Rapamycin ปรับเปลี่ยนการเปลี่ยนแปลงของไมโตคอนเดรียในเซลล์เดนไดรต์เพื่อลดการบาดเจ็บที่ไต
Feb 22, 2022
เชิงนามธรรม:เซลล์เดนไดรต์ (DCs) เป็นเซลล์ภูมิคุ้มกันที่มีลักษณะเฉพาะที่สามารถเชื่อมโยงการตอบสนองของภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติและแบบปรับตัวได้ และอิมมูโนเมตาบอลิซึมส่งผลกระทบอย่างมากต่อฟีโนไทป์ของพวกมัน ราพามัยซินเป็นสารประกอบแมคโครไลด์ที่ทำหน้าที่กดภูมิคุ้มกัน และใช้เพื่อป้องกันการสูญเสียการรับสินบนในการปลูกถ่ายไต การศึกษาในปัจจุบันได้ประเมินศักยภาพในการรักษาของดีซีที่ได้รับการบำบัดด้วย rapamycin แบบ ex-vivo เพื่อป้องกันไตในรูปแบบเมาส์เฉียบพลันไตบาดเจ็บ (อากิ). สำหรับการบำบัดด้วยราพามัยซินเดี่ยว (S) (ราปา-S-DC), Veh-DC ถูกบำบัดด้วยราพามัยซิน (10 นาโนกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงก่อน LPS ในทางตรงกันข้าม การบำบัดด้วยราพามัยซินมัลติเพิล (M) (Rapa-M-DC) ได้รับการบำบัด 3 ครั้งใน 7 วัน มีเพียงการบำบัดด้วยราพามัยซินใน ex-vivo หลายครั้งของ DCs เท่านั้นที่กระตุ้นให้เกิดโปรแกรมเมตาบอลิซึมของไมโตคอนเดรียอย่างต่อเนื่อง DC เหล่านี้มีไมโตคอนเดรียมากกว่า 18- เท่า มีอัตราการใช้ออกซิเจนสูงขึ้นเกือบ 4- เท่า และสร้าง ATP มากขึ้นเมื่อเทียบกับ Veh-DC (DC ที่ควบคุมโดย Veh) การวิเคราะห์วิถีแสดงให้เห็นการส่งสัญญาณของ IL10 เป็นวิถีทางที่มีส่วนสำคัญสู่อิมมูโนฟีโนไทป์ที่เปลี่ยนแปลงหลังการบำบัดด้วยราพามัยซินเมื่อเปรียบเทียบกับกระสายยาที่มีไซโตไคน์ต่ำกว่า Tnfa, Il1b และ Il6 อย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่สารควบคุมของเนื้อหายล Pgc1a, Tfam และ Ho1 ยังคงสูงขึ้น ที่สำคัญ การถ่ายโอน DC ที่ได้รับการรักษาด้วย rapamycin ไปยังผู้รับ WT เป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนทวิภาคีไตการขาดเลือดขาดเลือดได้รับการปกป้องอย่างมีนัยสำคัญไตจากการบาดเจ็บที่มีนัยสำคัญ3-ดีขึ้นเท่าตัวในการทำงานของไต. สุดท้าย การให้ DCs ที่มีจำนวน mitochondria สูงกว่า (ได้รับการรักษา ex-vivo ด้วย mitochondria ที่แยกออกมาอย่างมีสุขภาพดี (10 µg / mL) เมื่อวันก่อน) ยังป้องกันบางส่วนไตจากไออาร์ไอ การศึกษาเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการแช่ pre-emptive ของ DCs reprogrammed ex-vivo ที่มีเนื้อหา mitochondria สูงกว่ามีความสามารถในการรักษาเพื่อกระตุ้นฟีโนไทป์ของกฎระเบียบในการต่อต้านการอักเสบเพื่อปกป้องไตจากอาการบาดเจ็บ
คำสำคัญ:เซลล์เดนไดรต์; ราพามัยซิน; ไมโตคอนเดรีย; อาการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลัน การบาดเจ็บจากการกลับเป็นซ้ำของการขาดเลือด
บทนำพยาธิวิทยาเฉียบพลันไตบาดเจ็บมีหลายปัจจัยและเกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์ที่ซับซ้อนระหว่างไตเซลล์เนื้อเยื่อและเซลล์ภูมิคุ้มกัน [1,2] ในไต,เซลล์เดนไดรต์ธรรมดา (DCs) เป็นเซตย่อยของเซลล์ภูมิคุ้มกันที่สำคัญ และพบอย่างใกล้ชิดในพื้นที่คั่นระหว่างหน้าไต[3–5]. DCs เป็นหนึ่งในเซลล์หลักที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดและมีความจำเป็นในการป้องกันเชื้อโรค งานที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ของเราโดยใช้ DCs ที่ได้จากไขกระดูกได้แสดงให้เห็นว่าการบำบัดด้วย DCs สามารถควบคุมการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติและแบบปรับตัวต่างๆ ที่เกี่ยวข้องกับ AKI [6,7]
DCs ตั้งอยู่อย่างกว้างขวางทั่วเนื้อเยื่อทั้งหมด โดยมีชุดย่อยของ DCs (CD11c บวก DCs) อยู่ในไตพาเรงคิมา อย่างไรก็ตาม CD11c plus DCs เหล่านี้ยังมีบทบาทในการทำให้เกิดโรคในการเลวลงอาการบาดเจ็บที่ไตหลังการบาดเจ็บจากการขาดเลือดขาดเลือด (IRI) [8] IRI ถูกกำหนดให้เป็นการบาดเจ็บที่เกิดจากการนำเลือดที่มีออกซิเจนกลับคืนไปยังอวัยวะหนึ่งหลังจากช่วงเวลาของภาวะขาดเลือดขาดเลือด และมักพบในกล้ามเนื้อหัวใจตาย โรคหลอดเลือดสมอง และการปลูกถ่ายอวัยวะที่เป็นของแข็ง เพื่อตอบสนองต่อ IRI, CD11c บวก DCs ประกอบรวมด้วยส่วนสำคัญของการแทรกซึมของเซลล์อักเสบในไตเนื้อเยื่อ.
DC สามารถรับรู้รูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับเชื้อโรค (PAMPs) ผ่านตัวรับการรู้จำรูปแบบต่างๆ ที่ตั้งอยู่บนพื้นผิวของ DC เช่น ตัวรับค่าโทร (TLR) และตัวรับที่เหมือน NOD การจับตัวรับการรู้จำรูปแบบ (PRR) กับ PAMPs จำเพาะของพวกมันส่งผลให้เกิดการกระตุ้นของวิถีทางต่างๆ ซึ่งรวมถึงการตอบสนองของการอักเสบ การสังเคราะห์เปปไทด์ต้านจุลชีพ และการเหนี่ยวนำภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวที่อาศัยลิมโฟไซต์ [9] การวิจัยที่สำคัญได้ทุ่มเทให้กับการศึกษาการเปลี่ยนแปลงในพลังงานชีวภาพของเซลล์ของ DCs เมื่อเปิดใช้งานโดย PAMPs มีการพิสูจน์แล้วว่าการกระตุ้น DCs ด้วย lipopolysaccharide (LPS; PAMP ที่แตกต่างจากแบคทีเรีย gramnegative) โดยการจับกับตัวรับ TLR4 ที่จำเพาะทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญจากปฏิกิริยาออกซิเดชันฟอสโฟรีเลชั่นที่มีประสิทธิภาพสูงไปเป็นกระบวนการที่คล้ายกับการเผาผลาญของ Warburg หรือ glycolysis แบบแอโรบิก . เมแทบอลิซึมของ Warburg มีลักษณะเฉพาะโดยการเปลี่ยนไพรูเวตที่เกิดจากไกลโคไลซิสไปสู่การแปลงเป็นแลคเตทเพื่อการผลิตพลังงาน และอยู่ห่างจากการขนส่งไปยังไมโตคอนเดรียเพื่อผ่านกระบวนการแคแทบอลิซึมผ่านวงจร TCA แม้ว่าจะมีออกซิเจนเพียงพอก็ตาม คำอธิบายหนึ่งสำหรับปรากฏการณ์นี้เกี่ยวข้องกับผลกระทบปลายน้ำจำนวนมากของการเปิดใช้งาน TLR4 ซึ่งเป็นกิจกรรมที่เพิ่มขึ้นของซีรีน/ทรีโอนีนไคเนสที่เป็นเป้าหมายของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมของราพามัยซิน (mTOR) การยับยั้ง mTOR โดย rapamycin ช่วยรักษาหน้าที่ของไมโตคอนเดรียใน DC ที่ถูกกระตุ้นโดยการปรับลด iNOS โดยที่ DC ที่บำบัดด้วย rapamycin จะถูกกระตุ้นเมื่อมี LPS แสดงระดับของไกลโคไลซิสแบบแอโรบิกที่ลดลง [10] ปัจจุบันสารยับยั้ง mTORC1 เช่น rapamycin ถูกใช้ในการปลูกถ่ายอวัยวะที่เป็นของแข็งซึ่งเป็นทางเลือกที่เป็นไปได้สำหรับสารยับยั้ง calcineurin เพื่อหลีกเลี่ยงอาการเรื้อรังไตความเสียหายของ allograft เนื่องจากมีศักยภาพที่จะขยาย CD4 บวก CD25 บวก T-cells ตามกฎ [11,12] อย่างไรก็ตาม การใช้ราพามัยซินในการปลูกถ่ายอาจนำไปสู่ภาวะแทรกซ้อนจากการอักเสบซึ่งรวมถึงอาการบวมน้ำที่บริเวณรอบข้าง การเพิ่มขึ้นของครีเอตินิน และภาวะเกล็ดเลือดต่ำ การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่าผลข้างเคียงของสิ่งเร้าที่ขาดออกซิเจนได้รับการปรับปรุงโดยการสัมผัส LPS และลดทอนโดยราพามัยซิน [8,13]
