ติดต่อ:jerry.he@wecistanche.com

Lin Bai|Gui-ying Shi|ยาจุน หยาง|เว่ยเฉิน|เหลียนเฟิงจาง|ชวน ฉิน

Cistanche มีฤทธิ์ต่อต้านริ้วรอย

เชิงนามธรรม

พื้นหลัง: การลดลงของความสามารถในการฟื้นฟูและสภาวะสมดุลของอวัยวะที่เกี่ยวข้องกับเวลาเป็นลักษณะสำคัญของอายุมากขึ้น. Rehmannia glutinosa และ Astragalus membranaceus ถูกใช้เป็นยาสมุนไพรจีนโบราณเพื่อเพิ่มภูมิคุ้มกันและอายุยืนยาว อย่างไรก็ตาม ไม่ทราบกลไกในการชะลอความชราของยาสมุนไพร ในการศึกษานี้ เราศึกษากลไกของสมุนไพรผลการต่อต้านริ้วรอย.

วิธีการ: หนูถูกเลี้ยงด้วยอาหารที่เสริมด้วย R. glutinosa หรือ A. membranaceus เป็นเวลา 10 เดือน; กลุ่มควบคุมได้รับอาหารมาตรฐาน ฟีโนไทป์ถูกประเมินโดยใช้ระบบคะแนนการจัดระดับและการวิเคราะห์การอยู่รอด เปอร์เซ็นต์ของฟีโนไทป์ชราภาพของเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด (HSCs) ถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์การคัดแยกเซลล์ที่กระตุ้นการเรืองแสง หน้าที่และกลไกของ HSC ถูกวิเคราะห์โดยการทดสอบโคลนและปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์

ผลลัพธ์: Theผลการต่อต้านริ้วรอยของ R. glutinosa เกิดจากฟังก์ชันที่เพิ่มขึ้นของ HSCs หนูที่เลี้ยงด้วย R. glutinosa แสดงลักษณะของการชะลอตัวอายุมากขึ้นกระบวนการรวมทั้งความชราภาพลดลงและอัตราการรอดชีวิตที่เพิ่มขึ้น การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีแสดงให้เห็นจำนวนเซลล์ Lin–Sca1 บวก c–kit– (LSK) ที่ลดลง, HSC ระยะยาว (LT‐ HSCs) และ HSC ระยะสั้น (ST‐ HSCs) ในกลุ่ม R. glutinosa ในหลอดทดลอง การทดสอบโคลนได้แสดงความสามารถในการต่ออายุตัวเองที่เพิ่มขึ้นของ LT‐ HSCs จากกลุ่ม R. glutinosa เช่นเดียวกับการรักษา LSK ที่นิ่งผ่านการแสดงออก p18 ที่เพิ่มขึ้น กลุ่ม R. glutinosa ยังแสดงระดับของออกซิเจนปฏิกิริยาลดลงและเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ ‐gal plus ผ่านการปรับลดโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับความชราภาพของเซลล์ p53 และ p16

สรุป: Rehmannia glutinosa ออกแรงต่อต้านริ้วรอยผลกระทบโดยการรักษาความสงบและลดอายุของ HSCs

คำสำคัญ:การต่อต้านวัย, สเต็มเซลล์เม็ดเลือด, การนิ่ง, Rehmannia glutinosa

1|การแนะนำ

การแก่ชราหมายถึงการเสื่อมถอยทางหน้าที่ขึ้นกับเวลาที่ส่งผลกระทบต่อสิ่งมีชีวิตส่วนใหญ่ 1 การมีอายุยืนยาวของสิ่งมีชีวิตส่วนใหญ่คงอยู่โดยสเต็มเซลล์2 เซลล์ต้นกำเนิดเฉพาะเนื้อเยื่อมีความสามารถในการต่ออายุตัวเองและแยกความแตกต่างออกเป็นเซลล์เอฟเฟกต์ต่างๆ 3 อย่างไรก็ตาม ในระหว่างกระบวนการชราภาพ ความสามารถในการต่ออายุตัวเองนี้ลดลง ในที่สุดก็นำไปสู่การสะสมของเนื้อเยื่อที่ไม่ได้รับการซ่อมแซมและเสียหายในสิ่งมีชีวิตที่มีอายุมาก4 สูญเสียความสามารถในการรักษาสมดุลระหว่างความสงบและความแตกต่างในเซลล์ต้นกำเนิด/เซลล์ต้นกำเนิด ช่องอาจส่งผลให้เกิดการเสียชีวิตหรือโรคที่เกี่ยวข้องกับอายุ2 นอกจากนี้ การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้แนะนำว่าการฟื้นฟูเซลล์ต้นกำเนิดอาจทำให้ฟีโนไทป์ย้อนวัยได้5,6 ในระบบเม็ดเลือด เซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด (HSCs) มีหน้าที่ในการผลิตเซลล์เม็ดเลือด ในหนูที่มีอายุมาก ระบบเม็ดเลือดแสดงการด้อยค่าของเซลล์ T- และ B- และจำนวนเซลล์ myeloid เพิ่มขึ้น HSCs ที่มีอายุมากแสดงกิจกรรมการต่ออายุตัวเองที่ลดลงและความสามารถในการสร้างเม็ดเลือดใหม่ลดลง โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การเปลี่ยนแปลงที่เกี่ยวข้องกับอายุในช่อง HSC นั้นแสดงออกมาในโฮสต์ที่มีอายุมากขึ้นเป็นภาวะโลหิตจาง เพิ่มแนวโน้มที่จะเกิด myeloproliferative neoplasms การทำงานของภูมิคุ้มกันลดลง และเพิ่มอุบัติการณ์ของมะเร็ง7-9 อย่างไรก็ตาม กลไกของการเสื่อมสภาพของ HSC และ ไม่ทราบผลของยาสมุนไพรต่อการแก่ชราของ HSC10

