Transcriptomics เซลล์เดียวเผยปฏิกิริยาระหว่างเซลล์และเซลล์กรองไตที่หยุดชะงักหลังจากการบาดเจ็บของ Podocyte ในช่วงต้นและแบบคัดเลือก
Jul 01, 2024
โรคไตเรื้อรัง (CKD)ส่งผลกระทบต่อผู้คนถึง 700 ล้านคนทั่วโลกแล้วเฉพาะเจาะจงฟิการบำบัดด้วยคกำลังขาด1 มากมายโรคไตมีต้นกำเนิดมาจากฉันไม่ใช่โกลเมอรูลัส, ที่ฟิหน่วยบำบัดน้ำเสียของไต โกลเมอรูลัสประกอบด้วย (i) เซลล์เม็ดเลือดขาว ซึ่งเป็นเซลล์หลังไมโทติคชนิดพิเศษที่มีกระบวนการทางเท้าที่ซับซ้อนซึ่งประสานกันเป็นแผ่นไดอะแฟรมกรีดและพันรอบเส้นเลือดฝอยของไต (ii) เซลล์บุผนังหลอดเลือดซึ่งอยู่ตรงข้ามกับเซลล์พ็อดไซต์บนเยื่อหุ้มชั้นใต้ดินของไตที่ใช้ร่วมกัน (GBM); (iii) เซลล์ mesangial ที่สร้างเมทริกซ์ที่ให้การสนับสนุนโครงสร้างของโกลเมอรูลัส และ (iv) เซลล์เยื่อบุผิวข้างขม่อม (PECs) ซึ่งเรียงตัวอยู่ในแคปซูล Bowman2 โดยเฉพาะอย่างยิ่งการบาดเจ็บของพอโดไซต์นำไปสู่โรคไตที่ลุกลามและแพร่หลายอย่างมาก รวมถึงโรคไตเบาหวาน (DKD) โรคไตอักเสบส่วนโฟกัส (FSGS) และกลุ่มอาการไต (ทั้งไม่ทราบสาเหตุและทางพันธุกรรม) รูปแบบการบาดเจ็บตามแบบบัญญัติส่งผลให้เกิดการสูญเสียกระบวนการของเท้าที่เชื่อมต่อกันซึ่งเรียกว่ากระบวนการเท้า ซึ่งเกิดจากการจัดเรียงโครงร่างโครงร่างโครงร่างใหม่ของโครงร่างเซลล์ของแอกตินใหม่ การกำจัดนี้นำไปสู่การหยุดชะงักของไดอะแฟรมกรีดซึ่งเป็นสิ่งกีดขวางทางกายภาพที่ทำหน้าที่เป็นฟิตามมาด้วยการแยกตัวของ podocyte หรือการเสียชีวิต3,4 ในทางกลับกัน นอกเหนือจาก podocytes ที่ไม่บุบสลายแล้ว การก่อตัวและการบำรุงรักษาของไตฟิสิ่งกีดขวางการระบายน้ำจำเป็นต้องการสื่อสารภายในไตซึ่งควบคุมอย่างเข้มงวดโดยชุดกลไกการส่งสัญญาณแบบ autocrine และ paracrine ตัวอย่างเช่น ปัจจัยการเจริญเติบโตของหลอดเลือดบุผนังหลอดเลือด A (VEGFA) เป็นสัญญาณการอยู่รอดสำหรับเซลล์บุผนังหลอดเลือดที่ถูกหลั่งโดยเซลล์บุผนังหลอดเลือด และปัจจัยการเจริญเติบโตที่ได้มาจากเกล็ดเลือด B (PDGFB) เป็นสัญญาณการอยู่รอดสำหรับเซลล์มีเยื่อเมสันที่ถูกหลั่งโดยเซลล์บุผนังหลอดเลือด5 การหยุดชะงักของปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์และเซลล์เหล่านี้มักพบในโรคไตหลายชนิด รวมถึง FSGS และ DKD6 ดังนั้น การระบุการเปลี่ยนแปลงที่ก่อกวนเร็วที่สุดในโกลเมอรูลัสอาจเสนอเป้าหมายใหม่และโอกาสในการเพิ่มประสิทธิภาพความสำเร็จในการรักษาสำหรับรักษาโรคไต.