เป้าหมายคือการพัฒนาวิธีการใช้ยาระดับคลินิกที่ได้รับการอนุมัติจาก FDA เช่น Rapamycin เพื่อกระตุ้น DCs ด้านกฎระเบียบที่สามารถควบคุมการตอบสนองภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติและการปรับตัวที่ไม่ต้องการ จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้คือการกำหนดกลไกการป้องกันที่เป็นไปได้ของ BMDC ที่กระตุ้นด้วยราพามัยซินในแบบจำลองเมาส์พรีคลินิกของไตไออาร์ไอ การรักษา BMDCs ex-vivo ด้วย rapamycin จะช่วยหลีกเลี่ยงผลกระทบที่ไม่พึงประสงค์ที่อยู่นอกเป้าหมายและภาวะแทรกซ้อนจากการอักเสบที่เกี่ยวข้องกับการฉีดยาทั่วร่างกาย ปริมาณและระยะเวลาที่เหมาะสมของสารประกอบทางเภสัชวิทยาหรือยาส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับพารามิเตอร์ต่างๆ ในเซลล์มะเร็ง ราปามัยซินขนาดต่ำเมื่อเทียบกับขนาดสูงจะยับยั้ง mTORC1 และ mTORC2 อย่างแตกต่างกัน ส่งผลให้เกิดการยับยั้งการลุกลามของวัฏจักรเซลล์บางส่วนหรือทั้งหมด [14] สำหรับการศึกษาการปรับสภาพ BMDC ในอดีตของเราทั้งหมดในต้นฉบับปัจจุบัน เราเลือกราพามัยซินขนาดต่ำ 10 ng/mL โดยอิงจากการศึกษาที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้กับ BMDC ที่ทนต่อการแพ้ [15,16] ระยะเวลาของจำนวนโดส (สามหรือหนึ่ง) ขึ้นอยู่กับงานที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ของเราด้วยการขยายพันธุ์ BMDC ของเมาส์และเพิ่มด้วย GMCSF [17,18] ข้อมูลปัจจุบันของเราแสดงให้เห็นว่าทั้งการบำบัด DC แบบครั้งเดียวและหลายครั้งด้วยราพามัยซินทำให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่แข็งแกร่งน้อยกว่า (ไซโตไคน์ที่ต่ำกว่าและโมเลกุลที่กระตุ้นร่วมกัน) หลังจากการกระตุ้น LPS การถ่ายโอน rapamycin เดียวหรือหลายตัวที่ได้รับการรักษาด้วย DCs จะปกป้องอย่างเท่าเทียมกันไตจาก IRI ใน syngeneic (C57BL/6 BMDC→C57BL/6 หนูเมาส์) หรือ allogeneic (BALB/c BMDC→C57BL/6 หนูเมาส์) ของ IRI อย่างไรก็ตาม การบำบัดภายนอกร่างกายหลายครั้งด้วยราพามัยซิน (การรักษา 3 ครั้งใน 7 วัน) นอกเหนือจากการลดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันแล้ว ยังเพิ่มจำนวนไมโตคอนเดรียและการทำงาน (เครื่องวิเคราะห์ม้าน้ำ) เมื่อเทียบกับ DC ที่บำบัดด้วยกระสายยา การสังเกตจากการทดลองเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า DC ที่มีจำนวนไมโตคอนเดรียสูงกว่ามีศักยภาพที่จะกลายเป็นกฎข้อบังคับ และการถ่ายโอนเหล่านี้ DCs อาจปกป้องไตจากการบาดเจ็บจากการขาดเลือด จากการศึกษาล่าสุดของเราโดยใช้ DCs ที่บำบัดด้วย FTY720 แสดงให้เห็น [18] การปลูกถ่ายทางเภสัชวิทยาหรือไมโตคอนเดรียที่กระตุ้นจำนวนไมโตคอนเดรียในเซลล์ภูมิคุ้มกันที่สูงขึ้น (DCs หรือมาโครฟาจ) ยังทำให้เซลล์เหล่านี้มีฟีโนไทป์ที่ต้านการอักเสบ ซึ่งอาจเป็นผลจากการบำรุงรักษาไมโตคอนเดรีย ออกซิเดชันฟอสโฟรีเลชั่น (OXPHOS) และลดการเปลี่ยนเป็นไกลโคไลซิสเพื่อพลังงานหลังการกระตุ้น สำหรับผลกระทบเหล่านี้ เราได้เพิ่มจำนวนไมโตคอนเดรียจากภายนอกใน DC เพื่อทดสอบว่าจำนวนไมโตคอนเดรียที่สูงขึ้นสามารถกระตุ้นฟีโนไทป์ควบคุมโดยใช้การปลูกถ่ายไมโตคอนเดรีย การถ่ายโอน Mito-DC เหล่านี้ได้รับการคุ้มครองไตจาก IRI; อย่างไรก็ตาม ไม่เหมือนกับ Rapa-DCs Mito-DCs เหล่านี้ไม่มีการตอบสนองทางอิมมูโนเจนิกที่ลดลง (MHCII, โมเลกุลที่กระตุ้นร่วมและไซโตไคน์) หลังจากการกระตุ้น LPS ซึ่งอาจบ่งชี้ว่าจำนวนสำเนาของไมโตคอนเดรียที่เพิ่มขึ้นสามารถแทนที่การเปลี่ยนแปลงการทำงานที่เกิดจากการกระตุ้น LPS จากภายนอกได้ ในการศึกษานี้และดังที่ได้แสดงให้เห็นก่อนหน้านี้ [6,7,18] DCs ที่ฉีดอย่างเป็นระบบ (ที่บำบัดด้วยรถยนต์, ราพามัยซิน- หรือไมโทคอนเดรีย) ที่ขนาดครึ่งล้านจะพบได้เฉพาะในม้ามเท่านั้น และพบสัญญาณเพียงเล็กน้อยหรือไม่มีเลย ในไต. ในม้ามเช่น FTY720-DCs DC ที่อุดมด้วย rapamycin และ mitochondria อาจกระตุ้นการตอบสนองต่อการต้านการอักเสบซึ่งส่งผลให้มีการป้องกันไตไออาร์ไอ ผลการวิจัยจากเชื้ออสุจิเหล่านี้ให้หลักฐานใหม่ที่ชี้ให้เห็นถึงการเพิ่มจำนวนไมโตคอนเดรีย (จากภายนอกโดยการปลูกถ่ายไมโตคอนเดรียหรือโดยการแทรกแซงทางเภสัชวิทยา (FTY720 หรือราพามัยซิน)) ในเซลล์ภูมิคุ้มกันอาจเป็นวิธีการรักษาแบบใหม่เพื่อควบคุมการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในท้ายที่สุดเพื่อการป้องกันและ/หรือการรักษาในระยะเริ่มต้นอาการบาดเจ็บที่ไต
วัสดุและวิธีการ
หนูขั้นตอนและการจัดการสัตว์ทั้งหมดดำเนินการตามแนวทางของ National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals และหมายเลขโปรโตคอล Bajwa UTHSC 18-080 วันที่อนุมัติ 09/28/2018 ได้รับการอนุมัติจาก University of ศูนย์วิทยาศาสตร์สุขภาพเทนเนสซี (UTHSC) คณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของสถาบัน นโยบายการดูแลสัตว์ในห้องปฏิบัติการเป็นไปตามนโยบายการบริการสาธารณสุขว่าด้วยการดูแลอย่างมีมนุษยธรรมและการใช้สัตว์ทดลอง ผลลัพธ์ทั้งหมดได้รับการรายงานในลักษณะที่สอดคล้องกับแนวทาง ARRIVE [19] สำหรับการศึกษาการถ่ายโอนทั้งหมด C57BL/6J และ BALB/c หนูที่ซื้อมาจากห้องปฏิบัติการ Jackson (Bar Harbor, ME, USA) หนูได้รับการบำรุงรักษาในเรือนเพาะชำแบบ vivarium แบบมาตรฐานโดยมีวงจรแสง/มืดเป็นเวลา 12-ชม. บนอาหารเชาและน้ำมีให้ใช้อย่างอิสระ
ภาวะไตขาดเลือด - การบาดเจ็บซ้ำ มีการปฏิบัติตามขั้นตอนการผ่าตัดโดยละเอียดทั้งหมดตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ [18] หนูเมาส์ C57BL/6 เพศผู้ (อายุ 8-12 สัปดาห์) ได้รับภาวะขาดเลือดขาดเลือดทวิภาคี 26-นาที ตามด้วยการเกิดซ้ำ 20-24 ชั่วโมง Brieflfly หนูตัวผู้ทุกตัวได้รับการดมยาสลบด้วยการฉีดสารคีตามีนและไซลาซีนในช่องท้อง (ip) ด้วยการฉีด buprenorphine ใต้ผิวหนังและวางบนแผ่นอุ่นเพื่อรักษาอุณหภูมิของร่างกายที่ 34.5–36 ◦C จากนั้นหนูจะถูกสุ่มให้อยู่ในสภาวะการทำงานหลอกหรือ IRI ได้ทำการผ่าตัดผ่าปีกนกทั้งสองข้าง อุณหภูมิของร่างกายได้รับการตรวจสอบและรักษาตลอดระยะเวลาขาดเลือด หนูที่ถูกโกนขนได้ผ่านขั้นตอนเดียวกัน ยกเว้นการยึดหลอดเลือดและการปิดแผลผ่าตัด หนูที่มีหนึ่งไตโดยไม่มีการเกิดซ้ำ 24 ชั่วโมงหลังจากขาดเลือดขาดเลือดถูกแยกออกจากการวิเคราะห์ทั้งหมด
การประเมินการทำงานของไตและจุลพยาธิวิทยาเก็บเลือดภายใต้การดมยาสลบจากไซนัส retro-orbital และกำหนด creatinine ในพลาสมา (mg/dL) โดยใช้วิธีการทางเอนไซม์ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยจากโปรโตคอลของผู้ผลิต (Diazyme Laboratories, Poway, CA, USA) และไนโตรเจนในเลือดในปัสสาวะ (BUN ) และการวัดครีเอตินีนดำเนินการโดยใช้ QuantiChrom Urea Assay Kit (DIUR-100, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [18,20] สำหรับเนื้อเยื่อวิทยาไตถูกตรึงค้างคืนใน PLP 4 เปอร์เซ็นต์หรือฟอร์มาลิน 10 เปอร์เซ็นต์และฝังในพาราฟินไตถูกเตรียมสำหรับการย้อมสี H&E ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [18] และถ่ายภาพด้วยการปรับความสว่าง/ความคมชัดด้วยกล้องจุลทรรศน์ EVOS (Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, USA) สำหรับการหาปริมาณของคะแนนการบาดเจ็บที่ท่อ ภาคส่วนได้รับการประเมินโดยการนับเปอร์เซ็นต์ของท่อที่แสดงเนื้อร้ายของเซลล์ การสูญเสียขอบแปรง การก่อตัวหล่อ และการขยายท่อดังต่อไปนี้: 0=ปกติ; 1=น้อยกว่าหรือเท่ากับ 10 เปอร์เซ็นต์ ; 2=10 ถึง 25 เปอร์เซ็นต์ ; 3=26 ถึง 50 เปอร์เซ็นต์ ; 4=51 ถึง 75 เปอร์เซ็นต์ ; 5=มากกว่าหรือเท่ากับ 75 เปอร์เซ็นต์ ห้าถึง 10 ฟีฟิลด์จากแต่ละเมดัลลาชั้นนอกแต่ละอันได้รับการประเมินและให้คะแนนในลักษณะที่มืดบอด การเปลี่ยนแปลงทางเนื้อเยื่อวิทยาถูกแสดงเป็นเนื้อร้ายท่อเฉียบพลัน (ATN) ได้คะแนนตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [7,21] เซลล์ Apoptotic ตรวจพบโดย TUNEL assay (In Situ Cell Death Detection kit, TMR Red; Roche, Basel, Switzerland) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