ผู้คนต่างกังวลกับการชะลอกระบวนการชราภาพและคงความอ่อนเยาว์ตั้งแต่สมัยโบราณและต่อต้านริ้วรอยเป็นจุดสนใจของการวิจัยในปัจจุบัน การแพทย์แผนจีนได้รับความสนใจเพิ่มขึ้นในการรักษาโรคที่เกี่ยวข้องกับวัยชราต่างๆ สมุนไพรหลายชนิดที่ใช้ในยาจีนโบราณเป็นที่รู้จักว่ามีผลดีต่อการแก่ชราผ่านกลไกต่างๆ Rehmannia glutinosa และ Astragalus membranaceus มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในลักษณะนี้เป็นเวลาหลายพันปี

Rehmannia glutinosa ใช้ในการรักษาความผิดปกติของโรคเบาหวานต่างๆ เพิ่มการเผาผลาญของกระดูกในโรคกระดูกพรุน และยับยั้งการอักเสบของตับและการเกิดพังผืด นอกจากนี้ สมุนไพรนี้ยังมีผลอื่นๆ ได้แก่ป้องกันความเมื่อยล้า, ยากล่อมประสาทและคุณสมบัติป้องกันระบบประสาท ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา การศึกษาทางเภสัชวิทยาเกี่ยวกับ R. glutinosa และส่วนประกอบที่ออกฤทธิ์ของมันได้เน้นไปที่การกระทำในวงกว้างในเลือด ต่อมไร้ท่อ ระบบหัวใจและหลอดเลือด และระบบประสาทเป็นหลัก11-14 ดังนั้น R. glutinosa จึงมีภูมิคุ้มกันที่แข็งแกร่ง ‐ กิจกรรมการเสริมประสิทธิภาพ ซึ่งให้พื้นฐานทางทฤษฎีสำหรับการศึกษาเพิ่มเติม

Astragalus membranaceus มีคุณสมบัติเป็นยาชูกำลัง ปกป้องตับ ขับปัสสาวะ และขับเสมหะ15 และแสดงให้เห็นว่ามีสารกระตุ้นภูมิคุ้มกัน16ต้านการอักเสบ,และสารต้านอนุมูลอิสระผลกระทบ 17 การอธิบายกลไกระดับโมเลกุลที่เป็นรากฐานของผลกระทบของยาจีนโบราณในการปฏิบัติทางคลินิกเป็นขั้นตอนสำคัญในการนำไปใช้ทั่วโลก และหัวข้อนี้เป็นหัวข้อที่มีความสนใจในการวิจัยอย่างเข้มข้น

ดังนั้นในการศึกษานี้ เราจึงให้อาหารหนูที่เสริมด้วย R. glutinosa และ A. membranaceus เป็นเวลา 10 เดือน เพื่อสำรวจกลไกที่อยู่เบื้องหลังความสามารถของ R. glutinosa ในการเพิ่มอายุขัย

2|วัสดุและวิธีการ

2.1|การจัดกลุ่มและการรักษาสัตว์

หนูเพศเมีย C57BL/6J ได้รับการดูแลในสภาพแวดล้อมที่ปราศจากเชื้อโรคและเลี้ยงด้วยอาหารมาตรฐาน การใช้สัตว์ในการศึกษานี้ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของสถาบันสัตวศาสตร์ในห้องปฏิบัติการของวิทยาลัยการแพทย์สหภาพปักกิ่ง หนูเมาส์ (อายุ 10 เดือน) ถูกสุ่มแบ่งออกเป็นสามกลุ่ม (n=20/กลุ่ม) กลุ่มควบคุมได้รับอาหารมาตรฐาน (Beijing HFK Biosicence, Beijing, China) อาหารของอีกสองกลุ่มเสริมด้วย R. glutinosa และ A. membranaceus (การแพทย์แผนจีนปักกิ่ง ทงเหรินถัง ปักกิ่ง ประเทศจีน) ตามลำดับ ในขนาดยา 200 มก./วัน เป็นเวลา 10 เดือน ขนาดยานี้ถูกเลือกโดยใช้วิธีการทำให้เป็นมาตรฐานของพื้นที่ผิวกายเพื่อยืนยันขนาดยาจากการศึกษาในมนุษย์ไปจนถึงการศึกษาในหนูเมาส์ วัดน้ำหนักตัวทุก 2 เดือน และบันทึกการรอดชีวิตทุกวัน

2.2|การประเมินระดับความชราภาพ

ระบบคะแนนการให้เกรดถูกนำมาใช้เพื่อประเมินระดับของความชราภาพตามเกณฑ์ที่กำหนดโดย Takeda et al.18 แต่ละประเภทที่ระบุไว้ในโปรโตคอลได้รับการคัดเลือกจากสัญญาณทางคลินิกที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการชราภาพ หนูแต่ละตัวได้รับคะแนนเมื่ออายุ 18 เดือน และคะแนนในแต่ละประเภทจะถูกรวมเข้าด้วยกันเพื่อกำหนดคะแนนการให้คะแนนโดยรวม