สมุนไพรใหม่สำหรับการรักษาโรคไต
ได้รับการสนับสนุนจากสถาบันโรคเบาหวานและระบบทางเดินอาหารและโรคไตแห่งชาติ NIH ให้ทุน DK103658, DK099465 และ DK095045 (AG) การสื่อสารในไต ควบคุมอย่างเข้มงวดโดยชุดกลไกการส่งสัญญาณอัตโนมัติและพาราคริน ตัวอย่างเช่น ปัจจัยการเจริญเติบโตของหลอดเลือดบุผนังหลอดเลือด A (VEGFA) เป็นสัญญาณการอยู่รอดของเซลล์บุผนังหลอดเลือดที่ถูกหลั่งโดยเซลล์บุผนังหลอดเลือด และปัจจัยการเจริญเติบโตที่ได้มาจากเกล็ดเลือด B (PDGFB) เป็นสัญญาณการอยู่รอดของเซลล์เยื่อหุ้มปอดที่ถูกหลั่งโดยเซลล์บุผนังหลอดเลือด5 การหยุดชะงักของเซลล์เหล่านี้ ปฏิสัมพันธ์ของเซลล์มักถูกสังเกตพบในโฮสต์ของโรคไต รวมทั้ง FSGS และ DKD6 ดังนั้น การระบุการเปลี่ยนแปลงที่ก่อกวนเร็วที่สุดในโกลเมอรูลัสอาจเสนอเป้าหมายใหม่และโอกาสในการเพิ่มประสิทธิภาพความสำเร็จในการรักษาสำหรับการรักษาโรคไต
การจัดลำดับ RNA เซลล์เดี่ยว (scRNAseq) ได้ปฏิวัติความสามารถในการศึกษาประเภทเซลล์แต่ละประเภทของเนื้อเยื่อที่ซับซ้อนและสถานะของเซลล์หลังจากการรบกวนที่เฉพาะเจาะจง7,8 การศึกษา scRNAseq ล่าสุดในไตได้ให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับโปรไฟล์การถอดรหัสของเซลล์ไตประเภทในหนูที่มีสุขภาพดีและ ตัวอย่างของมนุษย์และในบางสภาวะของโรค รวมถึง DKD และ lupus nephritis.9e12 อย่างไรก็ตาม การศึกษาโดยละเอียดเกี่ยวกับสภาวะของเซลล์ไตนั้นถูกจำกัดด้วยเซลล์จำนวนเล็กน้อยที่สามารถวิเคราะห์ได้ นอกจากนี้ การเปลี่ยนแปลงเฉพาะประเภทเซลล์แรกสุดที่เกิดขึ้นในเซลล์ไตทั้งหมดเกี่ยวกับการบาดเจ็บของพอโดไซต์ยังไม่ได้รับการตรวจสอบและยังไม่ได้กำหนดไว้
การผ่าตัดทำลายพอโดไซต์โดยการกำจัดโปรตีนภายนอกที่จำเป็นอย่าง CTCF ซึ่งกระตุ้นให้เกิดภาวะโปรตีนยูริกที่ลุกลามและ CKD13 ในอดีต แบบจำลองเมาส์ CKD ถูกสร้างขึ้นโดยการกระตุ้นการบาดเจ็บที่ไตโดยสารพิษจากภายนอกหรือการแทรกแซงการผ่าตัด ระบบที่ต่ำกว่ามาตรฐานซึ่งไม่เพียงพอ สรุปการเปลี่ยนแปลงกลไกตามลำดับ การลบ CTCF ซึ่งเป็นโมเลกุลภายนอกที่สำคัญ นำไปสู่การสูญเสียพ็อดไซท์อย่างรวดเร็ว ภาวะอัลบูมินูเรียที่ก้าวหน้าอย่างรุนแรง การเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญของแร่ธาตุในกระดูก ไตวาย และการเสียชีวิตก่อนวัยอันควร13 แบบจำลองการลบ CTCF เฉพาะของพ็อดไซท์ที่เหนี่ยวนำไม่ได้ (iCTCFpod / ) มอบโอกาสพิเศษในการศึกษา การเปลี่ยนแปลงปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์และเซลล์ภายในเซลล์อันเป็นผลมาจากการบาดเจ็บของพอดไซท์ การแสดงออกของ Podocyte CTCF ไม่สามารถตรวจพบได้ในช่วงเวลาแรกสุด ที่ 1 สัปดาห์ของการเหนี่ยวนำ Cre ที่เป็นสื่อกลางของ doxycycline ใน iCTCFpod / หนู 13 การสูญเสีย podocyte ที่มีนัยสำคัญและก้าวหน้า ซึ่งวัดโดยการวิเคราะห์ทางจุลพยาธิวิทยา เริ่มต้นที่ 2 สัปดาห์หลังจากการเหนี่ยวนำ Cre ในการศึกษาปัจจุบัน การวิเคราะห์โดยละเอียดได้ดำเนินการที่จุดเวลา 1- สัปดาห์เพื่อระบุการเปลี่ยนแปลงแรกสุดในอันตรกิริยาระหว่างเซลล์กับเซลล์ในไตซึ่งเกิดจากการบาดเจ็บของพอดไซท์ซึ่งท้ายที่สุดจะนำไปสู่โรคไตวายเรื้อรัง
