ไมโครในโรคไตเลปโตสไปโรซีส Ⅱ

4. การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของโฮสต์ต่อ Leptospira spp.

เส้นทางหลักของเชื้อเลปโตสไปราคือการทะลุผ่านเยื่อเมือกหรือผิวหนังที่เปิดโดยตรงผ่านทางเลือด เนื้อเยื่อ ปัสสาวะ หรือน้ำที่ปนเปื้อน ซึ่งแพร่กระจายไปตามการไหลเวียนของระบบและแพร่กระจายไปยังอวัยวะต่างๆ เช่นตับ, ปอด และท่อส่วนใกล้เคียงของเนฟรอนในไตโดยสามารถขยายพันธุ์และดำรงอยู่ได้เป็นเดือน [51] ในระยะเริ่มแรกของการติดเชื้อการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติมีบทบาทสำคัญในการป้องกันด่านแรกในโรคเลปโตสไปโรซีส ซึ่งส่งผลต่อการตอบสนองของตัวรับการจดจำรูปแบบ, phagocytosis มาโครฟาจ, การเหนี่ยวนำของนอกเซลล์การสะสมนิวโทรฟิล, และการแทรกแซงของระบบเสริม [52].

ที่การตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันในมนุษย์มีบทบาทสำคัญในการการพัฒนาอาการทางคลินิกเช่นเดียวกับปัจจัยความรุนแรงของเชื้อก่อโรคบางชนิด โรคเลปโตสไปโรซีสในมนุษย์ส่วนใหญ่ไม่มีอาการหรือไม่รุนแรง และมีเพียง 10% ของผู้ป่วยเท่านั้นที่มีอาการรุนแรงโดยมีอวัยวะหลายส่วนล้มเหลว และอัตราการเสียชีวิตที่เกี่ยวข้องกับพายุไซโตไคน์และภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่อง สายพันธุ์ที่ทำให้เกิดโรคกระตุ้นการตอบสนองของร่างกายในระยะแบคทีเรีย แม้ว่าพฤติกรรมที่ตามมาของการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันไม่ชัดเจน ในการศึกษาผู้ป่วยที่มีอาการทางคลินิกหลายอย่างของโรคฉี่หนู ความรุนแรงของภาพทางคลินิกสัมพันธ์กับระดับไซโตไคน์ในซีรั่มต่างๆ เช่น TNF- , IL-10 และ IL-6 [53] แต่ ข้อสรุปนี้ยังคงเป็นที่ถกเถียงกัน [54] สภาวะเหล่านี้ทำให้เกิดความสนใจเพิ่มขึ้นในการทำความเข้าใจการตอบสนองของภูมิคุ้มกันโดยทั่วไปและเหตุการณ์ทางชีววิทยาที่เกิดขึ้นระหว่างการติดเชื้อ

CISTANCHE ใช้เวลานานเท่าใดในการทำงาน?

