SLC37A2 โมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับฟอสฟอรัสเพิ่มขึ้นในเซลล์กล้ามเนื้อเรียบในก้อนเนื้อแคลเซียม

การกลายเป็นปูนของหลอดเลือดเป็นแหล่งสำคัญของโรคหัวใจและหลอดเลือดในผู้ป่วยโรคไตเรื้อรังภาวะฟอสเฟตในเลือดสูงนำไปสู่การเพิ่มขึ้นของการไหลเข้าของฟอสฟอรัสในเซลล์ ซึ่งนำไปสู่การเพิ่มขึ้นของเซลล์ที่มีลักษณะคล้ายเซลล์สร้างกระดูกในเซลล์กล้ามเนื้อเรียบของหลอดเลือด PiT-1 ขนส่งฟอสเฟตในเซลล์กล้ามเนื้อเรียบของหลอดเลือด อย่างไรก็ตาม กลไกของการกลายเป็นปูนของหลอดเลือดยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างสมบูรณ์ การศึกษานี้ตรวจสอบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับฟอสฟอรัสที่ไม่ใช่ PiT-1 เราตั้งสมมติฐานว่าโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับฟอสฟอรัสเป็นของตัวละลายผู้ให้บริการซูเปอร์แฟมิลี (SLC) จะเกี่ยวข้องกับการกลายเป็นปูนในหลอดเลือด จากผลลัพธ์ของการวิเคราะห์ DNA microarray เรามุ่งเน้นไปที่ SLC37A2 และแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ mRNA ของเซลล์เหล่านี้เพิ่มขึ้นบนเซลล์กล้ามเนื้อเรียบของเอออร์ตาที่ถูกทำให้เป็นแคลเซียม (AoSMC) มีรายงานว่า SLC37A2 สามารถขนส่งทั้งการแลกเปลี่ยนกลูโคส-6-ฟอสเฟต/ฟอสเฟต และฟอสเฟต/ฟอสเฟต การวิเคราะห์ ในหลอดทดลอง แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ SLC37A2 ไม่ได้รับผลกระทบจากการอักเสบบน AoSMC การแสดงออกของ SLC37A2 mRNA และโปรตีนเพิ่มขึ้นใน AoSMC ที่ถูกทำให้เป็นแคลเซียม ในสิ่งมีชีวิต การวิเคราะห์แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ SLC37A2 mRNA ในเอออร์ตาของโรคไตเรื้อรังหนูมีความสัมพันธ์กับยีนเครื่องหมายกระดูก นอกจากนี้ SLC37A2 ถูกแสดงออกในบริเวณการกลายเป็นปูนของหลอดเลือดในหนูโรคไตเรื้อรัง. เป็นผลให้เราพบว่า SLC37A2 เป็นหนึ่งในโมเลกุลที่เพิ่มขึ้นด้วยกลายเป็นปูนของหลอดเลือดในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย

คำสำคัญ: SLC37A2,กลายเป็นปูนของหลอดเลือด, เซลล์กล้ามเนื้อเรียบของเอออร์ตาโรคไตเรื้อรัง, ภาวะฟอสเฟตในเลือดสูง

คลิกที่นี่เพื่อรับสารสกัดจากถังเก็บน้ำออร์แกนิกธรรมชาติที่มีเอไคนาโคไซด์ 25% และแอคทีโอไซด์ 9% สำหรับการทำงานของไต

บริการสนับสนุนของ Wecistanche - ผู้ส่งออก cistanche ที่ใหญ่ที่สุดในประเทศจีน:

อีเมล:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/โทรศัพท์:+86 15292862950

เลือกซื้อรายละเอียดข้อมูลจำเพาะเพิ่มเติม:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

