Transcriptomics เซลล์เดียวเปิดเผยปฏิกิริยาระหว่างเซลล์และเซลล์กรองไตที่หยุดชะงักหลังจากการบาดเจ็บของ Podocyte ในช่วงต้นและแบบคัดเลือก

ผลลัพธ์

Single-Cell Profiling of >29,000 เซลล์ไตเสริมไต

โปรโตคอลเซลล์เดียวปัจจุบันสำหรับระบุไตทั้งหมด<2.5% glomerular cells,9 and although a purifiedการเตรียมไตการใช้เม็ดแม่เหล็กช่วยเพิ่มคุณค่าให้กับประชากรกลุ่มนี้22 ทำให้ไม่สามารถจับเซลล์ไตประเภทอื่นที่อาจเป็นที่สนใจได้ วิธีการกรองถูกนำมาใช้เพื่อเพิ่มปริมาณโกลเมอรูลีและการจับตัวไปพร้อมๆ กันประเภทเซลล์ไตเพิ่มเติมเพื่อขยายการค้นพบเหล่านี้และพัฒนาความเข้าใจโดยละเอียดเกี่ยวกับปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์และเซลล์ภายในโกลเมอรูลัสในบริบทของภูมิทัศน์เซลล์ทั้งหมดของไต ก่อนและหลังการบาดเจ็บของพอดไซด์.

เพื่อระบุผลการถอดรหัสในระยะเริ่มแรกของการทำลายเซลล์ด้วยโพโทไซท์ในเซลล์ลักษณะเฉพาะประเภท, scRNAseq ดำเนินการกับเนื้อเยื่อไตจาก WT และ iCTCFpod / หนูที่รวบรวมโดยการกรองแบบอนุกรมหลังจากการรักษาด้วยด็อกซีไซคลิน 1 สัปดาห์ (รูปที่ 1A) เนื้อเยื่อไตจากสัตว์ WT สี่ตัว (การจำลองทางชีวภาพสี่ตัว) และ iCTCFpod / สัตว์สี่ตัวให้ผลรวม 14,783 WT และ 14,727 iCTCFpod / เซลล์ที่ทำโปรไฟล์หลังจากการกรอง (รูปที่เสริม S1, A และ B; ตารางเสริม S1 และ S2) ข้อมูลถูกทำให้เป็นมาตรฐานเพื่อลบเอฟเฟกต์เนื่องจากจำนวน UMI และเปอร์เซ็นต์ของการอ่านไมโตคอนเดรีย หลังจากการบูรณาการ WT และ iCTCFpod / ตัวอย่างแล้ว การจัดกลุ่มความละเอียดต่ำถูกใช้เพื่อตรวจจับเก้าคลัสเตอร์ (รูปที่ 1B) การทำซ้ำทางชีวภาพของ WT และ iCTCFpod / ตัวอย่างถูกกระจายไปยังกลุ่มทั้งหมด (รูปที่เสริม S2, AC) เซลล์ทุกประเภทของโกลเมอรูลัส รวมถึงประเภทเซลล์ไตเพิ่มเติม ถูกระบุโดยใช้เครื่องหมายที่สร้างขึ้นและได้มาจากข้อมูล (รูปที่ 1C; ตารางเสริม S3; รูปที่ S3A เพิ่มเติม) เซลล์ไต ซึ่งคิดเป็นทั้งหมด 82.1% ของเซลล์ที่ได้รับการกู้คืนทั้งหมด [36.9% เซลล์พอโดไซต์, 42.1% เซลล์บุผนังหลอดเลือดไต (GECs), เซลล์มีแซนเจียล 2.7% และ 0.36% PEC] ถูกแยกและจัดกลุ่มใหม่ (รูปที่ 1D) . พ็อดไซต์สี่กลุ่ม, GEC ห้ากลุ่ม และเซลล์ mesangial และ PEC อย่างละหนึ่งกลุ่ม แสดงถึงรูปแบบบัญญัติเครื่องหมายชนิดเซลล์, ถูกระบุตัวตน (รูปที่ 1E; รูปที่ S3B เพิ่มเติม) การจำลองทางชีวภาพของ WT และ iCTCFpod / ตัวอย่างถูกกระจายไปทั่วทุกกลุ่ม (รูปที่ S2 เพิ่มเติม, DF; ตารางเสริม S4) ตามที่คาดไว้ เนื่องจากการลบ CTCF ที่จำเพาะต่อพ็อดไซท์ทำให้เกิดการสูญเสียพ็อดไซท์ที่ตรวจพบได้ทางจุลพยาธิวิทยาที่ 2 สัปดาห์ 13 iCTCF พ็อด / ตัวอย่างมีเปอร์เซ็นต์ของพ็อดไซท์ที่ต่ำกว่าตัวอย่าง WT (รูปที่ 1F; ตารางเสริม S5) iCTCFpod / ตัวอย่างมีโพโดไซต์น้อยลง 13.1%, GEC เพิ่มขึ้น 11.9% และเซลล์ mesangial มากกว่าตัวอย่าง WT 1.5% (ตารางเสริม S5) PECs มีส่วนร่วม<1% to either of the iCTCFpod / or WT samples. This finding suggests that disruption of transcriptional programs critical for podocyte survival precedes histologically detectable podocyte injury and loss and highlights the power of scRNAseq in discerning subtle changes that can be missed by histologic analysis.