2.3|โฟลว์ไซโตเมทรี

เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวจากต่อมไทมัส ม้าม เลือดส่วนปลาย (PB) และไขกระดูก (BM) ม้ามและไธมัสถูกตัดออกทันที ล้างด้วยน้ำเกลือและชั่งน้ำหนัก ม้ามและไทมัสถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันอย่างนุ่มนวลในเครื่องผสมแก้วและเซลล์ถูกแขวนลอยในน้ำเกลือที่บัฟเฟอร์ด้วยฟอสเฟตที่ปราศจากเชื้อ (PBS) เซลล์จาก PB ถูกนำไปใช้กับการสลายเซลล์เม็ดเลือดแดง (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) เซลล์จาก BM ถูกแยกออกได้โดยการล้างทั้งกระดูกหน้าแข้งและกระดูกโคนขาด้วย PBS ที่ปลอดเชื้อ เซลล์ทั้งหมดถูกแยกออกได้โดยการกรองผ่านตาข่ายไนลอนที่ปราศจากเชื้อและย้อมเป็นเวลา 30 นาทีที่ 4 องศาด้วยแอนติบอดีคอนจูเกตที่มีฟลูออโรฟอร์ต่อไปนี้: ไฟโคอีริทริน (PE)- คอนจูเกตแอนติ-CD3 (G4.18), อัลโลไฟโคไซยานิน (APC) - CD4 (OX35) และแอนติ-CD8a คอนจูเกต PE-Cy7 (OX8) สำหรับเซลล์ BM มาร์คเกอร์เชื้อสายถูกย้อมโดยใช้ไบโอติน-คอนจูเกตแอนติเมาส์ CD4 (RM4-5), CD5 (53-7.3) CD8a (53-6.7), CD11b (M1/70), B220 (RA3-6B2), TER119 (TER- 119) และ Gr1 (RB6-8C5) ตามด้วยการย้อมสีด้วยแอนติบอดี APC-eFluor 780-conjugated streptavidin ยังได้รับจาก eBioscience (ซานดิเอโก แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) แอนติบอดีต่อไปนี้ถูกใช้สำหรับการย้อมสีพื้นผิว: APC immunoglobulin (Ig)M (II/41), fluorescein isothiocyanate (FITC) IgD (11-26), PE-Cy7 Sca-1 (D7), PE Flt3 ( A2F10), FITC B220 (RA3-6B2), FITC CD34 (RAM34), PerCP-Cy5.5 CD127 (A7R34), PE CD16/CD32 (93) และ PerCP-Cy5.5 CD3e (145-2C11) แอนติบอดีทั้งหมดได้มาจาก eBiosciences (San Diego, CA, USA) ข้อมูลได้มาโดยFACS

Aria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) และวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ FlowJo (Three Star, Ashland, OR, USA)

2.4|การวิเคราะห์วัฏจักรเซลล์

สำหรับการวิเคราะห์วัฏจักรเซลล์ เซลล์ BM ทั้งหมดถูกย้อมสำหรับเครื่องหมายพื้นผิวเซลล์ต้นกำเนิด (Lin–Sca-1 บวก c- KitHigh; LSTKs) จากนั้นตรึงและซึมผ่าน (00-5123-43; Becton Dickinson ) ก่อนลงสี FITC Ki-

67 แอนติบอดีและ 7-aminoactinomycin D (7-AAD) การรับข้อมูลดำเนินการบน FACS Aria II (Becton Dickinson) วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ซอฟต์แวร์ FlowJo

2.5|การย้อมสีที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพ

กิจกรรมที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพ (SA)‐ gal ยังถูกตรวจสอบโดยโฟลว์ไซโตเมทรีโดยใช้ C12FDG ตามที่อธิบายโดยผู้ผลิต (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) โดยสังเขป เซลล์ต้นกำเนิดถูกย้อมเป็นครั้งแรกสำหรับมาร์คเกอร์ที่ผิวเซลล์ จากนั้นจึงฟักด้วย 100 นาโนโมล L− 1 bafi-lomycin A1 เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศาเพื่อกระตุ้นการเกิดด่างของไลโซโซม หลังจากการล้างด้วย PBS เซลล์ถูกบ่มด้วย 2 มิลลิโมล L− 1 C12FDG เป็นเวลา 1-2 ชั่วโมงที่ 37 องศา และจากนั้นวิเคราะห์โดยใช้ FACS Aria I (เบคตัน ดิกคินสัน)

2.6|การกำหนดชนิดของออกซิเจนปฏิกิริยา (ROS) การผลิต

เซลล์ถูกบ่มด้วยไดคลอโรไดไฮโดรฟลูออเรสซีนไดอะซิเตต (DCFH- DA; Beyotime, Shanghai, China) ที่ 37 องศาเป็นเวลา 20 นาที DCFH- DA แพร่กระจายอย่างเฉยเมยเข้าสู่เซลล์ โดยที่เอสเทอเรสถูกดีอะซีไทเลตเพื่อสร้างรูปที่ไม่ใช่ฟลูออเรสเซนต์ 2′,7′-ไดคลอโรฟลูออเรสซีน (DCFH) ปริมาณการเรืองแสงที่ปล่อยออกมามีความสัมพันธ์กับปริมาณของ ROS ในเซลล์ ข้อมูลได้มาจาก FACS Aria I (Becton Dickinson) และวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ FlowJo

2.7|การวิเคราะห์ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์ (PCR)

