การสแกนด้วยกล้องจุลทรรศน์การนำไฟฟ้าของไอออนของโกลเมอรูลัสของมนุษย์ที่มีชีวิต

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:ali.ma@wecistanche.com

Ruslan Bohovyk1,2|Mykhailo Fedoriuk1,2|Elena Isaeva1,2|แอนดรูว์ เชฟชุค3|Oleg Palygin1|Alexander Staruschenko1,4

1ภาควิชาสรีรวิทยา, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI, USA2Department of Cellular Membranology, Bogomoletz Institute of Physiology, Kyiv, Ukraine3Department of Medicine, Imperial College London, London, UK4Clement J. Zablocki VA Medical Center, Milwaukee, WI, USA

จดหมายโต้ตอบAlexander Staruschenko and Ruslan Bohovyk, Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 8701 Watertown Plank Road, Milwaukee, WI 53226, USA.อีเมล: staruschenko@mcw.edu; rbogovik@gmail.com

ข้อมูลการจัดหาเงินทุนกรมกิจการทหารผ่านศึก หมายเลขทุน/รางวัล: I01 BX004024; สถาบันหัวใจ ปอด และโลหิตแห่งชาติ หมายเลขทุน/รางวัล: P01 HL116264 และ R35 HL135749; American Physiological Society, Grant/Award Number: Research Career Enhancement Award; สถาบันโรคเบาหวานและการย่อยอาหารแห่งชาติและไตโรค, หมายเลขทุน/รางวัล: DK126720

เชิงนามธรรม

ความเสียหายของ Podocyte เป็นลักษณะเด่นของโรคไต เช่น focal segmental glomerulosclerosis ซึ่งมักเกี่ยวข้องกับ albuminuria ที่ทำเครื่องหมายไว้และความก้าวหน้าของพยาธิสภาพของไต ความผิดปกติและการสูญเสียโครงสร้างของ Podocyte ยังเชื่อมโยงกับโรคที่เปลี่ยนแปลงน้อยที่สุดและพบได้บ่อยมากขึ้นโรคไตจากเบาหวาน. ในที่นี้ เราใช้เทคนิคการสแกนด้วยกล้องจุลทรรศน์การนำไฟฟ้าด้วยการสแกนไอออน (SICM) เป็นครั้งแรกเพื่อประเมินมนุษย์ที่แยกตัวออกมาใหม่โกลเมอรูลัสโทโพโลยี SICM ให้โอกาสพิเศษในการประเมินโกลเมอรูลัสpodocytes เช่นเดียวกับส่วนโครงสร้าง nephron อื่น ๆ ที่มีความละเอียดด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน แต่ในตัวอย่างที่มีชีวิต แสดงให้เห็นว่านี่คือการประยุกต์ใช้วิธี SICM ในมนุษย์ที่มีชีวิตโกลเมอรูลัสซึ่งให้การพิสูจน์หลักการสำหรับการวิเคราะห์แบบไดนามิกในอนาคตของสัณฐานวิทยาของเมมเบรนและพารามิเตอร์การทำงานต่างๆ ในเซลล์ของสิ่งมีชีวิต

