสำหรับการนำไปใช้ในการออกแบบวัคซีน เช่น วัคซีน mRNA

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

คำสำคัญ: โควิด-19; SARS-CoV-2}}; การสร้างภูมิคุ้มกันร่วม; วัคซีนดีเอ็นเอ โปรตีนขัดขวาง; โปรตีนโครงสร้าง

1. บทนำ

กลุ่มอาการทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง โคโรนาไวรัส 2 (SARS-CoV-2) เป็นสาเหตุของโรคโคโรนาไวรัส 2019 (COVID-19) ซึ่งทำให้เกิดการติดเชื้อและการเสียชีวิตนับล้านรายทั่วโลก และยังเป็นอันตรายต่อสุขภาพของมนุษย์และเศรษฐกิจโลก . แม้ว่าวิธีการรักษาที่มีประสิทธิผลยังไม่สามารถหาได้ แต่ก็มีความก้าวหน้าอย่างรวดเร็ว รวมถึงการประยุกต์ใช้การบำบัดด้วยเซลล์ CAR-T และนาโนเทคโนโลยี [1,2] การฉีดวัคซีนเป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพในการควบคุมการระบาดใหญ่ และวัคซีนหลายชนิดได้รับการอนุมัติให้ใช้โดยหน่วยงานกำกับดูแลด้านสุขภาพต่างๆ [3,4] จีโนมของไวรัสโคโรนาเข้ารหัสโปรตีนโครงสร้างหลักสี่ชนิด ได้แก่ สไปค์ (S) นิวคลีโอแคปซิด (N) เมมเบรน (M) และโปรตีนซองจดหมาย (E) ซึ่งมีหน้าที่ในการประกอบไวรัสและการปราบปรามการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของโฮสต์ [5 ] S โปรตีนประกอบด้วยกรดอะมิโน 1,273 ตัวที่ตกค้างซึ่งมีหน่วยย่อย 2 หน่วยคือ S1 และ S2 เป็นสื่อกลางในการเข้าสู่ไวรัสและเป็นเป้าหมายหลักในการพัฒนาวัคซีนป้องกันไวรัสโคโรนา [6–11] อย่างไรก็ตาม โปรตีน SARS-CoV-2 S มีความถี่ในการกลายพันธุ์สูง ไม่น่าแปลกใจเลยที่ SARS-CoV-2 ซึ่งเป็นไวรัส RNA มีการกลายพันธุ์อย่างต่อเนื่องและหลีกเลี่ยงไม่ได้ มีข้อกังวล (VOC) ของ SARS-CoV{21}} ห้ารูปแบบที่เกิดขึ้นตั้งแต่เดือนกันยายน 2020 รวมถึง B.1.1.7 (สหราชอาณาจักร อัลฟ่า) B.1.351 (แอฟริกาใต้ เบต้า) หน้า 1 (บราซิล, แกมมา), B.1.617.2 (อินเดีย, เดลต้า) และ B.1.1.529 (แอฟริกาใต้, โอไมครอน) (Andreano และ Rappuoli, 2021; Gupta, 2021) พวกมันทั้งหมดมีการกลายพันธุ์หลายครั้งในโปรตีนขัดขวาง [12] ตัวแปรเหล่านี้คุกคามประสิทธิภาพของวัคซีนป้องกันโควิด-19 ในปัจจุบัน ซึ่งออกแบบมาเพื่อกำหนดเป้าหมายเฉพาะโปรตีนสไปค์เท่านั้น

เอ็นโปรตีนของ SARS-CoV-2 จับกับ RNA ของไวรัสผ่านโดเมนการจับ RNA 140-ที่มีกรดอะมิโนยาวในแกนกลางในลักษณะ "เม็ดบีดบนเชือก" ไวรัสชนิดนี้ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างสูงในกลุ่มโคโรนาไวรัส โดยมีลำดับลำดับ ~90% ร่วมกับซาร์ส-CoV และยังเป็นโปรตีนโครงสร้างเพียงชนิดเดียวภายในไวรัส [13] นอกจากนี้ ยังมีบทบาทสำคัญในการบรรจุ RNA ของไวรัสลงในคอมเพล็กซ์ ribonucleo capsid และจำเป็นสำหรับการจำลอง RNA ของไวรัส การประกอบ virion และการปล่อยออกจากเซลล์เจ้าบ้าน [14] จากความคล้ายคลึงกันในลำดับสูงของโปรตีน N ในโคโรนาไวรัส จึงอาจเสนอแนะให้เป็นเป้าหมายของวัคซีนป้องกันข้าม ก่อนหน้านี้เราพบว่าการสร้างภูมิคุ้มกันร่วมกับวัคซีน DNA สองชนิดที่มีโปรตีน E และ M ให้การป้องกันบางส่วนต่อ SARS-CoV-2 และควรพิจารณาวิธีนี้ในระหว่างการพัฒนาวัคซีน [15] ขึ้นอยู่กับเอกสารภูมิทัศน์จาก WHO โดยปกติแล้วจะมีเจ็ดกลยุทธ์สำหรับตัวเลือกวัคซีน SARS-CoV-2 ซึ่งสามารถแบ่งเพิ่มเติมได้เป็นสามประเภท: ประการแรก วัคซีนที่ใช้โปรตีน รวมถึงวัคซีนไวรัสเชื้อตาย วัคซีนคล้ายไวรัส อนุภาคและวัคซีนหน่วยย่อยโปรตีน ประการที่สอง วัคซีนจากยีน รวมถึงวัคซีนเวกเตอร์ไวรัส วัคซีน DNA และวัคซีน mRNA ประการที่สาม การผสมผสานระหว่างวิธีการที่ใช้โปรตีนและยีน เช่น วัคซีนไวรัสที่มีชีวิต เทคโนโลยี DNA ซึ่งเป็นกลยุทธ์วัคซีนที่ใช้ยีนแบบใหม่สามารถเปรียบเทียบตัวเลือกและกลยุทธ์วัคซีนหลายตัวได้อย่างรวดเร็วในระหว่างการทดสอบพรีคลินิก [16,17] ตามทฤษฎีแล้ว โปรตีนของไวรัสเกือบทั้งหมดเป็นศักยภาพในการสร้างภูมิคุ้มกันและเป็นเป้าหมายของวัคซีน อย่างไรก็ตาม เท่าที่เราทราบ ความสามารถในการสร้างภูมิคุ้มกันและศักยภาพในการป้องกันของวัคซีน DNA สังเคราะห์ในการเข้ารหัสโปรตีน S ของ SARS-CoV-2 และโปรตีนโครงสร้างอื่นๆ ยังไม่ได้รับการรายงานอย่างเป็นระบบ วัคซีน DNA สี่ชนิดที่แสดงโปรตีน SARS-CoV-2 S, N, E และ M l ได้รับการประเมินสำหรับภูมิคุ้มกันและประสิทธิภาพในการป้องกันในหนู เพื่อสำรวจผลกระทบทางภูมิคุ้มกันของ S ร่วมกับโปรตีนโครงสร้างอื่นๆ

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. เซลล์

เซลล์ Huh7.5 และเซลล์ไตตัวอ่อนของมนุษย์ 293T ได้รับการเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 ◦C ในบรรยากาศที่มีความชื้นที่ 5% CO2 ตลอดการศึกษา เพาะเลี้ยงเซลล์ในอาหารเลี้ยงเชื้อ DMEM (HyClone, Logan, UT, USA) เสริมด้วย 10% FBS (GEMINI Co., เซี่ยงไฮ้, จีน) และ 1% penicillin-streptomycin (Gibco, New York, NY, USA) ทุกเซลล์ได้รับการยืนยันว่ามีการปนเปื้อนของไมโคพลาสมาเป็นลบ