ไขกระดูก (BM) - การเพาะเลี้ยงเซลล์เดนไดรต์ที่ได้รับมา (DC) และการถ่ายโอนที่นำมาใช้หนูเมาส์ C57BL/6J หรือ BALB/c WT เพศผู้อายุ 8–1 สัปดาห์0 สัปดาห์ถูกใช้เพื่อสร้าง DC จากสารตั้งต้น BM ทั้งหมด [22] ส่วนลอยเหนือตะกอนที่อุดมด้วย GMCSF ได้มาจากเซลล์ J558L ที่ทรานส์เฟกอย่างคงตัวด้วย GMCSF ของหนูเมาส์ เซลล์ไลน์เป็นของขวัญจาก Dr. Ira Mellman (Department of Biology, Yale University, New Haven, CT, USA) Brieflfly ที่แยกออกมาใหม่ BM ถูกเพาะเลี้ยงด้วย GMCSF หนูเมาส์ลูกผสม 6 ng/mL (ทั้งหมด 3 ทรีทเมนต์) เป็นเวลา 8 วันใน RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ขนาดที่เหมาะสมของ 10 ng/mL rapamycin ถูกกำหนดหลังจากทดสอบขนาดต่างๆ (0.1–10 ng/mL) BMDC ได้รับการบำบัดด้วยราพามัยซิน 10 ng/mL (Sigma, St. Louis, MO, USA) สำหรับการรักษาทั้งหมดสามทรีตเมนต์หรือ 1-การรักษาข้ามคืน) BMDC ถูกบำบัดด้วย TLR4 อะโกนิสต์ ไลโปโพลีแซคคาไรด์ (LPS; Escherichia coli serotype 0111:B4: 100 ng/mL; Sigma-Aldrich); หรือยานพาหนะ (1 × PBS) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงในอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับการศึกษาซินยีน (C57BL/6J BMDCs→C57BL/6J หนูเมาส์) และปล่อยทิ้งไว้ไม่บำบัดสำหรับการศึกษาเกี่ยวกับสารก่อภูมิแพ้ (BALB/c BMDCs→C57BL/6J หนูเมาส์) ล้างเซลล์ และ 0.5 × 106 เซลล์ต่อหนูหนึ่งตัวถูกฉีดเข้าเส้นเลือดดำ (iv) เข้าไปในหนูที่ไร้เดียงสา 1 วันก่อนทวิภาคีไตไออาร์ไอ BMDC ถูกติดฉลากด้วย MitoTracker CMXRos Red หรือ MitoTracker Deep Red (100 nM, 30 นาทีที่ 37 ◦C, Invitrogen) หรือ Mitosox (5 µM; 10 นาทีที่ 37 ◦C; Invitrogen)
PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณระดับการแสดงออกของ DNA mitochondrial สัมพัทธ์ (mtDNA) ถูกวัดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [23] Brieflfly, DNA จีโนมทั้งหมดถูกแยกออกและปริมาณที่เท่ากัน (5 ng) ถูกใช้สำหรับ RTPCR โดยใช้ ND1 เป็นไพรเมอร์ตัวแทนสำหรับ mtDNA และไพรเมอร์ HK2 สำหรับ DNA นิวเคลียร์ (nDNA) สำหรับหนูเมาส์และ ND6 สำหรับ mtDNA ของมนุษย์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [23,24] RNA ทั้งหมดถูกแยกออกและแปลงกลับเป็น cDNA และ RT-PCR ถูกดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [7,25,26]
การแยกไมโตคอนเดรียและการหาปริมาณไมโทคอนเดรียถูกแยกออกจากเซลล์ HEK293 ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [18] Brieflfly เพลท 60 ซม. ของเซลล์ HEK293 ถูกรวบรวมโดยการเติมบัฟเฟอร์การทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน 5 มล. (ซูโครส 300 มิลลิโมล/ลิตร, 10 มิลลิโมล/ลิตร HEPES-KOH, 1 มิลลิโมล/ลิตร EGTA-KOH, pH 7.4) ด้วยโพรทีเอส Subtilisin A 1 มก. Bacillus licheniformis (ซิกมา-อัลดริช). โปรโตคอลโดยละเอียดสำหรับการแยกไมโตคอนเดรียสามารถพบได้ในต้นฉบับที่ตีพิมพ์ก่อนหน้าของเรา [18]
2Seahorse Flux BioanalyzerBMDCs อายุเจ็ดวันถูกถ่ายโอนไปยัง 24-เพลตเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อของม้าน้ำ และวัดอัตราการใช้ออกซิเจน (OCR) และพารามิเตอร์ถูกคำนวณตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [25] โดยมีการปรับเปลี่ยนต่อไปนี้ หลังจากตรวจวัดอัตราการหายใจพื้นฐานแล้ว โอลิโกมัยซิน (Sigma; 2 µM), FCCP (Sigma; 1.5 µM; carbonyl cyanide 4- (triflfluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP)) และตัวยับยั้งการลำเลียงอิเล็กตรอน (คอมเพล็กซ์ I และ III) โรทีโนน (Sigma; 0.5 µM) และ antimycin A (Sigma; 0.5 µM)) ถูกฉีดตามลำดับในระหว่างการทดสอบ การหายใจแบบไมโตคอนเดรียพื้นฐาน, การหายใจที่เชื่อมโยงกับ ATP, การรั่วไหลของโปรตอน (การใช้ออกซิเจนที่ไม่ใช่ ATP), การหายใจสูงสุด, การหายใจแบบไม่ใช้ไมโทคอนเดรีย, ความสามารถในการหายใจสำรอง, อัตราส่วนการควบคุมการหายใจ และประสิทธิภาพการมีเพศสัมพันธ์ถูกกำหนดในทั้งเซลล์ตามยี่ห้อและคณะ . [27]; ใช้ N=4–5 หลุมสำหรับแต่ละกลุ่มทดลอง และการทดลองซ้ำอย่างน้อย 3 ครั้ง
Flow Cytometric Analysis, Western Blot และ ELISAเก็บข้อมูล Flow cytometry ดำเนินการบน FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) ด้วย Cytek {{0}}color flflow cytometry upgrade (Cytek Development, Inc., Fremont, CA, USA) ข้อมูลถูกวิเคราะห์โดยซอฟต์แวร์ FlowJo 9.0 (Tree Star, Ashland, OR, USA) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [6,7,28] สำหรับตัวกลาง ELISA ถูกรวบรวมจาก BMDC 24 ชั่วโมงหลังการบำบัดด้วย 100 ng/mL LPS ระดับ TNF , IL6 หรือ IL10 ถูกวัดโดยใช้ชุดอุปกรณ์ ELISA ของเมาส์ (Invitrogen) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิตและตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [18] Veh- หรือ Mito-DC ที่บำบัดด้วยและไม่มี LPS เป็นเวลา 6 หรือ 24 ชั่วโมงถูกใช้เพื่อแยกโปรตีนทั้งหมดโดยใช้บัฟเฟอร์ RIPA lysis ที่เสริมด้วยค็อกเทลตัวยับยั้งโปรตีเอสและฟอสฟาเตส (Thermo Fisher Scientifific, Vernon Hills, IL, USA) สำหรับ GAPDH lysate supernatants ถูกต้ม (10 นาทีที่ 100 ◦C) และ lysates ถูกทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาทีสำหรับค็อกเทล OXPHOS ของหนู (Abcam, Cambridge, MA, USA) [18] ก่อนหน้านี้ได้มีการอธิบายวิธีการที่มีรายละเอียดมากขึ้น [18]
การวิเคราะห์ข้อมูลและสถิติGraphPad Prism 8 (GraphPad Inc., San Diego, CA, USA) ใช้ในการวิเคราะห์และนำเสนอข้อมูล ข้อมูลได้รับการวิเคราะห์ หลังจากการแปลง หากจำเป็นเพื่อสร้างการแจกแจงแบบปกติ โดย 2-การทดสอบแบบเทลด์ หรือ 1-วิธี ANOVA ด้วยการวิเคราะห์แบบโพสต์-เฉพาะกิจ ตามความเหมาะสม การทดสอบ two-tailed unpaired t ใช้สำหรับการวิเคราะห์สองกลุ่ม p น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.05 ใช้เพื่อแสดงนัยสำคัญ
ผลลัพธ์
การรักษาหลายครั้งด้วย Rapamycin (Rapa-M) กระตุ้นจำนวนไมโตคอนเดรียที่สูงขึ้นและ DCs ที่สร้างภูมิคุ้มกันน้อยลงC57BL/6 WT DCs ถูกแยกเดี่ยวและขยายพันธุ์เป็นเวลา 8 วันในการมีอยู่ของ GMCSF และกระสายยา (1X PBS) หรือราพามัยซิน (10 นาโนกรัม/มิลลิลิตร) ทั้งหมดสามการบำบัด DCs ถูกบำบัดด้วย 100 ng/mL LPS ข้ามคืน DC ที่บำบัดด้วย LPS ถูกใช้สำหรับ RNASeq หรือติดฉลากด้วยสีย้อมไมโตคอนเดรียต่างๆ ข้อมูล RNASeq ยืนยันข้อมูลก่อนหน้านี้ว่าการรักษาด้วยราพามัยซินกระตุ้น DCs ที่สร้างภูมิคุ้มกันน้อยลงด้วยไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบที่ต่ำกว่าซึ่งควบคุมการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติและแบบปรับได้ด้วย IL10 เป็นวิถีการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญ (รูปวัสดุเสริม S1A, B และตาราง S1) เมื่อเทียบกับการบำบัดด้วยกระสายยา การบำบัดด้วยราพามัยซินเพิ่มปริมาณไมโตคอนเดรียใน BMDC (รูปที่ 1A) ตามที่ตรวจสอบด้วย MitoTracker CMXRos Red (50 นาโนโมลาร์) ที่มีและไม่มี LPS ในทำนองเดียวกัน มีการติดฉลากที่สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญด้วย MitoTracker Deep Red (100 นาโนโมลาร์) และการติดฉลากที่ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญด้วย MitoSox (5 µM) และหลังการกระตุ้น LPS ข้ามคืนใน Rapa-M-DC เมื่อเปรียบเทียบกับ Veh-DC (รูปที่ 1B,C) การหาปริมาณแบบกึ่งปริมาณของฮิสโตแกรม MFI สำหรับสีย้อมยลทั้งหมด (รูปที่ 1D) นอกจากนี้ Veh- และ Rapa-M-DCs ถูกย้อมโดยใช้ JC-1 เพื่อตรวจสอบว่าการรักษาด้วย Rapamycin เปลี่ยนศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียหรือไม่ การบำบัดหลายครั้งด้วยราพามัยซินไม่เปลี่ยนศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียที่เส้นพื้นฐานเมื่อเปรียบเทียบกับ BMDC ของกลุ่มควบคุมที่บำบัดด้วยกระสายยาดังที่แสดงโดยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ (รูปวัสดุเสริม S2A) และโฟลโฟลว์ ไซโตเมทรี (รูปวัสดุเสริม S2B,C)