คลิกเพื่อดูผลข้างเคียงและ Cistanche สำหรับโรคไต

1. บทนำ

โกลเมอรูลัสแสดงถึงกระจุกของเส้นเลือดฝอยที่ตั้งอยู่ที่ส่วนเข้าของเนฟรอน โดยที่เลือดถูกกรองอย่างเลือกสรรผ่านสิ่งกีดขวางการกรองไตซึ่งประกอบด้วยเซลล์บุผนังหลอดเลือด เยื่อหุ้มชั้นใต้ดินของไต และพอโดไซต์ กระบวนการหลักและกระบวนการรองของ podocytes ที่อยู่ติดกันพันกัน สร้างไดอะแฟรมแบบกรีดที่หุ้มเส้นเลือดฝอย glomeruli อย่างแน่นหนา ไดอะแฟรมนี้มีสัณฐานวิทยาที่ซับซ้อนและเป็นอุปสรรคสุดท้ายสำหรับการกรองเลือดที่เอื้อต่อการเลือกขนาดและยอมให้มีการซึมผ่านของโมเลกุลที่มีขนาดเล็กกว่าอัลบูมิน มีรายงานการลดลงของจำนวน podocyte และการเกิด foot process glomerulosclerosis ที่จุดโฟกัส โรคที่มีการเปลี่ยนแปลงน้อยที่สุด และโรคไตจากโรคเบาหวาน1-3นอกจากนี้ การสูญเสียและการปรับเปลี่ยนสถาปัตยกรรมของ podocytes สามารถเห็นได้ชัดในระยะเริ่มต้นของไตโรคที่อาจรองรับ/ทำให้ความก้าวหน้ารุนแรงขึ้น การถ่ายภาพด้วยความละเอียดสูงของสัณฐานวิทยาของเซลล์กำลังกลายเป็นเครื่องมือสำคัญและมีประโยชน์สำหรับการศึกษาโครงสร้างเซลล์และบทบาทที่พวกมันมีต่อการทำงานของเซลล์และความก้าวหน้าของโรค4 การสแกนด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (SEM) เป็นวิธีที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการศึกษาดังกล่าว ยังคงต้องใช้ขั้นตอนที่ซับซ้อนหลายขั้นตอนในการเตรียมตัวอย่าง ทำให้ไม่สามารถวิเคราะห์ตัวอย่างที่มีชีวิตได้5 ดังนั้นจึงมีความจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องพัฒนาเครื่องมือใหม่ในการศึกษาการเปลี่ยนแปลงของสัณฐานวิทยาของพอดไซต์ในตัวอย่างที่มีชีวิต โหมด Hopping Probe ของ Scanning Ion Conductance Microscopy (SICM) เป็นเทคนิคที่ช่วยให้สามารถถ่ายภาพพื้นผิวเซลล์ที่มีชีวิตที่มีความละเอียดสูงและไม่ใช้แสงได้โดยมีสัณฐานวิทยาที่ซับซ้อน6-8ข้อดีหลักของวิธีนี้คือความละเอียดเชิงพื้นที่ใกล้เคียงกับนาโนเมตรหลายขนาดและ ช่วง Z (แนวตั้ง) ยาว ซึ่งสามารถนำไปใช้กับตัวอย่างที่มีชีวิตซึ่งมีสัณฐานวิทยาที่ซับซ้อนภายใต้สภาวะที่เกี่ยวข้องทางสรีรวิทยา SICM เป็นเทคนิคการถ่ายภาพต่อเนื่องหลายรูปแบบที่สามารถใช้ร่วมกับเทคนิคอื่นๆ ที่จัดตั้งขึ้น การวิเคราะห์สัณฐานวิทยาของเมมเบรนพร้อมกันและแบบไดนามิก และพารามิเตอร์การทำงานต่างๆ เช่น ปริมาตรของเซลล์ ศักย์ของเมมเบรน กระแสช่องไอออนเดี่ยว และแม้แต่ไดนามิกของคอมเพล็กซ์โปรตีนเมมเบรน ในเซลล์ที่มีชีวิต9-11 ในที่นี้ เราให้ตัวอย่างการใช้ SICM เพื่อวิเคราะห์สัณฐานวิทยาของมนุษย์ที่มีชีวิตโกลเมอรูลัสโครงสร้าง.