แสดงออกไม่แตกต่างกันมากนัก แกนเหล่านี้ถูกจำกัดไว้ที่ 100 เส้นประบ่งบอกถึงพารามิเตอร์เริ่มต้น: cutoffP Z 0.25 C: การสร้างภาพการวิเคราะห์การเป็นตัวแทนมากเกินไปของยีนที่แสดงออกอย่างแตกต่างโดยไม่ซ้ำกันใน podocyte 1 นำเสนอเป็นเครือข่ายหรือแผนที่เสริมคุณค่า ยีนที่ทับซ้อนกันจะรวมกลุ่มเข้าด้วยกัน

สมุนไพรใหม่เพื่อสุขภาพไต

การลบ CTCF ที่ไม่สามารถเหนี่ยวนำได้เฉพาะของ Podocyte นำไปสู่การเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนในเซลล์ไตทุกประเภท

การวิเคราะห์การแสดงออกที่แตกต่างกันถูกดำเนินการในแต่ละ 11 คลัสเตอร์โดยเปรียบเทียบเซลล์ iCTCFpod / และ WT (ตารางเสริม S6) ยีนถูกพิจารณาว่าแสดงออกแตกต่างกันหากพบในอย่างน้อย 10% ของเซลล์ในคลัสเตอร์ที่กำหนด โดยมีการเปลี่ยนแปลงบันทึกสัมบูรณ์ขั้นต่ำที่ 0.1 และ P < 0 ที่ปรับแล้ว .05. Ctcf มีการแสดงออกที่แตกต่างกันในแต่ละกลุ่มของพ็อดไซต์ทั้งสี่กลุ่ม โดยมีการเปลี่ยนแปลงบันทึกพับเฉลี่ยที่ 0.39 0, 0.189, 0.331 และ 0.303 ตามลำดับ จำนวนเซลล์ในแต่ละคลัสเตอร์ถูกสุ่มตัวอย่างและทำการวิเคราะห์การแสดงออกที่แตกต่างกันซ้ำเพื่อเปรียบเทียบจำนวนยีนที่แสดงออกแตกต่างกันระหว่าง 11 คลัสเตอร์ กลุ่มพอโทไซต์มียีนที่แสดงออกแตกต่างกันมากที่สุด ตามมาด้วย GEC-1 และ GEC-2 (รูปที่ 1G) GEC สามกลุ่มที่เหลือ พร้อมด้วยเซลล์ mesangial และ PEC มียีนที่แสดงออกแตกต่างกันน้อยกว่ามาก (รูปที่ 1G) ซึ่งบ่งชี้ว่า GEC-1 และ GEC-2 ในบรรดากระจุกไตทั้งหมดได้รับผลกระทบมากที่สุด โดยผลที่ตามมาของการลบ CTCF การบาดเจ็บของ podocyte ที่ถูกทำลาย

โปรแกรมยีนที่เกี่ยวข้องกับโรคที่ระบุในกลุ่มเซลล์พอโดไซต์และเซลล์บุผนังหลอดเลือดโดยเฉพาะ

การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบว่ากลุ่มเซลล์พ็อดไซต์แต่ละกลุ่มตอบสนองต่อการบาดเจ็บอย่างไร แผนภาพเวนน์ของยีนที่แสดงออกแตกต่างกันในแต่ละกลุ่มของพ็อดไซต์ทั้งสี่กลุ่มเผยให้เห็นว่าพ็อดไซต์ 1 มียีนที่แสดงออกแตกต่างกันมากที่สุดของกลุ่มพ็อดไซต์ทั้งสี่ (รูปที่ 2A; ตารางเสริม S7) การสังเกตว่าหนึ่งในสี่กลุ่มของพ็อดไซต์ได้รับผลกระทบอย่างเด่นชัดมากขึ้นนั้นสอดคล้องกับข้อมูลทางจุลพยาธิวิทยาก่อนหน้านี้ที่บ่งชี้ว่าพ็อดไซต์ไม่ทั้งหมดได้รับผลกระทบด้วยความรุนแรงที่เท่ากันเมื่อเผชิญกับการบาดเจ็บ และเน้นย้ำถึงพลังของ scRNAseq ในการกำหนดคุณลักษณะทางโมเลกุลของสภาวะเซลล์ภายใน เซลล์ประเภทเดียวกัน 23 ทำการวิเคราะห์การเป็นตัวแทนมากเกินไปเพื่อระบุโปรแกรมยีนที่ได้รับการเสริมสมรรถนะอันเป็นผลมาจากการสูญเสีย CTCF ในคลัสเตอร์ podocyte 1 (ตารางเสริม S8) คำศัพท์ที่ได้รับการเสริมสมรรถนะสูงสุดถูกแสดงเป็นภาพด้วยแผนที่การตกแต่งเพื่อจัดกลุ่มชุดยีนที่ทับซ้อนกันร่วมกัน (รูปที่ 2B) กลุ่มคำศัพท์ที่ได้รับการเสริมสมรรถนะที่โดดเด่นคือฟังก์ชันของไมโตคอนเดรีย ซึ่งรวมถึงการสังเคราะห์ ATP, การเกิดปฏิกิริยาออร์กานีแบบไมโตคอนเดรีย, ห่วงโซ่การขนส่งอิเล็กตรอน และปฏิกิริยาออกซิเดชั่นฟอสโฟรีเลชั่น (รูปที่ 2B) ข้อมูลเหล่านี้ขยายขอบเขตงานล่าสุดที่ชี้ไปที่ความผิดปกติของไมโตคอนเดรียซึ่งเป็นสัญญาณของการบาดเจ็บของพอโทไซต์24 นอกจากนี้ พันธุศาสตร์ของมนุษย์ยังชี้ให้เห็นถึงความสำคัญของการทำงานของไมโตคอนเดรียในพอไซต์ไซต์ รวมถึงการกลายพันธุ์หลายอย่างในวิถีการสังเคราะห์ทางชีวภาพของ CoQ (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ6, และ ADCK4) ที่ทำให้เกิดโรคไต ส่วนใหญ่ในเด็ก 25,26 ดังนั้นจึงมีการตั้งสมมติฐานว่าความผิดปกติของไมโทคอนเดรียของพอดไซท์อาจแสดงถึงสภาวะของเซลล์ที่โดดเด่นที่เกี่ยวข้องกับโรคทั้งหมดที่เกิดจากการสูญเสียพ็อดไซท์24 ข้อมูลให้การสนับสนุนแนวคิดนี้ในจุดเดียว - ความละเอียดของเซลล์ ซึ่งบ่งชี้ว่าความผิดปกติของไมโตะ chondrial อาจแสดงถึงสภาวะการบาดเจ็บที่เร็วที่สุดในประชากรเฉพาะของพ็อดไซต์ ซึ่งนำไปสู่การสูญเสียพ็อดไซต์ หนึ่งในกลุ่มหลักของคำศัพท์ที่ได้รับการเสริมสมรรถนะจากการวิเคราะห์การแสดงออกมากเกินไป (รูปที่ 2B) คือการจัดระเบียบโครงร่างโครงร่างของเซลล์ เช่นเดียวกับคำศัพท์ที่ได้รับการเสริมสมรรถนะเดี่ยวที่เกี่ยวข้องสำหรับการยึดเกาะของเซลล์และเมทริกซ์ โครงร่างโครงร่างโครงร่างเซลล์ของแอคตินมีบทบาทสำคัญในการรักษาโครงสร้างที่เป็นเอกลักษณ์และซับซ้อนของพอดไซต์ และการยึดเกาะกับ GBM ถือเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการทำงานของพ็อดไซต์27 การยึดเกาะแบบโฟกัสที่เจริญเต็มที่ประกอบด้วยโปรตีนหลายร้อยตัวที่เชื่อมโยงโครงร่างโครงร่างของโครงร่างเซลล์ของแอคติน การจับเมทริกซ์ของตัวรับใหม่ การถ่ายโอนสัญญาณภายในเซลล์ และแอกตินพอลิเมอไรเซชัน หนึ่งในยีนที่มีการควบคุมต่ำที่สุดในพ็อดไซต์ 1 คือ Rhpn1 (รูปที่เสริม S4A) ซึ่งเป็นองค์ประกอบที่สำคัญสำหรับการสร้างไดนามิกของโครงร่างโครงร่างเซลล์ของพ็อดไซท์และการรักษาสถาปัตยกรรมกระบวนการของเท้าของพ็อดไซท์ 28 องค์ประกอบที่ซับซ้อน Arp2/3 nent Arpc3 ซึ่งเป็นตัวขับเคลื่อนของแอคตินพอลิเมอไรเซชัน ได้รับการควบคุมในกลุ่ม podocyte 1 (รูปที่ 2C; รูปที่ S4B เพิ่มเติม) ยีนสำหรับส่วนประกอบเพิ่มเติมของสารเชิงซ้อน Actr2 ยังได้รับการควบคุมทั้งใน podocyte 1 และ podocyte 4 นอกจากนี้ Wasl ซึ่งมีผลิตภัณฑ์โปรตีน N-WASP ยังกระตุ้น Arp2/3 complex และจำเป็นสำหรับการบำรุงรักษา ของการเกิด podocyte foot pro cesses ใน vivo29 ก็ได้รับการควบคุมใน podocyte 1, podocyte 3 และ podocyte 4 เช่นกัน ตัวควบคุมโครงร่างโครงร่างของเซลล์ Arhgdia ซึ่งการลบออกเกี่ยวข้องกับ nephrotic syndrome ในหนู 30 ถูกควบคุมใน podocyte 1 (รูปที่ 2ซี) ระดับการแสดงออกของ Rho GTPases สองตัวที่เป็นตัวควบคุมที่ได้รับการยอมรับอย่างดีของ actin cytoskel eton และการเปลี่ยนแปลงการยึดเกาะของเซลล์ ก็มีการเปลี่ยนแปลงเช่นกัน: RhoA ได้รับการควบคุมขึ้นและ RhoC ได้รับการควบคุมลง เช่นเดียวกับเอฟเฟกต์ดาวน์สตรีมส่วนกลางของ Rac1, Pak1 ซึ่งสอดคล้องกับ การศึกษาก่อนหน้า23 นอกจากนี้ Cd2ap ซึ่งเป็นองค์ประกอบโครงร่างโครงร่างโครงร่างของเซลล์พ็อดไซท์แอกตินที่สำคัญ 27,32 ได้รับการควบคุมในพ็อดไซท์ 1 การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ร่วมกันชี้ให้เห็นว่าหนึ่งในการตอบสนองพ็อดไซท์แรกสุดต่อการบาดเจ็บที่ถูกลบของ CTCF คือการเปลี่ยนแปลงองค์ประกอบที่สำคัญของ แอกตินไซโตโครงกระดูกในการต่อสู้เพื่อรักษาความผูกพันกับ GBM และทำให้รอดชีวิตจากการบาดเจ็บได้ นอกจากนี้ scRNAseq ยังระบุผู้ไกล่เกลี่ยที่เฉพาะเจาะจงของการตอบสนองนี้ซึ่งจับคู่กับประชากรเฉพาะของพอดไซต์ โดยชี้ไปที่สมมุติว่า tar ได้รับสำหรับการแทรกแซงการรักษาตั้งแต่เนิ่นๆ