4.1. Leptospira และระบบเสริม

กิจกรรมโปรตีโอไลติกของโปรตีเอส Leptospiral กับเมทริกซ์นอกเซลล์ทำให้การติดเชื้อเข้าสู่กระแสเลือดได้ ระบบเสริมในระบบไหลเวียนโลหิตเป็นหนึ่งในกลไกหลักของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติต่อเลปโตสไปราที่ทำให้เกิดโรค อย่างไรก็ตาม เลปโตสไปราได้พัฒนากลยุทธ์ในการหลีกเลี่ยงการโจมตีของระบบคอมพลีเมนท์ด้วยการจับโปรตีนเข้ากับโมเลกุลและผลิตโปรตีเอส เช่น เทอร์โมไลซิน ซึ่งเป็นเอนไซม์เมทัลโลโปรตีนเนสเป็นกลางที่ทนความร้อนได้ซึ่งส่งผลต่อสายโซ่โปรตีน C3 สายพันธุ์ที่ก่อให้เกิดโรคจับแฟคเตอร์ H (FH), โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับแฟคเตอร์ H 1 (FHR{3}}), โปรตีนคล้ายแฟคเตอร์ 1 (FHL{7}}), และโปรตีนการจับ C4b (C4BP) ทั้งหมด ซึ่งมีหน้าที่ในการยับยั้งระบบเสริม [55] มีสามกลยุทธ์หลักในการหลีกเลี่ยงเชื้อ Leptospira ที่ทำให้เกิดโรค [55,56] ผ่านการรบกวนของตัวควบคุมคอมพลิเมนต์ของโฮสต์ โปรตีเอสของโฮสต์ และโปรตีเอสของแบคทีเรีย สำหรับสารควบคุมเสริม Leptospira ใช้ Factor H (FH ซึ่งเป็นสารควบคุมของวิถีทางเสริมทางเลือก) และโปรตีนที่มีผลผูกพันกับ C4 (C4BP ซึ่งเป็นสารควบคุมของวิถีทางเสริมของคลาสสิกและเลคติน) เพื่อเร่งการสลายตัวของคอนเวอร์เตสของ C3 และยังทำหน้าที่เป็นปัจจัยร่วมของปัจจัย I สำหรับความแตกแยกของ C3b และ C4b [57,58] โปรตีนเลปโตสไปรัล (LcpA) ร่วมกับไวโตรเนกติน (Vn ซึ่งเป็นตัวควบคุมวิถีส่วนปลาย) จับกับ C9 และยับยั้งการเกิดพอลิเมอไรเซชัน [59] ดังนั้นจึงอาจขัดขวางการก่อตัวของเมมเบรนที่กระตุ้นการทำงานของเมมเบรน (MAC) [60] นอกจากนี้ Leptospira ที่ทำให้เกิดโรคยังจับโปรตีเอสของโฮสต์หลายชนิด เช่น Urokinase-type plasminogen activator (uPA) ที่กระตุ้นให้เกิด active plasmin [61] (serine protease) สำหรับการย่อย C3b, C4b และ C5 บนพื้นผิว Leptospira [62] นอกจากนี้ metalloproeases และ thermolysin ซึ่งเป็นโปรตีเอสของ Leptospira ภายนอกสามารถแยกและยับยั้งโปรตีนเสริมหลายชนิด (C2, C3, C4 และ Factor B) [60] การรวมกันของสารควบคุมเสริมจากโฮสต์และเลปโตสไปราที่ทำให้เกิดโรค ช่วยให้การตั้งอาณานิคมของแบคทีเรียในอวัยวะเป้าหมายของโฮสต์ง่ายขึ้น [63]

4.2. เลปโตสไปราและนิวโทรฟิล

ในระหว่างการติดเชื้อ Leptospira สายพันธุ์ที่ทำให้เกิดโรคจะกระตุ้นการกระตุ้นนิวโทรฟิลอย่างรุนแรงและการตอบสนองต่อการอักเสบ นิวโทรฟิลมีความสำคัญต่อการควบคุมจุลินทรีย์ แต่ก็มีส่วนทำให้เนื้อเยื่อในโฮสต์เสียหายด้วย มีการแสดงให้เห็นว่าการสะสมนิวโทรฟิลนอกเซลล์ในระดับต่ำเนื่องจากกิจกรรมของนิวโทรฟิลต่ำในการไหลเวียนจะทำให้โรคฉี่หนูเพิ่มขึ้น ซึ่งบ่งชี้ว่าการก่อตัวของการรับสมัครนิวโทรฟิลในหลอดเลือดอาจมีความสำคัญในการป้องกันการแพร่กระจายของเลปโตสไปราที่ทำให้เกิดโรคในระยะเริ่มแรก [64]

4.3. Leptospira และ Macrophages

ในระยะเริ่มแรกของการติดเชื้อเลปโตสไปรา มาโครฟาจมีบทบาทสำคัญในการกำจัดสไปโรเคต กลไกเอฟเฟกต์นี้ร่วมกับการตอบสนองของไซโตไคน์ที่มีประสิทธิภาพเกี่ยวข้องกับการควบคุมฟาโกไซติกและการแพร่กระจายของการติดเชื้อ แม้ว่า Leptospira spp. ได้รับการแสดงให้เห็นว่ากระตุ้นการตายของเซลล์ในมาโครฟาจผ่านทางวิถี Fas/FasL-caspase-8/-3 และอำนวยความสะดวกในการอยู่รอดและการแพร่กระจายของพวกมันในโฮสต์เนื่องจากการปล่อยอะพอพโทซิสและเอนโดนิวคลีเอสที่กระตุ้นไมโตคอนเดรียในผู้ติดเชื้อ มาโครฟาจ [65] มีการวิจัยล่าสุดเกี่ยวกับไมโครทรานสคริปโตมของมาโครฟาจที่ติดเชื้อเลปโตสไปรา เพื่อตรวจสอบกลไกอีพิเจเนติกส์ เช่น การควบคุมหลังการถอดรหัสโดย RNA ขนาดมหึมาที่ติดเชื้อ Leptospira แสดงให้เห็นว่า microRNAs (miRNAs) ได้รับการควบคุมโดยการติดเชื้อ spirochete ซึ่งแสดงให้เห็นว่ากฎระเบียบนี้มีความสำคัญอย่างยิ่งในการตอบสนองของเซลล์ระบบภูมิคุ้มกันเหล่านี้ในการติดเชื้อ Leptospira [66] ในมาโครฟาจของมนุษย์ การกระตุ้นการอักเสบที่เกิดจากออกซิเจนชนิดปฏิกิริยาและไลโซโซมอลคาเทซิน B ที่เกิดจากการติดเชื้อเลปโตสไปรามีระดับ NLRP3 และ IL-18 ที่โดดเด่น ซึ่งสนับสนุนการผลิต IL-1 และนำไปสู่ ความเป็นไปได้ของการเกิด phagocytosis และการสร้างแบบจำลองอย่างรวดเร็วของไซโตไคน์บางชนิดมีความสัมพันธ์กับความต้านทานต่อโรคเลปโตสไปโรซิส [67]