(Veh) และติดฉลากด้วย (A) MitoTracker CMXRos (50 nM) หรือ (B) MitoSox (5 µM) หรือ (C) MitoTracker Deep Red (100 nM) . (D) การวิเคราะห์กึ่งเชิงปริมาณของ MFI ของสีย้อมไมโตคอนเดรียที่ติดฉลากข้อมูล flflow cytometry (E) DC ถูกเพาะในเครื่องวิเคราะห์ Seahorse XF-24e ที่ถูกกระตุ้นด้วยและไม่มี LPS เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และกำหนดอัตราการใช้ออกซิเจน (OCR) ในระหว่างการบำบัดแบบต่อเนื่องด้วยโอลิโกมัยซิน (1), FCCP (2) และ แอนติมัยซิน เอ/โรทีโนน (3). (F) การหาปริมาณการผลิต OCR พื้นฐานและ ATP (G) ระดับ mRNA ของ Pgc1a และ Tfam ใน Veh-DC และ Rapa-M-DC ที่บำบัดด้วย LPS 100 ng/mL หรือปล่อยทิ้งไว้โดยไม่กระตุ้นเป็นเวลา 24 ชั่วโมง (H) การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีของ MHC II, โมเลกุลที่กระตุ้นร่วม (CD40/80/86) และการแสดงออกของ PDL1 ถูกกำหนดหาโดยมีและไม่มีการกระตุ้น LPS (I) ELISA ของ IL10, IL6 และ TNF จาก Veh-DC และ Rapa-M-DC ที่บำบัดด้วย LPS 100 ng/mL เป็นเวลา 24 ชั่วโมง (J–L) ระดับ mRNA ของ Il10, Tnfa และ Il6 ใน Veh-DC และ Rapa-M-DC ที่บำบัดด้วย LPS 100 ng/mL หรือปล่อยทิ้งไว้โดยไม่กระตุ้นเป็นเวลา 24 ชั่วโมง * p น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.05, ** p น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.01 และ *** p น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.001, ANOVA ทางเดียวตามด้วยการทดสอบหลังของ Tukey การแสดงข้อมูลหมายถึง ± SEM ของสามเท่า
การเปลี่ยนแปลงการทำงานของไมโตคอนเดรีย การวิเคราะห์พลังงานชีวภาพได้รับการประเมินโดยใช้เครื่องวิเคราะห์ทางชีวภาพของม้าน้ำ ตามรายงานก่อนหน้านี้ [18] LPS ลดการใช้ออกซิเจนเมื่อเทียบกับการควบคุม Veh ใน Veh-DC ตามที่คาดไว้ (รูปที่ 1E เส้นสีน้ำเงินถึงสีดำ) ที่น่าสนใจคือ DC rapa-M ที่มีหรือไม่มี LPS จะมี OCR พื้นฐานที่สูงกว่า (รูปที่ 1E เส้นสีเขียวถึงสีน้ำเงิน ณ เวลาศูนย์) Rapa-M-DC แสดงให้เห็นถึงความล้มเหลวในการเพิ่มความสามารถในการหายใจสูงสุดหลังจากการฉีด FCCP ในเซลล์ที่ไม่ถูกกระตุ้นซึ่งคงอยู่ด้วยการกระตุ้น LPS ซึ่งแสดงให้เห็นว่าราพามัยซินลดความสามารถในการหายใจสำรอง ตามที่รายงานก่อนหน้านี้ของเราทำงานร่วมกับ FTY-DC [18] DC ที่บำบัดด้วย LPS มีการผลิต ATP ที่ลดลงตามที่วัดโดย OCR (สีน้ำเงินเป็นสีดำ) เมื่อเทียบกับ Veh-DC Rapa-M-DC แสดงให้เห็นการผลิต ATP ที่มากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับ Veh-DC ใน DC ทั้งที่ไม่ถูกกระตุ้นและที่กระตุ้นด้วย LPS (รูปที่ 1F) Rapa-M-DCs แสดงระดับ mRNA ที่เพิ่มขึ้นสำหรับสารกระตุ้นร่วมแกมมาที่กระตุ้นด้วยเปอร์รอกซิโซม proliferator-activated 1-อัลฟา (Pgc1a) เทียบกับ Veh-DCs (รูปที่ 1G) และการแสดงออกของยีนสำหรับ Pgc1a และปัจจัยการถอดรหัสไมโตคอนเดรีย A (Tfam ) ถูกคงรักษาไว้ใน Rapa-M-DC หลังจากการกระตุ้น LPS ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าการขยายพันธุ์ของ BMDC ต่อหน้าราปามัยซินเพิ่มปริมาณไมโตคอนเดรีย, OCR พื้นฐาน และการผลิต ATP
เพื่อทดสอบว่าราพามัยซินนอกเหนือจากการเพิ่มจำนวนไมโตคอนเดรียและฟังก์ชันยังทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงใน DC โมเลกุลที่กระตุ้นร่วมหลังจากทดสอบ LPS หรือไม่ ที่น่าสนใจ หลังการบำบัดด้วย LPS Rapa-M-DC มีระดับการแสดงออกที่ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญของโมเลกุลการนำเสนอแอนติเจนที่กระตุ้นร่วมกัน (CD80, CD86 และ CD40), MHCII และ PDL1 เปรียบเทียบกับ Veh-DC (ภาพที่ 1H สีน้ำเงินกับสีแดง) สิ่งที่น่าสนใจคือ Rapa-M-DC มีระดับการแสดงออกที่คล้ายกันสำหรับ PDL1 เมื่อเทียบกับ Veh-DC แต่มีอัตราส่วน PDL1/CD86 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังการกระตุ้น LPS เมื่อเทียบกับ LPS ที่บำบัดด้วย Veh-DC โดยที่ PDL1/CD{{ 18}} ลดลง (Veh/Veh 0.59 ± 0.03 vs. Veh/LPS 0.43 ± 0.{{33 }}02, p < 0.001="" และ="" rapa/veh="" 0.56="" ±="" 0.001="" เทียบกับ="" rapa/lps="" 0.73="" ±="" 0.02,="" p="">< 0.05)="" ไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญในการแสดงออกของ="" cd11c="" ระหว่าง="" veh-="" และ="" rapa-m-dc="" แม้ว่า="" rapa-m-dc="" จะมีสัญญาณกระจัดกระจายด้านล่างซึ่งบ่งชี้ขนาดที่เล็กกว่าของเซลล์หลังการกระตุ้น="" lps="" (ไม่แสดงข้อมูล)="" rapa="" m-dcs="" มีระดับ="" mtdna/ndna="" สัมพัทธ์สูงกว่าเมื่อเทียบกับ="" veh-dc="" (105.7="" ±="" 8.7="" เทียบกับ="" 196.8.9="" ±="" 49.3)="" ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการรักษาด้วยราพามัยซินเพิ่มจำนวน="" dc="" mitochondria="" ราพามัยซินลดการแสดงออกของยีนของ="" il6,="" il10="" และ="" tnfa="" ที่เหนี่ยวนำโดย="" lps="" และความเข้มข้นของโปรตีนของ="" tnf="" และ="" il6="" อย่างมีนัยสำคัญ="" แต่คงระดับ="" il10="" ให้สูงขึ้นเมื่อเปรียบเทียบกับ="" veh-dc="" ที่บำบัดด้วย="" lps="" (รูปที่="" 1i–l)="" ยีนอื่นๆ="" ที่ทราบว่าควบคุมโดยราพามัยซิน="" (="" autophagy="" หรือการอักเสบ)="" แสดงอยู่ในตารางสารเสริม="" s2="" ยีนหลัง="" lps="">
การถ่ายโอน Rapa-M-DC ปกป้องไตจากการบาดเจ็บจากการขาดเลือดDC ทั้งหมดถูกกระตุ้นด้วย 100 ng/mL LPS ก่อนการถ่ายโอนในการศึกษาสังเคราะห์ทั้งหมด (C57BL/6 BMDC→C57BL/6 หนูเมาส์) ฉีด DC ครึ่งล้าน 1 วันก่อน 26-นาทีทวิภาคีไตไออาร์ไอ แผนผังของการออกแบบการศึกษา (รูปที่ 2A) ในกลุ่มควบคุม หนูถูกฉีดด้วย 1 × PBS โดยไม่มีการควบคุมเซลล์ (NC) เมื่อเทียบกับหนูที่ได้รับการรักษาด้วย NC และ Veh-DC หนูที่ได้รับการรักษาด้วย Rapa-M-DC ได้รับการปกป้องอย่างมีนัยสำคัญไตจากการบาดเจ็บ creatinine ในพลาสมา (รูปที่ 2B); พบการเปลี่ยนแปลงที่คล้ายกันใน BUN ในหนูเหล่านี้ [Sham 41.30 ± 3.4 เทียบกับ NC 159.75 ± 3.2 เทียบกับ Veh-DC 151.82 ± 1.5 เทียบกับ Rapa-M-DC 114.68 ± 16.3; p < 0.05="" nc="" หรือ="" veh-dc="" เทียบกับ="" rapa-m-dc]="" การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยา="" (รูปที่="" 2c,d)="" การศึกษาเชิงฟังก์ชันคู่ขนาน="" หนูที่ได้รับการรักษาด้วย="" rapa-m-dc="">ไตระดับ mRNA ของ Kim1 [Veh DC 0.016 ± 0.009 เทียบกับ Rapa-M-DC {{2{{23} }}}.001 ± 0.002] Ngal [Veh-DC 2.14 ± 1.2 เทียบกับ Rapa-M-DC 0.12 ± 0.09] และ Tnfa [Veh-DC 0.19 ± 0.15 เทียบกับ Rapa-M-DC 0.0005 ± 0.0002] เมื่อเปรียบเทียบกับหนูเมาส์ที่ได้รับการรักษาด้วย Veh-DC ในการศึกษาเหล่านี้ และดังที่แสดงไว้ก่อนหน้านี้ [6,7,17,18] หนูที่ได้รับการรักษาด้วย Veh-DC ในขนาดครึ่งล้านจะมีการเปลี่ยนแปลงที่เทียบเท่ากันในการทำงานของไตและไตโปรไฟล์ไซโตไคน์ ในการศึกษาการถ่ายโอน syngeneic หนูที่ได้รับการรักษาด้วย Rapa-M-DC ได้ลดการตายของเซลล์ (การติดฉลาก digoxigenin deoxyuridine nick-end ที่ปลายขั้ว deoxynucleotidyl transferase (TUNEL]) เมื่อเทียบกับหนูที่ได้รับการรักษาด้วย Veh-DC (Veh-DC 3.8 ± 1.4 เทียบกับ Rapa- M-DC 1.1 ± 0.6; p < 0.05);="" ภาพตัวอย่างจากการวิเคราะห์="" tunel="" แสดงในรูปวัสดุเสริม="" s3="" ที่น่าสนใจคือไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญในจำนวนของนิวโทรฟิลที่แทรกซึมในหนูที่ได้รับการรักษาด้วย="" rapa-m-dc="" เมื่อเปรียบเทียบกับ="" veh-dc="" (ไม่แสดงข้อมูล)="" แสดงว่าหนูที่ได้รับการรักษาด้วย="" rapa-m-dc="" อาจไม่มีการเปลี่ยนแปลงใดๆ="" ในคีโมไคน์="" แม้ว่า="">