เนื่องจากจำนวนผู้ป่วยด้วยโรคไตเรื้อรัง(CKD) เพิ่มขึ้น จำนวนผู้ป่วยต้องฟอกไตก็จะเพิ่มขึ้นเช่นกัน เสียชีวิตมากที่สุดในผู้ป่วยที่เข้ารับการรักษาการฟอกไตเนื่องจากโรคหลอดเลือดหัวใจเช่นหัวใจล้มเหลว, ความผิดปกติของหลอดเลือดสมองหรือกล้ามเนื้อหัวใจตาย (,2) แหล่งที่มาสำคัญของโรคหัวใจและหลอดเลือดคือการกลายเป็นปูนนอกมดลูก () ความผิดปกติที่เกิดจากการก่อตัวและการสะสมของผลึกแคลเซียมฟอสเฟตในเนื้อเยื่ออ่อน (4 6) ปัจจัยต่างๆ เช่น การอักเสบ ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน และการเพิ่มขึ้นของระดับแคลเซียมในพลาสมา (Ca) และฟอสฟอรัส (P) มีส่วนเกี่ยวข้องกับการลุกลามของการกลายเป็นปูนในหลอดเลือด ในบรรดาปัจจัยเหล่านี้ ภาวะฟอสเฟตในเลือดสูงมีความเกี่ยวข้องอย่างยิ่งกับการกลายเป็นปูนในหลอดเลือด (7.8) ภาวะฟอสเฟตในเลือดสูงเกิดจากการได้รับ P มากเกินไปในขณะที่การทำงานของไตลดลง ดังนั้น ผู้ป่วยที่ได้รับการฟอกไตจำเป็นต้องจำกัดการบริโภค P. (79-12) อย่างไรก็ตาม มีรายงานว่ากลายเป็นปูนของหลอดเลือดมีความก้าวหน้าอยู่แล้วเมื่อเริ่มฟอกไต นอกจากนี้ยังพบในผู้ป่วยโรคไตวายเรื้อรังระยะเริ่มต้นเมื่อไม่ปรากฏว่ามีฟอสเฟตในเลือดสูง (3) ดังนั้นจึงเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องป้องกันการกลายเป็นปูนของหลอดเลือดในผู้ป่วยโรคไตวายเรื้อรังระยะเริ่มต้น เพื่อปรับปรุงการพยากรณ์โรคในชีวิต

ซึ่งนำไปสู่การไหลเข้าของ P ที่เพิ่มขึ้นในเซลล์กล้ามเนื้อเรียบของหลอดเลือด (VSMC) P ที่ไหลเข้ามาจะดำเนินการผ่าน PiT-1 ซึ่งเป็นตัวขนส่งบนพื้นผิวเยื่อหุ้มเซลล์ของ VSMC PiT- เป็นสมาชิกของซูเปอร์แฟมิลีตัวพาตัวถูกละลาย (SLC) ซึ่งรวมถึงตัวขนส่งโซเดียมฟอสเฟตที่เข้ารหัสโดย SLC20A1.04 PiT- ลำเลียงฟอสเฟตผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ที่ขึ้นกับ Na และต่อมาทำให้เกิดแร่เมทริกซ์เนื่องจากระดับ p ที่สูงขึ้น) ในฐานะภายในเซลล์ ระดับ P เพิ่มขึ้น VSMC เริ่มแสดงปัจจัยการถอดรหัสของกระดูก เช่น ปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับรันต์ 2(Runx2)(16) ผลกระทบนี้ตามมาด้วยการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของยีนที่จำเพาะต่อเซลล์สร้างกระดูก เช่น Osteopontin และ Osteocalcin นอกจากนี้ยังลดการแสดงออกของโปรตีนเฉพาะกล้ามเนื้อเรียบอีกด้วย เช่น โปรตีนของกล้ามเนื้อเรียบ 22-0 (SM22-0) เกิดขึ้น เป็นผลให้ VSMC ถูกเปลี่ยนเป็นเซลล์ที่มีลักษณะคล้ายเซลล์สร้างกระดูก (1718)การศึกษาทางคลินิกล่าสุดแสดงให้เห็นว่าระดับแคลเซียมในเลือด อนุภาคโปรตีน (CPP) ซึ่งเป็นตัวแทนของอนุภาคคอลลอยด์แคลเซียมฟอสเฟต เพิ่มขึ้นเมื่อการทำงานของไตลดลง (19-21)นอกจากนี้ มีรายงานความสัมพันธ์กับระดับ CPP และ P ในเลือด2o2i) มีความเป็นไปได้ที่ CpP อาจกระตุ้นให้เกิดการลุกลามของการกลายเป็นปูนในหลอดเลือด22-24)