2.2. การสร้างวัคซีน DNA การเข้ารหัส SARS-CoV-2 S/N/E/M

ยีนที่เข้ารหัสโปรตีน S/N ของ SARS-CoV-2 ซึ่งมีลำดับ Kozak ที่ปลาย N (GCCACC) ตามด้วยรหัสเริ่มต้น (ATG) ถูกสังเคราะห์โดยใช้รหัสที่ปรับให้เหมาะสมกับสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (GenScript Co., Nanjing , จีน). จากนั้นจึงทำการโคลนเข้าไปในเวกเตอร์นิพจน์ pcDNA3.1 (+) ผ่านการย่อยแบบ EcoRI และ XbaI และตั้งชื่อ pS/pN (วัคซีน DNA) (รูปที่ 1A) โปรตีน pE/PM ถูกสร้างขึ้นและระบุตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [15] วัคซีนถูกเตรียมโดยใช้ชุด Maxiprep ที่ปราศจากเอนโดท็อกซิน (Qiagen, ปักกิ่ง, จีน) และลำดับได้รับการยืนยันโดยใช้การจัดลำดับ DNA ของ Sanger การแสดงออกของโปรตีน S/N ได้รับการยืนยันโดยใช้เวสเทิร์นบล็อตติงและแอนติ-เอส (Sino Biological, ปักกิ่ง, จีน)/แอนติ-N แอนติบอดีเจือจางที่ 1:1000 การทดลองเหล่านี้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [15,18]

รูปที่ 1 การออกแบบและการแสดงออกของโครงสร้างวัคซีนโปรตีน S/N ที่ใช้ DNA ลูกผสม SARS-CoV-2 (A) แผนผังไดอะแกรมของวัคซีนจากดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์ที่เข้ารหัส SARS-CoV-2 สไปค์ (PS), นิวคลีโอแคปซิด (pN), เอเว่นเวลล์ (pE) และ/หรือโปรตีนเมมเบรน (PM) (B) การแสดงออกของโปรตีนเป้าหมายในวัคซีน DNA ได้รับการตรวจสอบผ่านการวิเคราะห์แบบเวสเทิร์นบล็อตของเซลล์ 293T ที่ถูกถ่ายด้วยพลาสมิด pS/pN/pE/pM

2.3. การสร้างภูมิคุ้มกันและความท้าทาย

หนู BALB/c ตัวเมีย (ห้องทดลองชาร์ลส์ริเวอร์ ประเทศฝรั่งเศส) อายุ 6 สัปดาห์ถูกเก็บไว้ที่สถาบันแห่งชาติด้านอาชีวอนามัยและการควบคุมพิษในสภาพแวดล้อมที่มีอุณหภูมิ 21 °C และควบคุมความชื้นด้วยรอบแสง/มืด 12 ชั่วโมง ในขณะเดียวกัน มีการจัดเตรียมอาหารและน้ำให้โดยไม่จำกัด และการทดลองกับสัตว์ทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมการทดลองในสัตว์ของศูนย์ควบคุมและป้องกันโรคแห่งประเทศจีน (China CDC) การวิจัยเป็นไปตามกฎระเบียบด้านจริยธรรมที่เกี่ยวข้อง

หนูถูกแบ่งแบบสุ่มออกเป็นห้ากลุ่มและสร้างภูมิคุ้มกันด้วย pS/pN เพียงอย่างเดียวหรือสร้างภูมิคุ้มกันร่วมด้วย pS + pN หรือ pS + pE + PM ในวันที่ 0, 21 และ 42 โดยการฉีดเข้ากล้ามเนื้อบวกด้วยกระแสไฟฟ้า (35 มก./50 มล.) (รูปที่ 2) [19,20] โดยสรุป วัคซีน DNA ถูกฉีดเข้าไปในกล้ามเนื้อ tibialis anterior (TA) และกระตุ้นด้วยไฟฟ้าทันทีโดยใช้อิเล็กโทรดอาเรย์สองเข็มที่ห่างกัน 5 มม. (ECM830; BTX) พร้อมเข็ม ซีรั่มจากหนูถูกรวบรวมเพื่อการวิเคราะห์การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกาย และม้ามของหนูถูกประมวลผลเพื่อวัดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของเซลล์ (รูปที่ 2)

รูปที่ 2 แผนผังของการสร้างภูมิคุ้มกันและความท้าทายของ SARS-CoV-2 ระยะเวลาของการฉีดวัคซีน ความท้าทาย และการเก็บตัวอย่างเลือด/เนื้อเยื่อ หนู BALB/C ถูกแบ่งแบบสุ่มออกเป็นกลุ่ม

การทดลองท้าทาย SARS-CoV-2 ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [15,21] โดยสรุป หนูได้รับการดมยาสลบและจากนั้นจึงแปลงสัญญาณในจมูกด้วย 2.5 × 108 PFU ของ Ad5-hACE2 ในปริมาตรรวม 45 ไมโครลิตร ห้าวันหลังการถ่ายทอด หนูได้รับการดมยาสลบ จากนั้นฉีดเข้าจมูกด้วย 1 × 105 TCID50 ของ SARS-CoV-2 (อู่ฮั่น/IVDC HB-02/2019) ในปริมาณน้ำเกลือรวม 50 µL กันชน. งานทั้งหมดเกี่ยวกับ SARS-CoV-2 ที่มีชีวิตในแบบจำลองเมาส์ดำเนินการในห้องปฏิบัติการ Animal Biosafety Level 3 (ABSL-3)

2.4. เอนไซม์ที่เชื่อมโยงการทดสอบอิมมูโน

การตรวจวิเคราะห์อิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA) ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [15] โดยสรุป โปรตีน S (ซื้อจาก Sino Biological)/N (ของขวัญจากซอง) เจือจางในบัฟเฟอร์คาร์บอเนต (0.1 M, pH 9.6) ถูกเคลือบลงบนเพลต EIA/RIA ของหลุม 96- (เทอร์โม Fisher Scientific, วอลแทม, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) ค้างคืนที่อุณหภูมิ 4 ◦C เพลตถูกปิดกั้นด้วยซีรั่มแพะ 10% 200 ไมโครลิตรใน PBS ที่ 37 —C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ตามด้วยการล้างห้าครั้งด้วย PBST จากนั้น ตัวอย่างซีรัมที่เจือจางตามลำดับในซีรั่มแพะ 2% ใน PBS ถูกเติมและบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 37 ◦C ตามด้วยการล้างห้าครั้งด้วย PBST IgG Ab ของแพะที่คอนจูเกตด้วย HRP (1:5000) ถูกเติมที่ 37 ◦C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ซับสเตรต TMB ทั้งหมด 100 ไมโครลิตรถูกเติมลงในแต่ละหลุมและระงับด้วย 50 ไมโครลิตรของ 2 โมลาร์ H2SO4 อ่านการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตรโดยใช้ SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, ฮ่องกง, จีน)

cistanche พืชเพิ่มระบบภูมิคุ้มกัน

คลิกที่นี่เพื่อดูผลิตภัณฑ์ Cistanche Enhance Immunity

【สอบถามเพิ่มเติม】 อีเมล:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. การทดลองการติดเชื้อไวรัสหลอกและการทำให้เป็นกลาง

การทดสอบการวางตัวเป็นกลางของไวรัสหลอกดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [21,22] พลาสมิดที่แสดงโปรตีน S ของไวรัสบรรพบุรุษถูกสร้างขึ้นก่อนหน้านี้ [22] ยีนโปรตีนขัดขวาง SARS-CoV-2 ของตัวแปร Omicron (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) ได้รับการสังเคราะห์ (ของขวัญจาก Vazyme Biotech Co., Ltd., หนานจิง, จีน) ใช้โคดอนที่ปรับให้เหมาะสมกับสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและโคลนเข้าไปในเวกเตอร์ pcDNA3.1 ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [22] โดยสรุป พลาสมิดซึ่งแสดงออกนักข่าวลูซิเฟอเรสและพลาสมิดซึ่งแสดงออก S โปรตีนถูกทรานส์เฟกร่วมกันไปในเซลล์ HEK 293T โดยใช้ X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent การเพาะเลี้ยงเซลล์ได้รับการรีเฟรช 6 ชั่วโมงหลังการเปลี่ยนถ่าย และส่วนเหนือตะกอนที่มีไวรัสเทียมจะถูกเก็บเกี่ยวหลังจาก 48 ชั่วโมงและเก็บไว้ที่ −70 ◦C ในการทดสอบการวางตัวเป็นกลางของไวรัสหลอกนั้น ส่วนผสมของซีรั่มและไวรัสที่เท่ากันนั้นจะถูกบ่มที่ 37 ปริมาตรของส่วนเหนือตะกอนที่ประกอบด้วยไวรัสหลอก จากนั้นจึงเติมลงในซีรั่มที่เจือจาง oC เป็นเวลา 1 ชม. จากนั้นสื่อเพาะเลี้ยงเซลล์ Huh7.5 ถูกแทนที่ด้วยของผสมซีรั่ม–ไวรัส 100 µL และถูกบ่มที่ 37 —C เป็นเวลา 12 ชั่วโมง เซลล์ที่เพาะเลี้ยงด้วย pseudoviruses ของ SARS-CoV-2 เท่านั้นจะทำงานพร้อมกัน ต่อจากนั้นอาหารเลี้ยงเชื้อถูกแทนที่ด้วย DMEM (2% FBS) และการฟักตัวถูกบ่มที่ 37 ◦C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้น ทำการวัดสัญญาณลูซิเฟอเรสโดยใช้ชุดหิ่งห้อยลูซิเฟอเรสของ Bright-Glo (Promega)