GBM เป็นโครงข่ายของโปรตีนเมทริกซ์นอกเซลล์ที่ตั้งอยู่ระหว่างพ็อดไซต์และ GEC ซึ่งให้การสนับสนุนเชิงโครงสร้างสำหรับเส้นเลือดฝอยของไต ทำหน้าที่ยึดลิแกนด์สำหรับตัวรับบนพื้นผิวของ GEC ที่อยู่ติดกัน พ็อดไซต์ และเซลล์มีซองเจียล และมีส่วนช่วยในการคัดเลือกตัวกรองไต33 หนึ่ง ขององค์ประกอบที่สำคัญของ GBM คือคอลลาเจนประเภท IV ɑ5 (Col4a5); การเปลี่ยนแปลงในยีนนี้ทำให้เกิดกลุ่มอาการ Alport และ FSGS ในมนุษย์ 33,34 สายพันธุ์ใน Col4a3 ซึ่งเป็นองค์ประกอบโครงสร้างอีกประการหนึ่งของ GBM ได้รับการระบุเมื่อเร็ว ๆ นี้โดยการศึกษาความสัมพันธ์ของจีโนมที่ครอบคลุมใน DKD35 ดังนั้นการเปลี่ยนแปลงส่วนประกอบ GBM เป็น ผลที่ตามมาของการบาดเจ็บของพอโลไซต์มีความเกี่ยวข้องในวงกว้างกับโรคไตหลายชนิด การแสดงออกของยีนที่เข้ารหัสส่วนประกอบโครงสร้างของ GBM ถูกรบกวนในแบบจำลองหรือไม่ Col4a5 ได้รับการควบคุมใน iCTCFpod / podocytes (โดยมีการเปลี่ยนแปลง log fold เป็น 0.130) (รูปที่ S4C เพิ่มเติม; ตารางเสริม S6) การวิเคราะห์ตัวรับลิแกนด์ชี้ให้เห็นว่าการควบคุม Col4a5 ใน podocyte 1 นำไปสู่การเพิ่มปฏิสัมพันธ์กับเซลล์ของกลุ่ม GEC ทั้งห้ากลุ่มและเซลล์ mesangial ผ่านอินทิกรัลหลายตัว (รูปที่ 3A) การแสดงออกของ Col4a5 ใน Nphs2-ซึ่งแสดงออกถึงพ็อดไซต์เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.0001; การทดสอบทีแบบสองด้านที่แก้ไขโดย Welch) (รูปที่ 3B) การควบคุม Col4a5 ที่สังเกตได้ซึ่งมีความละเอียดเชิงพื้นที่ได้รับการตรวจสอบโดย HCR ซึ่งเป็นวิธีการที่สร้างการเรืองแสงโมเลกุลเดี่ยวผ่าน ในแหล่งกำเนิด ไฮบริดไอเซชัน (รูปที่ 3C; รูปที่ S5 เพิ่มเติม) ผลลัพธ์นี้ยืนยันว่าข้อมูลยีนแต่ละตัวที่ได้มาจากการทดลองการถอดเสียงแบบเซลล์เดียวสามารถตรวจสอบความถูกต้องได้โดยอิสระ ด้วยความละเอียดเชิงพื้นที่ ซึ่งสนับสนุนความถูกต้องของข้อสรุปที่วาดโดย ana lyses แบบคำนวณ นอกจากนี้ ข้อมูลเหล่านี้เน้นย้ำว่าการตอบสนองที่สำคัญต่อการบาดเจ็บโดยประชากรกลุ่มพอดไซต์ที่เฉพาะเจาะจงคือการควบคุมการผลิตคอลลาเจน ซึ่งอาจเป็นสาเหตุให้เกิด GBM ที่โดดเด่นหรือหนาที่พบในโรคที่ลุกลาม เช่น DKD.35