อย่างไรก็ตาม มีการสังเกตการกลายเป็นปูนของหลอดเลือดในผู้ป่วยโรคไตวายเรื้อรังระยะเริ่มต้นที่มีระดับ P ในพลาสมาปกติ (13) นอกจากนี้ PiT-1 mRNA ยังแสดงออกอย่างแพร่หลายในเนื้อเยื่อทั้งหมด ดังนั้นอีกโมเลกุลหนึ่งอาจทำหน้าที่หลักในด้านของการกลายเป็นปูนในหลอดเลือด มีรายงานว่าการอักเสบส่งเสริมการกลายเป็นปูนของหลอดเลือด ปัจจัยการอักเสบ เช่น อินเตอร์ลิวคิน (IL)-1B, IL-6 และปัจจัยเนื้อร้ายของเนื้องอก-อัลฟา (TNF-a) ชักนำให้เกิดการแยกความแตกต่างของ VSMC ไปเป็นเซลล์ที่มีลักษณะคล้ายเซลล์สร้างกระดูก (2s26) TNF-a ชักนำให้เกิดการกลายเป็นปูนในหลอดเลือด ผ่านวิถีแคมป์ ซึ่งมีบทบาทในการสร้างความแตกต่างของเซลล์สร้างกระดูก2728) IL-6 ควบคุมวิถีทางต่างๆ ที่นำไปสู่การกลายเป็นปูนในหลอดเลือดของ VSMC2-31) นอกจากนี้ IllB, IL-6 และ TNF-a ก็เป็นปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับการเพิ่มขึ้นของแคลเซียมในหลอดเลือดที่เกิดจากระดับ p สูง 3233) อย่างไรก็ตาม ข้อมูลปัจจุบันไม่สามารถอธิบายกลไกของหลอดเลือดได้ครบถ้วน

กลายเป็นปูนที่เกิดจากปัจจัยเหล่านี้ เราตั้งสมมติฐานว่าอาจมีโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับ P อื่น ๆ เช่นโมเลกุลใน SLC superfamily ซึ่งเกี่ยวข้องกับการกลายเป็นปูนในหลอดเลือด เรามุ่งเน้นไปที่โปรตีนของเมมเบรนในซูเปอร์แฟมิลี SLC และตรวจสอบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับ P ที่อาจเป็นไปได้ นอกเหนือจาก PiT-1 สำหรับการมีส่วนร่วมในการกลายเป็นแคลเซียมในหลอดเลือด นอกจากนี้เรายังตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่างโมเลกุลของผู้สมัครกับการกลายเป็นปูนของหลอดเลือด ในวิดีโอและ ในร่างกาย

วัสดุและวิธีการ

การเพาะเลี้ยงเซลล์ เซลล์กล้ามเนื้อเรียบของมนุษย์ปกติ (AoSMC) ได้มาจาก Lonza (บาเซิล, สวิตเซอร์แลนด์) AoSMC ได้รับการเพาะเลี้ยงตามคำแนะนำของผู้ผลิต AoSMC ถูกคงรักษาไว้ในตัวกลางการเจริญเติบโต (ตัวกลางของเซลล์กล้ามเนื้อเรียบที่เสริมด้วยซีรั่มของวัวในครรภ์ 5% (FBS), ปัจจัยการเจริญเติบโตของผิวหนังชั้นนอก, อินซูลิน, ปัจจัยการเจริญเติบโตของไฟโบรบลาสต์-B และเจนตามิซิน/แอมโฟเทอริซิน-B) สื่อก็เปลี่ยนวันเว้นวัน AoSMC ถูกปลูกในตู้ฟัก CO 5% ที่ได้รับความชื้นที่ 37 องศา และคงไว้จนกว่าจะถึงจุดบรรจบกัน จากนั้นจึงนำไปใช้ในการทดลอง

AoSMC กลายเป็นแคลเซียม การกลายเป็นปูนของ AoSMC ถูกชักนำตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 435) AOSMC ได้รับการเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ Eagle'smodified ของ Dulbecco เสริมด้วย 15% FBS และเพนิซิลลิน-สเตรปโตมัยซิน และเพาะเลี้ยงด้วย 2.6 mM P เป็นเวลา 3, 6, 9, 12 และ 14 วัน ความเข้มข้นของ P ถูกปรับโดย P บัฟเฟอร์NaH, PO/Na และ HPO พีเอช 7.2) AoSMC อื่นๆ ไม่ได้รับการเพาะเลี้ยงด้วย 2.6 mM P