RNA ทั้งหมดถูกสกัดจากเซลล์โดยใช้รีเอเจนต์ TRIzol (Invitrogen, San Diego, CA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ยีนที่น่าสนใจได้รับการขยายจาก RNA ทั้งหมดที่บำบัดด้วย DNase I โดยใช้ M- MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, WI, USA)

และไพรเมอร์โพลี-dT ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ PCR มีดังนี้: p21 (5′-TCCAGACATTCAGAGCCACA-3′ และ 5′-CGAAGAGACAACGG- CACACT-3′, Tm=60 องศา , 30 รอบ), p53 (5′-CATGAACCGCCGACC- TATC- 3′ และ 5′-TCCCGGAACATCTCGAGGC-3′, Tm=62 องศา , 35 รอบ), p16 (5′-CGAACTCTTTCGGTCGTACCC-3′ และ 5′- CGAATCTGCACCGTAGTTGAGC-3′, Tm=62 องศา , 35 รอบ), p57 (5′- AGGAGCAGGACGAGAATCAA-3′ และ 5′- TTCTCCTGCGCAGTTCTC TT-3′, Tm=61 องศา , 30 รอบ), p19 (5′-ATGGGTCGCAGGTTCTTGGT-3′ และ 5′-GTAGTGGGGTCCTCGCAGTT-3 ′, Tm=61 องศา , 35 รอบ), p18 (5′-GGGACCTAGAGCAACTTACT-3′ และ 5′-TGACAGCAAAAC- CAGTTCCA-3′, Tm=61 องศา , 30 รอบ), glyceraldehyde 3-phosphate ดีไฮโดรจีเนส (5′-GAGCGAGACCCCACTAACAT-3′ และ 5′-TTCACACCCATCACAAACAT-3′, Tm=60 องศา , 25 รอบ) เรียลไทม์ (RT)‐ PCR ดำเนินการโดยใช้ SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Shuzo, Kyoto, Japan) ในระบบตรวจจับ ABI StepOne™ (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)

2.8|การตรวจโคลนนิ่ง

ระยะยาว (LT)- HSCs ถูกจัดเรียงโดยการคัดแยกเซลล์ที่กระตุ้นด้วยแสงฟลูออเรสเซนต์ (FACS) จากนั้นเพาะเลี้ยงในเพลตเซลล์ 96 หลุมโดยใช้ตัวกลางที่เป็นเมทิลเซลลูโลส (HSC007; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) . มีการเตรียมบ่อจำลองสิบหลุมสำหรับแต่ละตัวอย่าง เราใช้เพลตเพาะเซลล์ 96 หลุม สามเซลล์ต่อหนึ่งหลุม สองสัปดาห์หลังจากการชุบ นับจำนวนและขนาดของอาณานิคมด้วยกล้องจุลทรรศน์

2.9|การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลได้รับการวิเคราะห์โดย ANOVA ทางเดียวโดยใช้ซอฟต์แวร์ Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) และ GraphPad Prism (ซอฟต์แวร์ GraphPad, La Jolla, CA, USA) ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย± SD P < 0.05="">

3|ผลลัพธ์

3.1|R. glutinosa และ A. membranaceus มีฤทธิ์ในการต่อต้านริ้วรอย

เพื่อยืนยันผลการต่อต้านริ้วรอยของ R. glutinosa และ A. membranaceus เราได้ตรวจสอบผลของการให้ยาเป็นอาหารเสริม (200 มก./วัน) ต่อจากนั้น เราบันทึกน้ำหนักตัว ระดับความชราภาพ และอัตราการรอดตายของหนู น้ำหนักตัวของหนูที่เลี้ยงด้วย R. glutinosa หรือ A. membranaceus นั้นปกติเมื่อเทียบกับในกลุ่มควบคุม แม้ว่าจะมีการลดน้ำหนักของกลุ่ม R. glutinosa และ A. membranaceus ที่ 20 เดือน (รูปที่ 1A) การวิเคราะห์ระดับความชราภาพเผยให้เห็นการเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องและไม่สามารถย้อนกลับได้ในคะแนนการให้เกรดกับอายุที่เพิ่มขึ้นในกลุ่ม R. glutinosa และ A. membranaceus เมื่อเปรียบเทียบกับในกลุ่มควบคุม แม้ว่าการเพิ่มขึ้นจะถูกระบุมากกว่าในกลุ่ม A. membranaceus กลุ่ม (รูปที่ 1B) คะแนนการให้คะแนนที่สูงเกิดจากการเริ่มมีอาการของความเฉื่อยชาและการเกิดปฏิกิริยาเร็วขึ้น การสูญเสียความมันวาวของผิวหนังและความหยาบที่เพิ่มขึ้น ผมร่วง รอยโรครอบขอบประสาทตา ภาวะกระดูกพรุนของกระดูกสันหลังเพิ่มขึ้น และความรุนแรงที่เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัด18 หนูเมาส์ในกลุ่ม A . กลุ่มหนู membranaceus แสดงให้เห็นลักษณะฟีโนไทป์ของความชราภาพมากขึ้นรวมทั้งการสูญเสียความมันวาวของผิวหนังและผมร่วง. เส้นโค้งการเอาชีวิตรอดแสดงให้เห็นว่าอายุขัยของหนูในกลุ่ม R. glutinosa และ A. membranaceus นั้นยาวกว่าในกลุ่มควบคุมเล็กน้อย (รูปที่ 1C) ข้อมูลเหล่านี้ยืนยันผลการต่อต้านริ้วรอยของทั้ง R. glutinosa และ A. membranaceus แม้ว่า R. glutinosa จะพบว่ามีประสิทธิภาพในการชะลอกระบวนการชราภาพมากกว่า