GEC-1 and GEC-2 had nearly as many differentially expressed genes as podocyte clusters 2 to 4, whereas the remaining GEC clusters, mesangial cells, and PECs had fewer differentially expressed genes. Therefore, these two endothelial clusters were most affected by podocyte injury. GEC-1 expressed >ยีนที่แสดงออกแตกต่างกันอย่างมีเอกลักษณ์ 600 ยีน (รูปที่ S6A เพิ่มเติม; ตารางเสริม S9) การวิเคราะห์การเป็นตัวแทนชี้ให้เห็นว่ายีนที่แสดงออกอย่างมีเอกลักษณ์เฉพาะตัวใน GEC -1 ได้รับการเสริมสมรรถนะในโปรแกรมยีนสำหรับการย้ายเซลล์และการยึดเกาะ (รูปที่ S6, B และ C เพิ่มเติม; ตารางเสริม S10) การวิเคราะห์เหล่านี้เผยให้เห็นการเปลี่ยนแปลงการถอดเสียงที่เก่าแก่ที่สุดที่เกิดขึ้นใน GEC เป็นการตอบสนองต่อการบาดเจ็บของพ็อดไซต์

การสร้างแบบจำลองการสื่อสารระหว่างเซลล์เผยให้เห็น

ปฏิสัมพันธ์ที่สำคัญระหว่างประเภทเซลล์ในการตอบสนองต่อการบาดเจ็บของพอโดไซต์ในระยะเริ่มแรก

