thภาษา
หน้าหลัก / ความรู้ / เนื้อหา

ความรู้

การจัดลำดับ RNA เซลล์เดียวของเซลล์ปัสสาวะเผยให้เห็นถึงความหลากหลายของเซลล์ที่แตกต่างกันในโรคโควิด-19–AKI ที่เกี่ยวข้อง

Jun 17, 2024

เชิงนามธรรม

ความเป็นมา AKI เป็นผลสืบเนื่องที่พบบ่อยของการติดเชื้อ SARS-CoV-2 และมีส่วนทำให้เกิดความรุนแรงและการเสียชีวิตของโควิด-19 ที่นี่ เราทดสอบสมมติฐานที่ว่าการเปลี่ยนแปลงของไตที่เกิดจาก AKI ที่เกี่ยวข้องกับ COVID-19 สามารถตรวจพบได้ในเซลล์ที่เก็บจากปัสสาวะ วิธีการ เราดำเนินการจัดลำดับ RNA เซลล์เดียว (scRNAseq) กับเซลล์ที่ฟื้นตัวจากปัสสาวะของผู้ป่วยที่เข้ารับการรักษาในโรงพยาบาลแปดรายที่มีเชื้อ COVID-19 โดยมี (n55) หรือไม่มี AKI (n53) เช่นเดียวกับผู้ป่วยสี่รายที่ไม่มี AKI ที่ไม่ใช่ COVID–19 (n54) เพื่อประเมินความแตกต่างในองค์ประกอบของเซลล์และการแสดงออกของยีนระหว่าง AKI ผลลัพธ์ การวิเคราะห์เซลล์ 30,076 เซลล์เผยให้เห็นประเภทเซลล์ที่หลากหลาย ซึ่งส่วนใหญ่เป็นไตเซลล์ท่อปัสสาวะ และเซลล์ภูมิคุ้มกัน การวิเคราะห์วิถีทางของเซลล์ท่อจากผู้ป่วยที่มี AKI แสดงให้เห็นการเพิ่มคุณค่าของการถอดเสียงที่เกี่ยวข้องกับวิถีทางที่เกี่ยวข้องกับความเสียหาย เมื่อเปรียบเทียบกับผู้ที่ไม่มี AKI การแสดงออกของ ACE2 และ TMPRSS2 สูงที่สุดในเซลล์ urothelial ในบรรดาเซลล์ประเภทที่ได้รับการกู้คืน โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ในผู้ป่วยรายหนึ่ง เราตรวจพบ RNA ของไวรัส SARS-CoV-2 ในเซลล์ท่อปัสสาวะ เซลล์เดียวกันนี้ได้รับการเสริมสมรรถนะสำหรับการถอดเสียงที่เกี่ยวข้องกับวิถีทางต้านไวรัสและต้านการอักเสบ เราประสบความสำเร็จในการดำเนินการ scRNAseq กับตะกอนปัสสาวะจากผู้ป่วยที่เข้ารับการรักษาในโรงพยาบาลด้วยโรค COVID-19 เพื่อศึกษาการเปลี่ยนแปลงของเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับ AKI โดยไม่เป็นอันตราย และสร้างชุดข้อมูลที่รวมทั้งเซลล์ไตที่ได้รับบาดเจ็บและไม่ได้รับบาดเจ็บ นอกจากนี้ เรายังจัดเตรียมหลักฐานเบื้องต้นเกี่ยวกับการติดเชื้อโดยตรงของเซลล์กระเพาะปัสสาวะโดย SARS-CoV-2 ตะกอนปัสสาวะมีข้อมูลมากมายและเป็นทรัพยากรที่มีประโยชน์สำหรับการศึกษาพยาธิสรีรวิทยาและการเปลี่ยนแปลงของเซลล์ที่เกิดขึ้นในโรคไต.