2.6. การทดสอบการทำให้เป็นกลางของ SARS-CoV-2

มีการใช้ SARS-CoV-2 (หวู่ฮั่น/IVDC-HB-02/2019) ในการทดลองนี้ โดยสรุป ซีรั่มถูกเจือจางสองเท่าจากการเจือจางเริ่มต้นที่ 1:10 ผสมกับ SARS-CoV ที่มีชีวิตซึ่งมีปริมาตรเท่ากัน (10–15 pfu/หลุม)-2 และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 ◦C หลังจากนั้นพวกมันก็ถูกเติมเข้าไปในเซลล์เวโรที่เพาะไว้ หลังจากการฟักตัวที่ 37 ◦C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จะสังเกตเห็นผลกระทบทางไซโตพาทิก (CPE) และส่วนลอยเหนือตะกอนจากการเพาะเลี้ยง 100 ไมโครลิตรถูกเก็บเกี่ยวสำหรับการสกัดกรดนิวคลีอิกและ PCR การถอดรหัสแบบย้อนกลับเรืองแสงแบบเรียลไทม์ (RT-PCR) ค่ามัธยฐานของการทำให้เป็นกลาง (ND50) คำนวณโดยใช้วิธี Reed–Munch [15]

2.7. IFN-ELISpot Assay

แหล่งรวมเปปไทด์ที่ครอบคลุมโปรตีน S/N/E/M ทั้งหมดเป็น 15-เมอร์ที่ต่อเนื่องกันเหนือการขัดถูด้วยกรดอะมิโน 10 ตัวถูกสังเคราะห์โดย Scilight Biotechnology, LLC ประมาณ 2.5 มก. ของเปปไทด์บริสุทธิ์แต่ละตัวในกลุ่มเปปไทด์มีอยู่ต่อขวด การทดลองดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [18] โดยสรุป 96-เพลตหลุม (ชุด BD ELISPOT, สหรัฐอเมริกา) ถูกเคลือบด้วย Ab ที่ต้าน–IFN- และบ่มข้ามคืนที่ 4 ◦C จานถูกปิดกั้นด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่สมบูรณ์หลังจากการล้างสามครั้ง เก็บเกี่ยวเซลล์ม้ามหลังจากหนูถูกการุณยฆาตในวันที่ 35 และ 120 สารแขวนลอยเซลล์เดี่ยวสดจากแต่ละกลุ่มถูกชุบที่ 5 × 106 ต่อหลุม และเติมเปปไทด์ จากนั้นเพลตจะถูกบ่มที่ 37 ◦C ใน 5% CO2 เป็นเวลา 22 ชั่วโมงและตรวจพบโดยใช้เครื่องอ่านเพลท ELISpot (Biosys, So. Pasadena, CA, USA) หน่วยสร้างจุด (SFU) แสดงแทน IFN- ที่ทำให้ทีเซลล์หลั่ง

2.8. การประเมินการป้องกันในหนูหลังโรคซาร์ส-CoV-2 ความท้าทาย

การทดลองได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [15,21] โดยสรุป ปอดถูกเก็บเกี่ยวหลังจากที่หนูถูกการุณยฆาต เนื้อเยื่อครึ่งหนึ่งถูกใช้สำหรับการสกัดกรดนิวคลีอิก, RT-PCR เรืองแสงแบบเรียลไทม์ และ TCID50 อีกครึ่งหนึ่งถูกส่งไปยังวิทยาลัยสัตวแพทยศาสตร์ China Agricultural University เพื่อทำการประเมินทางพยาธิวิทยา

2.9. การวิเคราะห์ทางสถิติ

การทดสอบทีแบบแยกคู่ การทดสอบ ANOVA แบบสองทาง และการทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Dunnett ดำเนินการโดยใช้ GraphPad Prism 7 0 (GraphPad Software LLC) ค่า p < 0.05 ได้รับการพิจารณาว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ (* p < 0.05; ** p < 0.01; * ** p < 0.001; **** p < 0.0001)

3. ผลลัพธ์

3.1. การศึกษาลักษณะของวัคซีน DNA

ตรวจพบระดับโปรตีน E และ M โดยใช้ Western blotting เราวัดการแสดงออกของโปรตีน S/N/E/M ที่เข้ารหัสของ SARS-CoV-2 ในเซลล์ HEK-293 T ที่แปลงสภาพด้วยพลาสมิด pS/pN/pE/pM ผ่านการวิเคราะห์เวสเทิร์นบล็อต โดยใช้สารต่อต้าน แอนติบอดี -S/anti-N และแอนติบอดี-6 x แอนติบอดีของเขาในเซลล์ไลเซต แถบดังกล่าวประมาณน้ำหนักโมเลกุลที่คาดการณ์ไว้ของโปรตีน S (140–142 kDa), N (45 kDa), E (10 kDa) และ M (22–25 kDa) (รูปที่ 1B)

3.2. การผลิต Anti-S และ/หรือ anti-N IgG ที่แข็งแกร่งและยั่งยืนซึ่งเกิดจาก pS และ/หรือ pN DNA

เซรั่มวัคซีนถูกรวบรวมจากหนูเมาส์ BALB/c ที่ 35, 56, 96 และ 120 วัน (รูปที่ 2) ระดับแอนติ S/แอนติ-N IgG ถูกตรวจพบโดยใช้ ELISA ขนาดของการตอบสนอง IgG เฉพาะ S- หรือ N ที่เกิดจาก pS หรือ pN เพิ่มขึ้นในซีรั่มหลังจากการเพิ่มครั้งแรกและครั้งที่สอง anti-S และ anti-N IgG titers ในกลุ่ม pS + pN สูงกว่าในกลุ่มอื่น อย่างไรก็ตาม ความแตกต่างไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ (รูปที่ 3A, B) ไม่พบการตอบสนองของแอนติบอดีจำเพาะโปรตีน E/M ที่แข็งแกร่ง ซึ่งสอดคล้องกับผลการศึกษาก่อนหน้านี้ (ไม่แสดงข้อมูล) [15]

รูปที่ 3 การตอบสนองของบีเซลล์ต่อ SARS-CoV-2 ในหนู BALB/c ( A ) ไตเตรทจุดสิ้นสุดที่มีผลผูกพันกับ IgG ในซีรั่มสำหรับ SARS-CoV -2 S ( A ) และโปรตีน N ( B ) (C) ไทเทอร์การทำให้เป็นกลางถูกกำหนดตามระบบไวรัสจำลอง SARS-CoV-2 (D) ไทเทอร์การทำให้เป็นกลางของ Anti-SARS-CoV-2 ถูกกำหนดโดยใช้ไวรัส SARS-CoV-2 (E) การทดสอบการทำให้เป็นกลางโดยอิงตามระบบไวรัสปลอมชนิด Omicron ของ SARS-CoV{15}} อัตราส่วนการยับยั้งสำหรับซีรั่มจากกลุ่มจำลอง (สีน้ำเงิน), pS (สีแดง), pS + pN (สีเขียว), pS + pE + pM (สีชมพู) และ pN (สีส้ม) จะแสดงขึ้น แถบข้อผิดพลาดแสดงถึง SEM และค่า p ถูกคำนวณโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทางและการวิเคราะห์ภายหลังของ Sidak โดยที่ * p < 0.05

3.3. แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางในระดับสูงที่เกิดจากการสร้างภูมิคุ้มกันร่วมกับวัคซีน pS และ pN