วัสดุและวิธีการ
การดูแลสัตว์
การศึกษานี้ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ที่โรงพยาบาลบริกแฮมและโรงพยาบาลสตรี โรงเรียนแพทย์ฮาร์วาร์ด การศึกษาในสัตว์ทั้งหมดดำเนินการตามแนวทางที่กำหนดและได้รับอนุมัติโดยคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ที่โรงพยาบาลบริกแฮมและโรงพยาบาลสตรี โรงเรียนแพทย์ฮาร์วาร์ด หนู iCrepod-Ctcfwt/fl ถูกสร้างขึ้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า และผสมพันธุ์เพื่อสร้างหนู iCrepod-Ctcffl/fl (iCTCFfl/fL) และ iCrepod-Ctcfwt/wt [wild-type (WT)] การศึกษานี้ใช้หนูทั้งตัวผู้และตัวเมีย ด็อกซีไซคลิน (4 กรัม/ลิตร) (Sigma D9891) ได้รับการบริหารอย่างต่อเนื่องในน้ำดื่มที่มีซูโครส (50 กรัม/ลิตร) (VWR BDH0308) ให้กับทั้ง iCTCFfl/fL (สร้าง iCTCFpod / หนูเมาส์) และหนูควบคุมครอก WT (6 ถึง 8 อายุหลายสัปดาห์เมื่อเริ่มใช้ด็อกซีไซคลิน) เพื่อกระตุ้นการแสดงออกของ Cre โดยเฉพาะในพอดไซด์
อาหารเสริมไตจากไตทั้งหมด
iCTCFpod / และหนู WT ถูกสังเวยหลังจากการรักษาด้วยด็อกซีไซคลินเป็นเวลา 1 สัปดาห์ และไตจะถูกผ่าและล้างอย่างรวดเร็วด้วยสารละลายเกลือที่สมดุลของแฮงค์เย็นฉ่ำ (หมายเลขแค็ตตาล็อก 14170112, Thermo Scientific, Waltham, MA) หลังจากนำแคปซูลไตออกแล้ว โกลเมอรูลีจะถูกเสริมสมรรถนะที่อุณหภูมิ 4 C โดยใช้เทคนิคการกรอง14 ด้วยตะแกรงขนาด 180- มม., 75- มม. และ 53- มม. เศษส่วนอุดมด้วยไตที่เก็บจากตะแกรง 53- มม. ถูกล้างด้วยสารละลายเกลือที่สมดุลของแฮงค์ส 1 แฮงค์ที่เย็นด้วยน้ำแข็ง แล้ววางลงบนน้ำแข็ง
การเตรียมสารแขวนลอยเซลล์เดียว
การเตรียมห้องสมุดและการจัดลำดับเซลล์เดียว
เซลล์เดี่ยวได้รับการประมวลผลผ่าน 10 Chromium 30Single Cell Platform โดยใช้ Chromium Single Cell 30Library, Gel Bead และ Chip Kits (10 Genomics, Pleas anton, CA) ตามระเบียบการของผู้ผลิต โดยสรุป เซลล์ 10,{5}} เซลล์ถูกเพิ่มลงในแต่ละช่องของชิปเพื่อแบ่งเป็นเม็ดเจลในอิมัลชันในเครื่องมือโครเมียม ตามด้วยการสลายเซลล์และการถอดรหัสแบบย้อนกลับด้วยบาร์โค้ดของ RNA ในหยด การแตกตัวของอิมัลชันตามมาด้วยการขยาย การแยกส่วน และการเติมตัวปรับต่อและดัชนีตัวอย่าง ห้องสมุดถูกรวมเข้าด้วยกันและจัดลำดับบน Illumina HiSeq
ปฏิกิริยาลูกโซ่ไฮบริด