30

อาหารเพื่อสุขภาพออร์แกนิกเพื่อสุขภาพไต

การแนะนำ

กลุ่มอาการทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง การติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2 (SARS-CoV-2) ทำให้เกิดพยาธิสภาพในหลายระบบ รวมถึงไต และ AKI มีความเกี่ยวข้องกับการเจ็บป่วยและเสียชีวิตอย่างมีนัยสำคัญในโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 (โควิด-19) (1 –5) การศึกษาหลายชิ้นแสดงให้เห็นว่าอัตรา AKI ที่สูงในผู้ป่วยที่เข้ารับการรักษาในโรงพยาบาลด้วยโรคโควิด-19 (6) โดยบางการศึกษารายงานว่าผู้ติดเชื้อมากถึง 50% พัฒนา AKI (7–9) ตัวรับ SARS-CoV-2 หลัก ACE2 แสดงออกบนเซลล์เยื่อบุผิวทั่วทั้งระบบทางเดินปัสสาวะ รวมถึงเซลล์ท่อส่วนใกล้เคียงและเซลล์ท่อปัสสาวะ (10–13) แม้ว่าจะไม่ชัดเจนว่า AKI ในผู้ป่วยโรคโควิด-19 เกิดจากการติดเชื้อไวรัสโดยตรงที่ท่อใกล้เคียง หรือเป็นผลมาจากการตอบสนองของระบบต่อ SARS-CoV-2 (14–22) ในทำนองเดียวกัน ยังไม่ชัดเจนว่า SARS-CoV-2 สามารถทำให้เกิดโรคกระเพาะปัสสาวะอักเสบจากไวรัสผ่านการติดเชื้อโดยตรงของเซลล์ท่อปัสสาวะได้หรือไม่ แม้ว่าจะมีการเสนอความเป็นไปได้นี้แล้วก็ตาม (23–26) แม้จะมีความชุกสูงของ AKI ที่เกี่ยวข้องกับ COVID-19 แต่การเปลี่ยนแปลงเซลล์ที่ซ่อนอยู่ซึ่งเกิดขึ้นในการตั้งค่าของ AKI ยังคงเป็นที่เข้าใจได้ไม่ดี

7

AKI ที่เกี่ยวข้องกับโควิด-19 ยังคงได้รับการศึกษาเป็นส่วนใหญ่ เนื่องจากการเข้าถึงเนื้อเยื่อไตจำเป็นต้องมีการตรวจชิ้นเนื้อหรือการวิเคราะห์หลังชันสูตร (27) การศึกษาล่าสุดตรวจพบเซลล์ไต กระเพาะปัสสาวะ และภูมิคุ้มกันที่หลากหลายในปัสสาวะ (28–30) ดังนั้น ปัสสาวะอาจให้ข้อมูลเชิงลึกที่มีคุณค่าในการศึกษาการเปลี่ยนแปลงของไตแบบไม่รุกล้ำในช่วง AKI ที่เกี่ยวข้องกับโควิด-19 ที่นี่ เราทำการจัดลำดับ RNA เซลล์เดียว (RNA-Seq) เพื่อระบุลักษณะความหลากหลายของเซลล์ในปัสสาวะของผู้ป่วยที่เข้ารับการรักษาในโรงพยาบาลที่เป็นโรคโควิด-19 โดยมีและไม่มี AKI เราทดสอบสมมติฐานที่ว่าการเปลี่ยนแปลงของไตใน AKI ที่เกี่ยวข้องกับ COVID-19 สามารถตรวจพบได้ในเซลล์ที่เก็บจากปัสสาวะ นอกจากนี้ เรายังรวบรวมตัวอย่างจากผู้ป่วยที่ไม่มีเชื้อโควิด-19 และ AKI (non–Covid–19 AKI) เราพบประชากรเซลล์ภูมิคุ้มกันอักเสบจำนวนมากและวิถีทางการกระตุ้นที่แตกต่างกันใน AKI ที่เกี่ยวข้องกับ COVID–19 รวมถึงหลักฐานเบื้องต้นสำหรับการติดเชื้อโดยตรงของเซลล์ท่อปัสสาวะโดย SARS-CoV-2