4.4. การตอบสนองทางร่างกายต่อ Leptospira

การตอบสนองของร่างกายต่อ Leptospira โดยเฉพาะนั้นมีลักษณะเฉพาะคือการผลิตแอนติบอดี IgM และ IgG ในวันที่สามของอาการ นอกจากนี้ มีการรายงานการผลิต IgA ตั้งแต่วันแรกจนถึงเดือนที่เก้าหลังการติดเชื้อ ในความเป็นจริง การเพิ่มขึ้นของ IgM ได้ถูกนำมาใช้เป็นทางเลือกในการวินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรซิสในระยะเริ่มแรก [68] ผลของการตอบสนองทางร่างกายในมนุษย์ที่เป็นโรคฉี่หนูทำให้สามารถวินิจฉัยทางเซรุ่มวิทยาหลังการติดเชื้อตามธรรมชาติได้ [69] สิ่งสำคัญที่สุดของการตอบสนองของร่างกายในการติดเชื้อเลปโตสไปราอาจเป็นการสร้างแอนติบอดีป้องกัน วัคซีนที่มีอยู่ในปัจจุบันสำหรับโรคฉี่หนูประกอบด้วยการเตรียมเซลล์โดยสมบูรณ์และมีข้อจำกัด เช่น ประสิทธิภาพต่ำ ผลข้างเคียงหลายประการ การสร้างความจำภูมิคุ้มกันต่ำ และการขาดการป้องกันข้ามสำหรับความแตกต่างของซีโรวาร์ ดังนั้นการพัฒนาวัคซีนใหม่ๆ จึงเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการควบคุมโรค และขณะนี้กำลังมีการวิจัยเพื่อผลิตวัคซีนจากการสร้างภูมิคุ้มกันทางพันธุกรรม [70] OMP ของ Leptospira ได้รับการพิจารณาว่าเป็นแอนติเจนซึ่งมีภูมิคุ้มกันที่ดีกว่าสำหรับ B lymphocytes ซึ่งรวมถึง epitopes ที่มีโครงสร้าง OmpL187- 98, OmpL1173-191, OmpL1297-320, LipL4130-48, LipL{ {9}} และ LipL41263-282 [71] เอพิโทปเหล่านี้มีแนวโน้มว่าจะเป็นตัวเลือกสำหรับการพัฒนาวัคซีนสากล

4.5. การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวต่อ Leptospira: ทีเซลล์และไซโตไคน์