รูปที่ 1 Rehmannia glutinosa และ Astragalus membranaceus hadผลการต่อต้านริ้วรอย. หนูได้รับอาหารที่เสริมด้วย R. glutinosa พื้นดินหรือ A. membranaceus (200 มก./วัน); กลุ่มควบคุมได้รับอาหารมาตรฐาน A. การเปลี่ยนแปลงน้ำหนักตัวของหนูที่วัดทุกๆ 2 เดือน B, การเปลี่ยนแปลงคะแนนการชราภาพของหนูตามอายุ C เส้นโค้งการเอาตัวรอด ข้อมูลแสดงถึงค่าเฉลี่ย± SD; n=20 หนู/กลุ่ม ข้อมูลแสดงถึงค่าเฉลี่ย± SD; n=5 หนู/กลุ่ม*P < 0.05,="" ***p=""><>

3.2|R. glutinosa ลดจำนวนเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด

ความอ่อนล้าของสเต็มเซลล์เป็นผลลัพธ์ที่สืบเนื่องมาจากความเสียหายที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพหลายประเภท และสาเหตุสำคัญประการหนึ่งของการแก่ชราของเนื้อเยื่อและร่างกาย1 การศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้แนะนำว่าการฟื้นฟูสเต็มเซลล์อาจทำให้ฟีโนไทป์ย้อนวัยในระดับสิ่งมีชีวิตได้5 เรา สันนิษฐานว่าผลการต่อต้านริ้วรอยของ R. glutinosa เป็นสื่อกลางโดยการเสริมการทำงานของเซลล์ต้นกำเนิด ดังนั้นเราจึงทำการวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีของจำนวนเซลล์ต้นกำเนิด/เซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดที่แยกได้จากหนู (อายุ 20 เดือน) ที่เลี้ยงด้วยอาหารที่เสริมด้วย R. glutinosa หรือ A. membranaceus (200 มก./วัน) เป็นเวลา 10 เดือน (รูปที่ 2A) . เปอร์เซ็นต์ของ LSK ลดลงในกลุ่ม R. glutinosa และ A. membranaceus (รูปที่ 2B) จำนวนของ LT- และระยะสั้น (ST)- HSCs ลดลงประมาณสองเท่าในกลุ่ม R. glutinosa เมื่อเทียบกับจำนวนในกลุ่มควบคุม (รูปที่ 2C- D) ตรวจพบต้นกำเนิดของต่อมน้ำเหลืองที่พบบ่อย (CLP) จำนวนมากขึ้นในกลุ่ม R. glutinosa เมื่อเปรียบเทียบกับจำนวนในกลุ่มควบคุม (รูปที่ 2I) ไม่มีความแตกต่างในจำนวนของต้นกำเนิด multipotent (MPPs), ต้นกำเนิด myeloid ทั่วไป (CMPs), granulocyte-macrophage progenitors (GMPs) และ megakaryocyte-erythroid progenitors (MEPs) ในกลุ่ม R. glutinosa เมื่อเปรียบเทียบกับจำนวนในกลุ่ม กลุ่มควบคุม. ในกลุ่ม A. membranaceus ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในจำนวนของ LT- และ ST- HSCs เมื่อเปรียบเทียบกับตัวเลขในกลุ่มควบคุม (รูปที่ 2C- D) นอกจากนี้ ไม่มีความแตกต่างในจำนวนของเซลล์ MPP, CMP, MEP และ CLP เมื่อเปรียบเทียบกับตัวเลขในกลุ่มควบคุม (รูปที่ 2E, 2F, 2H และ 2I); อย่างไรก็ตามจำนวนของ GMP ลดลงในกลุ่ม A. membranaceus ดังนั้น หนูที่รับประทานอาหารเสริมด้วย R. glutinosa แสดงจำนวนเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดและเซลล์ต้นกำเนิดที่ลดลง

3.3|R. glutinosa ปรับปรุงการทำงานและรักษาความนิ่งของ HSCs

เพื่อประเมินการทำงานของ HSCs ทดสอบศักยภาพของโคลนของ LT‐ HSCs ในหลอดทดลอง เราจัดเรียงเซลล์ LT- HSCs ลงในอาหารที่มีเมทิล- เซลลูโลสเบสโดยใช้ FACS และนับจำนวนและขนาดของโคโลนีหลังจาก 14 วัน เมื่อเทียบกับจำนวนและขนาดของโคโลนีที่สร้างโดยเซลล์จากหนูในกลุ่มควบคุม เซลล์จากหนูในกลุ่ม R. glutinosa แสดงจำนวนโคโลนีที่เพิ่มขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับขนาดเล็ก (P=0.0241 ) และโคลนขนาดใหญ่ (P=0.0418) ในขณะที่จำนวนจากหนูในกลุ่ม A. membranaceus ไม่มีความแตกต่าง (รูปที่ 3) ขนาดและจำนวนอาณานิคมที่เพิ่มขึ้นในกลุ่ม R. glutinosa แนะนำว่าสมุนไพรนี้ช่วยเพิ่มศักยภาพในการต่ออายุตัวเองของ LT‐ HSCs