หลังจากระบุโปรแกรมยีนที่ถูกรบกวนในกลุ่มเซลล์ที่แตกต่างกันหลายแห่ง การศึกษาต่อไปจึงพยายามทำความเข้าใจว่า crosstalk ของเซลล์และเซลล์ไตได้รับอิทธิพลจากการบาดเจ็บของ podocyte อย่างไร การศึกษาครั้งแรกได้ตรวจสอบรายชื่อยีนที่แสดงออกที่แตกต่างกันในกลุ่มเซลล์พ็อดไซต์, GEC และ mesangial การแสดงออกของลิแกนด์ autocrine prosurvival ที่สำคัญสองตัวคือ Vegfa และ Pdgfb รวมถึงการแสดงออกของตัวรับ PDGFB, Pdgfrb ถูกรบกวน (ตารางเสริม S6) การแสดงออกของ Vegfa ลดลงในกลุ่มพอโดไซต์ทั้งหมด (หมายถึงการเปลี่ยนแปลงพับบันทึกระหว่าง 0.034 และ 0.149) ในทางตรงกันข้าม การแสดงออก Pdgfb เพิ่มขึ้นในกลุ่ม GEC ทั้งหมด (หมายถึงการเปลี่ยนแปลงการพับบันทึกระหว่าง 0.031 และ 0.140) และตัวรับ Pdgfrb ได้รับการควบคุมในเซลล์ mesangial (หมายถึงการเปลี่ยนแปลงการพับบันทึกเฉลี่ยของ 0.155) การวิเคราะห์นี้ชี้ให้เห็นว่าการบาดเจ็บของ podocyte นำไปสู่การแสดงออกที่ลดลงของลิแกนด์ Vegfa ที่ prosurvival ซึ่งส่งผลเสียต่อ GEC เพื่อชดเชย GEC อาจควบคุมลิแกนด์ Pdgfb ที่ก่อให้เกิดการรอดชีวิต กระตุ้นให้เซลล์ mesangial ควบคุมตัวรับ Pdgfrb

NicheNet ซึ่งเป็นอัลกอริธึมใหม่ที่อนุมานว่าการโต้ตอบของตัวรับลิแกนด์ที่ได้มาจากข้อมูลการแสดงออกอาจส่งผลกระทบต่อเป้าหมายเฉพาะอย่างไร โดยการบูรณาการความรู้ที่มีอยู่แล้วเกี่ยวกับเครือข่ายการส่งสัญญาณและกฎระเบียบ ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจสอบปฏิสัมพันธ์ระหว่างลิแกนด์กับตัวรับและยีนเป้าหมายสมมุติของพวกเขาอย่างลึกซึ้งยิ่งขึ้น 20 NicheNet ถูกนำไปใช้กับ แบบจำลองในการโต้ตอบระหว่างพ็อดไซต์และ GEC เช่นเดียวกับเซลล์ mesan gial และ GEC ที่อาจกระตุ้นให้เกิดยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน (ยีนเป้าหมาย) ใน GEC ในการตั้งค่าการบาดเจ็บของพ็อดไซต์ (รูปที่ 4A) สำหรับการวิเคราะห์นี้ คลัสเตอร์ทั้งหมดของเซลล์แต่ละประเภทถูกรวมเข้าเป็นคลัสเตอร์เดียว ลิแกนด์ที่ทำนายอันดับต้นๆ ที่แสดงออกโดยเซลล์ mesangial และ/หรือ podocytes ได้แก่ pleiotrophin (Ptn), angiopoietin 2 (Angpt2), Col4a1, โมเลกุลการยึดเกาะของเซลล์หลอดเลือด 1, โปรตีน morphogenetic ของกระดูก 4 (Bmp4), Ephrin B1, ปัจจัยการเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อเกี่ยวพัน และเซมาฟอร์ริง 3e (Sema3e) (รูปที่ 4B) รูปแบบการแสดงออกของตัวรับ GEC ซึ่งเป็นที่ทราบกันว่าลิแกนด์เหล่านี้ทำหน้าที่ถูกแมปไว้ถัดจากการวิเคราะห์กิจกรรมลิแกนด์ นอกจากนี้ ยังได้แมปยีนเป้าหมายที่คาดการณ์ไว้ซึ่งมีการแสดงออกที่แตกต่างกันใน iCTCFpod / GEC เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุม WT ผลลัพธ์ในรูปที่ 4B สรุปเป็นแปลงวงกลมในรูปที่ 4, C และ D