เลปโตสไปราที่ทำให้เกิดโรคทำให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยอาศัย T และ B lymphocytes ร่วมกับการแสดงออกของไซโตไคน์ที่อาจเกี่ยวข้องกับแผนภูมิแรงโน้มถ่วง การกระตุ้นทีเซลล์ระหว่างการติดเชื้อเลปโตสไปราจะเริ่มต้นการตอบสนองต่อการอักเสบ โดยส่วนใหญ่ผ่านการผลิตไซโตไคน์ นี่เป็นสิ่งสำคัญในการกำจัดการติดเชื้อตั้งแต่เนิ่นๆ แต่การผลิตไซโตไคน์ที่ทำให้เกิดการอักเสบที่ไม่สามารถควบคุมได้ยังสามารถส่งผลให้เกิดการผลิตไซโตไคน์มากเกินไป ตามมาด้วยภาวะอิมมูโนอัมพาต ซึ่งอาจนำไปสู่ภาวะติดเชื้อและความล้มเหลวของหลายอวัยวะ ทีลิมโฟไซต์ผลิต IL-1, IL-6, IL-12, อินเตอร์เฟอรอน (IFN)- และ TNF- ซึ่งทำหน้าที่เป็นตัวดึงดูดคีโมเพื่อคัดเลือกเม็ดเลือดขาวในบริเวณที่มีการติดเชื้อ สิ่งที่น่าสนใจใน ex vivo เซลล์ naïve δ T แพร่กระจายในวัฒนธรรมของเซลล์โมโนนิวเคลียร์ในเลือดส่วนปลาย (PBMC) กระตุ้นด้วยแอนติเจนของ Leptospira พร้อมกับสร้างทั้ง IL-17 และ IFN [72] ยิ่งไปกว่านั้น ในขณะที่หนูพันธุ์ป่าที่ติดเชื้อเลปโตสไปโรซีสแสดงระดับไซโตไคน์จำนวนมากที่สูงกว่า รวมถึง IL-4, IL-10 และ IL-13 เมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่ไม่ติดเชื้อ แต่หนูหนูที่เกิดจากเลปโตสไปราแบบเรื้อรัง โรคไตอักเสบ (Daf1-/- หนู) แสดงการแสดงออกที่สูงขึ้นของแอคตินของกล้ามเนื้อเรียบ, IL-10, IL-13 แต่ไม่มีความแตกต่างของ IL-12 และ IL{{21} } ระดับ [73] ด้วยเหตุนี้ Daf1 และ IL-17 อาจมีบทบาทสำคัญในการป้องกันการลุกลามของ CKD เนื่องจากการเชื่อมโยงระหว่าง CKD ในหนูที่เกิดจาก Leptospira กับการเกิดพังผืดของไต [72,73] อย่างไรก็ตาม สมมติฐานของการตอบสนองของไซโตไคน์ที่เลือกสรรในการลุกลามของโรคยังไม่สามารถสรุปได้ในโรคเลปโตสไปโรซิสของมนุษย์จนถึงขณะนี้ ในผู้ป่วยโรคเลปโตสไปโรซิสขั้นรุนแรงและการมีส่วนร่วมของปอด ระดับ IL-6, CXCL8 และ IL-10 ที่เพิ่มขึ้นเมื่อเปรียบเทียบกับผู้ป่วยโรคเลปโตสไปโรซีสที่ไม่รุนแรง [53] ไซโตไคน์ที่มีความเข้มข้นสูงเหล่านี้ในผู้ป่วยโรคเลปโตสไปโรซิสเน้นย้ำถึงบทบาทสำคัญในการพัฒนาโรคเลปโตสไปโรซีสชนิดรุนแรง

ในผู้ป่วยที่ติดเชื้อรุนแรง จะพบ CD4+ T ลิมโฟไซต์ที่มีโปรไฟล์การอักเสบและผู้ผลิต IL-2 และ IFN- ในขณะที่ CD4+ CD25ผู้ผลิต IL สูง-10 เกือบจะขาดไปแล้ว กฎระเบียบของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยอาศัย T lymphocyte ไม่ได้ป้องกันความเสียหายของเนื้อเยื่อที่เกิดจากการตอบสนองต่อการอักเสบของเลปโตสไปรา ใน CD4+ T ลิมโฟไซต์ของมนุษย์ที่เป็นโรคเลปโตสไปโรซิสรุนแรง การผลิต TNF และไซโตไคน์ที่ทำให้เกิดการอักเสบอื่นๆ สูงกว่าในผู้ที่มีรูปแบบไม่รุนแรงของโรค ซึ่งบ่งชี้ว่าไซโตไคน์เหล่านี้สามารถใช้เป็นเครื่องหมายของ ความรุนแรงในระยะภูมิคุ้มกันของการติดเชื้อ [74] การผลิต IL-10 มีความเกี่ยวข้องกับความเสี่ยงต่อการเสียชีวิตในคนที่เป็นโรคเลปโตสไปโรซีส อย่างไรก็ตาม การศึกษาที่ดำเนินการกับมนุษย์ที่สัมผัสและไม่มีอาการเกี่ยวข้องกับการผลิตไซโตไคน์นี้กับการควบคุมการตอบสนองต่อการอักเสบและการอยู่รอด [74] ในระหว่างการติดเชื้อเลปโตสไปรา สารไกล่เกลี่ยการอักเสบและการทำงานของเซลล์เม็ดเลือดขาวบางชนิด เช่น ทีลิมโฟไซต์ จะถูกควบคุมอย่างรวดเร็วในผู้ที่ดื้อยา ตรงกันข้ามกับสิ่งที่เกิดขึ้นในบุคคลที่เป็นโรคเลปโตสไปโรซีสในรูปแบบรุนแรง [75]