อาการโรคไต-ไต

2. วัสดุและวิธีการ

สำหรับการทดลอง เราใช้ส่วนหนึ่งของพื้นที่คอร์เทกซ์จากมนุษย์ที่ปลูกถ่ายทิ้งไตผ่าและเก็บไว้ในสารละลายถนอมอาหารในวิสคอนซิน ตามด้วยการฟักตัวในสารละลายน้ำเกลือทางสรีรวิทยาที่มีออกซิเจน (PSS) 12 โกลเมอรูไลของไตถูกแยกออกโดยใช้เทคนิคการแยกตัวของเสียงตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้13 วิธีการนี้ช่วยให้สามารถแยกโกลเมอรูไลของไตที่ได้รับการเก็บรักษาไว้อย่างดีออกจากมนุษย์ได้อย่างรวดเร็วไต. เพื่อทำการถ่ายภาพ SICM มนุษย์ที่แยกออกมาใหม่โกลเมอรูลัสถูกยึดติดกับพื้นผิวแก้วโพลี-แอล-ไลซีนที่ใส่เข้าไปในห้องเซลล์ที่เต็มไปด้วยสารละลาย PSS ตัวอย่างถูกวางตำแหน่งด้วยตนเองในทิศทาง xy ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบออปติคัลแบบกลับหัว Nikon TE2000-U (Nikon Instruments) สำหรับโพรบกระโดด ใช้นาโนปิเปตแก้วโบโรซิลิเกตที่สร้างภาพ SICM ที่มีความต้านทานประมาณ 100 MΩ ซึ่งสอดคล้องกับเส้นผ่านศูนย์กลางปลายโดยประมาณประมาณ 120 นาโนเมตร นาโนปิเปตถูกดึงด้วยตัวดึงเปลวไฟแนวนอน/สีน้ำตาล P-97 (Sutter Instruments, Novato, CA) นาโนปิเปตถูกเติมด้วยสารละลาย PSS เดียวกันกับที่ใช้ในอ่างและถูกจัดตำแหน่งในทิศทาง z ด้วยตัวกระตุ้นแบบเพียโซอิเล็กทริก กระแสไอออนที่ไหลผ่านนาโนปิเปตวัดด้วยแอมพลิฟายเออร์แพตช์แคลมป์ Axopatch 700B (Axon Instruments) ในโหมดแคลมป์แรงดัน และตรวจสอบโดยยูนิเวอร์แซลคอนโทรลเลอร์ที่ปรับแต่งเองได้ (ICAPPIC Ltd, UK) ซึ่งควบคุมตัวอย่างและการวางตำแหน่งปิเปตไปพร้อม ๆ กัน 6 การทดลองทั้งหมดดำเนินการที่อุณหภูมิห้อง (20-22 องศา ) สำหรับการสร้างภาพโครงสร้างที่ซับซ้อนซับซ้อน เช่น กระบวนการของเท้าของพอโดไซต์ในโกลเมอรูลัสเราใช้โหมดถอยหลัง/กระโดด SICM ซึ่งเหมาะสมที่สุดสำหรับการถ่ายภาพภูมิประเทศของเซลล์ที่มีชีวิตที่มีความละเอียดสูง6,14 ขั้นตอนเดียวของหลักการกระโดดประกอบด้วยเหตุการณ์เมื่อวัดกระแสอ้างอิงโดยการวางตำแหน่งนาโนปิเปตให้ดีเหนือ ตัวอย่าง. จากนั้น นาโนปิเปตเข้าใกล้แนวแกน z ไปยังพื้นผิวตัวอย่างจนกว่าระดับกระแสไฟที่วัดได้จะลดลงจนถึงค่าที่ตั้งไว้ล่วงหน้าซึ่งสอดคล้องกับ ~ 1.0 เปอร์เซ็นต์ -1.2 เปอร์เซ็นต์ของกระแสอ้างอิง ในขณะนี้ วิธีการสิ้นสุดลง พิกัด XYZ ของแอคชูเอเตอร์พายโซ XY และ Z จะถูกบันทึกเป็นพิกัดพื้นผิวตัวอย่างสำหรับจุดถ่ายภาพแรก และปิเปตจะถูกถอนออกจากพื้นผิว ขั้นตอนนี้จะทำซ้ำที่จุดสร้างภาพแต่ละจุดตามแกน xy ที่กำหนดโดยความละเอียดที่ตั้งไว้ล่วงหน้าและช่วงพื้นที่สแกน สำหรับรูปที่ 1B ช่วงการสแกนและความละเอียดของภาพคือ 30 µm × 30 µm และ 512 px × 512 px และสำหรับรูปที่ 1C คือ 5 µm × 5 µm และ 480 px × 480 px ตามลำดับ ข้อมูลภูมิประเทศ SICM ดิบและการประมวลผลภาพหลังดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์กล้องจุลทรรศน์ SICM ImageViewer (ICAPPIC Ltd, UK)