ไมโครอาร์เรย์ดีเอ็นเอ ใช้ RNA ทั้งหมดของตัวอย่าง AoSMC ที่เพาะเลี้ยงและไม่ได้เพาะเลี้ยงด้วย 2.6 mM P วิเคราะห์ RNA ทั้งหมด 5.0 ug โดยใช้ DNA microarray (Agilent Technologies, Tokyo. Japan) SurePrint G3 Human GE 8 x 60k เวอร์ชัน ไมโครอาร์เรย์ 2 ตัวถูกใช้เพื่อตรวจสอบยีนประมาณ 26,000 ตัว อัตราส่วนคำนวณโดยการหารระดับการแสดงออกของ AoSMC ที่เพาะเลี้ยงด้วย 2.6 mM เป็นเวลา 12 วันด้วยระดับการแสดงออกของ AoSMC ที่ไม่เพาะเลี้ยงด้วย 2.6 mM P

ดีเอ็นเอไมโครเรย์

ใช้ RNA ทั้งหมดของตัวอย่าง AoSMC ที่เพาะเลี้ยงและไม่ได้เพาะเลี้ยงด้วย 2.6 mM P วิเคราะห์ RNA ทั้งหมด 5.0 ug โดยใช้ DNA microarray (Agilent Technologies, Tokyo. Japan) SurePrint G3 Human GE 8 x 60k เวอร์ชัน ไมโครอาร์เรย์ 2 ตัวถูกใช้เพื่อตรวจสอบยีนประมาณ 26,000 ตัว อัตราส่วนถูกคำนวณโดยการหารระดับการแสดงออกบน AoSMC ที่เพาะเลี้ยงด้วย 2.6 มิลลิโมลาร์ เป็นเวลา 12 วันโดยระดับการแสดงออกบน AoSMC ที่ไม่เพาะเลี้ยงด้วย 2.6 มิลลิโมลาร์ การแสดงออกของ SLC37A2 ในการอักเสบของหลอดเลือด เพื่อกระตุ้นการตอบสนองต่อการอักเสบใน AoSMC เซลล์จะถูกเพาะเลี้ยงด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อจนกระทั่งถึงจุดบรรจบกันแล้วทำการรักษาด้วย 1 ugmL lipopolysaccharides (LPS) (LPS จาก escherichia coli O111:B4; Sigma, St. Louis, MO) เป็นเวลา 24 และ 72 โดยไม่มี 2.6 mM P. AoSMC อื่นๆ ไม่ได้ถูกเพาะเลี้ยงด้วยการวิเคราะห์ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) แบบเรียลไทม์ RNA ทั้งหมดถูกสกัดจาก AoSMC ที่รับการรักษาด้วย LPS เป็นเวลา 24 และ 72 ชั่วโมง และเซลล์ที่ไม่ได้รับการรักษาด้วย LPS PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณที่ใช้สีเขียวของ SYBR ดำเนินการโดยใช้ cDNA สังเคราะห์และชุดไพรเมอร์ที่เหมาะสมสำหรับยีนเป้าหมายแต่ละยีนด้วยระบบ PCR แบบเรียลไทม์ StepOnePlus (Applied Biosystems, FosterCity, CA) ลำดับไพรเมอร์มีดังนี้: IL ของมนุษย์-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' และ 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC ของมนุษย์-3' และ 5CCATTGGTGTAGTCAGACG-3'; กลีเซอรัลดีไฮด์-3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- และ 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3.IL-6 และระดับการแสดงออก mRNA ของ SLC37A2 ถูกคำนวณหลังจากการทำให้เป็นมาตรฐานด้วย GAPDH การแสดงออกของ SLC37A2 ในการกลายเป็นแคลเซียม AoSMC ยอดรวมถูกสกัดจาก AoSMC ที่ไม่ได้เพาะเลี้ยงด้วย 2.6 mM P และเซลล์ AoSMC เพาะเลี้ยงด้วย 2.6 mM P เป็นเวลา 3, 6, 9, 12 และ 14 วัน PCR แบบเรียลไทม์ดำเนินการโดยใช้ cDNA สังเคราะห์ ลำดับไพรเมอร์มีดังนี้ ดังต่อไปนี้: Human Runx2, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3' และ 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3 ระดับนิพจน์ Runx2 และ SLC37A2 mRNA ถูกคำนวณหลังจากการทำให้เป็นมาตรฐานด้วย APPH