โดยสรุป การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่อการติดเชื้อเลปโตสไปรายังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างสมบูรณ์ เนื่องจากพฤติกรรมทางคลินิกของผู้ป่วยโรคเลปโตสไปโรซีส ซึ่งมีปฏิสัมพันธ์กับปัจจัยความรุนแรงต่างๆ ของจีโนมของแบคทีเรีย ซึ่งทำให้เลปโตสไปรามีความสามารถในการก่อโรคที่มั่นคง

5. อาการทางคลินิก

อาการทางคลินิกของโรคเลปโตสไปโรซีสมีความหลากหลาย ตั้งแต่อาการไม่รุนแรงและไม่เฉพาะเจาะจง เช่น อาการคล้ายไข้หวัดใหญ่ (มีไข้ ปวดกล้ามเนื้อ และปวดศีรษะ) ไปจนถึงอาการรุนแรงร่วมกับการบาดเจ็บของอวัยวะระยะสุดท้าย (เช่น AKI ตับวายเฉียบพลัน และ diathesis เลือดออกหรือที่เรียกว่า Weil's syndrome), ไอเป็นเลือดเฉียบพลันจากเลือดออกในปอด, ความสับสนเฉียบพลันจากเยื่อหุ้มสมองอักเสบปลอดเชื้อ และภาวะหัวใจล้มเหลวเฉียบพลันจากกล้ามเนื้อหัวใจอักเสบเฉียบพลันหรือกึ่งเฉียบพลัน [7] ดังนั้น ตัวชี้วัดที่สงสัยว่าเป็นโรคเลปโตสไปโรซีส 3 ประการ ได้แก่ (i)โรคไข้เฉียบพลัน, (ii) อาการตัวเหลือง และ (iii)อาการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลัน[12]. ตัวพยากรณ์โรคเลปโตสไปโรซิสในรูปแบบรุนแรง ได้แก่ ปวดกล้ามเนื้ออย่างรุนแรงตั้งแต่เริ่มมีอาการ มีแนวโน้มเลือดออกรุนแรง และมีอาการดีซ่านอย่างเห็นได้ชัด ที่น่าสนใจก็คือการมีอยู่ของสิ่งที่มีอยู่ก่อนแล้วโรคไตเรื้อรัง(ขนาดไตเล็ก) หรือไตที่ขยายใหญ่ขึ้นและแออัดพร้อมกับเนื้องอกมีความสัมพันธ์กับผลลัพธ์ที่เลวร้ายที่สุด [12] ดังนั้นผู้ป่วยโรคไตที่เกิดจากโรคเลปโตสไปโรซีสจึงควรได้รับการรักษาอย่างทันท่วงที

6. การวินิจฉัย

6.1. การวินิจฉัยทางคลินิก

การวินิจฉัยโรคฉี่หนูขึ้นอยู่กับประวัติการสัมผัส ปัจจัยเสี่ยง และอาการทางคลินิก ความสงสัยที่มีดัชนีสูงสามารถหลีกเลี่ยงความเสียหายของอวัยวะในภายหลังได้ อย่างไรก็ตาม อาการของโรคเลปโตสไปโรซีสมักถูกเข้าใจผิดว่าเกิดจากสาเหตุอื่นของกลุ่มอาการไข้เฉียบพลัน เช่น การติดเชื้อไข้เลือดออก มาลาเรีย โรคตับอักเสบ และโรคภูมิต้านตนเองที่ออกฤทธิ์ การไม่มีสัญญาณทางพยาธิวิทยาของโรคฉี่หนูหมายความว่าการวินิจฉัยจะขึ้นอยู่กับการประเมินไข้และปวดกล้ามเนื้อในผู้ป่วยจากพื้นที่ระบาด ด้วยเหตุนี้ การตรวจวินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรซีสในห้องปฏิบัติการจึงเป็นสิ่งจำเป็น