ไทเทอร์ที่ทำให้เป็นกลางของตัวอย่างซีรัมที่เจือจางตามลำดับถูกกำหนดโดยใช้ไวรัส SARS-CoV-2 เทียม ระดับสูงสุดของแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลาง (nAbs) ถูกสังเกตพบในกลุ่ม pS + pN โดยมีไทเทอร์เฉลี่ยเรขาคณิต EC50 ซึ่งกันและกันไปถึง 2988 (ในวันที่ 35) และ 3578 (ในวันที่ 56) (รูปที่ 3C) ผลลัพธ์ที่คล้ายกันถูกสังเกตโดยใช้การทดสอบไมโครนิวทรัลไลเซชันของไวรัสที่มีชีวิต (MN) โดยที่ระดับของ nAbs ในกลุ่ม pS + pN สูงกว่าระดับในกลุ่ม S ในวันที่ 56 และ 96 (p < 0.05; 3 มิติ) นอกจากนี้ ระดับของ nAbs ในกลุ่ม pS + pN ในวันที่ 56 (เพิ่มครั้งที่สอง) สูงกว่าระดับในวันที่ 35 อย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05; รูปที่ 3 มิติ)

กิจกรรมการทำให้เป็นกลางของสูตรวัคซีนแต่ละสูตรต่อตัวแปร Omicron ของ SARS-CoV-2 ถูกกำหนดเพิ่มเติมโดยใช้แพลตฟอร์มเทียมและตัวอย่างซีรั่ม โปรไฟล์การวางตัวเป็นกลางกับไวรัส Omicron ในวันที่ 35 และ 56 นั้นคล้ายคลึงกับโปรไฟล์การวางตัวเป็นกลางกับไวรัสของบรรพบุรุษ (รูปที่ 3E) ซึ่งบ่งชี้ว่าการรักษา PS + pN มีศักยภาพในการทำให้เป็นกลางข้าม

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

3.4. การตอบสนองของทีเซลล์เกิดจากการฉีดวัคซีน DNA

ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ การตอบสนองของ T-cell ต่อแอนติเจน S/N/E/M ของ SARS-CoV-2 ได้รับการประเมินโดยใช้ IFN-ELISpot ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [15] ตามที่คาดไว้ ทั้งเกณฑ์ PS + pN และ pS + pE + pM ชักนำให้เกิดระดับ IFN + ทีเซลล์ที่จำเพาะสำหรับ S โปรตีนในวันที่ 12 0 สูงกว่าในวันที่ 35 อย่างมีนัยสำคัญ (p < 0 05; รูปที่ 4A) ยิ่งไปกว่านั้น จำนวนเซลล์ IFN + T ที่จำเพาะสำหรับโปรตีน N ในวันที่ 120 (การเพิ่มครั้งที่สอง) นั้นสูงกว่าในวันที่ 35 ในกลุ่ม pS + pN อย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05; รูปที่ 4B) ในที่สุด จำนวนเซลล์ IFN + T ที่จำเพาะสำหรับโปรตีน M ในวันที่ 120 (การเพิ่มครั้งที่สอง) สูงกว่าในวันที่ 35 อย่างมีนัยสำคัญในทั้งสองกลุ่ม (p <0.05; รูปที่ 4D)

รูปที่ 4 การตอบสนองของทีเซลล์ต่อโปรตีนโครงสร้างแต่ละตัวของ SARS-CoV-2 ในหนู BALB/c (A) การตอบสนองของทีเซลล์ถูกวัดโดยใช้ IFN-ELISpot ในเซลล์ม้ามที่ถูกกระตุ้นเป็นเวลา 20 ชั่วโมงโดยมีกลุ่มเปปไทด์ที่ทับซ้อนกันซึ่งครอบคลุม SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, และ (D) เอ็มโปรตีน แท่งแสดงถึงค่าเฉลี่ย ± SD การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทางและการทดสอบหลังการทดสอบของ Sidak โดยที่ * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.01 และ **** p < 0.0001

3.5. การป้องกันแบบเสริมฤทธิ์ที่เกิดจากการสร้างภูมิคุ้มกันร่วมกับ pS/pN หรือ pS/pE/pM

จากนั้น เราประเมินประสิทธิภาพในการป้องกันของวัคซีน DNA โดยใช้หนู hACE2 ที่สร้างภูมิคุ้มกันหลังความท้าทายด้วยไวรัส SARS-CoV-2 ซึ่งเป็นบรรพบุรุษ หลังการท้าทาย หนูในกลุ่มจำลองจะลดน้ำหนักลงทีละน้อย ในทางตรงกันข้าม หนูที่ได้รับภูมิคุ้มกันด้วย pS หรือ pS+ แสดงการลดน้ำหนักเล็กน้อยทันทีหลังการติดเชื้อ ตามด้วยการฟื้นตัว (รูปที่ 5A) ไม่พบไวรัสที่มีชีวิตในหนูที่ได้รับวัคซีน pS, pS + pN หรือ pS + pE + pM นอกจากนี้ การฉีดวัคซีน pS + pN ยังช่วยลดจำนวนสำเนา RNA ของไวรัสอย่างมีนัยสำคัญ เมื่อเปรียบเทียบกับที่ได้รับด้วยการฉีดวัคซีน pS เพียงอย่างเดียว (p=0.0228; รูปที่ 5B) นอกจากนี้ จุลพยาธิวิทยาของปอดแสดงให้เห็นว่าหนูทั้งในกลุ่มจำลองและ pN แสดงจุดโฟกัสของการอักเสบ เยื่อหุ้มปอดอักเสบ การยุบตัวของถุงลม การแทรกซึมของเซลล์อักเสบในระดับสูง และบริเวณที่มีเลือดออก ในการเปรียบเทียบ หนูที่ได้รับการรักษาด้วย pS + pN หรือ pS + pE + pM แสดงการเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาที่รุนแรงน้อยกว่า และคะแนน INHAND หลังการท้าทายต่ำกว่ากลุ่มอื่น (รูปที่ 5C)

รูปที่ 5 ประสิทธิภาพในการป้องกันของการสร้างภูมิคุ้มกันภายหลังความท้าทายด้วยไวรัส SARS-CoV{2}} ที่มีชีวิต (A) ชั่งน้ำหนักหนูทุกวัน (ค่าเฉลี่ย ± ข้อผิดพลาดมาตรฐานของค่าเฉลี่ย (SEM), n=4) เป็นเวลาสามวันหลังการท้าทาย (B) ไตเตรท SARS-CoV-2 ที่ติดเชื้อในปอดทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในวันที่สามหลังความท้าทาย ตามที่กำหนดโดยการทดสอบ TCID5{{10}} และหมายเลขสำเนา RNA ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติระหว่างกลุ่มถูกกำหนดโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว ตามด้วยการแก้ไขการเปรียบเทียบหลายรายการของ Dunnett (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 และ **** พี < 0.0001) (C) การวิเคราะห์ทางจุลพยาธิวิทยาของปอดโดยใช้การย้อมสี H&E

4. การอภิปราย

ในการศึกษานี้ การสร้างภูมิคุ้มกันร่วมกับวัคซีน DNA สองชนิดที่แสดงโปรตีน S และ N กระตุ้นให้เกิด nAbs ในระดับสูง และมีประสิทธิภาพสูงในการลดปริมาณไวรัส SARS-CoV-2 ในหนู วัคซีน DNA ที่แสดงโปรตีน S กระตุ้นให้ระดับภูมิคุ้มกันของเซลล์จำเพาะโปรตีน S เพิ่มขึ้นหลังจากการฉีดวัคซีนสามครั้งเมื่อหนูได้รับการสร้างภูมิคุ้มกันร่วมกับโปรตีน N/E และ M และบรรเทาการเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาหลังการท้าทาย เท่าที่เราทราบ นี่เป็นรายงานแรกที่เปิดเผยการเพิ่มประสิทธิภาพการทำงานร่วมกันของภูมิคุ้มกันและการป้องกันในหนูโดยใช้วัคซีน DNA ที่เข้ารหัสโปรตีน S เมื่อพวกมันถูกสร้างภูมิคุ้มกันร่วมกับวัคซีน DNA ที่เข้ารหัสโปรตีนโครงสร้างอื่นๆ ของโรค SARS-CoV{{8 }}