การรักษาเดี่ยวด้วย Rapamycin (Rapa-S) ทำให้เกิด DCs ที่สร้างภูมิคุ้มกันน้อยลงโดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงพลวัตของไมโตคอนเดรียต่อไป เราทดสอบว่าการรักษาด้วยราพามัยซินเพียงครั้งเดียวนั้นเพียงพอที่จะทำให้เกิดฟีโนไทป์ของกฎระเบียบหรือไม่ ซึ่งจะทำให้มีความเป็นไปได้ที่จะกระตุ้นฟีโนไทป์ของกฎข้อบังคับให้มีความเกี่ยวข้องทางคลินิกมากขึ้น WT DCs ถูกแยกออกและขยายพันธุ์เป็นเวลา 8 วันต่อหน้า GMCSF รวมเป็นสามทรีตเมนต์ DCs อายุเจ็ดวันได้รับการรักษาด้วยราพามัยซิน (10 ng/mL) ก่อนการบำบัดด้วย 100 ng/mL LPS สำหรับการฟักไข่ข้ามคืนและติดฉลากในวันถัดไปด้วย MitoTracker CMXRos สีแดง (50 นาโนโมลาร์) เมื่อเทียบกับการบำบัดด้วยยานพาหนะ การบำบัดด้วย Rapa-S จะไม่เปลี่ยนเนื้อหาในไมโตคอนเดรียใน BMDC (รูปที่ 3A) ที่มีและไม่มี LPS ในทำนองเดียวกัน ไม่มีการเปลี่ยนแปลงในการติดฉลากด้วย MitoTracker Deep Red (100 nM) และ MitoSox (5 µM) และหลังจากการกระตุ้น LPS ข้ามคืนใน Rapa-S-DC เมื่อเปรียบเทียบกับ Veh-DC (รูปที่ 3B,C). การหาปริมาณแบบกึ่งปริมาณของฮิสโตแกรม MFI สำหรับสีย้อมยลทั้งหมด (รูปที่ 3D) ในทำนองเดียวกัน สำหรับการวิเคราะห์การบำบัดหลายรายการ Veh- และ Rapa-S-DCs ถูกย้อมสีโดยใช้ JC{{20}} เพื่อตรวจสอบว่าการบำบัดด้วยราปามัยซินเพียงครั้งเดียวเปลี่ยนศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียหรือไม่ การบำบัดเพียงครั้งเดียวด้วยราพามัยซินไม่เปลี่ยนศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียที่เส้นพื้นฐานเมื่อเปรียบเทียบกับ BMDC ของกลุ่มควบคุมที่บำบัดด้วยกระสายยาดังที่แสดงโดยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ (รูปวัสดุเสริม S2A) และโฟลโฟลว์ ไซโตเมทรี (รูปวัสดุเสริม S2B,C) LPS ลดการใช้ออกซิเจนเมื่อเทียบกับตัวควบคุม Veh ใน Veh-DC ตามที่คาดไว้ (รูปที่ 3E เส้นสีน้ำเงินถึงสีดำ) Rapa-S-DCs ไม่มีการเปลี่ยนแปลงใน OCR พื้นฐาน (รูปที่ 3E เส้นสีเขียวถึงสีน้ำเงินที่เวลาศูนย์) เมื่อการผลิต ATP ถูกหาปริมาณ LPS ลดการผลิต ATP ตามที่วัดโดย OCR (สีน้ำเงินเป็นสีดำ) ใน Veh-DC และ Rapa-S-DC (รูปที่ 3F) อย่างไรก็ตาม Rapa-S-DC แสดงระดับ mRNA ที่เพิ่มขึ้นสำหรับ Pgc1a เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม Veh และระดับเหล่านี้คงอยู่ใน Rapa-S-DC หลังจาก LPS (รูปที่ 3G) การเปลี่ยนแปลงเพียงเล็กน้อยหรือไม่มีเลยถูกสังเกตพบในระดับการถอดเสียงของ Tfam ต่อไป เราทดสอบว่าการบำบัดเพียงครั้งเดียวด้วยราพามัยซินทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงใน DC โมเลกุลที่กระตุ้นร่วมกันหลังจาก LPS หรือไม่ ที่น่าสนใจ หลังจากการบำบัดด้วย LPS แล้ว Rapa-S-DC มีระดับการแสดงออกที่ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญของโมเลกุลการนำเสนอแอนติเจนที่กระตุ้นร่วม (CD80, CD86 และ CD40), MHCII, และ PDL1 เมื่อเปรียบเทียบกับ Veh-DC (รูปที่ 3H) Rapa-S-DC มีระดับการแสดงออกที่คล้ายกันสำหรับ PDL1 เมื่อเปรียบเทียบกับ Veh-DC และมีการลดลงที่มีนัยสำคัญคล้ายกันในอัตราส่วน PDL1/CD86 หลังการกระตุ้น LPS ที่เปรียบเทียบกับ Veh-DC (Veh/Veh 0 59 ± 0.03 เทียบกับ Veh/LPS 0.43 ± 0.002, p < 0.001="" และ="" rapa-s/veh="" 0.69="" ±="" 0.02="" เทียบกับ="" rapa-s/lps="" 0.56="" ±="" 0.008,="" p="">< 0.05)="" การบำบัดครั้งเดียวด้วย="" rapamycin="" ลดการแสดงออกของยีนของ="" il6,="" il10="" และ="" tnfa="" ที่เกิดจาก="" lps="" อย่างมีนัยสำคัญพร้อมกับความเข้มข้นของโปรตีนที่ต่ำกว่าของ="" il10="" ที่มีการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยหรือไม่มีเลยใน="" tnf="" และหลังการรักษาด้วย="" lps="" (รูปที่="" 3i–l)="" ยีนอื่นที่เป็นที่รู้จักซึ่งควบคุมโดย="" rapamycin="" (autophagy="" [beclin,="" atg7,="" atg9,="" lc3b="" และ="" lamp2]="" หรือการอักเสบ="" [il1b,="" il12p40,="" tlr4,="" nos2,="" hif1a="" และ="" ho1])="" ถูกควบคุมเพียงบางส่วนเมื่อเทียบกับ="" dc="" ของยานพาหนะหลังจากการกระตุ้น="" lps="" (เสริม)="" ตารางวัสดุ="">
การถ่ายโอน Rapa-S-DC ปกป้องไตจากการบาดเจ็บจากการขาดเลือดDC ทั้งหมดถูกกระตุ้นด้วย 100 นาโนกรัม/มิลลิลิตร LPS หรือบำบัดด้วยราพามัยซิน (10 นาโนกรัม/มิลลิลิตร) ก่อนการถ่ายโอนในการศึกษาซินยีนทั้งหมด (หนูเมาส์ C57BL/6 BMDC→C57BL/6) DCs ครึ่งล้านถูกฉีด 1 วันก่อนทวิภาคีไตไออาร์ไอ แผนผังของการออกแบบการศึกษา (รูปที่ 4A) ในกลุ่มควบคุม หนูถูกฉีดด้วย 1 × PBS โดยไม่มีการควบคุมเซลล์ (NC) เมื่อเทียบกับหนูที่ได้รับการรักษาด้วย Veh-DC หนูที่ได้รับการรักษาด้วย Rapa-S-DC ได้รับการปกป้องอย่างมีนัยสำคัญไตจากการบาดเจ็บของครีเอตินีนในพลาสมา (รูปที่ 4B); พบการเปลี่ยนแปลงที่คล้ายกันใน BUN ในหนูเหล่านี้ [Veh-DC 151.82 ± 1.5 เทียบกับ Rapa-S-DC 139.53 ± 3.8] การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยา (รูปที่ 4C,D) การศึกษาเชิงฟังก์ชันคู่ขนาน หนูที่ได้รับการรักษาด้วย Rapa-S-DC มีค่าต่ำกว่าไตระดับ mRNA ของ Kim1 [Veh-DC 0.016 ± 0.{{10}}}{{20}}9 เทียบกับ Rapa -S-DC 0.004 ± 0.002] Ngal [Veh DC 2.14 ± 1.2 เทียบกับ Rapa-S-DC 0.14 ± 0.008] และ Tnfa [Veh-DC 0.196 ± 0.15 เทียบกับ Rapa-S-DC 0.0017 ± 0.001] เมื่อเปรียบเทียบกับหนูเมาส์ที่ได้รับการรักษาด้วย Veh-DC
Allogeneic BMDC การถ่ายโอน Rapa-M-DC หรือ Rapa-S-DC ช่วยปกป้องไตจากการบาดเจ็บจากการขาดเลือดอย่างเท่าเทียมกันครึ่งล้าน DCs ถูกฉีด 1 วันก่อนทวิภาคีไตIRI สำหรับการศึกษาการถ่ายโอน allogeneic (BALB/C BMDC→C57BL/6 หนูเมาส์) แผนผังของการออกแบบการศึกษา (รูปที่ 5A) ในฐานะกลุ่มควบคุม หนูเมาส์ถูกฉีดด้วย 1x PBS เนื่องจากไม่มีตัวควบคุม (NC) เมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่ได้รับการรักษาด้วย Veh-DC, หนูที่ได้รับการรักษาด้วย Rapa-M-DC หรือ Rapa-S-DC นั้นได้รับการปกป้องอย่างมีนัยสำคัญไตจากการบาดเจ็บ (รูปที่ 5B) การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยา (รูปที่ 5C,D) การศึกษาเชิงฟังก์ชันคู่ขนาน หนูที่ได้รับราพามัยซินดีซีมีค่าต่ำกว่าไตระดับ mRNA ของ Kim1 [Veh-DC 0.04 ± 0.{{10}}2 เทียบกับ Rapa-M-DC 0 005 ± 0.0{{30}}2 เทียบกับ Rapa-S-DC 0.{{37} }05 ± 0.0002], Ngal [Veh-DC 0.57 ± 0.3 เทียบกับ RapaM-DC 0.19 ± 0.11 เทียบกับ Rapa- S-DC 0.05 ± 0.01] และ Tnfa [Veh-DC 0.037 ± 0.02 เทียบกับ Rapa-M-DC 0.007 ± 0.003 เทียบกับ Rapa-S-DC 0.008 ± 0.005] เมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่ได้รับการรักษาด้วย Veh-DC ในการศึกษาการถ่ายโอน allogeneic หนูที่ได้รับการรักษาด้วย Rapa-M-DC หรือ Rapa-S-DC ได้ลดการตายของเซลล์ TUNEL เมื่อเทียบกับหนูที่ได้รับการรักษาด้วย Veh-DC (Veh-DC 16.7 ± 8.2 เทียบกับ Rapa-M-DC 7.2 ± 2.5 เทียบกับ Rapa- S-DC 9.1 ± 0.1)
Mitochondria Loaded DCs (Mito-DC) จากภายนอกที่มีพลวัตของไมโตคอนเดรียที่สูงขึ้นและฟีโนไทป์ที่สร้างภูมิคุ้มกันมากขึ้นหลังการกระตุ้น LPSWT DCs ถูกแยกออกและขยายพันธุ์เป็นเวลา 8 วันต่อหน้า GMCSF รวมเป็น 3 ทรีทเมนต์ DCs อายุเจ็ดวันถูกบำบัดข้ามคืนด้วยไมโตคอนเดรียจากภายนอกของมนุษย์ (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เมื่อเทียบกับการบำบัดด้วยรถยนตร์ ไมโตคอนเดรียที่บำบัดด้วย DC Mito-DC มีไมโตคอนเดรียสูงกว่า ไมโทคอนเดรียถูกแยกออกจากเซลล์ของมนุษย์ HEK293 BMDC ถูกวิเคราะห์สำหรับการมีอยู่ของไมโตคอนเดรียของมนุษย์ใน WT DC ของหนูเมาส์โดยใช้ไพรเมอร์ mtDNA ของมนุษย์สำหรับ NADH ดีไฮโดรจีเนส (ND) เนื้อหา [mtDNA] ของมนุษย์ใน Veh-DC คือ {{10}}.26 ± 0.10 เทียบกับ 16.8 ± 0.59; p < 0.001="" เพิ่มขึ้น="" 63-="" เท่าในจีโนม="" dna="" ที่แยกได้จาก="" bmdcs="" ข้อจำกัดของการทดสอบในปัจจุบันคือการวัด="" mtdna="" ของมนุษย์หรือ="" moue="" ที่สัมพันธ์กับ="" dna="" นิวเคลียร์="" และ="" mtdna="" ของมนุษย์จำนวนเล็กน้อยที่ตรวจพบใน="" veh-dc="" อาจเกิดจากการทับซ้อนกันเล็กน้อยในลำดับของ="" nd="" ในการทดสอบ="" pcr="" หรือความเป็นไปได้เนื่องจากเรา="" แสดงการแสดงออกที่สัมพันธ์กับ="" dna="" นิวเคลียร์ของหนูเมาส์="" เพื่อตรวจสอบว่าปริมาณไมโตคอนเดรียที่สูงขึ้นยังเปลี่ยนแปลงการทำงานของไมโตคอนเดรียด้วยหรือไม่="" การวิเคราะห์พลังงานชีวภาพได้ดำเนินการโดยใช้เครื่องวิเคราะห์ทางชีวภาพของม้าน้ำ="" lps="" ลดการใช้ออกซิเจนเมื่อเทียบกับการควบคุม="" veh="" ใน="" veh-dc="" ตามที่คาดไว้="" (รูปที่="" 