รูปที่ 1 การประยุกต์ใช้การสแกนภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์สื่อกระแสไฟฟ้าในการสแกน A, มนุษย์ที่แยกตัวออกมาใหม่โกลเมอรูลัสยึดติดกับพื้นผิวกระจกโพลี-ไลซีน ด้านซ้ายมือคือไมโครปิเปตเข้าใกล้พื้นผิวโกลเมอรูลัสเพื่อทำการถ่ายภาพ SICM B, ตัวอย่างขององค์ประกอบกั้นการกรองโกลเมอรูลัส ซึ่งรวมถึงกระบวนการพอดไซต์และเท้าที่ปกคลุมภาชนะ มองเห็นได้โดย SICM 45 นาทีสำหรับการสแกนพื้นที่ทั้งหมด (30 × 30 µm, ความละเอียด 512 × 512 พิกเซล, แกน z เปลี่ยน 15 µm) C, ขยายมุมมองเกี่ยวกับสถาปัตยกรรมของกระบวนการเท้าทุติยภูมิของมนุษย์ podocyte เปิดเผยโดย SICM ที่มีความละเอียดสูง 12 นาทีสำหรับการสแกนพื้นที่ทั้งหมด (ความละเอียด 5 × 5 µm, ความละเอียด 480 × 480 พิกเซล, แกน z เปลี่ยน 3 µm) แถบมาตราส่วนจะปรากฏขึ้น

3. ผลลัพธ์และการอภิปราย

คุณภาพของภาพ SICM เทียบได้กับ SEM และช่วยให้ตรวจสอบได้อย่างแม่นยำโกลเมอรูลัสโครงสร้างพื้นผิว รวมถึงหลอดเลือดและ podocytes และสถาปัตยกรรมของกระบวนการรองเท้า4 ในการศึกษาก่อนหน้านี้ เราใช้การถ่ายภาพ SICM เพื่อประเมินการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างทางพยาธิวิทยาในกระบวนการ podocyte เท้าในหนูไตเบาหวานชนิดที่ 2 (T2DN) 15 เรา ได้ทำการวิเคราะห์เปรียบเทียบสถาปัตยกรรมสามมิติของแผงกั้นการกรองแบบโพโดไซต์ในหนูที่ไม่เป็นเบาหวานและหนู T2DN ข้อมูลของเราเผยให้เห็นการสูญเสียกระบวนการตีบของ podocyte อย่างมีนัยสำคัญใน T2DN glomeruli ซึ่งให้การประเมินที่แม่นยำสำหรับการเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาที่เกิดขึ้นในโรคไตจากเบาหวานที่อยู่ภายใต้ภาวะไตวายในปัสสาวะและอัลบูมินูเรียในหนูเหล่านี้15ในที่นี้ เป็นครั้งแรกที่เราได้แสดงให้เห็นแนวทางที่ประสบความสำเร็จในการประเมินทั้งสาม โครงสร้างพื้นผิวมิติของโกลเมอรูลัสมนุษย์ที่มีชีวิตที่แยกออกมาใหม่ glomeruli ของไตของมนุษย์เป็นโครงสร้างทรงกลมที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 300 µm16; ดังนั้น ปลายปิเปตจะต้องเข้าใกล้ส่วนบนสุดของพื้นที่ที่สนใจอย่างระมัดระวัง การตั้งค่า SICM ของเรามีช่วงสแกนเนอร์แกน z 25 µm และ 30 × 30 µm แกน xy ซึ่งทำให้เราได้ภาพที่มีความละเอียดสูงของส่วนใหญ่โกลเมอรูลัสพื้นผิว. เวลาในการรับจะขึ้นอยู่กับช่วงการสแกน ความละเอียด และขนาดปลายอิเล็กโทรดกระโดด สำหรับการถ่ายภาพเซลล์ที่มีชีวิตในโครงสร้างที่ซับซ้อน เช่น โกลเมอรูลัสที่เพิ่งแยกออกมาใหม่ เวลาในการสแกนจะแตกต่างกันไปตั้งแต่ 10 ถึง 50 นาทีต่อเฟรม (ดูรายละเอียดเพิ่มเติมในคำอธิบายภาพ) ผลสะสมของความละเอียดสูง พื้นที่การสแกนขนาดใหญ่ และความผันผวนแบบสุ่มในระบบสิ่งมีชีวิต อาจส่งผลให้สิ่งประดิษฐ์เกี่ยวกับภาพที่แสดงเป็นการเลื่อนแนวนอนและแนวตั้งระหว่างรอบการเปลี่ยนตำแหน่งปิเปตที่คาดหวัง โปรดทราบว่าในรูปทรงที่ซับซ้อนซึ่งมีการเปลี่ยนแปลงอย่างกะทันหันของตำแหน่งพื้นผิว ทั้งเวลาในการรับข้อมูลและสิ่งแปลกปลอมในการถ่ายภาพ เช่น พิกเซลมืดหรือพิกเซลเสีย อาจเพิ่มขึ้นได้ ภาพภูมิประเทศ SICM (รูปที่ 1A) แสดงภาพเส้นเลือดฝอยที่ปกคลุมโดยกระบวนการตีบของโพโดไซต์หลักและรองที่มองเห็นได้ชัดเจน SICM ช่วยให้ได้ภาพตัวอย่างที่มีช่วงการสแกนที่แตกต่างกันในระดับนาโนเมตร ทำให้มีระดับความละเอียดที่เพียงพอ17 รูปที่ 1B แสดงถึงสถาปัตยกรรมของกระบวนการเกี่ยวกับเท้าทุติยภูมิของมนุษย์ที่เปิดเผยโดย SICM ที่มีความละเอียดสูง การวิเคราะห์เพิ่มเติมของภาพภูมิประเทศดังกล่าวสามารถใช้เพื่อศึกษาการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของกระบวนการที่เท้าของพอดไซต์ภายใต้สภาวะทางพยาธิวิทยาและเพื่อตอบสนองต่อการใช้ยาต่างๆ