6.2. การวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการ

โรคเลปโตสไปโรซีสวินิจฉัยได้ยากในห้องปฏิบัติการ โดยเฉพาะในระยะเฉียบพลัน สามารถทำได้โดยการระบุสไปโรเชตหรือส่วนประกอบของสไปโรเชตโดยตรงในของเหลวหรือเนื้อเยื่อในร่างกาย การแยกเลปโตสไปร์ในการเพาะเลี้ยง หรือการตรวจหาแอนติบอดีเฉพาะตลอดระยะทางคลินิกต่างๆ โรคเลปโตสไปโรซีสแยกแยะได้ยากจากโรคต่างๆ เช่น มาลาเรีย ไข้เลือดออก ริกเก็ตเซีย ไข้หวัดใหญ่ ตับอักเสบ และไข้เหลือง เนื่องจากมีลักษณะทางคลินิกที่คลุมเครือ ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีการทดสอบในห้องปฏิบัติการเพื่อยืนยันการวินิจฉัย การตรวจหาแอนติบอดีต่อเลปโตสไปร์ เลปโตสไปร์เอง หรือกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิกเป็นพื้นฐานสำหรับการทดสอบเหล่านี้ (DNA) การวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการในปัจจุบันมีทั้งการระบุโดยตรง (การตรวจหา Leptospira spirochetes หรือ DNA ในตัวอย่างหรือการแยกสิ่งมีชีวิตออกจากสิ่งส่งตรวจ) และการตรวจจับทางอ้อม (การวินิจฉัยทางซีรั่มวิทยาหรือวิทยาทางเซรุ่มวิทยาเพื่อระบุการติดเชื้อ Leptospiral ซึ่งอาศัยการตรวจหาแอนติบอดีจำเพาะต่อแอนติบอดีต่างๆ แอนติเจนของ Leptospiral) (ตารางที่ 1)

6.2.1. การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์โดยตรง การเพาะเลี้ยง และการตรวจหาแอนติเจน

เลปโตสไปร์เป็นเกลียวที่บาง สว่าง และเคลื่อนที่ได้อย่างแข็งขัน โดยมีลักษณะการหมุนอย่างรวดเร็ว (การเคลื่อนไหวกระตุก) ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ดาร์กฟิลด์แบบธรรมดา (DFM) และเลปโตสไปร์ประมาณ 10 มิลลิลิตร/มิลลิลิตร จำเป็นสำหรับการตรวจจับหนึ่งเซลล์ต่อสนาม เมื่อระยะเวลาของการติดเชื้อนานขึ้นหนึ่งสัปดาห์ ทำให้ผลผลิตของ DFM เสียชีวิตประมาณ 10% (จาก 100 เป็น 90%) เพื่อเพิ่มความไววิธีการย้อมสีพิเศษหลายวิธี การย้อมสี Warthin– Starry silver [76] และการสร้างภูมิคุ้มกัน (immunohistochemistry, immunofluorescence, immunomagnetic antigen capture และการย้อมสี immunoperoxidase [77]) ที่ต้องใช้แอนติบอดีปฐมภูมิจำเพาะของ serovar (แยกหรือรวมกัน)

ตารางที่ 1. การทดสอบทางห้องปฏิบัติการเพื่อวินิจฉัยโรคฉี่หนู

LAMP, การขยายความร้อนใต้พิภพแบบพึ่งสื่อกลาง; PCR ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส NGS, การหาลำดับยุคหน้า; IHA, การเกิดเม็ดเลือดแดงโดยอ้อม; ELISA การทดสอบอิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ IgM, อิมมูโนโกลบูลินเอ็ม; MAT การทดสอบการเกาะติดกันด้วยกล้องจุลทรรศน์ MCAT การทดสอบการเกาะติดกันของไมโครแคปซูล DNA, กรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก; DFM กล้องจุลทรรศน์สนามมืด