6a="" เส้นสีน้ำเงินถึงสีดำ)="" mito-dcs="" มี="" ocr="" พื้นฐานที่สูงกว่า="" (รูปที่="" 6a="" เส้นสีเขียวถึงสีน้ำเงิน="" ณ="" เวลาศูนย์)="" เมื่อรักษาด้วย="" uncoupler="" fccp="" mito-dc="" แสดงให้เห็นถึงความล้มเหลวในการเพิ่มความสามารถในการหายใจสูงสุดในเซลล์ที่ไม่ถูกกระตุ้นซึ่งคงอยู่ด้วยการกระตุ้น="" lps="" ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการรักษาด้วยไมโตคอนเดรียที่แยกได้จะลดความสามารถในการหายใจสำรอง="" (อาจเป็นเพราะอยู่ที่="" ocr="" สูงสุดแล้วในสถานะพื้นฐาน)="" เมื่อการผลิต="" atp="" ถูกหาปริมาณ="" lps="" ลดการผลิต="" atp="" ตามที่วัดโดย="" ocr="" (สีน้ำเงินเป็นสีดำ)="" ใน="" veh-dc="" mito-dc="" แสดงให้เห็นการผลิต="" ocr="" และ="" atp="" พื้นฐานที่มากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับ="" veh-dc="" ใน="" dc="" ที่กระตุ้นด้วย="" lps="" (รูปที่="" 6b)="" mito-dc="" แสดงระดับ="" mrna="" ที่เพิ่มขึ้นสำหรับ="" pgc1a="" และ="" tfam="" ที่ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญอย่างน่าสนใจเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม="" veh="" (รูปที่="" 6c)="" ความแตกต่างใน="" pgc1a="" และ="" tfam="" ในชุดการทดลองเหล่านี้หลังการกระตุ้น="" lps="" เมื่อเทียบกับข้อมูลในรูปที่="" 1="" และ="" 3="" อาจเนื่องมาจากการใช้="" balb/c="" bmdc="" เมื่อเทียบกับ="" c57bl/6="" bmdcs="" dcs="" จาก="" balb/c="" มีการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในการผลิตไมโตคอนเดรียและไซโตไคน์หลังการกระตุ้น="" [29,30]="" ความเป็นไปได้เนื่องจากการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ใน="" dc="" ในอดีต="" เราได้ใช้เวลาขาดเลือดในหนู="" balb/c="" ที่สูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับ="" c57bl/6="">ไตบาดเจ็บ [6,18]. ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าการถ่ายโอนไมโตคอนเดรียที่มีสุขภาพดีจากภายนอกส่งผลให้ปริมาณไมโตคอนเดรีย, OCR พื้นฐาน และการผลิต ATP เพิ่มขึ้น สิ่งนี้ชี้ให้เห็นถึงศักยภาพของฟีโนไทป์ที่ต้านการอักเสบใน DCs หลังการรักษาด้วยไมโต chondria จากภายนอก ดังที่แสดงในการศึกษาก่อนหน้านี้ของเรา [18] ต่อไป เราทดสอบว่า DC ที่บำบัดด้วยไมโตคอนเดรียภายนอกซึ่งส่งผลให้จำนวนไมโตคอนเดรียเพิ่มขึ้นและฟังก์ชันยังทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงใน DC โมเลกุลที่กระตุ้นร่วมหลังจาก LPS หรือไม่ อย่างน่าทึ่ง โดยมีและไม่มีการกระตุ้น LPS, Mito-DC มีระดับการแสดงออกที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของโมเลกุลการนำเสนอแอนติเจนที่กระตุ้นร่วมกัน (CD80, CD86 และ CD40), MHCII และ PDL1 ที่เปรียบเทียบกับ Veh-DC (รูปที่ 6D) นอกจากนี้ Mito-DC มีระดับการแสดงออกที่สูงกว่าสำหรับ PDL1 เมื่อเทียบกับ Veh-DC อย่างไรก็ตาม พวกมันยังมีอัตราส่วน PDL1/CD86 เพิ่มขึ้นหลังจากการกระตุ้น LPS เมื่อเทียบกับ Veh-DC ที่บำบัดด้วย LPS (ไม่แสดงข้อมูล) Mito-DC มีการแสดงออกของยีนที่ไม่ชัดเจนอย่างเห็นได้ชัดของ Tnfa ที่เกิดจาก LPS แต่การแสดงออกของยีนที่สูงกว่าของ Il6 และ Il10 เมื่อเทียบกับ Veh-DC และความเข้มข้นของโปรตีนที่ต่ำกว่าของ TNF และ IL10 แต่ยังคงรักษาระดับ IL6 ให้สูงขึ้นเมื่อเปรียบเทียบกับ Veh-DC ที่บำบัดด้วย LPS (รูปที่ 6E -ชม). ยีนอื่นๆ ที่ทราบว่าควบคุมโดยไมโตคอนเดรีย ( autophagy [Beclin, Atg7, Atg9, Lc3b และ Lamp2] หรือการอักเสบ (Il1b, Il12p40, Tlr4, Nos2, Hif1a และ Ho1]) ถูกควบคุมบางส่วนหลังจากการกระตุ้น LPS (ตารางวัสดุเสริม S3) Veh-DC และ Mito-DC ถูกบำบัดด้วย LPS เป็นเวลา 6 และ 24 ชั่วโมง วัดการเปลี่ยนแปลงสัมพัทธ์ในไมโตคอนเดรียเชิงซ้อน Mito-DC ที่บำบัดด้วยและไม่มี LPS มีระดับโปรตีนที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของสารเชิงซ้อนของไมโตคอนเดรีย IV, II และ I และระดับของคอมเพล็กซ์ V และ III ที่ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับ Veh-DC (รูปที่ 6I) การวิเคราะห์กึ่งเชิงปริมาณของการแสดงออกของโปรตีนสัมพัทธ์ของคอมเพล็กซ์ไมโตคอนเดรียต่อ GAPDH (รูปที่ 6J) มีจุดบล็อทแบบยาวเป็นฟิกเกอร์เสริม (รูปวัสดุเสริม S4–S7)
รูปที่ 6 Mitochondria load DCs (Mito-DC) มีฟังก์ชัน mitochondrial และการสร้างภูมิคุ้มกันที่สูงขึ้นหลังจากการกระตุ้น LPS เมื่อเทียบกับ Veh-DCs Veh-DC อายุเจ็ดวันและถูกบ่มด้วย 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร HEK293 ไมโทคอนเดรียหนึ่งวันก่อนการบำบัดด้วย 100 ng/mL LPS เป็นเวลาเพิ่มเติม 24 ชั่วโมงหรือปล่อยทิ้งไว้โดยไม่ถูกกระตุ้น ( เว่อร์). (A) 24 ชั่วโมงหลังจากการเติมไมโตคอนเดรีย DCs ถูกเพาะในเครื่องวิเคราะห์ Seahorse XF-24e ที่ถูกกระตุ้นด้วยและไม่มี LPS เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และกำหนดอัตราการใช้ออกซิเจน (OCR) ในระหว่างการบำบัดแบบต่อเนื่องด้วยโอลิโกมัยซิน (1 ), FCCP (2) และแอนติมัยซิน A/โรทีโนน (3) (B) การหาปริมาณการผลิต OCR พื้นฐานและ ATP (C) ระดับ mRNA ของ Pgc1a และ Tfam ใน Veh-DC และ Mito-DC ที่บำบัดด้วย LPS 100 ng/mL หรือปล่อยทิ้งไว้โดยไม่กระตุ้นเป็นเวลา 24 ชั่วโมง (D) การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีของ MHCII, โมเลกุลที่กระตุ้นร่วม (CD40/80/86) และการแสดงออกของ PDL1 ถูกกำหนดหาโดยมีและไม่มีการกระตุ้น LPS (E) ELISA ของ IL10, IL6 และ TNF จาก Veh-DC และ Mito-DC ที่บำบัดด้วย LPS 100 ng/mL เป็นเวลา 24 ชั่วโมง (F–H) ระดับ mRNA ของ Tnfa, Il6 และ Il10 ใน Veh-DC และ Mito-DC ที่บำบัดด้วย LPS 100 ng/mL หรือปล่อยทิ้งไว้โดยไม่กระตุ้นเป็นเวลา 24 ชั่วโมง การแสดงข้อมูลหมายถึง ± SEM, * p น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.05, ** p น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.01 และ *** p น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.001, ANOVA ทางเดียวตามด้วยหลังการทดสอบของ Tukey การแสดงข้อมูลหมายถึง ± SEM ของสามเท่า
Allogeneic BMDC การถ่ายโอนของ Mito-DC Protectsไตจากการบาดเจ็บจากการขาดเลือด ฉีด DCs ครึ่งล้าน 1 วันก่อนทวิภาคีไตการศึกษาการถ่ายโอน IRI สำหรับ Mito-DC allo geneic (BALB/C BMDC→C57BL/6 หนู) แผนผังของการออกแบบการศึกษา (รูปที่ 7A) ในฐานะกลุ่มควบคุม หนูเมาส์ถูกฉีดด้วย 1x PBS เนื่องจากไม่มีการควบคุมเซลล์ (NC) เมื่อเทียบกับหนูที่ได้รับการรักษาด้วย Veh-DC หนูที่ได้รับการรักษาด้วย Mito-DC ได้รับการปกป้องอย่างมีนัยสำคัญไตจากการบาดเจ็บ (รูปที่ 7B) การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยา (รูปที่ 7C,D) การศึกษาเชิงฟังก์ชันคู่ขนาน หนูที่ได้รับการรักษาด้วย Mito-DC มีค่าต่ำกว่าไตระดับ mRNA ของ Kim1 [Veh-DC 0.04 ± 0.02 เทียบกับ Mito-DC 0.02 ± 0.01] Ngal [Veh-DC 0.57 ± 0.3 เทียบกับ Mito-DC 0.39 ± {{29} }.20] และ Tnfa [Veh-DC 0.037 ± 0.02 เทียบกับ Mito-DC 0.0028 ± 0.0013] เมื่อเปรียบเทียบกับหนูเมาส์ที่ได้รับการรักษาด้วย Veh-DC ในการศึกษาการถ่ายโอน allogeneic หนูที่ได้รับการรักษาด้วย Mito-DC ได้ลดการตายของเซลล์ TUNEL เมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่ได้รับการรักษาด้วย Veh-DC (Veh-DC 16.7 ± 8.2 เทียบกับ Mito-DC 3.0 ± 1.2)