รีเอเจนต์ของปฏิกิริยาลูกโซ่ไฮบริไดเซชัน (HCR) v3 ทั้งหมด (โพรบ, กิ๊บติดผม และบัฟเฟอร์) ถูกซื้อจาก Molecular Technologies (พาซาดีนา, แคลิฟอร์เนีย) เนื้อเยื่อบางๆ (10 ม.) ถูกติดไว้ในแผ่นกระจกด้านล่าง 24- (หมายเลขแค็ตตาล็อก 82050-898, VWR, Radnor, PA) เคลือบด้วย 1:5{{38} } การเจือจางของ (3-อะมิโนโพรพิล)ไตรเอทอกซีไซเลน (หมายเลขแค็ตตาล็อก 440140, ซิกมา-อัลดริช) สารละลายต่อไปนี้ถูกเติมลงในเนื้อเยื่อ: ฟอร์มาลิน 10% (หมายเลขแค็ตตาล็อก 100503- 120, VWR) เป็นเวลา 15 นาที, การล้างสองครั้งด้วย 1 PBS (หมายเลขแค็ตตาล็อก AM9625, Thermo Fisher Scientific), เย็นด้วยน้ำแข็ง 70% EtOH ที่ 20 C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง (ถึงข้ามคืน) การล้างโซเดียมซิเตรตน้ำเกลือ 5 รายการสามครั้งด้วย Tween 0.2%-20 (SSCT) (หมายเลขแค็ตตาล็อก 15557044, Thermo Fisher Scientific), บัฟเฟอร์ไฮบริไดเซชัน (เทคโนโลยีระดับโมเลกุล) เป็นเวลา 10 นาที, โพรบใน บัฟเฟอร์ไฮบริไดเซชันข้ามคืน, ล้างบัฟเฟอร์ล้างสี่ครั้ง (เทคโนโลยีโมเลกุล) เป็นเวลา 15 นาที, ล้างสามครั้งด้วย 5 SSCT, บัฟเฟอร์ขยายสัญญาณ (เทคโนโลยีโมเลกุล) เป็นเวลา 10 นาที และล้างสามครั้งเป็นเวลา 15 นาทีด้วย 5 SSCT (1:10,{{31 }} DAPI หมายเลขแค็ตตาล็อก TCA2412-5MG, VWR) ในการล้างครั้งที่สอง กิ๊บติดผมถูกทำให้เสียสภาพด้วยความร้อนในบัฟเฟอร์การขยายสัญญาณข้ามคืน ตัวอย่างถูกจัดเก็บและถ่ายภาพใน 5 SSCT การถ่ายภาพดำเนินการบนดิสก์คอนโฟคอลแบบหมุนได้ (Yokogawa W1 บน Nikon Eclipse Ti) ที่ใช้งานซอฟต์แวร์ NIS-elements AR ทำการวิเคราะห์และประมวลผลภาพบนซอฟต์แวร์ ImageJ Fiji เวอร์ชัน 2.1.0/1.53c (NIH, Bethesda, MD; //imagej.nih.gov/ij)
การประมวลผลข้อมูลและการควบคุมคุณภาพ
A Cellranger toolkit (version 2.1.1) was used to perform demultiplexing using the cellranger mkfastq command and the cellranger count command for alignment to the mouse transcriptome, cell barcode partitioning, collapsing unique molecular identifier (UMI) to transcripts, and gene-level quantification. Cells were filtered to include cells expressing a minimum of 500 genes and a maximum of 4000 genes. Furthermore, the percentage of reads mapping to mitochondrial genes was capped at 12%. DoubletFinder was used to identify potential doublets.15 Clusters with >75% ของเซลล์ที่ถูกจัดประเภทเป็นดับเบิ้ลต์ที่มีความมั่นใจสูงถูกลบออกจากการวิเคราะห์เพิ่มเติม เซลล์ที่เหลือซึ่งจัดประเภทเป็นดับเบิ้ลที่มีความมั่นใจสูงก็ถูกลบออกจากการวิเคราะห์เพิ่มเติมเช่นกัน การวิเคราะห์เกี่ยวข้องกับการสุ่มตัวอย่างจำนวนเซลล์เพื่อพิจารณาความแตกต่างนี้ ตัวอย่างเช่น หากมีเซลล์ WT น้อยลงในประเภทเซลล์ที่กำหนด ตัวอย่างเซลล์ iCTCF แบบสุ่มซึ่งเท่ากับจำนวนเซลล์ WT จะถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกที่แตกต่างกัน