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

มีการสังเกต epitopes B-cell ภูมิคุ้มกันในบริเวณแอนติเจน N ในการศึกษาหลายชิ้น วัคซีนที่มีสาร N มักจะไม่สามารถกระตุ้น nAbs ได้ อาจเป็นเพราะไม่มีโปรตีน N ปรากฏบนพื้นผิวของไวรัส โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การสร้างภูมิคุ้มกันร่วมกับโปรตีน S และ N ทำให้เกิดระดับ nAbs ที่ต้านไวรัส SARS-CoV ของบรรพบุรุษและ Omicron -2 ได้สูงกว่ากลุ่มอื่นๆ การตอบสนองของ nAb ที่เพิ่มขึ้นสัมพันธ์กับการกวาดล้างของไวรัสที่ดีขึ้นและประสิทธิภาพในการป้องกัน ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าการรักษาด้วย pS + pN มีประสิทธิภาพมากกว่าการรักษาด้วย pS เพียงอย่างเดียวในการลดปริมาณไวรัส SARS-CoV-2 หลังความท้าทาย การศึกษาก่อนหน้านี้รายงานว่าหนูแฮมสเตอร์ที่ได้รับการฉีดวัคซีนซึ่งแสดงออกร่วมกันของโปรตีน M และ N ได้รับการปกป้องจากการลดน้ำหนักอย่างรุนแรงและพยาธิสภาพของปอด และได้ลดระดับของไวรัสในช่องปากและปอดหลังการติดเชื้อ SARS-CoV-2 ลงอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งสอดคล้องกับผลลัพธ์ของเรา [23] น่าเสียดายที่การลดระดับไทเตอร์ของไวรัสไม่สามารถนำมาประกอบกับโปรตีน M หรือ N โดยเฉพาะได้ และระดับ nAb ไม่ได้รับการประเมินในการศึกษานี้ การศึกษาวัคซีน mRNA ของ SARS-CoV-2 รายงานว่าการสร้างภูมิคุ้มกันร่วมด้วย S + N ทำให้เกิดการตอบสนองของทีเซลล์ที่จำเพาะต่อ S-CoV8+ และทำให้การทำงานของแอนติบอดีเป็นกลาง ซึ่งให้การปกป้องปอดจากเดลต้าได้ดีขึ้น ตัวแปรเมื่อเทียบกับ S เพียงอย่างเดียวซึ่งสอดคล้องกับผลการศึกษานี้ [24] การศึกษาอื่นรายงานว่าโปรตีน N ของโคโรน่าไวรัสในกระเพาะและลำไส้อักเสบที่แพร่กระจายได้ส่งเสริมการสังเคราะห์แอนติบอดีที่เป็นกลางเมื่อเซลล์ TGEV-IMMUNE ของสุกรถูกกระตุ้นด้วยการรวมกันของโปรตีน S และ N ในหลอดทดลอง และผลนี้อาจอธิบายได้โดยการตอบสนองของ T-lymphocyte ของตัวช่วย เอ็นโปรตีน [25]

อิมมูโนโดมิแนนต์ CD4+/CD8+ ทีเซลล์เอพิโทปในบริเวณ N-แอนติเจนได้รับการระบุก่อนหน้านี้ การศึกษาหลายชิ้นรายงานว่าวัคซีนที่ใช้โปรตีน SARS-CoV-2 N กระตุ้นการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันของเซลล์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ กลุ่ม S + N แสดงระดับภูมิคุ้มกันของเซลล์จำเพาะโปรตีน S เพิ่มขึ้นหลังการฉีดวัคซีนสามครั้ง การศึกษาวัคซีน mRNA ของ SARS-CoV-2 รายงานว่า S + N แบบผสมผสานชักนำให้เกิดการตอบสนองของทีเซลล์ CD เฉพาะ S-Specification8+ เมื่อเปรียบเทียบกับ S เพียงอย่างเดียว ซึ่งสอดคล้องกับผลลัพธ์ของเรา [24] การศึกษาอื่นรายงานว่าการตอบสนองของทีเซลล์ต่อแอนติเจนของ S และ N หลังจากการฉีดวัคซีนไพรม์ hAd5 S + N แบบดูอัลแอนติเจนเพียงอย่างเดียวนั้นเทียบเท่ากับการตอบสนองจากผู้ป่วยที่ติดเชื้อ SARS-CoV-2- ก่อนหน้านี้ และในแบบจำลองการทำนายซิลิโกของทีเซลล์ การเชื่อมโยง epitope HLA ชี้ให้เห็นว่าการตอบสนองของ T-cell ต่อวัคซีน hAd5 S + N จะยังคงรักษาประสิทธิภาพไว้เทียบกับตัวแปร B.1.351 นอกจากนี้ พลาสมาจากผู้ป่วยที่ติดเชื้อ SARS-CoV-2- ก่อนหน้านี้แสดงความสัมพันธ์ในการจับกับเซลล์ที่แสดงโครงสร้าง S-Fusion + N-ETSD แอนติเจนคู่ที่สูงกว่าเมื่อเทียบกับ hAd5 S-Fusion เพียงอย่างเดียว ซึ่งเสนอแนะเพิ่มเติมว่าความสามารถในการสร้างภูมิคุ้มกันของ วัคซีนแอนติเจนคู่ S + N ดีกว่าวัคซีนเอสแอนติเจนเดี่ยว [26]

ตรวจไม่พบไวรัสที่มีชีวิตในปอด และการลดน้ำหนักหลังความท้าทายลดลงในกลุ่ม pS, pS + pN และ pS + pE + pM ในขณะที่การรักษาด้วย pN ไม่ได้ลดระดับไทเตอร์ของไวรัสอย่างมีประสิทธิภาพ การค้นพบนี้เน้นย้ำถึงความจำเป็นและประสิทธิผลของเอสโปรตีนในฐานะเป้าหมายของวัคซีน โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การสร้างภูมิคุ้มกันร่วมกับ pS และ pN มีผลดีกว่า pS หรือ pN ในการกวาดล้างไวรัส กลุ่ม pS + pE + pM บ่งชี้การเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาในปอดน้อยลง ซึ่งสอดคล้องกับผลการศึกษาก่อนหน้าของเรา [15] กลุ่ม S + N มีสำเนา RNA ของไวรัสในปอดต่ำ น้ำหนักลดลง และฟื้นตัวได้เร็วหลังเกิดโรค SARS-CoV-2 เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มที่ได้รับวัคซีน S/N เพียงอย่างเดียว ซึ่งสอดคล้องกับ ผลการศึกษาครั้งนี้ อย่างไรก็ตาม ไม่มีกลุ่มใดตรวจพบไทเทอร์ของแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลาง ซึ่งอาจอธิบายได้จากความแตกต่างในพันธุ์วัคซีนและสัตว์ทดลอง [26] การศึกษาวัคซีนเวกเตอร์อะดีโนไวรัส SARS-CoV-2 ฉบับหนึ่งรายงานว่าวัคซีนชนิด S ให้การป้องกันสมองแบบเฉียบพลันได้ก็ต่อเมื่อมีการสร้างภูมิคุ้มกันร่วมกับวัคซีน N [27] การศึกษาอีกชิ้นหนึ่งได้พัฒนาวัคซีน Tri: ChAd, Bi: ChAd และ Mono: ChAd ที่แสดงโปรตีน S1/N/RdRp, N/RdRp และ S1 ตามลำดับ และทดสอบในสัตว์ทดลอง B.1.351 พบพยาธิสภาพโดยรวมอย่างกว้างขวางใน Mono: ChAdlungs ในขณะที่ปอด Bi: ChAd และ Tri: ChAd ปรากฏว่าแทบไม่มีพยาธิสภาพนี้เลย [28]