อภิปราย ในการศึกษาปัจจุบัน เราได้แสดงให้เห็นถึงการป้องกันจากไตIRI ที่เหนี่ยวนำโดยการถ่ายโอน DC ที่ได้รับการบำบัดด้วยราพามัยซิน (ไม่ว่าจะครั้งเดียวหรือหลายครั้ง) จะควบคุมฟังก์ชัน DC ที่ขึ้นอยู่กับการเปลี่ยนแปลงสัมพัทธ์ในไดนามิกของไมโตคอนเดรีย การบำบัดทั้งแบบครั้งเดียวและหลายครั้งด้วยราพามัยซินทำให้เกิดอิมมูโนเจนิกที่ลดลง (ไซโตไคน์ที่ต่ำกว่าและโมเลกุลที่กระตุ้นร่วมกัน) DCs การถ่ายโอน Rapa-M-DCs หรือ Rapa-S-DCs ปกป้องไตจากการบาดเจ็บจากการกลับเป็นเลือดของการขาดเลือด ซึ่งบ่งชี้ว่าสถานะภูมิคุ้มกันที่ลดลงของ DCs ที่ดัดแปลงด้วยราพามัยซินทำให้เกิดการป้องกัน นอกจากนี้ การถ่ายโอน Veh-DC ที่มีจำนวน mitochondria เพิ่มขึ้นชั่วคราวยังช่วยป้องกันไตจาก IRI (รูปที่ 8A–D)) จากการศึกษาเหล่านี้ เราสามารถสรุปได้ว่าการฉีด DCs ที่สร้างภูมิคุ้มกันน้อยลงเป็นหัวใจสำคัญในการกระตุ้นการป้องกันจาก IRI ซึ่งเป็นกระบวนการที่สามารถทำได้โดยการรักษาทางเภสัชวิทยา (rapamycin) หรือโดยการถ่ายโอนไมโตคอนเดรียจากภายนอกที่มีสุขภาพดี ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ [31] และได้รับการยืนยันในการศึกษา RNAseq ของเรา โดยรวมแล้วไม่มีลายเซ็นที่ทนต่อโรคได้อย่างชัดเจนซึ่งเกี่ยวข้องกับ DC ที่มอดูเลตด้วย rapamycin แม้ว่า rapamycin DCs จะแสดงการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญบางอย่างในยีนหลังจากการกระตุ้น LPS เมื่อเทียบกับ DC ของกระสายยา แต่สิ่งเหล่านี้ถูกจำกัดที่ RapaM-DC ที่มีการส่งสัญญาณที่อาศัยไซโตไคน์และการผลิตไซโตไคน์ที่ต่ำกว่า (การส่งสัญญาณ TNF ผ่านการผลิต NF-kB และ IFN) ล้วนมีความสำคัญในทั้งคู่ การตอบสนองภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติและแบบปรับตัว ตามที่รายงานและยืนยันก่อนหน้านี้ในการศึกษาของเรา การส่งสัญญาณ IL-10 ถูกระบุว่าเป็นเส้นทางหลักที่แตกต่างกันใน DC ที่บำบัดด้วยราพามัยซินด้วย FDR 5.87 × 10 4 (วัสดุเสริม รูปที่ S1) ซึ่งเป็นลักษณะเด่นของไซโตไคน์ ของลายเซ็นทนใน DCs
ในอดีต DCs ที่ทนได้ (Tol-DC) ได้รับการระบุว่ามีการเจริญพันธุ์หรือกึ่งอ่อนโดยมีการแสดงออกที่ต่ำของการกระตุ้นร่วม (CD80, CD86, CD40) ที่มีการผลิต IL10 เพิ่มขึ้นพร้อมกับการคัดหลั่ง IL12 และ IFN ต่ำ ความสามารถที่ต่ำกว่าในการไพรม์ทีเซลล์และมีศักยภาพในการชักนำ Treg หลังการกระตุ้นการอักเสบที่ต้นเหตุ [32,33] DC ที่มีการควบคุมหรือทนต่อสารสามารถแยกความแตกต่างได้ ในหลอดทดลอง โดยการใช้ยาหรือสารกดภูมิคุ้มกัน เช่น FTY720 [18] หรือ rapamycin (การศึกษาในปัจจุบัน) หรือไซโตไคน์ที่ต้านการอักเสบ เช่น IL10 [34] หรือผ่านการดัดแปลงทางพันธุกรรม
บทบาทของเซลล์เดนไดรต์ในการบาดเจ็บของไตเฉียบพลัน (AKI)แม้ว่าความก้าวหน้าทางเภสัชวิทยาที่สำคัญสำหรับการป้องกันหรือการรักษาอาการบาดเจ็บต่างๆ ก็ยังไม่มีสำหรับ AKI ดังนั้นจึงยังคงเป็นภาระด้านสุขภาพที่สำคัญ [35] นอกจากนี้ สำหรับการป้องกันหรือลดการตอบสนองของภูมิคุ้มกันแบบปรับตัว การปฏิเสธการปลูกถ่าย allograft ที่เป็นสื่อกลางหรือโรคภูมิต้านตนเอง การใช้ยากดภูมิคุ้มกันที่ไม่เฉพาะเจาะจงนั้นสัมพันธ์กับผลข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์ ดังนั้น การใช้ชนิดของเซลล์ภูมิคุ้มกันเช่น DCs ที่สามารถกำหนดเป้าหมายการตอบสนองภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติและแบบปรับตัวได้จึงเป็นข้อดี นอกจากนี้ DCs เป็นเซลล์ที่สำคัญในภูมิคุ้มกันหรือความอดทน และแนวคิดของการใช้ DCs ที่ควบคุมโดยอดีตร่างกายหรือที่ยอมรับได้ในการรักษามะเร็งโดยใช้เซลล์เป็นพื้นฐานสำหรับโรคมะเร็ง ความผิดปกติของภูมิต้านทานผิดปกติ และการปลูกถ่ายยังอยู่ภายใต้การตรวจสอบ [36] เภสัชวิทยา (FTY720 [18]) หรือกลยุทธ์ทางชีววิทยา (ดัดแปลงพันธุกรรม) กระตุ้น DCs ด้านกฎระเบียบหรือความทนทาน (Tol-DC) [37] ซึ่งสามารถต้านทานการเจริญเต็มที่หรือมีระดับการสุกที่ต่ำกว่า หรือถูกกระตุ้นอีกทางหนึ่งซึ่งท้ายที่สุดจะแสดงระดับ MHC I ต่ำ หรือ MHC II และโมเลกุลที่กระตุ้นร่วม เช่น CD40, CD80 และ CD86 การใช้หนูแปลงพันธุ์ CD11c-DTR เราได้เผยแพร่การศึกษาก่อนหน้านี้ที่แสดงให้เห็นว่าการพร่องของ DC ที่มีพิษคอตีบมีการป้องกันเมาส์อย่างมีนัยสำคัญไตจากการบาดเจ็บจากการกลับเป็นเลือดขาดเลือด (IRI) [7,38] และในทางกลับกัน การเพิ่มขึ้นของตัวเลข DC ที่ขึ้นกับขนาดยาทำให้รุนแรงขึ้นไตบาดเจ็บ[7] แนะนำว่า DCs สามารถมีบทบาทสำคัญในการควบคุม AKI เป็นมูลค่าการกล่าวขวัญว่าใน AKI รูปแบบของ AKI ที่ใช้ (เคมีบำบัดโดยใช้ซิสพลาตินหรือภาวะขาดเลือดขาดเลือด) กำหนดบทบาทของ DCs เพื่อเปลี่ยนแปลงการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน ใน AKI ที่เหนี่ยวนำโดย cisplatin การทำ DC ablation โดยการใช้หนูที่ดัดแปลงพันธุกรรมหรือโดยการฉีด liposomal chlodronate ส่งผลให้เกิดการบาดเจ็บมากขึ้นเนื่องจาก IL-10 ที่ผลิตจาก DC ในแบบจำลองนี้มีความจำเป็นอย่างยิ่งต่อการลดอาการบาดเจ็บที่ไต [39,40]
Rapamycin: การอักเสบ, เซลล์ภูมิคุ้มกัน, Ischemia Reperfusion Injury (IRI)การศึกษาที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นถึงบทบาทในการป้องกันของราพามัยซินในแบบจำลอง AKI โดยใช้การศึกษา IRI ที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมการแทรกซึมของเซลล์ NKT และการทำงานจึงทำให้ดีขึ้นไตบาดเจ็บ[41] ในการศึกษานี้ หนูทดลองได้รับการรักษาด้วยราพามัยซิน 3 ครั้งเป็นเวลา 24 ชั่วโมง, 1 ชั่วโมงก่อนขาดเลือดขาดเลือด และ 12 ชั่วโมงหลังขาดเลือดขาดเลือด การให้ยาทางปากแบบเรื้อรังของหนูหนึ่งวันก่อนไตIRI และทุกวันหลังจากนั้น (สูงสุด 7 วัน) ส่งผลให้สูงขึ้นไตบาดเจ็บเนื่องจากการยับยั้งของไตการเพิ่มจำนวนเซลล์ท่อที่ 1 และ 3 วันหลังขาดเลือด [42]. สิ่งนี้เห็นได้ชัดเจนในแบบจำลองหนูเมาส์ของการอุดกั้นท่อไตข้างเดียว (UUO) ซึ่งการรักษาด้วยราพามัยซินดีขึ้นไตการเกิดพังผืดโดยการยับยั้งการส่งสัญญาณ mTOR โดยตรงใน myofifibroblasts และมาโครฟาจคั่นระหว่างหน้า [43] การศึกษาเหล่านี้แนะนำว่าราพามัยซินอาจมีผลตรงกันข้ามในโรคเฉียบพลันและเรื้อรังต่างๆไตโมเดล อย่างไรก็ตาม การศึกษาต่างๆ ได้รายงานถึงบทบาทที่เป็นอันตรายต่อราพามัยซินในแบบจำลองสัตว์ของ IRI การให้ยาราพามัยซินในช่องปาก (4 มก./วัน) เป็นเวลา 7 วันในสุกรยอร์คเชียร์ทำให้การหดตัวของหลอดเลือดที่ขึ้นกับบุผนังหลอดเลือดบกพร่องและเนื้อร้ายของกล้ามเนื้อหัวใจเพิ่มขึ้นในรูปแบบการอุดตันของหลอดเลือดหัวใจ [44] อย่างไรก็ตาม ในหนู การรักษาแบบเฉียบพลันด้วยราพามัยซิน (หนึ่งชั่วโมงก่อนภาวะขาดเลือดขาดเลือด การฉีดเข้าช่องท้อง) กระตุ้นการป้องกันหัวใจด้วยการควบคุม JAK2-การส่งสัญญาณ STAT3 เพื่อป้องกันกล้ามเนื้อหัวใจตาย [45] ขึ้นอยู่กับเส้นทาง (การให้ยาหรือฉีดเข้าใต้ผิวหนังหรือในช่องท้อง) การให้ยา (0.1–6 มก./กก./วัน) ระยะเวลา (ก่อนกำหนดหรือล่าช้า) [46] และประเภทของแบบจำลองที่ใช้ (หัวใจ [47] , ตับ [48] หรือไต[41,49]), ราพามัยซินได้รับการแสดงว่าป้องกัน [47] หรือไม่ป้องกัน [50]