การจัดกลุ่มแบบไม่มีผู้ดูแลและการลดขนาด
การตั้งค่าเริ่มต้นในแพ็คเกจ Seurat R16 เวอร์ชัน 3.0 ถูกนำมาใช้สำหรับการทำให้เป็นมาตรฐาน (NormalizeData) ของการนับการแสดงออกของยีน การระบุยีนของตัวแปร (FindVariableGenes) การค้นหาจุดยึดการรวม (FindIntegrationAnchors) และการรวมตัวอย่าง (IntegrateData) . ความแปรปรวนที่ไม่พึงประสงค์เกิดขึ้นเนื่องจากจำนวน UMI และอัตราส่วนของการจับคู่การอ่านกับยีนไมโตคอนเดรีย (ScaleData) การลดขนาดทำได้โดยใช้การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (RunPCA) บนยีนที่แปรผันสูง ฟังก์ชัน PCElbowPlot() ใช้เพื่อแยกแยะส่วนประกอบหลักสำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม สำหรับการจัดกลุ่มเซลล์ทั้งหมด องค์ประกอบหลัก 40 แรกจะบันทึกความแปรปรวนทั้งหมดอย่างเพียงพอ คลัสเตอร์ที่แตกต่างกันระดับโมเลกุลถูกระบุโดยใช้พารามิเตอร์เริ่มต้น (FindClusters) และความละเอียด 0.4 (FindNeighbors) ข้อมูลได้รับการประมวลผลและปรับขนาดตามที่อธิบายไว้ข้างต้นหลังจากการย่อยเซลล์ไต มีการใช้ส่วนประกอบหลักทั้งหมด 30 รายการสำหรับการจัดกลุ่มดาวน์สตรีมที่ความละเอียด 0.3 (FindNeighbors)
การจำแนกประเภทเซลล์
ยีนที่เสริมคลัสเตอร์หรือยีนมาร์กเกอร์ถูกคำนวณโดยใช้การทดสอบผลรวมอันดับของวิลคอกซัน (FindAllMarkers) สำหรับการแสดงออกที่แตกต่างกันของยีนในเซลล์คลัสเตอร์เทียบกับเซลล์อื่นทั้งหมด และการเลือกยีนเหล่านั้นที่ผ่านค่า P ที่ปรับแล้ว (อัตราการค้นพบที่ผิดพลาด) ค่าตัดของ {{1 }}.05 เป็นตัวแทนคลัสเตอร์ เอกลักษณ์ของคลัสเตอร์ถูกกำหนดโดยการเปรียบเทียบยีนที่ขับเคลื่อนด้วยข้อมูลกับรายการยีนที่ดูแลโดยวรรณกรรมสำหรับประเภทเซลล์ไตที่โตเต็มที่
การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนเชิงอนุพันธ์
การวิเคราะห์การแสดงออกเชิงอนุพันธ์แบบคู่ใน Seurat (FindMarkers) ถูกนำมาใช้กับเกณฑ์การเปลี่ยนแปลงการพับบันทึกที่ตั้งค่าเป็น {{0}}.01 และพารามิเตอร์เริ่มต้นเพื่อวิเคราะห์การแสดงออกที่แตกต่างกันระหว่างเซลล์ iCTCFpod / และ WT ในคลัสเตอร์เฉพาะ ภายใน FindMarkers นั้น ident.1 ถูกตั้งค่าเป็น iCTCFpod / เซลล์เฉพาะคลัสเตอร์ และ ident.2 ถูกตั้งค่าเป็นเซลล์ WT เฉพาะคลัสเตอร์ที่สอดคล้องกัน ยีนที่มีการปรับ P <0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญ
การวิเคราะห์การแสดงออกมากเกินไป