วัสดุและวิธีการ

ผู้เข้าร่วมและตัวแปร ผู้ใหญ่อายุ 18 ปีขึ้นไปได้รับการตรวจคัดกรองระหว่างการรับเข้าหรือย้ายไปที่โรงพยาบาลมหาวิทยาลัยอลาบามาที่โรงพยาบาลเบอร์มิงแฮม (UAB) ระหว่างเดือนมีนาคมถึงพฤษภาคม 2564 กรณีของ AKI ถูกระบุโดยใช้โรคไตการปรับปรุงคำจำกัดความของผลลัพธ์โดยรวมโดยการเพิ่มขึ้นของครีเอตินีนในเลือด (sCr) .0.3 มก./ดล. ภายใน 48 ชั่วโมงหรือ .1.53 ครีเอตินีนพื้นฐาน กลุ่มควบคุมที่ไม่มีการเปลี่ยนแปลงในครีเอตินีนถูกเลือกตามอายุและการจับคู่เพศเมื่อเป็นไปได้และประมวลผลด้วยตัวอย่าง AKI แต่ละรายการตามลำดับ sCr พื้นฐานถูกกำหนดโดยใช้ค่า sCr ล่าสุด 7–365 วันก่อนเข้ารับการรักษาในโรงพยาบาล ข้อมูลทางคลินิกเพิ่มเติมเกี่ยวกับข้อมูลประชากร ประวัติทางการแพทย์ ลักษณะทางคลินิก และค่าห้องปฏิบัติการถูกดึงมาจากแผนภูมิผู้ป่วยผ่านทางทีม UAB Center for Clinical and Translational Sciences i2b2 รวมผู้ป่วยที่เข้ารับการรักษาในโรงพยาบาลด้วยโรคโควิด-19 แปดราย ห้ารายที่มี AKI และอีกสามคนที่ไม่มี AKI การศึกษานี้และการเก็บตัวอย่างได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการพิจารณาของสถาบัน UAB ทีมที่ปรึกษาโรคไตเฉียบพลันของ UAB ยังเก็บตัวอย่างจากผู้ป่วยที่มี AKI ที่ไม่ใช่โควิด-19 (n54) เพื่อเปรียบเทียบการเปลี่ยนแปลงของเซลล์กับ AKI ที่เกี่ยวข้องกับโควิด-19 สิ่งเหล่านี้ถูกรวบรวมภายใต้ระเบียบการของคณะกรรมการพิจารณาของสถาบันอื่นที่อนุญาตให้เก็บตัวอย่างปัสสาวะที่เหลือได้ ดังนั้นจึงไม่มีการระบุชื่อ

2

การเก็บตัวอย่างและการประมวลผล

ทุกขั้นตอนดำเนินการบนน้ำแข็ง เก็บปัสสาวะเป็นตัวอย่างที่เป็นโมฆะหรือจากสายสวนปัสสาวะ ตัวอย่างถูกถ่ายโอนไปยังห้องปฏิบัติการความปลอดภัยทางชีวภาพระดับ 21 ทันทีเพื่อดำเนินการ ตัวอย่างปัสสาวะถูกถ่ายโอนไปยังหลอดรูปกรวยขนาด 50- มล. และปั่นแยกที่ 10003 ก. เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 C เม็ดเซลล์ถูกล้างด้วย PBS เย็นน้ำแข็ง กรองผ่านตัวกรอง 40- มม. และปั่นแยกอีกครั้ง เซลล์ที่มีชีวิตถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ชุดกำจัดเศษซากของ MACS (มิลเทนยี ไบโอเทค) ตามด้วยชุดกำจัดเซลล์ตาย EasySep Annexin V (สเต็มเซลล์) โดยสรุป เซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ใน PBS เย็นน้ำแข็งและผสมกับสารละลายกำจัดเศษ PBS เย็นถูกซ้อนทับบนของผสมและปั่นแยกที่ 3003 กรัม เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 C สองเฟสบนสุดถูกดูดออก และจากนั้น เซลล์ที่เหลือถูกล้างด้วย PBS เซลล์ถูกแขวนลอยใหม่และผสมกับค็อกเทลกำจัดเซลล์ที่ตายแล้ว, ค็อกเทลคัดเลือกไบโอติน และจากนั้น RapidSpheres ก่อนที่จะแยกในแม่เหล็ก EasySep เซลล์ถูกล้างและแขวนลอยใหม่ใน PBS 52 มล. (ไม่มีแคลเซียมหรือแมกนีเซียม) 10.04% BSA (Fisher Scientific) สำหรับการประมวลผล scRNAseq