ในขณะเดียวกัน การเพาะเชื้อเลปโตสไปราจากเลือด ปัสสาวะ น้ำไขสันหลัง และเนื้อเยื่อชิ้นเนื้อสามารถทำได้ในช่วงสองสามวันแรกถึง 10 วันหลังเริ่มมีอาการ (ระยะโรคเลปโตสไปโรซิส) เนื่องจากพวกมันเติบโตช้า (ใช้เวลาสองเท่า 6-8 ชั่วโมง) จู้จี้จุกจิก และมีแนวโน้มที่จะเกิดการปนเปื้อน ตัวอย่างการเพาะเลี้ยงจะต้องเก็บไว้อย่างน้อย 3-4 เดือนก่อนที่จะถูกทิ้งเป็นผลลบ) โดยมีความไวเพียง 23% แต่จำเป็น การทดสอบความไวต่อยา [6] ด้วยเหตุนี้ EMJH (Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris) media (oleic albumin complex) ประกอบด้วย bovine Serum albumin (เศษส่วน V), Tween 80, แอมโมเนียมคลอไรด์ไทอามีน, โมโนโพแทสเซียมฟอสเฟต, ไดโซเดียมฟอสเฟต และสารอาหารต่างๆ [78] มากที่สุด ที่ใช้กันทั่วไป ในขณะที่สื่อ T80/40/LH เฉพาะทางมากขึ้น (โพลีซอร์เบต 40, แลคตาบูมิน ไฮโดรไลเซต, ซูเปอร์ออกไซด์ ดิสมิวเตส และเซรั่มกระต่าย) จำเป็นสำหรับซีโรวาร์บางชนิด [79] สำหรับการแยกเลปโตสไปร์ที่ทำให้เกิดโรคขนาดใหญ่และหลากหลายในเบื้องต้น Hornsby–Alt–Nally (HAN) ดูเหมือนจะเป็นสื่อที่ดี [80]

การตรวจหาแอนติเจนของ Leptospiral โดยอิมมูโนเพอรอกซิเดส อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ หรือระบบการจับแอนติเจนของอิมมูโนแมกเนติกได้รับการพัฒนาสำหรับตัวอย่างที่มีภาระแบคทีเรียต่ำหรือด้วยกล้องจุลทรรศน์สนามมืดไม่สามารถนำมาใช้ได้ แต่ไม่ได้ดำเนินการเป็นประจำเนื่องจากข้อจำกัดของแอนติบอดีปฐมภูมิ [77] ในทางตรงกันข้าม การจดจำกรดนิวคลีอิกด้วยการขยาย DNA ใหม่ ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) (เช่น Nested-PCR, PCR เชิงปริมาณ [qPCR]), การขยายความร้อนใต้พิภพโดยใช้ลูปเป็นสื่อกลาง (LAMP) และลำดับถัดไป (NGS) มีประโยชน์สำหรับการวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการตั้งแต่เนิ่นๆ และแม่นยำ โดยเฉพาะอย่างยิ่งกับ การแยกเชื้อ Leptospira โดยใช้การเพาะเชื้อทางชีววิทยาและการผสมพันธุ์ DNA (การตรวจ DNA) [81,82] สามารถขยายเป้าหมาย Leptospiral ที่หลากหลาย (เช่น 16S ribosomal RNA) หรือ DNA เพื่อการวินิจฉัย [83] และ PCR แบบเรียลไทม์ (RT-PCR) มีความไวและเฉพาะเจาะจงมากกว่า PCR มาตรฐาน [84] เนื่องจากไพรเมอร์ RT-PCR บางตัวอาจเชื่อมโยงกับตำแหน่งที่ไม่เฉพาะเจาะจง ซึ่งนำไปสู่ผลลัพธ์ที่ผิดพลาด การตรวจ PCR แบบเรียลไทม์แบบเรียลไทม์ล่าสุดจึงได้รับการพัฒนาโดยใช้ไพรเมอร์สองชุด [85] Nested PCR ยังช่วยในการตรวจจับตำแหน่ง DNA ที่เฉพาะเจาะจงและละเอียดอ่อนมากขึ้นด้วยชุดไพรเมอร์เพิ่มเติม [86,87] อย่างไรก็ตาม แนวโน้มในปัจจุบันสำหรับการวินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรซีสคือการใช้ทั้งเทคนิคทางซีรัมวิทยาและโมเลกุล เช่น PCR และ ELISA (ง่ายกว่า MAT ทางเซรุ่มวิทยามาตรฐานทองคำ) สำหรับประเทศที่มีทรัพยากรจำกัด [88,89] นอกจากนี้ เทคนิค LAMP [90] เพื่อตรวจหายีน 16S rRNA (rrs) เป็นวิธีที่คุ้มค่า รวดเร็ว และให้ผลตอบแทนสูงในการตรวจหาเลปโตสไปร์ที่ทำให้เกิดโรคในปัสสาวะ ปัจจุบัน NGS เป็นวิธีการที่ไม่ขึ้นกับวัฒนธรรมที่มีความแม่นยำมากที่สุดในการวิเคราะห์จีโนมหลักในของเหลวในร่างกาย (เลือดและปัสสาวะ) [91] และทิศทางในอนาคตของการทดสอบโรคเลปโตสไปโรซีสคือการมุ่งไปสู่การจำแนกระดับโมเลกุลของเลปโตสไปร์ ซึ่งเอาชนะข้อจำกัดของ การแยกเชื้อเลปโตสไปร์ออกจากตัวอย่างทางคลินิก ดังนั้นคุณค่าของ PCR ในการวินิจฉัยทางคลินิกของโรคเลปโตสไปโรซีสจึงเป็นสิ่งที่ดีเป็นพิเศษ และมีเทคนิคสมัยใหม่หลายอย่างเกิดขึ้น