การประยุกต์ใช้เทคนิค SICM เพื่อตรวจสอบโครงสร้างพื้นผิวสามมิติของตัวอย่างเนื้อเยื่ออ่อน ได้แก่โกลเมอรูลัสและเซลล์ podocyte ได้รับการแนะนำครั้งแรกโดย Nakajima et al4 ผู้เขียนใช้ไตชิ้นเพื่อเปรียบเทียบเทคนิคนี้กับ SEM ทั่วไป ที่นี่ เราขยายการศึกษาเหล่านี้ไปยังโกลเมอรูลัสของมนุษย์ เมื่อใช้วิธีนี้ เราได้เปิดเผยศักยภาพอันยิ่งใหญ่ของเทคนิค SICM สำหรับการตรวจสอบ .ที่รวดเร็วและเชื่อถือได้โกลเมอรูลัสอุปสรรคการกรอง ข้อดีอย่างหนึ่งของ SICM (นอกเหนือจากการใช้ตัวอย่างที่มีชีวิต) คือไม่ต้องมีขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างหลายขั้นตอนซึ่งปกติที่จำเป็นสำหรับการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์ EM รวมถึงการคายน้ำและการตรึงสารละลาย ดังนั้น SICM จึงสามารถหลีกเลี่ยงการหดตัวของตัวอย่างที่สังเกตได้จาก EM ซึ่งอาจนำไปสู่ขนาดจริงที่ทำให้เข้าใจผิดได้ ที่สำคัญ SICM แบบเรียลไทม์บน glomeruli ที่แยกออกมาใหม่ยังช่วยให้ทดสอบไดนามิกของการเคลื่อนไหวของเท้าในกระบวนการตอบสนองต่อการสัมผัสยาที่น่าสนใจอย่างเฉียบพลัน สุดท้าย สามารถใช้ปิเปต SICM เพื่อทำการบันทึก patch-clamp ของกระแสช่องสัญญาณเดียวได้18เพื่อจุดประสงค์นี้ หลังจากที่สร้างแผนที่ภูมิประเทศขึ้นใหม่แล้ว ซอฟต์แวร์ซื้อ (ICAPPIC Ltd, UK) อนุญาตให้ใช้เบรกควบคุมของแก้ว SICM โพรบกระโดดบนพื้นผิวห้องเพาะเลี้ยง ลดความต้านทานไมโครอิเล็กโทรดต่อสภาวะแพตช์แคลมป์ (7 ถึง 12 MΩ) และทำให้เหมาะสำหรับการบันทึกแบบช่องสัญญาณเดียวในการทดลองเดียวกัน SICM อนุญาตให้เลือกตำแหน่งที่แน่นอนของอิเล็กโทรด patch-clamp บนพื้นผิวเซลล์โดยอิงจากข้อมูลภูมิประเทศโดยวิธีการแนวตั้งที่มีการควบคุมอย่างดีด้วยความแม่นยำระดับนาโนเมตร ส่งผลให้เกิดการก่อตัวง่ายของ gigaseal ที่สัมผัสกับเยื่อหุ้มเซลล์ที่เรียกว่า Smart Patch.19