ลิแกนด์ ตัวรับ และยีนเป้าหมายหลายตัวมีความโดดเด่นจากการวิเคราะห์นี้ Pleiotrophin ซึ่งเป็นลิแกนด์ที่แสดงออกอย่างมากในเซลล์ mesangial (รูปที่ 4B) เป็นปัจจัยการเจริญเติบโตที่หลั่งออกมาซึ่งสามารถจับและยับยั้งโปรตีนไทโรซีนฟอสฟาเตสตัวรับประเภท B กระตุ้นการย้ายถิ่นของเซลล์บุผนังหลอดเลือดผ่านทาง Tek (Tie2) / Angpt137 และ Kdr (Vegfr2) / Vegfa38 ที่เพิ่มขึ้น การส่งสัญญาณ ด้วยเหตุนี้ Tek จึงได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญใน GEC (รูปที่ 4B) Angpt2 ซึ่งแสดงออกอย่างมากในเซลล์ mesangial เป็นลิแกนด์ที่เป็นปฏิปักษ์ของ Tek ซึ่งยับยั้งการจับกันของ Angpt1.39 เนื่องจากการส่งสัญญาณ Angpt1 เป็นที่รู้กันว่าส่งเสริมการอยู่รอดของ podocyte และการหยุดชะงักของอัตราส่วน Angpt1/Angpt2 มีส่วนช่วยในการพัฒนา DKD,40 ลิแกนด์นี้ การวิเคราะห์ตัวรับดูเหมือนจะชี้ไปที่การส่งสัญญาณ Tek ที่ไม่เหมาะสมใน GECs ซึ่งเป็นหนึ่งในผลที่ตามมาแรกสุดของการบาดเจ็บของพ็อดไซต์

การศึกษานี้ยังพบการเปลี่ยนแปลงที่โดดเด่นในการแสดงออกของคอลลาเจนประเภท IV ในเซลล์ไตหลายเซลล์ (รูปที่ 4B) โดยปกติแล้วจะผลิตโดยเซลล์เม็ดเลือดขาวที่มีสุขภาพดี คอลลาเจน IV het erotrimers จะเปลี่ยนจาก ɑ1ɑ1ɑ2 เป็น ɑ3ɑ4ɑ5 ในระหว่างการพัฒนาของไต ซึ่งจำเป็นสำหรับการสร้าง GBM และการทำงานที่เหมาะสม ,34 การควบคุมขั้นสูงของ Col4a1 พร้อมด้วยการขยายตัวของเมทริกซ์ mesangial มักพบใน DKD41,42 ในการวิเคราะห์ปัจจุบัน Col4a1 ถูกแสดงออกโดยทั้งเซลล์ mesangial และ GECs (การแสดงออกเฉลี่ยของแผนที่ความร้อนลิแกนด์) (รูปที่ 4B) และได้รับการควบคุมโดยเฉพาะใน iCTCFpod / GECs เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุม WT ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า GEC ควบคุม Col4a1 ในการตั้งค่าการบาดเจ็บของพ็อดไซต์ ซึ่งอาจนำไปสู่ ​​GBM ที่เป็นพังผืดที่แข็งขึ้นซึ่งมีส่วนทำให้เกิดการพัฒนาของเส้นโลหิตตีบแบบปล้อง

Bmp4 เป็นลิแกนด์ mesangial ที่แสดงออกอย่างมากซึ่งระบุโดยการวิเคราะห์ NicheNet (รูปที่ 4, BD) BMPs มีบทบาทสำคัญในการพัฒนาไตและโรค43 Bmp4 ได้รับการควบคุมในการเกิดภาวะไตอักเสบจากเบาหวานในหนูแรท42 และรักษาหนูด้วย โรคเบาหวานด้วยแอนติบอดีต่อต้าน BMP4 จะป้องกันการควบคุม Col4a1 และการขยายตัวของเมทริกซ์ mesangial44 สิ่งที่น่าสนใจเป็นพิเศษคือพบว่า mesangial Bmp4 กระตุ้นการแสดงออกของ GEC Smad6 (รูปที่ 4B) การแสดงออกของ Smad6 นั้นเกิดจาก BMP และในวงตอบรับเชิงลบ Smad6 ยับยั้ง BMP โดยเฉพาะรวมถึง BMP4.45 Smad6 ถูกควบคุมใน iCTCFpod / GECs เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุม WT แนะนำการส่งสัญญาณ BMP ที่เพิ่มขึ้นในเซลล์บุผนังหลอดเลือดในการตั้งค่าของการบาดเจ็บของ podocyte .