การวิเคราะห์การซับแบบตะวันตก

โปรตีนทั้งหมดถูกรวบรวมจากตัวอย่าง AoSMC ที่เพาะเลี้ยงภายใต้เงื่อนไขเดียวกันกับที่ใช้สำหรับการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ ตัวอย่างเหล่านี้ถูกแยกโดยใช้น้ำเกลือทริสบัฟเฟอร์ (pH 75) เสริมด้วย 5% NP-40 และค็อกเทลตัวยับยั้งโปรตีเอส 1% วัดตัวอย่างความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน BCA (Thermo FisherScientific.Waltham, MA) และความเข้มข้นถูกปรับโดยการซับแบบตะวันตก แยกโปรตีน 10 ไมโครกรัมในเจลโพลีอะคริลาไมด์ 10% โดยใช้โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรโฟรีซิส เมมเบรนได้รับการบำบัดด้วย SLC37A2antibody (Novus Biologicals, Centennial, CO) หรือแอนติบอดี GAPDH (GeneTex, Irvine, CA) เป็นแอนติบอดีปฐมภูมิบ่มด้วย Rabbit lgG Horseradish peroxidase-conjugated antibody (R&D Systems, Minneapolis, MN) เป็นแอนติบอดีทุติยภูมิ และแสดงภาพโดยใช้ Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, England) และเครื่องวิเคราะห์ภาพเรืองแสง (LAS{12}} plus, FUNIFILM, โตเกียว, ญี่ปุ่น) วงดนตรีถูกหาปริมาณโดยใช้อิมาเจล

การทดลอง

โปรโตคอลการศึกษาทั้งหมดได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมของมหาวิทยาลัยเฮียวโกะ คณะวิชาวิทยาศาสตร์มนุษย์และสิ่งแวดล้อม หนู Sprague-Dawley เพศผู้อายุ 12 สัปดาห์ซื้อจาก Japan SLC (ชิซูโอกะ ประเทศญี่ปุ่น) หนูถูกเลี้ยงไว้ในวัฏจักรมืด 12- รอบ 12- ชั่วโมง (09:00-21:00) และอนุญาตให้เข้าถึงอาหารและน้ำบริสุทธิ์พิเศษได้ฟรี