12

scRNAseq

เซลล์ที่บริสุทธิ์ถูกถ่ายโอนไปยัง UAB Flow Cytometry และ Single Cell Core และประมวลผลทันทีโดยใช้ชุดลำดับ RNA เซลล์เดียว Chromium 39 (103จีโนมิกส์) ตามที่ผู้ผลิตกำหนด'คำแนะนำการระงับเซลล์ถูกนับรวมกับ 103 ผสมรีเอเจนต์โครเมียมและบรรจุลงในไมโครชั้นuidicอุปกรณ์แบ่งพาร์ติชันเซลล์เดียวซึ่งสลายและย้อนกลับการถอดรหัสเกิดขึ้นในไมโครหยด ผลลัพธ์ cDNAเป็นแอมป์ฟิแก้ไขโดย PCR แล้วประมวลผลเพื่อให้ได้ผลผลิต
ไลบรารีลำดับบาร์โค้ด การจัดลำดับคู่ท้ายดำเนินการบนแพลตฟอร์มการจัดลำดับของ Illumina NovaSeq6000 หรือ NextSeq500 (Illumina) การอ่านได้รับการประมวลผลแล้วโดยใช้ 103 ซอฟต์แวร์เซลล์เดียวของ Genomics Cell RangerSuite เวอร์ชัน 6.0 บน UAB Cheaha High-Performanceคลัสเตอร์คอมพิวเตอร์ บีซีแอลฟิไฟล์ถูกแปลงเป็น FASTQฟิโดยใช้ฟังก์ชันรวดเร็วของ CellRanger เซลล์เรนเจอร์fast ใช้เพื่อจัดตำแหน่ง FASTQฟิเป็นจีโนมที่กำหนดเองประกอบด้วยจีโนมมนุษย์ hg38 (GRCh38.p13) ด้วย
จีโนม SARS-CoV-2 (NC_045512.2) ที่ถูกแทรกเป็นเอ็กซอน (31) ตารางยีน ตารางบาร์โค้ด และเมทริกซ์นิพจน์การถอดเสียงถูกสร้างขึ้นสำหรับการวิเคราะห์ระบุไว้ด้านล่าง


การวิเคราะห์ข้อมูล

การวิเคราะห์ดำเนินการโดยใช้แพ็คเกจที่สร้างขึ้นสำหรับสภาพแวดล้อมการวิเคราะห์ทางสถิติ R (เวอร์ชัน 4.06) ข้อมูลได้รับการวิเคราะห์เป็นหลักใน Seurat เวอร์ชัน 3.2.3 (32,33) และเวอร์ชันดังกล่าวการพึ่งพาที่เกี่ยวข้อง ข้อมูลจากคนไข้แต่ละรายถูกนำเข้าโดยใช้ Read103 ฟังก์ชั่นแล้วจึงสร้างรวบรวมไว้ในวัตถุ Seurat โดยใช้ CreateSeuratObject สำหรับการควบคุมคุณภาพ เซลล์ที่มีคุณสมบัติเฉพาะมีจำนวนมากกว่า 2,500 เซลล์หรือต่ำกว่า 200 และเซลล์ที่มีสัดส่วนไมโตคอนเดรียของ.15% เป็นฟิหมดไป ข้อมูลถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดยใช้ Logทำให้เป็นมาตรฐานและปรับขนาดเพื่อเตรียมสำหรับมิติเชิงเส้นการลดน้อยลง. วัตถุจากผู้ป่วยแต่ละรายมีป้ายกำกับด้วยเอกลักษณ์เฉพาะกลุ่มฟิแคตไอออนแล้วรวมเข้าเป็นวัตถุเดียวโดยใช้ฟังก์ชันผสาน Seurat คนไข้แซมples ถูกรวมเข้ากับฟังก์ชัน RunHarmony โดยใช้แพ็คเกจ Harmony R (34) การวิเคราะห์องค์ประกอบหลักถูกดำเนินการ จากนั้น เซลล์จะถูกรวมกลุ่มตามการแสดงออกของยีนที่แตกต่างตามที่ Seurat กำหนดฟังก์ชัน FindAllMarkers ตั้งค่าเป็นความละเอียดหนึ่ง มิติการลดขนาดทำได้โดยใช้ท่อร่วมสม่ำเสมอการประมาณและการฉายภาพ ชนิดของเซลล์มีลักษณะเฉพาะฟิเอ็ดโดยการเปรียบเทียบการถอดเสียงที่แสดงออกมาแตกต่างกันแต่ละคลัสเตอร์ที่มีการถอดเสียงที่รู้จักซึ่งเกี่ยวข้องกับข้อมูลจำเพาะฟิc ประเภทเซลล์ (29,35,36) ใช้แพ็คเกจ Escape R เพื่อรันการวิเคราะห์การเพิ่มปริมาณชุดยีน (GSEA) (37) Webเกสตัลท์อาร์ใช้สำหรับการวิเคราะห์ภววิทยาของยีนเพื่อระบุวิถีทางโดยใช้กระบวนการทางชีวภาพและสารานุกรมเกียวโตของฐานข้อมูลยีนและจีโนม (38)




คุณอาจชอบ