หนึ่งในลิแกนด์ที่ถูกจัดลำดับความสำคัญที่ระบุในพ็อดไซต์คือ Sema3e (รูปที่ 4, BD) เซมาโฟรินคลาส 3 เป็นโปรตีนที่หลั่งออกมาซึ่งทำงานในกระบวนการทางชีวภาพที่หลากหลาย รวมถึงการสร้างเส้นเลือดใหม่ การสร้างต่อมน้ำเหลือง และโรค46 Sema3a ได้รับการควบคุมใน DKD ของมนุษย์47 และ Sema3g เพิ่งถูกระบุว่าเป็นยีนที่จำเพาะต่อพ็อดไซต์ที่ปกป้องพ็อดไซต์จากการอักเสบ ในร่างกาย 48 บทบาทของ Sema3e ใน podocyte ยังไม่ชัดเจน การวิเคราะห์ในปัจจุบันเผยให้เห็นคู่รีเซพเตอร์-ลิแกนด์ที่ไม่รู้จักก่อนหน้านี้โดยที่ podocyte Sema3e โต้ตอบกับ plexinD1 บน GEC เพื่อกระตุ้นเป้าหมายยีนดาวน์สตรีมหลายเป้าหมายในการตั้งค่าการบาดเจ็บของโพโดไซต์(รูปที่ 4, C และ D)

ในบรรดายีนเป้าหมาย GEC ที่ระบุใหม่หลายยีน Hes1 และ Cx3cl1 ยังพบในโปรแกรมยีนการยึดเกาะที่เสริมสมรรถนะใน GEC -1 (รูปที่ 4, BD; รูปที่ S6 เพิ่มเติม) Hes1 เป็นเป้าหมายของการส่งสัญญาณแบบ Notch ซึ่งมีบทบาทสำคัญในการพัฒนาไต แต่การเปิดใช้งานใหม่อาจทำให้เกิดพังผืดได้49 Cx3cl1 เป็นเคมีบำบัดที่ส่วนใหญ่ผลิตโดยเยื่อบุผิวของไตซึ่งทำหน้าที่เป็นโมเลกุลของสารดึงดูดเคมีและการยึดเกาะสำหรับตัวรับของมัน Cx3cr1 ซึ่ง มีการแสดงออกอย่างแพร่หลายในเม็ดเลือดขาวเม็ดเลือดขาวชนิดโมโนนิวเคลียร์และการไหลเวียนโลหิต 50 Cx3cl1 มีส่วนเกี่ยวข้องในโรคไตหลายชนิดรวมถึง DKD, IgA nephropathy และ glomerulonephritis 50 Hes1 และ Cx3cl1 ได้รับการควบคุมใน iCTCFpod / GECs เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุม WT แนะนำ GEC ตอบสนองต่อการบาดเจ็บของพอดไซต์โดยการควบคุมโปรแกรมการอักเสบและการเกิดพังผืด

ในที่สุด เนื่องจากลิแกนด์และเป้าหมายจำนวนมากที่ระบุในการวิเคราะห์ NicheNet มีส่วนเกี่ยวข้องใน DKD ทั้งในแบบจำลองของสัตว์ฟันแทะและในมนุษย์ ชุดข้อมูลจึงถูกเปรียบเทียบกับชุดข้อมูลการถอดเสียงนิวเคลียสชุดเดียวของ DKD ของมนุษย์ในยุคแรก ๆ การเปรียบเทียบทำจากยีนที่แสดงออกแตกต่างกันระหว่างกลุ่มเซลล์ของมนุษย์และเมาส์ จากยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน 138 ยีนใน DKD GEC ของมนุษย์ มีการระบุยีน 25 ยีนในเซลล์ iCTCFpod / endothelial ของเมาส์ รวมถึง Col4a1 (รูปที่เสริม S7; ตารางเสริม S11) ข้อสรุปร่วมกันเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าโปรแกรมเซลล์บุผนังหลอดเลือดที่มักจะหยุดชะงักใน DKD ของมนุษย์สามารถสรุปได้บางส่วนในรูปแบบเมาส์ของการบาดเจ็บของไตในระยะเริ่มแรกผ่านการระเหยแบบเลือก podocyte นอกจากนี้ ผลลัพธ์เหล่านี้ยังชี้ให้เห็นว่า นอกเหนือจากพ็อดไซต์แล้ว อาจมีเป้าหมายเฉพาะเจาะจงของเยื่อบุผนังหลอดเลือดที่เป็นไปได้และกลยุทธ์การรักษาเพื่อหยุดหรือชะลอการลุกลามของโรคไตที่ซับซ้อนและแพร่หลายสูง เช่น DKD