นอกจากนี้ สัตว์ที่ไม่ได้รับการฉีดวัคซีนยังมีปริมาณไวรัสในปอดสูง ในขณะที่การรักษาด้วย Tri: ChAd สามารถลดปริมาณไวรัสลงได้ 3.5 logs อย่างมีนัยสำคัญ ในการเปรียบเทียบ ทั้งวัคซีน Bi: ChAd และ Mono: ChAd สามารถลดปริมาณไวรัสได้เพียงปานกลางเท่านั้น ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าผลการป้องกันของวัคซีนแอนติเจนคู่ S/N ต่อตัวแปรต่างๆ อาจดีกว่าผลการป้องกันของวัคซีนแอนติเจนเดี่ยวชนิด S ซึ่งสอดคล้องกับผลลัพธ์ของเรา [28] การศึกษาบางส่วนรายงานว่าหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกันโปรตีน N จะมีอาการปอดอักเสบอย่างรุนแรงหลังการติดเชื้อ SARS-CoV [29–31] การศึกษาก่อนหน้านี้ยังรายงานด้วยว่าการสร้างภูมิคุ้มกันด้วยวัคซีนเวกเตอร์ adenovirus ที่แสดงโปรตีน Mouse Hepatitis Virus N ช่วยปกป้องหนูจากการติดเชื้อร้ายแรง ซึ่งแสดงให้เห็นว่าโปรตีน N สามารถสร้างผลการป้องกันได้ [32] นอกจากนี้ กลุ่มที่ได้รับวัคซีน CRT/N DNA ยังมีระดับไทเตอร์ของไวรัสลดลงอย่างมีนัยสำคัญภายหลังการทดลอง โดยไวรัสวัคซีนจะแสดงโปรตีน SARS-CoV N [33]

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

การศึกษาชิ้นหนึ่งเกี่ยวกับเอสโปรตีนแสดงให้เห็นว่าการผสมวัคซีน DNA/โปรตีนทำให้เกิดภูมิคุ้มกันทั้งในร่างกายและเซลล์ได้ดีกว่าวัคซีน DNA/โปรตีนเพียงอย่างเดียว [8] วัคซีนที่มุ่งเป้าไปที่โปรตีน S เท่านั้นได้แสดงให้เห็นประสิทธิภาพที่ลดลงในการป้องกันเชื้อโควิดระดับเล็กน้อยถึงปานกลาง-19 ที่เกิดจากสายพันธุ์ที่เกิดขึ้นใหม่ บทบาทของโปรตีนโครงสร้าง SARS-CoV-2 ที่ได้รับการอนุรักษ์ รวมถึงโปรตีน N/E/M สมควรได้รับความสนใจในการออกแบบและการประยุกต์ใช้วัคซีน เนื่องจากการตอบสนองของทีเซลล์ที่เกิดจากวัคซีนต่ออีพิโทปที่ได้รับการอนุรักษ์ โดยทั่วไปจะไม่ได้รับผลกระทบจากการกลายพันธุ์ . การศึกษาชิ้นหนึ่งรายงานว่าผู้ป่วยที่หายจากโรคซาร์ส (n=23) ยังคงมีทีเซลล์หน่วยความจำที่อยู่ได้ยาวนานซึ่งมีปฏิกิริยากับโปรตีน N ของ SARS-CoV 17 ปีหลังจากการระบาดในปี 2546 ซึ่งแสดงปฏิกิริยาข้ามที่รุนแรงต่อ SARS CoV{ {15}} เอ็นโปรตีน ซึ่งช่วยตรวจสอบการใช้โปรตีน เอ็น เป็นเป้าหมายของวัคซีนป้องกันข้ามกลุ่มเพิ่มเติม [34] การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าการสร้างภูมิคุ้มกันร่วมของ pS/pN มีความสัมพันธ์กับการตอบสนองของ nAb ที่สูงขึ้น การกวาดล้างของไวรัสที่ดีขึ้น และการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันของเซลล์ที่ดีขึ้น และอาจให้การป้องกันที่ดีขึ้นหลังความท้าทายของ SARS-CoV-2 เมื่อเทียบกับ pS เพียงอย่างเดียว นอกจากนี้ สายพันธุ์ SARS-CoV-2 ยังแสดงให้เห็นว่าแพร่ระบาดในสัตว์หลายชนิด และมีการสังเกตการแพร่เชื้อจากคนสู่สัตว์ในสัตว์ป่าและสัตว์เลี้ยงบางชนิด [7] ดังนั้น วัคซีน SARS-CoV-2 สำหรับสัตวแพทย์จึงจำเป็นต้องได้รับการดูแลมากขึ้น นอกจากนี้ นาโนเทคโนโลยีอาจเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพในการเพิ่มประสิทธิภาพวัคซีนและสมควรได้รับความสนใจมากขึ้น [2]

การศึกษาครั้งนี้มีข้อจำกัดหลายประการ ประการแรก เราสังเกตกลยุทธ์วัคซีน DNA ในหนู BALB/c เท่านั้น และการศึกษาในอนาคตควรประเมินผลกระทบทางภูมิคุ้มกันของสูตรวัคซีนเหล่านี้ในสัตว์ทดลองรุ่นอื่น ประการที่สอง จำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่อทำความเข้าใจอย่างถ่องแท้ถึงกลไกระดับโมเลกุลที่เป็นรากฐานของการตอบสนองของทีเซลล์ CD8 ที่จำเพาะต่อ nAb และ S-จำเพาะ ซึ่งเกิดจากการสร้างภูมิคุ้มกันร่วมโดยใช้โปรตีน S และ N และเพื่อควบคุมความรู้นี้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพของโควิด-19 การออกแบบวัคซีน ในที่สุด การทำงานของแอนติบอดีจำเพาะโปรตีน N สมควรได้รับการศึกษาเพิ่มเติม

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

โดยสรุป การศึกษานี้ประเมินศักยภาพในการป้องกันภูมิคุ้มกันของการสร้างภูมิคุ้มกันร่วมกับโปรตีน S, N, E และ M ของ SARS-CoV-2 วัคซีนหลายชนิดที่มุ่งเป้าไปที่โปรตีน S เท่านั้นจะมีผลในการป้องกันลดลงต่อสายพันธุ์ที่มีความหลากหลายที่เกิดขึ้นใหม่ ผลลัพธ์ของเราจะวางรากฐานสำหรับการพัฒนาวัคซีนป้องกันโควิดแบบปฏิกิริยาข้าม-19 เพื่อควบคุมสายพันธุ์ SARS-CoV-2 ในปัจจุบันและที่เกิดขึ้นใหม่ และป้องกันการแพร่ระบาดของไวรัสโคโรนาที่อาจเกิดขึ้น

อ้างอิง

1. ซมีฟสกายา อี.; วาลิอุลลินา, อ.; กานีวา ฉัน.; เปตูคอฟ, อ.; ริซวานอฟ อ.; Bulatov, E. การประยุกต์ใช้การบำบัดด้วยเซลล์ CAR-T นอกเหนือจากมะเร็งวิทยา: โรคภูมิต้านตนเองและการติดเชื้อไวรัส ชีวเวชศาสตร์ 2021, 9, 59. [CrossRef] [PubMed]

2. ราชิดซาเดห์, ฮ.; ดานาฟาร์ เอช.; ราฮิมิ เอช.; โมซาฟารี ฟ.; ซาเลเฮียบาร์ ม.; ราห์มาติ, แมสซาชูเซตส์; ราฮามูซ-ฮักไฮฮี ส.; มูซาซาเดห์ น.; โมฮัมมาดี, อ.; เออร์ตาส, YN; และคณะ นาโนเทคโนโลยีต่อต้านไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ (โคโรนาไวรัสกลุ่มอาการทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง 2): การวินิจฉัย การรักษา การบำบัด และมุมมองในอนาคต นาโนการแพทย์ 2021, 16, 497–516. [ครอสอ้างอิง]

3. ฟอนทาเนต, อ.; Cauchemez, S. COVID-19 ภูมิคุ้มกันหมู่: เราอยู่ที่ไหน แนท. สาธุคุณอิมมูนอล. 2020, 20, 583–584. [CrossRef] [PubMed]

4. เจยานาธาน ม.; อัฟคามี ส.; สมายล์ เอฟ.; มิลเลอร์, มิสซิสซิปปี; ลิชตี, BD; Xing, Z. ข้อควรพิจารณาด้านภูมิคุ้มกันสำหรับกลยุทธ์วัคซีนโควิด-19 แนท. สาธุคุณอิมมูนอล. 2020, 20, 615–632. [CrossRef] [PubMed]

5. แวนเดลลี อ.; มอนติ ม.; มิลาเน็ตติ อี.; อาร์มอส, อ.; รูเพิร์ต เจ.; แซคโค อี.; เบชารา อี.; เดลี ปอนติ, ร.; Tartaglia, การวิเคราะห์โครงสร้างของ GG ของจีโนม SARS-CoV-2 และการทำนายปฏิสัมพันธ์ของมนุษย์ กรดนิวคลีอิก Res 2020, 48, 11270–11283. [CrossRef] [PubMed]