HSCs ส่วนใหญ่ในหนูที่โตเต็มวัยยังคงนิ่งอยู่ 19 ดังนั้น การคงสภาพนิ่งของเซลล์จึงเป็นกลไกที่สำคัญสำหรับการต่ออายุเซลล์ต้นกำเนิดด้วยตนเอง20,21 การลดลงที่สังเกตพบใน HSCs แนะนำให้เพิ่มจำนวนเซลล์ใน R. glutinosa และ A. กลุ่มเยื่อหุ้มเซลล์; ดังนั้นเราจึงตรวจสอบสถานะวัฏจักรเซลล์ของ HSCs ผ่านการวิเคราะห์ตัวทำเครื่องหมายเซลล์ที่มีการงอกขยาย Ki-67 ร่วมกับการกำหนดปริมาณ DNA 7-AAD ในประชากร LSK เราสังเกตเห็นจำนวนเซลล์ LSK ที่เพิ่มขึ้นในระยะ G0 ในกลุ่ม R. glutinosa และ A. membranaceus เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ในกลุ่มควบคุม (รูปที่ 4A) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า R. glutinosa และ A. membranaceus รักษาความสงบของ HSCs

การวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ของตัวควบคุมวัฏจักรเซลล์ในเซลล์ LSK เปิดเผยว่า p18, p19 และ p57 มีบทบาทสำคัญในการรักษาความสงบของ HSC22-24 ไม่พบการเปลี่ยนแปลงที่ชัดเจนสำหรับ p57 และ p19 (รูปที่ 4C- D) และ p18 ถูกควบคุมในกลุ่ม R. glutinosa เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม และปรับเพิ่มขึ้นเล็กน้อยในกลุ่ม A. membranaceus (รูปที่ 4B)

รูปที่ 2 Rehmannia glutinosa และ Astragalus membranaceus ส่งผลต่อจำนวนเซลล์ต้นกำเนิด/เซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด หนู (อายุ

20 เดือน) ถูกเลี้ยงด้วยอาหารที่เสริมด้วย R. glutinosa หรือ A. membranaceus (200 มก./วัน) เป็นเวลา 10 เดือน (n=5/กลุ่ม); กลุ่มควบคุมได้รับอาหารมาตรฐาน เซลล์ไขกระดูก (BM) ที่แยกออกมาใหม่ถูกย้อมด้วยแอนติบอดีที่ระบุและวิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตเมทรี A, โปรไฟล์การย้อมสีที่เป็นตัวแทนของเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด BM และประชากรเซลล์ต้นกำเนิด B เปอร์เซ็นต์ของ Lin–Sca1 บวก c–kit– เซลล์ (LSKs) ในเซลล์ BM C- I, หมายเลขเซลล์ของ (C) ระยะยาว (LT; Lin–, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit , CD34 plus – , Flt3–); D ระยะสั้น (ST; Lin–, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit , CD34 plus plus , Flt3–); E, multipotent progenitor (MPP; Lin– ​​, Sca-1 plus , c‐ Kit plus , Flt3 plus ); F, ต้นกำเนิด myeloid ทั่วไป (CMP; Lin– ​​, Sca-1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/ CD32–); G, ต้นกำเนิดเม็ดเลือดมาโครฟาจ (GMP; Lin– ​​, Sca-1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/CD32 plus ); H, megakaryocyte-erythroid progenitor (MEP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit– , CD34–, CD16/CD32–); และ I, ต้นกำเนิดของต่อมน้ำเหลืองทั่วไป (CLP; Lin–, Sca‐ 1low, c‐ Kitlow, CD127 plus ) ข้อมูลแสดงถึงค่าเฉลี่ย± SD; n=5 หนู/กลุ่ม *P < 0.05,="" **p=""><>

3.4|R. glutinosa ชะลอความชราของ HSCs

การเสริมอาหารระยะยาวด้วย R. glutinosa สามารถยืดอายุขัยของหนูได้ ความชราของเซลล์เพิ่มขึ้นตามอายุ ดังนั้นเราจึงตรวจสอบการเสื่อมสภาพของ HSC ในหนูที่มีอายุมากขึ้นโดยการวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทริกของ HSC ที่ย้อมด้วย SA-gal โดยใช้สารตั้งต้นที่มีสารเรืองแสง (C12FDG) 25 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ SA-gal-positive ลดลงใน หมู่ R. glutinosa ซึ่งบ่งชี้ว่า R. glutinosa ชะลอความชราของเซลล์ LSK (รูปที่ 5A)

ชนิดของออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยามีบทบาทสำคัญในการชราภาพของ HSC และการสูญเสียการหยุดนิ่งของ HSC มักสัมพันธ์กับ ROS ของเซลล์ที่เพิ่มขึ้น การวิเคราะห์ ROS ภายในเซลล์ใน LSK พบว่าระดับลดลงในกลุ่ม R. glutinosa เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม กลุ่ม (รูปที่ 5B) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า R. glutinosa อาจรักษา HSC quiescence และปรับปรุงฟังก์ชัน HSC โดยการลดระดับ ROS

จากนั้นเราตรวจสอบการแสดงออกของยีนหลายตัวที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพของเซลล์โดยการวิเคราะห์ RT- PCR ของเซลล์ LSK เปรียบเทียบ

รูปที่ 3 หน้าที่ของเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดที่ได้รับการปรับปรุงด้วยการเสริม Rehmannia glutinosa ในอาหาร ศักยภาพในการโคลนนิ่งในหลอดทดลองของเซลล์ตับ stellate ในระยะยาวจากหนูทดลอง (n=3)