อาหารทดลองประกอบด้วยอาหารควบคุม P (1.0% P, 0.6Ca, 20% โปรตีน), อาหารที่มีอะดีนีน (0.75% อะดีนีน , 1.0% P, 0.6%Ca, โปรตีน 2.5%), อาหารที่มี P (LP) ต่ำ (0.2% P,0 .6% Ca, 10%โปรตีน) และอาหารที่มี P สูง (HP) (1.0% P, 0.6% Ca, โปรตีน 10%) โดยอิงตามอาหาร AIN93-G (ตะวันออก ยีสต์ โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น) โดยมีเคซีนเป็นแหล่งโปรตีน3637) มีรายงานอาหารที่มีโปรตีนต่ำเพื่อส่งเสริมการเกิดแคลเซียมในหลอดเลือดในหนูที่มีภาวะไตวายที่เกิดจากอะดีนีน ดังนั้นจึงมีการจำกัดโปรตีน3738)ก่อนทำการจัดกลุ่ม หนูทุกตัว (n=23) ได้รับอาหาร MF มาตรฐาน (ยีสต์ตะวันออก) เป็นเวลาหนึ่งสัปดาห์เพื่อปรับตัวให้ชินกับสภาพแวดล้อม เมื่ออายุ 13 สัปดาห์ หนูถูกแบ่งออกเป็น 2 กลุ่ม: กลุ่มควบคุม (n=5) และกลุ่ม CKD ที่เกิดจากอะดีนีน (n=18) กลุ่มควบคุมได้รับอาหาร P ควบคุมเป็นเวลา 6 สัปดาห์ . กลุ่ม CKD ที่เกิดจากอะดีนีนได้รับอาหารที่มีอะดีนีนเป็นเวลาประมาณ 3 สัปดาห์ และจากนั้นถูกแบ่งออกเป็น 2 กลุ่มย่อยเพิ่มเติม: กลุ่ม CKD-LP (n=8) หรือกลุ่ม CKDHP (n=10) หนูของกลุ่ม CKD-LP และกลุ่ม CKD-HP ได้รับอาหาร LP และอาหาร HP เป็นเวลา 3 สัปดาห์ ตามลำดับในระหว่างช่วงทดลอง โดยมีการบันทึกการบริโภคอาหารทุกวัน ในระหว่างการรับประทานอาหารอะดีนีน จะมีการเก็บตัวอย่างเลือดจากหลอดเลือดดำส่วนหางระหว่างเวลา 10:00 AM ถึง 11:00 AM สัปดาห์ละครั้งจนถึงสัปดาห์ที่สอง และหลังจากนั้นทุกๆ 2 วันเพื่อตรวจดูระดับพลาสมา ในระหว่างการรับประทานอาหาร LP หรืออาหาร HP จะมีการเก็บตัวอย่างเลือดสัปดาห์ละครั้ง เก็บตัวอย่างปัสสาวะและบันทึกปริมาตรปัสสาวะสัปดาห์ละครั้ง หนูถูกสังเวยด้วยยาชาโดยใช้ไอโซฟลูเรน (Wako Pure Chemical Industries, โอซาก้าญี่ปุ่น) และการผ่าตัดเปิดช่องท้อง เก็บตัวอย่างเลือดจาก inferior vena cava และ thoracoabdominal aorta เพื่อการวิเคราะห์

การแสดงออกของ SLC37A2 บนเอออร์ตา

ประมาณหนึ่งในสามของเอออร์ตาทรวงอกช่องท้องที่รวบรวมได้ถูกนำมาใช้เพื่อให้เห็นภาพการกลายเป็นปูนและดำเนินการสร้างภูมิคุ้มกัน เอออร์ตาถูกฝังอยู่ในพาราฟินและ 4- ส่วนถูกตัดออก ส่วนต่างๆ ถูกย้อมโดยใช้วิธี Von Kossa สำหรับชุดแคลเซียม (Polysciences. Warrington, PA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ทำการวิเคราะห์การสร้างภูมิคุ้มกันด้วยส่วนอนุกรม ส่วนต่างๆ ถูกบ่มด้วยแอนติบอดี SLC37A2 ข้ามคืนที่ 4 องศา จากนั้นทำการบำบัดด้วย Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, โตเกียว, ญี่ปุ่น) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากนั้น ส่วนต่างๆ ได้รับการบำบัดด้วยชุดซับสเตรต DAB (นิชิเร)

Total RNA ถูกสกัดจากส่วนที่เหลือของเอออร์ตาทรวงอกช่องท้องที่แช่แข็ง PCR แบบเรียลไทม์ดำเนินการโดยใช้ cDNA สังเคราะห์ ลำดับไพรเมอร์มีดังนี้: หนู Osteo-Pontin,5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' และ 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' และ; หนู SLC37A2, 5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' และ 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3 ระดับการแสดงออกของ mRNA ของ mRNA ของ Osteopontin และ SLC37A2 mRNA ถูกคำนวณหลังจากการทำให้เป็นมาตรฐานด้วย GAPDH

การวิเคราะห์ทางสถิติ.

ข้อมูลจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย + SE วิเคราะห์ความแตกต่างระหว่างกลุ่มโดยใช้การทดสอบที ในการทดลอง AoSMC ที่ถูกทำให้กลายเป็นแคลเซียมด้วยฟอสเฟต มีการวิเคราะห์ความแตกต่างโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวตามด้วยวิธีของ Dunnett ในการทดลองแบบจำลอง CKD มีการวิเคราะห์ความแตกต่างโดยใช้การทดสอบ K ruskal-Wallis ตามด้วยวิธี Steel-Dwass หาค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ (rs) โดยใช้การทดสอบอันดับสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของสเปียร์แมน สำหรับการทดสอบทั้งหมด ค่า p สองด้าน<0.05 were considered statistically significant.