โดยสรุป วิธีการที่อธิบายไว้ในที่นี้มีศักยภาพที่ดีเยี่ยมสำหรับการศึกษาโกลเมอรูไลและกลุ่มเนฟรอนที่แยกได้ใหม่อื่นๆ นอกจากนี้ยังแสดงให้เห็นว่าสามารถใช้มนุษย์ได้ไตตัวอย่างที่ไม่มีการเตรียมการอย่างละเอียดเพื่อประเมินการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาในการศึกษาพยาธิสภาพ

Cistanche สำหรับโรคไต

กิตติกรรมประกาศ

การวิจัยในห้องปฏิบัติการของผู้เขียนได้รับทุนจาก Department of Veteran Affairs I01 BX004024, the National Heart, Lung and Blood Institute R35 HL135749 and P01 HL116264, the National Institute of Diabetes and Digestive andไตโรค R01 DK126720 และรางวัล American Physiological Society Research Research Enhancement Award

ขัดผลประโยชน์

ดร.แอนดรูว์ เชฟชุกเป็นผู้ถือหุ้นและรับค่าที่ปรึกษาจาก ICAPPIC Ltd. ผู้เขียนคนอื่นๆ ทั้งหมดประกาศไม่มีส่วนได้เสียในการแข่งขัน

ผลงานของผู้เขียน

Ruslan Bohovyk: แนวความคิด (เท่ากับ); การจัดการข้อมูล (ลูกค้าเป้าหมาย); การวิเคราะห์อย่างเป็นทางการ (ผู้นำ); การเขียนแบบร่างต้นฉบับ (เท่ากัน); การเขียน-ตรวจทานและแก้ไข (เท่ากัน) Mykhailo Fedoriuk: การจัดการข้อมูล (รองรับ); การวิเคราะห์อย่างเป็นทางการ (สนับสนุน); การเขียน-ตรวจทานและแก้ไข (เท่ากัน) Elena Isaeva: แนวความคิด (สนับสนุน); การจัดการข้อมูล (สนับสนุน); การวิเคราะห์อย่างเป็นทางการ (สนับสนุน); การเขียนแบบร่างต้นฉบับ (สนับสนุนการพอร์ต); การเขียน-ตรวจทานและแก้ไข (เท่ากัน) Andrew Shevchuk:แนวความคิด (สนับสนุน); ซอฟต์แวร์ (รองรับ); การเขียนแบบร่างต้นฉบับ (สนับสนุน); การเขียน-ตรวจทานและแก้ไข (เท่ากัน) Oleg Palygin: แนวความคิด (เท่ากับ); การวิเคราะห์อย่างเป็นทางการ (สนับสนุน); วิธีการ (สนับสนุน); การบริหารโครงการ (สนับสนุน); การเขียนแบบร่างต้นฉบับ (สนับสนุน); การเขียน-ตรวจทานและแก้ไข (เท่ากัน) Alexander Staruschenko: แนวความคิด (ผู้นำ); การบริหารโครงการ (ผู้นำ); ทรัพยากร (ตะกั่ว); การกำกับดูแล (ผู้นำ); การเขียนแบบร่างต้นฉบับ (เท่ากัน); การเขียน-ตรวจทานและแก้ไข (เท่ากัน)

คำชี้แจงความพร้อมใช้งานของข้อมูล

ข้อมูลที่สนับสนุนการค้นพบของการศึกษานี้มีให้จากผู้เขียนที่เกี่ยวข้องเมื่อมีการร้องขอที่สมเหตุสมผล