กับกลุ่มควบคุม การแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับความชราของเซลล์ p53 และ p16 ถูกปรับลดลงในกลุ่ม R. glutinosa (รูปที่ 5D- E) แต่การแสดงออกของ p53 และ p16 ไม่ได้ถูกควบคุมอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่ม A. membranaceus และกลุ่มควบคุม (รูปที่ 5D- E) เมื่อนำมารวมกัน ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าวัฏจักรสำคัญต่างๆ ของเซลล์และยีนที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพของเซลล์ควบคุมการทำงานของ HSCs ในหนูที่เลี้ยงด้วยอาหารที่เสริมด้วย R. glutinosa

3.5|R. glutinosa เพิ่มภูมิคุ้มกัน B-cell

ลิมโฟไซต์ B และ T มีความสำคัญต่อการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน T lymphocytes มีบทบาทสำคัญในการสร้างภูมิคุ้มกันและการควบคุมของเซลล์ ในขณะที่ B lymphocytes มีส่วนสำคัญในการสร้างภูมิคุ้มกันทางร่างกาย การเพิ่มจำนวนเม็ดเลือดขาวเป็นดัชนีที่สะท้อนภูมิคุ้มกันอินทรีย์ในทันที เพื่อตรวจสอบบทบาทในการเสริมสร้างภูมิคุ้มกัน ผลของ R. glutinosa และ A. membranaceus ต่อการเพิ่มจำนวนเม็ดเลือดขาว

หนูเมาส์ในกลุ่ม R. glutinosa แสดงจำนวน HSC ที่ลดลงและจำนวน CLP ที่เพิ่มขึ้น การวิเคราะห์โฟลว์ cytometric แสดงจำนวนที่เพิ่มขึ้นของบีเซลล์ที่เจริญเต็มที่ (B220 บวก ) ใน PB, BM และม้ามของหนูในกลุ่ม R. glutinosa เมื่อเทียบกับจำนวนที่ตรวจพบในกลุ่มควบคุม (รูปที่ 6A); อย่างไรก็ตาม ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในจำนวนของทีเซลล์ (CD4 plus และ CD8 plus ), monocytes และ granulocytes (CD11b plus ) ระหว่างสองกลุ่ม (รูปที่ 6B‐ D) ดังนั้น ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าอาหาร R. glutinosa ช่วยเพิ่มภูมิคุ้มกัน B-cell

รูปที่ 4 ผลิตภัณฑ์เสริมอาหารของ Rehmannia glutinosa และ Astragalus membranaceus ช่วยรักษาความนิ่งของเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด A, เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ในแต่ละเฟสของวัฏจักรเซลล์ การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมตริกของ 7-aminoactinomycin D (7-AAD) และการย้อมสี Ki-67 ของ Lin–Sca1 บวก c-kit– เซลล์ (LSKs) B, การวิเคราะห์ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์ของการแสดงออกของยีน LSK ที่เรียงลำดับ; GAPDH ถูกใช้เพื่อทำให้เป็นมาตรฐาน ข้อมูลแสดงถึงค่าเฉลี่ย± SD ของการทดลองสามครั้ง *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>

รูปที่ 5 การเสริมอาหาร Rehmannia glutinosa ช่วยลดความชราของเซลล์ตับ stellate (HSC) หนู (อายุ 20 เดือน) ได้รับอาหารโดยอาหารเสริม Rehmannia glutinosa หรือ Astragalus membranaceus (200 มก./วัน) เป็นเวลา 10 เดือน (n {{4) }}/กลุ่ม); กลุ่มควบคุมได้รับอาหารมาตรฐาน A, การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทริกของเซลล์ SA-gal-positive Lin–Sca1 plus c-kit– (LSK) โดยใช้สารตั้งต้น ‐galactosidase เรืองแสง (C12FDG) B เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ที่เป็นบวกของชนิดออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) ใน LSKs การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมตริกของ LSK ที่เป็นบวก ROS ข้อมูลแสดงถึงค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) *P < 0.05,="" ***p="">< 0.001.="" c,="" รูปแบบการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับความชราภาพของเซลล์ใน="" lsks;="" gapdh="" ถูกใช้เพื่อทำให้เป็นมาตรฐาน="" ข้อมูลแสดงถึงค่าเฉลี่ย±="" sd="" ของการทดลองสามครั้ง="" *p="">< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>

4|อภิปรายผล

ในการศึกษานี้ เราได้ศึกษากลไกของผลการต่อต้านริ้วรอยของ R. glutinosa หรือ A. membranaceus โดยการเสริมอาหารของหนูด้วยสมุนไพรในปริมาณ 200 มก./วัน เป็นเวลา 10 เดือน พบว่า R. glutinosa มีฤทธิ์ในการต่อต้านวัย รวมทั้งความชราภาพลดลงและการรอดชีวิตของ HSCs เพิ่มขึ้นด้วย

เสริมภูมิคุ้มกันบีเซลล์ ในแง่ของกลไกของผลการต่อต้านริ้วรอยเราพบว่า R. glutinosa ลดจำนวน HSCs ในขณะที่ความสามารถในการงอกขยายเพิ่มขึ้น นอกจากนี้ R. glutinosa ยังคงรักษาความนิ่งของ HSC และลดจำนวนเซลล์ SA-gal-positive และระดับ ROS ผ่านการควบคุม p18, p53 และ p16 ผลลัพธ์ของเรายืนยันว่าผลการต่อต้านริ้วรอยของ R. glutinosa ในหนูเมาส์ได้รับการรักษาโดยการรักษาความสงบและเพิ่มการทำงานของ HSCs