6. แจ็คสัน, ซีบี; ฟาร์ซาน ม.; เฉินบี.; Choe, H. กลไกของการเข้าสู่เซลล์ SARS-CoV-2 แนท. สาธุคุณโมล เซลล์ไบโอล 2022, 23, 3–20. [ครอสอ้างอิง]

7. คอนฟอร์ติ อ.; ซานเชซ อี.; ซัลวาโตรี อี.; ลีโอน, ล.; คอมปาญโญน, ม.; ปินโต อี.; ปาลัมโบ ฟ.; ดาคุนโต อี.; มูซี่, อ.; รอสซิลลี ก.; และคณะ วัคซีนทดลอง DNA เชิงเส้นที่เข้ารหัสโดเมนการจับตัวรับ SARS-CoV-2 กระตุ้นการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันที่มีศักยภาพและการทำให้แอนติบอดีเป็นกลางในแมวบ้าน โมล เธอ. วิธีการ คลินิก. นักพัฒนา 2023. [ครอสอ้างอิง]

8. บอร์โกยาโควา MB; คาร์เพนโก, LI; เมอร์คูเลวา ไอโอวา; ชเชอร์บาคอฟ, DN; รูโดเมตอฟ, AP; สตารอสตินา, EV; ชานชิน, ดีวี; อิซาเอวา, AA; เนสเมยาโนวา VS; โวลโควา, เนวาดา; และคณะ การสร้างภูมิคุ้มกันของวัคซีนรวม DNA/โปรตีนเพื่อต้านโควิด-19 วัว. ประสบการณ์ ไบโอล ยา 2023, 1–4. [ครอสอ้างอิง]

9. คู, ล.; ยี่ซ.; เซินย.; ลิน ล.; เฉิน เอฟ.; ซูย.; วูซ.; ถังเอช.; จางเอ็กซ์.; เทียน เอฟ.; และคณะ วัคซีน RNA แบบวงกลมสำหรับต้าน SARS-CoV-2 และสายพันธุ์ใหม่ๆ เซลล์ 2022, 185, 1728–1744.e16 [ครอสอ้างอิง]

10. คอร์เบตต์ แคนซัส; เอ็ดเวิร์ดส์ ดีเค; เลสต์, เอสอาร์; อาบีโอนา, OM; โบโยกลู-บาร์นัม, S.; กิลเลสปี RA; ฮิมานสุ ส.; เชฟเฟอร์ อ.; ซิวาโว, คอนเนตทิคัต; ดิปิอาซซา AT; และคณะ การออกแบบวัคซีน mRNA ของ SARS-CoV-2 ทำได้โดยการเตรียมพร้อมสำหรับเชื้อโรคต้นแบบ ธรรมชาติ 2020, 586, 567–571. [ครอสอ้างอิง]

11. เทียน เจเอช; พาเทล น.; เฮาพท์ ร.; โจว เอช.; เวสตัน ส.; แฮมมอนด์ เอช.; ล็อก เจ.; พอร์ทนอฟ, อ.; นอร์ตัน เจ.; เกเบร-ซาบิเยร์ ม.; และคณะ วัคซีน SARS-CoV-2 ขัดขวางไกลโคโปรตีนผู้สมัคร NVX-CoV2373 การสร้างภูมิคุ้มกันในลิงบาบูนและการป้องกันในหนู แนท. ชุมชน 2021, 12, 372. [CrossRef] [PubMed]

12. อันเดรียโน อี.; ปาซิเอลโล ฉัน.; พิคชินี่ ก.; มังกานาโร น.; พิเลรี ป.; ฮิเซนี ฉัน.; ลีโอนาร์ดี ม.; ปันตาโน อี.; อับเบนโต, ว.; เบนินคาซา, L.; และคณะ ภูมิคุ้มกันแบบผสมปรับปรุงบีเซลล์และแอนติบอดีต่อสายพันธุ์ SARS-CoV-2 ธรรมชาติ 2021, 600, 530–535 [ครอสอ้างอิง]

13. นักวี, เอเอที; ฟาติมา, ก.; โมฮัมหมัด ต.; ฟาติมา, สห.; ซิงห์ ไอเค; ซิงห์, อ.; เอทิฟ เอสเอ็ม; หริปราสาด ก.; ฮาซัน จีเอ็ม; ฮัสซัน รัฐมิชิแกน เจาะลึกจีโนม โครงสร้าง วิวัฒนาการ การเกิดโรค และการรักษาของ SARS-CoV{2}}: แนวทางจีโนมเชิงโครงสร้าง ไบโอชิม. ชีวฟิสิกส์ แอคต้า โมล พื้นฐาน โรค 2020, 1866, 165878. [CrossRef] [PubMed]

14. Abbasi, J. วัคซีน DNA ใหม่-19 เกี่ยวกับโควิดของอินเดียสำหรับวัยรุ่นและผู้ใหญ่เป็นครั้งแรก JAMA 2021, 326, 1365. [CrossRef] [PubMed]

15. เฉิน เจ.; เติ้ง ย.; หวง บ.; มือ.; วังว.; หวาง ม.; ไจ้ค.; จ้าว ซ.; หยางร.; จ้าว ย.; และคณะ วัคซีน DNA ที่แสดงซองจดหมายและโปรตีนเมมเบรนให้การป้องกันบางส่วนจาก SARS-CoV-2 ในหนู ด้านหน้า. อิมมูนอล. 2022, 13, 827605. [CrossRef]

16. เตบาส ป.; เครย์ยัค, แคลิฟอร์เนีย; พาเทล, อ.; มาสโลว์ เจเอ็น; พรุ่งนี้ ส.ส. ; ซิลเวสเตอร์, เอเจ; น็อบล็อค, ด.; กิลเลสปี อี.; อามันเต้ ด.; ราซีน ต.; และคณะ วัคซีน DNA SynCon®Ebola GP ในผิวหนังมีความเสถียรของอุณหภูมิและแสดงให้เห็นข้อดีของภูมิคุ้มกันในระดับเซลล์และร่างกายได้อย่างปลอดภัยในอาสาสมัครที่มีสุขภาพดี เจติดเชื้อ โรค 2019, 220, 400–410. [ครอสอ้างอิง]

17. สมิธ สกว.; พาเทล, อ.; รามอส ส.; เอลวูด ด.; จู้เอ็กซ์.; ยัน เจ.; แกรี่ อังกฤษ; วอล์คเกอร์, SN; ชูลเธส, เค.; ม.; และคณะ ภูมิคุ้มกันของผู้สมัครรับวัคซีน DNA สำหรับโรคโควิด-19 แนท. ชุมชน 2020, 11, 2601. [CrossRef]

18. จ้าว ซ.; เติ้ง ย.; นิว ป.; ซองเจ.; วังว.; ดู่ ย.; หวง บ.; วังว.; จาง ล.; จ้าว ป.; และคณะ การสร้างภูมิคุ้มกันร่วมกับ CHIKV VLP และวัคซีน DNA กระตุ้นให้เกิดการตอบสนองทางร่างกายที่ดีในหนู อิมมูนอลด้านหน้า 2021, 12, 655743. [CrossRef]

19. กวน เจ.; เติ้ง ย.; เฉิน เอช.; หยิน เอ็กซ์.; หยางย.; Tan, W. การรองพื้นด้วยวัคซีน DNA สองตัวที่แสดงโปรตีน NS3 ของไวรัสตับอักเสบซีที่กำหนดเป้าหมายไปที่เซลล์ dendritic ทำให้เกิดศักยภาพในการป้องกันที่แตกต่างกันที่เหนือกว่าในหนู โค้ง. วิโรล. 2558, 160, 2517–2524. [ครอสอ้างอิง]

20. เฉิน เอช.; เหวิน บ.; เติ้ง ย.; วังว.; หยิน เอ็กซ์.; กวน เจ.; เรือนล.; Tan, W. ปรับปรุงผลการสร้างภูมิคุ้มกันของ DNA บวกกับอิเล็กโตรโพเรชั่น ในร่างกาย ด้วยการรวมกันของพลาสมิดไวรัสตับอักเสบบี core-PreS1 และ S-PreS1 คลินิก. วัคซีนอิมมูนอล 2011, 18, 1789–1795. [ครอสอ้างอิง]