6.2.2. การตรวจหาแอนติบอดีต่อต้านเลปโตสไปรา

มีการใช้การวินิจฉัยทางเซรุ่มวิทยาหลายอย่าง ตัวอย่างเช่น การทดสอบแอนติบอดีจำเพาะสกุล (การเกิดเม็ดเลือดแดงโดยอ้อม [IHA] การทดสอบอิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ [ELISA] Lepto Dri Dot [การเกาะติดของน้ำยาง] การเกาะติดกันของไมโครแคปซูล [MCAT]) และการทดสอบแอนติบอดีจำเพาะของซีโรวาร์ (การทดสอบการเกาะติดกันด้วยกล้องจุลทรรศน์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ [ เสื่อ]) [92,93]. ด้วยเหตุนี้ เกณฑ์ MAT สำหรับการวินิจฉัยคือ (i) การไตเตรทที่เพิ่มขึ้นสี่เท่าในซีรั่มคู่ (การเปลี่ยนแปลงของซีรั่มของการติดเชื้อในปัจจุบัน) หรือ (ii) การไทเทอร์สูงเพียงครั้งเดียว ( มากกว่าหรือเท่ากับ 1:400 หรือ 1:800 ซึ่งสูงกว่าในการแพร่ระบาด พื้นที่) (ภาวะติดเชื้อ) (แอนติบอดีอาจคงอยู่ได้ระยะหนึ่งหลังการติดเชื้อหรือปฏิกิริยาข้ามกับโรคอื่น ๆ) นอกจากนี้ MAT ยังต้องการแผงแสดงสดของซีโรวาร์ Leptospira ทั้งหมดในภูมิภาค พร้อมด้วยแผงซีโรวาร์ที่ได้มาตรฐานในท้องถิ่น [93,94] ตามองค์การโลกเพื่อสุขภาพสัตว์ (ตัวแทนแอนติเจน 19 รายการจาก 15 ซีโรกรุ๊ป) [95] เนื่องจากตรวจพบแอนติบอดีได้ภายใน 5-7 วันหลังการติดเชื้อ การทดสอบ MAT จึงเป็นลบ (ไทเทอร์ < 1:50) ในช่วง 2-3 วันแรกของการติดเชื้อ การวินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรซิสสามารถทำได้โดยตัวอย่างปัสสาวะ [96] โดยใช้ทั้งซีรัมวิทยาและการตรวจจับระดับโมเลกุล (16S rRNA) โดยเฉพาะในผู้ป่วยที่ติดเชื้อเมื่อเร็วๆ นี้ (MAT มากกว่าหรือเท่ากับ 1:800 หรือ ELISA IgM-positive หรือทั้งสองอย่าง) [97] .

ด้วยทรัพยากรที่จำกัด คะแนนการทำนายทางคลินิก [98] ขึ้นอยู่กับประวัติทางคลินิกที่เกี่ยวข้องและการทดสอบในห้องปฏิบัติการที่เกี่ยวข้อง โดยมีการให้คะแนนใน 7 ด้านดังนี้ ความดันเลือดต่ำ (3) โรคดีซ่าน (2) อาการปวดกล้ามเนื้อ (2) AKI (1.5) , ฮีโมโกลบินต่ำ (3), ภาวะโพแทสเซียมในเลือดต่ำโดยมีภาวะโซเดียมในเลือดต่ำ (3) และนิวโทรฟิเลีย (1) ได้รับการเสนอ (คะแนนสรุปจุดตัดที่ 4 มีพื้นที่ใต้เส้นโค้งลักษณะการทำงานของตัวรับ {{10}}.78 ( 95% CI 0.68–0.89) สำหรับการวินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรซิส [77]) คะแนนความน่าจะเป็นของ Thai-Lepto-on-admission นี้อาจเป็นเครื่องมือในการวินิจฉัยโรคฉี่หนูในระยะแรกโดยสันนิษฐานในผู้ป่วยที่มีอาการต้องสงสัยทางคลินิกขั้นรุนแรง