Rehmannia glutinosa ซึ่งใช้เป็นยาสมุนไพรจีนโบราณมาเป็นเวลาหลายพันปี สามารถใช้รักษาภาวะน้ำตาลในเลือดต่ำในผู้ป่วยเบาหวานต่างๆ ได้27,28 มีรายงานว่าสารสกัดจาก R. glutinosa ช่วยเพิ่มการเผาผลาญของกระดูก29 นอกจากนี้ R. glutinosa ยับยั้งการตอบสนองต่อการอักเสบและอาการต่างๆ 30,31 และป้องกันความเสียหายของเซลล์โดยการขับอนุมูลอิสระ14,32 ในการศึกษานี้ เราพบว่าการเสริมอาหารหนูด้วย R. glutinosa ออกแรงผลการต่อต้านริ้วรอยและเพิ่มภูมิคุ้มกัน B-cell โดยการเพิ่มความสามารถในการงอกของ LT- HSCs และลดจำนวนของเซลล์ SA-gal-positive และระดับ ROS

ระดับของความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชันพบว่าเพิ่มขึ้นตามอายุในเซลล์และเนื้อเยื่อต่างๆ ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันเป็นตัวกำหนดที่สำคัญของการต่ออายุ HSC ด้วยตนเอง การสูญเสียการหยุดนิ่งของ LT‐ HSC มักสัมพันธ์กับ ROS ของเซลล์ที่เพิ่มขึ้น ซึ่งสัมพันธ์เชิงลบกับการต่ออายุด้วยตนเองของ HSC26 Catalpol เป็นกลูโคไซด์ชนิดอิริดอยด์ ซึ่งพบได้ในรากของ R. glutinosa Catalpol แสดงให้เห็นการยับยั้งความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ความเสียหายของ DNA และการลดขนาดเทโลเมียร์ผ่านเส้นทาง PGC-1 /TERT ในการศึกษาก่อนหน้านี้ 33 ในการศึกษาของเรา ระดับ ROS ลดลงในเซลล์ LSK จากกลุ่ม R. glutinosa เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ดังนั้น R. glutinosa จึงยืดอายุการอยู่รอดของหนูเมาส์โดยการยับยั้งความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันใน HSCs

รูปที่ 6 การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมตริกของเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ภูมิคุ้มกันที่เจริญเต็มที่ในเลือดส่วนปลาย (PB) ไขกระดูก (BM) ม้าม และต่อมไทมัส หนู (อายุ 20 เดือน) ถูกเลี้ยงด้วยอาหารเสริมด้วย Rehmannia glutinosa หรือ Astragalus membranaceus (200 มก./วัน) เป็นเวลา 10 เดือน (n=5/กลุ่ม); กลุ่มควบคุมได้รับอาหารมาตรฐาน A, การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมตริกของเปอร์เซ็นต์ของเซลล์บี (B220 บวก ) ใน PB, BM และม้าม B, การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทริกของเปอร์เซ็นต์ของเซลล์โมโนไซต์และแกรนูโลไซต์ (CD11b บวก ) ใน PB และ BM C และ D, การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทริกของเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ CD4 plus และ CD8 plus ใน PB, ม้าม และไธมัส ข้อมูลแสดงถึงค่าเฉลี่ย± SD *P <>

Astragalus membranaceus ยังใช้ในยาจีนโบราณเพื่อส่งเสริมภูมิคุ้มกัน ลดน้ำตาลในเลือด และส่งเสริมการตายของเซลล์เนื้องอก และยังมีสารต้านอนุมูลอิสระและต่อต้านริ้วรอยคุณสมบัติ. ในการศึกษานี้ เราพบว่าการเสริมอาหารด้วย A. memranaceus เป็นเวลา 10 เดือนไม่มีผลที่ชัดเจนเมื่อเปรียบเทียบกับที่พบในหนูควบคุม ในขณะที่น้ำหนักของหนูลดลงเมื่ออายุ 20 เดือน ดังนั้น A. membranaceus อาจไม่เหมาะสมสำหรับการบำบัดด้วย LT กับหนูที่ได้รับอาหาร

โดยสรุป ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่า R. glutinosa สามารถยืดอายุขัยของหนูเมาส์ได้โดยการคงสภาพนิ่งและเพิ่มฟังก์ชันของ HSC นอกจากนี้ R. glutinosa ยังสามารถลดระดับระหว่างเซลล์ของ ROS และจำนวนเซลล์ SA‐gal-positive และเพิ่มภูมิคุ้มกัน B-cell

กิตติกรรมประกาศ

การศึกษานี้ได้รับการสนับสนุนบางส่วนโดย National Science Foundation for China (31672374), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (2016-12M-1-012) และ PUMC Youth Fund (2017310018)

ผลประโยชน์ทับซ้อน

ไม่มี.

ผลงานของผู้เขียน

ผู้เขียนที่ระบุไว้ทั้งหมดมีคุณสมบัติตรงตามข้อกำหนดสำหรับการประพันธ์ CQ และ LFZ คิดและออกแบบการทดลอง LB ทำการทดลองและเขียนการทดสอบต้นฉบับหลัก GYS ดำเนินการและวิเคราะห์ข้อมูลของ FACS YJY ออกแบบการทดลองเกี่ยวกับการแพทย์แผนจีน ห้องสุขาจัดการหนู ผู้เขียนทุกคนได้อ่านและอนุมัติต้นฉบับแล้ว