เซลล์บำบัดและราพามัยซินการแพร่กระจายของ BMDC ของหนูเมาส์หรือ CD14 ของมนุษย์ บวกกับ monocytes ที่เราพิจารณาว่าเรื้อรังชักนำให้เกิดฟีโนไทป์ในการป้องกันหรือควบคุมทางเลือกใน DC ที่ควบคุมการตอบสนองของภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดและแบบปรับตัว ในโรคที่เกิดจากการปลูกถ่ายอวัยวะเทียบกับเจ้าภาพที่ทำให้เสียชีวิต DCs ที่สร้างขึ้นด้วยราพามัยซินลด MHC II และโมเลกุลที่กระตุ้นร่วมกัน แต่มีประชากรของ IL12 สูงขึ้นหลังจากการกระตุ้น LPS IL12 ที่สร้าง Rapa-M-DC เหล่านี้ได้ปรับปรุงการตายของเซลล์ทีเซลล์ alloreactive ซึ่งเป็นกลไกที่เกี่ยวข้องกับ IFN [51] ในทำนองเดียวกัน CD14 บวกโมโนไซต์ที่แพร่พันธุ์ต่อหน้าราปามัยซินยังผลิต IL12p70 ที่สูงขึ้นพร้อมกับระดับ IL27 ที่ควบคุมการทำงานของเซลล์ NK ซึ่งเปลี่ยนการตอบสนองของทีเซลล์ที่เป็นอัลโลเจนิกผ่านทาง IFN [52] ในไต,การถ่ายโอน Tregs ที่ได้รับ rapamycin ได้ยับยั้ง T cell, myeloid cell และ myofifibroblast อย่างเห็นได้ชัด ส่งผลให้เฉียบพลันและเรื้อรังดีขึ้นโรคไตเปรียบเทียบกับการรักษาหนูด้วย Rapamycin โดยตรง [53] ในทำนองเดียวกัน การถ่ายโอนเซลล์ต้านจากมัยอีลอยด์ที่ได้รับการบำบัดด้วยราพามัยซิน (MDSC) ไปใช้ในหนูดีขึ้นการทำงานของไตด้วยความเสียหายทางเนื้อเยื่อวิทยาที่ลดลงและการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกัน [54] การศึกษาเหล่านี้ให้หลักฐานว่าการบำบัดด้วยเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับการรักษาเซลล์ที่มีราพามัยซินก่อนการฉีดจะหลีกเลี่ยงผลข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์ที่อาจเกี่ยวข้องกับการรักษาด้วยราพามัยซินทั้งระบบ นอกจากนี้ เราได้ทดสอบการใช้เมตฟอร์มินหรือสารประกอบ เช่น 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1- -4- ribofuranoside (AICAR) เพื่อกระตุ้นฟีโนไทป์ควบคุมใน DC ของเมาส์เพื่อทดสอบบทบาทในการเปลี่ยนแปลงไตไออาร์ไอ เช่นเดียวกับกลยุทธ์การจ่ายยาที่ใช้กับราพามัยซิน (Rapa-S-DC) เราบำบัด BMDC ด้วยขนาดต่ำของเมตฟอร์มิน (1 มิลลิโมลาร์) หรือ AICAR (1 มิลลิโมลาร์) ในวันที่ 7 ร่วมกับ LPS เราฉีด 0.5 x 106 ของ metformin-DCs หรือ AICAR-DCs อย่างเป็นระบบหนึ่งวันก่อนไตไออาร์ไอ หนูที่บำบัดด้วยเมตฟอร์มิน-DC หรือ AICAR-DC อย่างใดอย่างหนึ่งได้รับการปกป้องอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่ได้รับการบำบัดด้วย NC หรือ Veh-DC (การสังเกตที่ไม่ได้เผยแพร่ ห้องทดลองของ Bajwa) ดังนั้น ยาหรือสารประกอบหลายชนิดที่กระตุ้นการเปลี่ยนแปลงทางเมตาบอลิซึมหรือกระตุ้นวิถี AMPK อาจคุ้มค่าที่จะทดสอบโดยลำพังหรือร่วมกัน เป็นที่น่าสังเกตว่าการใช้ยาหรือสารประกอบหลายอย่างรวมกัน (เมตฟอร์มินหรือ AICAR) ที่อาจช่วยเสริมผลการป้องกันของราพามัยซินนั้นยังไม่มีการสำรวจเมื่อประเมินการใช้ใน BMDC ในเซลล์มะเร็ง การรวม AICAR กับ rapamycin จะช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของ rapamycin เพื่อยับยั้ง mTORC2 เพื่อกระตุ้นการตายของเซลล์ [55] ในทีเซลล์ การใช้เมตฟอร์มินและราพามัยซินร่วมกันได้รับการทดสอบว่าเป็นตัวควบคุมจุดตรวจเมตาบอลิซึมที่อาจส่งผลต่อการทำงานของทีเซลล์ [56] ดังนั้น วิธีการรักษาแบบผสมผสานเหล่านี้จึงควรได้รับการทดสอบในอนาคตด้วย BMDC ที่ทนต่อสารก่อมะเร็งหรือตามระเบียบข้อบังคับในฐานะผู้ควบคุมที่มีศักยภาพโดยตรงหรือโดยอ้อมของจุดตรวจเมตาบอลิซึม
Rapamycin: บทบาทของไมโตคอนเดรียในเซลล์เดนไดรต์และมาโครฟาจฟังก์ชั่น DC และมาโครฟาจถูกควบคุมโดยเมแทบอลิซึมของไมโตคอนเดรีย มาโครฟาจประเภทที่ 1 [57,58] และอิมมูโนเจนิก DCs (การกระตุ้นด้วย TLR-mediated) มีการเปลี่ยนผ่านเมตาบอลิซึมซึ่งไมโตคอนเดรียลออกซิเดชันฟอสโฟรีเลชันถูกยับยั้งโดยไนตริกออกไซด์ที่สังเคราะห์ภายในร่างกาย (NO) และความมุ่งมั่นต่ออัตราไกลโคไลติกแบบแอโรบิกสูง [59] การกระตุ้น DCs หรือมาโครฟาจโดย TLR agonists (LPS หรือ CpG) หลายตัวนำไปสู่การเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วของ glycolysis ตามด้วยการลดลงของ OXPHOS และศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย [59–61] บทบาทบางอย่างของไมโตคอนเดรียได้รับการแสดงให้เห็นด้วย DCs ที่รักษาในหลอดทดลองด้วยวิตามินดี DC เหล่านี้ได้เพิ่ม OXPHOS, มวลไมโตคอนเดรีย และการผลิต mROS [62] การศึกษาล่าสุดของเราโดยใช้ FTY720 [18] แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงที่คล้ายกันใน DC (OXPHOS ที่สูงขึ้นและการสร้างภูมิคุ้มกันน้อยลง) การรักษาด้วยราพามัยซินแบบเฉียบพลันได้รับการแสดงเพื่อยืดอายุเซลล์ของ DCs ที่ขึ้นอยู่กับการรักษาหน้าที่ของไมโตคอนเดรีย [10] ผ่านการยับยั้ง NO ตรงกันข้ามกับการเพิ่มอายุขัยของ DCs กลุ่มเดียวกันยังรายงานว่าการได้รับ rapamycin ใน DCs เฉียบพลันหรือสั้น ๆ ยังทำให้สารกระตุ้นที่มีศักยภาพของ CD8 บวก T เฉพาะแอนติเจน ซึ่งช่วยเพิ่มการควบคุม B16 melanoma เมื่อฉีดวัคซีนในหนู [63] การบำบัดแบบเฉียบพลัน (90 นาที) ของ DCS ที่ได้มาจากโมโนไซต์ของมนุษย์ด้วยราพามัยซินยับยั้งโมเลกุลซึ่งกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่เหนี่ยวนำด้วย LPS และศักยภาพในการกระตุ้นแบบ allo ที่เกี่ยวข้องกับการไร้ความสามารถของ DCS ที่ถูกบำบัดเพื่อเพิ่มการส่งสัญญาณ NF-kB [64] ในแมคโครฟาจ ราพามัยซินยับยั้งการผลิต IL1 และ IL-18หลังจากการกระตุ้น LPS กระบวนการที่เกี่ยวข้องกับการลด ROS ของไมโตคอนเดรีย (mtROS) โดยการยับยั้งวิถีของ NLRP3 inflflammasome-p38 MAPK-NF-kB โดยตรง [65] rapamycin condensed DC (Rapa-DC) จากหนูและมนุษย์มีพฤติกรรมแตกต่างกัน เมื่อเทียบกับหนูเมาส์ Rapa-DC Rapa-DC ของมนุษย์ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีความทนทานต่อการเจริญเต็มที่บางส่วนหลังจากไซโตไคน์ที่ลุกลามอย่างรวดเร็วและแสดงความแตกต่างในการควบคุมการขยายตัวของ T-cell ของเอฟเฟกต์และ ฟังก์ชัน [66] Macedo et al. Macedo et al. Macedo et al. ได้ทบทวนคุณสมบัติทางภูมิคุ้มกันในการควบคุมดูแลของ DCs ที่ได้รับโมโนไซต์ที่ปรับสภาพด้วยราพามัยซิน [67].
ผลการวิจัยในปัจจุบันของเราบ่งชี้ว่า DCs ที่บำบัดด้วยราพามัยซินเดี่ยวหรือหลายตัวมีฟีโนไทป์ที่สร้างภูมิคุ้มกันและกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่ลดลงหลังจากการกระตุ้น LPS การโอน DCs เหล่านี้ปกป้องไตจากไออาร์ไอ Rapamycin ควบคุมการเปลี่ยนแปลงของไมโตคอนเดรีย การรักษาหลายอย่างเท่านั้นทำให้เกิดจำนวนไมโตคอนเดรียที่สูงขึ้น ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า DC mitochondrial dynamics (ปริมาณ mitochondria สูงกว่า) พร้อมด้วยฟีโนไทป์ immunogenic น้อยที่เหนี่ยวนำโดย rapamycin ให้การป้องกันร่วมกันไตจากการบาดเจ็บจากสารเคมี แม้ว่าสิ่งที่น่าสนใจกว่านั้น ข้อมูลของเราที่มี DCs ที่ได้รับการรักษาด้วยไมโตคอนเดรียภายนอกบ่งชี้ว่าจำนวนไมโตคอนเดรียที่สูงขึ้นสามารถเอาชนะสถานะอิมมูโนเจนิกของ DCs ได้มากขึ้นหลังจากการกระตุ้น LPS เพื่อปกป้องเช่นกันไตจากไออาร์ไอ เป็นเรื่องที่น่าสนใจที่จะยืนยันว่าจำนวนไมโตคอนเดรียที่สูงขึ้นใน DC เปลี่ยนแปลงการตอบสนองของ T เซลล์หรือไม่ DCs มีความสามารถในการเปลี่ยนแปลงการตอบสนองของภูมิคุ้มกันตามที่การศึกษาก่อนหน้านี้ระบุไว้ ข้อมูลเบื้องต้นของเราบ่งชี้ว่า ในการศึกษาการเพิ่มจำนวนเซลล์ T ที่ก่อให้เกิดโรคทั้งหมด DC ที่มีจำนวนไมโตคอนเดรียสูงกว่าจะยับยั้งการเพิ่มจำนวน CD4 T เซลล์ในปฏิกิริยาลิมโฟไซต์แบบผสม (MLR ข้อมูลไม่แสดง) ขณะนี้ยังไม่ชัดเจนว่า DC ที่มีจำนวนไมโตคอนเดรียสูงกว่าสามารถกระตุ้นการตอบสนอง Treg ที่อาจส่งผลในเชิงบวกต่อการปกป้องไตจากไออาร์ไอ สิ่งเหล่านี้จะเป็นจุดสนใจของการศึกษาครั้งต่อไปของเรา
บทสรุป โดยสรุป เราได้แสดงให้เห็นว่า BMDC สามารถควบคุมได้ไตบาดเจ็บโดยกลไกล anism ที่เกี่ยวข้องกับการสร้าง mitochondria biogenesis โดยการบำบัดหลายครั้งด้วย rapamycin หรือการเพิ่มจำนวน mitochondria จากภายนอกโดยใช้ mitochondria จากภายนอก เราสรุปได้ว่า DC ตามกฎข้อบังคับ (DC ที่มีจำนวนไมโตคอนเดรียสูงกว่า) อาจมีประโยชน์ในไตIRI เช่นเดียวกับในสภาวะการอักเสบอื่น ๆ เช่นการปลูกถ่ายและความผิดปกติของภูมิต้านทานผิดปกติเพื่อป้องกันหรือรักษาอาการบาดเจ็บ