21. หยาง ร.; เติ้ง ย.; หวง บ.; หวาง ล.; ลินอ.; หลี่ย.; วังว.; หลิว เจ.; ลู ส.; จ้าน ซ.; และคณะ วัคซีน mRNA สำหรับโควิด-19 ที่มีโครงสร้างเปลือกหุ้มแกนกลางซึ่งมีรูปแบบการกระจายตัวทางชีวภาพที่ดีและภูมิคุ้มกันที่ดี การถ่ายโอนสัญญาณ เป้าหมายเธอ 2021, 6, 213. [CrossRef] [PubMed]

22. หยาง ร.; หวง บ.; อ, ร.; หลี่วว.; วังว.; เติ้ง ย.; Tan, W. การพัฒนาและประสิทธิผลของระบบ SARS-CoV-2 เทียมตามที่กำหนดโดยการทำให้ประสิทธิภาพเป็นกลางและการทดสอบการยับยั้งการเข้า ในหลอดทดลอง ไบโอเซฟ สุขภาพ 2020, 2, 226–231. [CrossRef] [PubMed]

23. เจีย คิว.; บีเลเฟลด์-โอมันน์, เอช.; เมซง RM; มาเลซา-กาลีค, S.; คูเปอร์, SK; โบเวน, RA; Horwitz, MRA การจำลองวัคซีนเวกเตอร์จากแบคทีเรียที่แสดงออกถึงเยื่อหุ้มเซลล์ SARS-CoV-2 และโปรตีนนิวคลีโอแคปซิดช่วยป้องกันโควิดที่รุนแรง-19- เช่นเดียวกับโรคในหนูแฮมสเตอร์ วัคซีน NPJ 2021, 6, 47. [CrossRef] [PubMed]

24. ฮัจนิค RL; แพลนเต, เจเอ; เหลียง ย.; อาลาเมห์ ม.-ก.; ถังเจ.; จง, ค.; อดัม, อ.; ชาร์ตัน ด.; ราฟาเอล GH; หลิวย.; และคณะ การฉีดวัคซีน mRNA แบบผสมผสานช่วยเพิ่มการป้องกันตัวแปรเดลต้า SARS-CoV-2 bioRxiv 2021 [CrossRef]

25. อันตอน, IM; กอนซาเลซ ส.; บูลลิโด, เอ็มเจ; คอร์ซิน ม.; ริสโก้, ซี.; แลงเกเวลด์, เจพี; Enjuanes, L. ความร่วมมือระหว่างโปรตีนโครงสร้างกระเพาะลำไส้อักเสบโคโรนาไวรัส (TGEV) ที่ถ่ายทอดได้ในการเหนี่ยวนำแอนติบอดีจำเพาะไวรัสในหลอดทดลอง ไวรัส Res 1996, 46, 111–124. [ครอสอ้างอิง]

26. เดแชมโบลท์ ย.; ลินช์ เจ.; วอร์เนอร์, บี.; เทียร์นีย์, เค.; ฮวีญ ด.; เวนดราเมลลี ร.; ช่างตัดเสื้อ น.; ฟรอสต์, เค.; บูธ ส.; ซาเจช บ.; และคณะ การฉีดวัคซีนเดี่ยวด้วยไวรัสวัคซีน ACAM2000 ชนิดรีคอมบิแนนท์ซึ่งแสดงการเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วและโปรตีนนิวคลีโอแคปซิดช่วยปกป้องแฮมสเตอร์จากโรคทางคลินิกที่เกิดจาก SARS-CoV-2- bioRxiv 2021 [CrossRef]

27. เปนาโลซา-แมคมาสเตอร์ พี.; คลาส เจ.; ดังกี ต.; วัคซีนนิวคลีโอแคปซิด Richner, JM A SARS CoV-2 ป้องกันการแพร่กระจายของไวรัสในระยะไกล bioRxiv 2021.

28. อัฟคามี ส.; ดาโกสติโน นาย; จางอ.; สเตซีย์ HD; มาร์ซอก อ.; คัง, อ.; ซิงห์ร.; พวนันทศิวัม เจ.; เย่ ก.; หลัว เอ็กซ์.; และคณะ การนำส่งเยื่อเมือกของระบบทางเดินหายใจของวัคซีนป้องกันโควิด-19 ยุคถัดไปให้การป้องกันที่แข็งแกร่งต่อเชื้อ SARS-CoV ทั้งบรรพบุรุษและสายพันธุ์ที่แปรผัน-2 เซลล์ 2022, 185, 896–915.e19 [ครอสอ้างอิง]

29. เจิ้ง น.; เซี่ยร.; ยางค.; หยิน บ.; หลี่ย.; ด้วน ค.; เหลียง, ล.; กัว เอช.; Xie, Q. เพิ่มการแสดงออกของโปรตีนนิวคลีโอแคปซิด SARS-CoV ในยาสูบและการสร้างภูมิคุ้มกันในหนู วัคซีน 2552, 27, 5001–5007 [ครอสอ้างอิง]

30. ยาซุย ฟ.; ไก่ค.; คิตะบาทาเกะ ม.; อิโนะอุเอะ ส.; โยเนดะ ม.; โยโกจิ ส.; เคส อาร์.; เซกิกุจิ ส.; โมริตะ, เค.; ฮิชิมะ ต.; และคณะ การสร้างภูมิคุ้มกันก่อนเกิดโรคทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง (SARS) - โปรตีนนิวคลีโอแคปซิดที่เกี่ยวข้องกับไวรัสโคโรนา (SARS-CoV) ทำให้เกิดโรคปอดบวมรุนแรงในหนูที่ติดเชื้อ SARS-CoV เจ. อิมมูนอล. 2008, 181, 6337–6348. [ครอสอ้างอิง]

31. เดมิง ดี.; เชียฮาน ต.; เฮย์ส ม.; ยอนต์ บ.; เดวิส น.; ซิมส์, อ.; ม.สุธาร์; ฮาร์เคมา เจ.; วิตมอร์, อ.; ผักดองร.; และคณะ ประสิทธิภาพของวัคซีนในหนูวัยชราที่ถูกท้าทายด้วยการแพร่ระบาดของเชื้อ SARS-CoV ชนิดรีคอมบิแนนท์และสายพันธุ์ที่ขัดขวางจากสัตว์สู่คน PLoS Med. 2549, 3, e525. [CrossRef] [PubMed]

32. เวสเซลลิ่ง เจจี; โกเดเก้, จีเจ; ไชนส์, VE; พรีเวค, ล.; เกรแฮม เอฟ.; ฮอร์ซิเนค, พิธีกร; Rottier, PJ Mouse ไวรัสตับอักเสบขัดขวางและโปรตีนนิวคลีโอแคปซิดที่แสดงโดยเวกเตอร์ adenovirus ช่วยปกป้องหนูจากการติดเชื้อร้ายแรง เจ. พล. วิโรล. 1993, 74, 2061–2069. [CrossRef] [PubMed]

33. คิม ไต้หวัน; ลี เจเอช; ฮุง เอฟซี; เป็ง ส.; โรเดน ร.; วัง พิธีกร; วิสซิดี ร.; ไช่ วายซี; เขาล.; เฉิน พีเจ; และคณะ การสร้างและการศึกษาคุณลักษณะของวัคซีน DNA โดยมุ่งเป้าไปที่โปรตีนนิวคลีโอแคปซิดของกลุ่มอาการทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรงของไวรัสโคโรนา เจ. วิโรล. 2004, 78, 4638–4645. [CrossRef] [PubMed]

34. เลอ เบิร์ต น.; ตาล, AT; กุนาเซการัน, ก.; ธรรม CYL; ฮาเฟซี ม.; เจีย, อ.; ชอง MHY; ลิน ม.; ตาล น.; ลินสเตอร์ ม.; และคณะ ภูมิคุ้มกันของทีเซลล์ SARS-CoV-2-เฉพาะในกรณีของโควิด-19 และโรคซาร์ส และการควบคุมที่ไม่ติดเชื้อ ธรรมชาติ 2020, 584, 457–462. [ครอสอ้างอิง]