การวิเคราะห์การเป็นตัวแทนมากเกินไปถูกนำมาใช้เพื่อตรวจสอบว่าการทำงานหรือกระบวนการทางชีววิทยาที่ทราบนั้นถูกนำเสนอมากเกินไปหรือทำให้สมบูรณ์ในรายการของยีนที่แสดงออกแตกต่างกันหรือไม่ แพ็คเกจ R คลัสเตอร์โปรไฟล์ 18 โดยเฉพาะฟังก์ชันenrichGO ถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์การเป็นตัวแทนมากเกินไป มีการใช้พารามิเตอร์เริ่มต้น โดยมีข้อยกเว้นของ ont Z BP, pvaluecutoff Z 0.25 และ qvaluecutoff Z 0.25 จากนั้นจึงใช้แผนเพิ่มประสิทธิภาพแพ็คเกจ R (GitHub, https://github.com/YuLab-SMU/enrichplot เข้าถึงล่าสุดเมื่อวันที่ 30 สิงหาคม 2564) โดยเฉพาะฟังก์ชัน emapplot เพื่อแสดงภาพผลลัพธ์การเพิ่มคุณค่าโดยการวางแผนเงื่อนไขการเพิ่มคุณค่าสูงสุด
การวิเคราะห์ตัวรับลิแกนด์
iTALK19 ถูกใช้เพื่อจับคู่ตัวรับกับลิแกนด์ที่ถูกแสดงออกอย่างแตกต่างใน iCTCFpod / podocytes โดยเฉพาะอย่างยิ่ง rawParse ใช้ในการคำนวณการแสดงออกเฉลี่ยของแต่ละยีน โดยใช้ข้อมูลที่ปรับขนาดจาก Seurat FindLR ที่ใช้ประเภทข้อมูล Z หมายถึงใช้ในการระบุคู่ลิแกนด์และตัวรับ คู่ที่น่าสนใจของลิแกนด์และรีเซพเตอร์ถูกพล็อตโดยใช้พารามิเตอร์เริ่มต้นของ LRPlot ความหนาของเส้นบ่งชี้ถึงการแสดงออกเฉลี่ยสัมพัทธ์ของลิแกนด์ และขนาดของหัวลูกศรบ่งชี้ถึงการแสดงออกเฉลี่ยสัมพัทธ์ของตัวรับ
การวิเคราะห์ NicheNet
แพ็คเกจ R NicheNet20 ถูกใช้เพื่อทำนายปฏิสัมพันธ์ของลิแกนด์รีเซพเตอร์ที่อาจกระตุ้นให้เกิดการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนในประเภทเซลล์ที่สนใจ คลัสเตอร์พอโดไซต์ทั้งหมดและคลัสเตอร์เอนโดธีเลียมทั้งหมดถูกรวมกันเพื่อการวิเคราะห์นี้ พารามิเตอร์เริ่มต้นทั้งหมดถูกใช้ ยกเว้นการตั้งค่าเกณฑ์การตัดที่ต่ำกว่า 0.11 สำหรับการเตรียม_ลิแกนด์_เป้าหมาย_การแสดงภาพ การประมวลผลภาพ HCR และการหาปริมาณ รูปภาพได้รับการประมวลผลโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ2 (NIH, Bethesda, MD; http://imagej.nih.gov/ij) สำหรับไฟล์ ImageJ มีการใช้เวอร์ชัน 2.1.0/1.53c (http://imagej.net/ ผู้ร่วมให้ข้อมูล (เข้าถึงล่าสุด 2 สิงหาคม 2020) ไฟล์ Raw ND2 ถูกลบพื้นหลังโดยใช้วิธี Rolling Ball (rolling Z 50 สแต็กเลื่อน) จากนั้นฉายความเข้มเฉลี่ยของภาพ Z-stack และช่องภาพถูกแบ่งและบันทึกแยกกัน CellProfiler เวอร์ชัน 3.1.5 (Broad Institute of MIT และ Harvard, Cambridge, MA) ใช้สำหรับการแบ่งส่วนเซลล์ตามความเข้มของแสงเรืองแสง ของช่อง DAPI และสำหรับการวัดความเข้มของแสงฟลูออเรสเซนซ์ในช่องที่เหลือ มีการประเมิน WT สี่ตัวและ iCTCFpod / หนูเพื่อการวิเคราะห์ทางสถิติ
บริการสนับสนุนของ Wecistanche - ผู้ส่งออก cistanche ที่ใหญ่ที่สุดในประเทศจีน:
อีเมล:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/โทรศัพท์:+86 15292862950
เลือกซื้อรายละเอียดข้อมูลจำเพาะเพิ่มเติม:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
คลิกที่นี่เพื่อรับสารสกัดจากถังเก็บน้ำออร์แกนิกธรรมชาติที่มีเอไคนาโคไซด์ 25% และแอคทีโอไซด์ 9% สำหรับการทำงานของไต
