การวิเคราะห์โปรตีโอมและความสามารถในการต้านไวรัส ต้านมะเร็ง และสารต้านอนุมูลอิสระในหลอดทดลองของสารสกัดที่เป็นน้ำของเห็ดเลนตินูลาเอโดเดสและเห็ด Pleurotus Ostreatus

สอบถามรายละเอียดเพิ่มเติมได้ที่tina.xiang@wecistanche.com

เชิงนามธรรม: ในการศึกษานี้ เราศึกษาสารสกัดในน้ำของเห็ดที่รับประทานได้ Pleurotus ostreatus (เห็ดนางรม) และ Lentinula edodes (เห็ดหอม) การวิเคราะห์โปรตีโอมดำเนินการโดยใช้ LC-Triple TOF-MS และแสดงการแสดงออกของโปรตีน 753 ชนิดโดย Pleurotus ostreatus และ 432 โปรตีนโดย Lentinula edodes เปปไทด์ที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพ: Rab GDP dissociation inhibitor, superoxide dismutase, thioredoxin reductase, serine proteinase และ lectin ถูกระบุในเห็ดทั้งสองชนิด สารสกัดยังรวมถึงสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่มีแนวโน้ม ได้แก่ ฟีนอลฟลาโวนอยด์, วิตามิน และกรดอะมิโน สารสกัดมีแนวโน้มกิจกรรมต้านไวรัสด้วยดัชนีการเลือก (SI) 4.5 สำหรับ Pleurotus ostreatus กับ adenovirus (Ad7) และกิจกรรมเล็กน้อยสำหรับ Lentinula edodes ต่อโรคเริม-II (HSV-2) สารสกัดไม่เป็นพิษต่อเซลล์โมโนนิวเคลียร์ในเลือดของมนุษย์ปกติ (PBMCs) ในทางตรงกันข้าม พวกเขาแสดงความเป็นพิษต่อเซลล์ในระดับปานกลางต่อเซลล์มะเร็งหลายชนิด นอกจากนี้ ประเมินฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระโดยใช้DPPHการกวาดล้างอย่างรุนแรง, การกำจัดไอออนอนุมูลอิสระของ ABTS และการทดสอบ ORAC สารสกัดทั้งสองมีศักยภาพฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยกิจกรรมสูงสุดที่เห็นได้สำหรับ Pleurotus ostreatus (IC50 ug/mL)=39.46 ± 1.27 สำหรับ DPPH;11.22±1.81 สำหรับ ABTS; และ 21.40±2.20 สำหรับการทดสอบ ORAC การศึกษานี้สนับสนุนการใช้เห็ดเหล่านี้ในการแพทย์ในแง่ของความเป็นพิษต่อเซลล์ต่ำต่อ PBMC ปกติเมื่อเทียบกับความสามารถในการต้านไวรัส ต้านเนื้องอก และต้านอนุมูลอิสระ

คีย์เวิร์ด: เชื้อราขาวเน่า; Pleurotus ostreatus; Lentinula edodes; เห็ดหอม; สารต้านอนุมูลอิสระ ต้านมะเร็ง; ยาต้านไวรัส

1. บทนำ

เห็ดมีโอกาสสูงในด้านการผลิตยาและอาหารเสริม นอกจากมีคุณสมบัติทางประสาทสัมผัสที่ดีและมีคุณค่าทางโภชนาการสูงแล้ว ยังมีรายงานว่าเห็ดหลายชนิดมีฤทธิ์ทางเภสัชวิทยามากมาย [1-3] ในบรรดาเห็ดที่ปลูกกันอย่างแพร่หลายที่สุดคือ Lentinula edodes(เห็ดหอม) และ Pleurotus ostreatus (เห็ดนางรม) เห็ดหอมมาเป็นอันดับสองรองจาก Agaricus bisporus ในฐานะเห็ดที่บริโภคได้มากที่สุดในโลก [4] เห็ดนี้มีผลต้านเชื้อแบคทีเรีย เชื้อรา ไวรัส ตับ ป้องกันน้ำตาลในเลือด และภูมิคุ้มกัน [5-7] อุดมไปด้วยโมเลกุลที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพ ซึ่งมีการศึกษามากที่สุดคือ "เลนติแนน" ซึ่งเป็นพอลิแซ็กคาไรด์ที่มีฤทธิ์ต้านแบคทีเรีย ไวรัส และเนื้องอก นอกเหนือจาก "เลนตินัน" ซึ่งช่วยควบคุมภาวะไขมันในเลือดผิดปกติและน้ำตาลในเลือดสูง [8] Pleurotus ostreatus เป็นสายพันธุ์ที่พบมากที่สุดในสกุล Pleurotus [9] หรือที่เรียกว่าเห็ดนางรม เป็นตัวย่อยสลายไม้และมีกิจกรรมทางชีวภาพที่หลากหลาย [10] เมื่อเปรียบเทียบกับเห็ดรักษาโรคอื่นๆ เห็ดนางรมกลายเป็นที่นิยมมากขึ้นในฐานะผู้ส่งเสริมสุขภาพ [11] การปรากฏตัวของส่วนประกอบที่มีคุณค่าทางโภชนาการจำนวนมาก เช่น เลคติน โพลีแซ็กคาไรด์ วิตามิน และแร่ธาตุในเห็ดนางรมทำให้สามารถมีคุณสมบัติในการต้านมะเร็งสารต้านอนุมูลอิสระ, ต้านเบาหวาน, ต้านจุลชีพ, และต้านภาวะไขมันในเลือดสูง [12,13]. เมื่อเทียบกับเห็ดชนิดอื่นที่กินได้ หอยนางรมและเห็ดชิตาเกะมีระยะเวลาการเจริญเติบโตสั้นและสามารถเก็บเกี่ยวได้ตลอดทั้งปี 14 อันเป็นผลมาจากความง่ายในการเพาะปลูกและการทดสอบ คุณค่าทางโภชนาการสูงและประโยชน์ทางยาที่คาดหวัง เห็ดเหล่านี้จึงมีศักยภาพมหาศาล ในอุตสาหกรรมอาหารและยา [4,15]. ที่จริงแล้ว Basidiomycetes ที่สูงกว่าสามารถมีแนวโน้มว่าจะเป็นอาหารอเนกประสงค์

สารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพหลายชนิด รวมทั้งน้ำตาล โปรตีนที่ออกฤทธิ์ทางสรีรวิทยา กรดไขมันไม่อิ่มตัว ฟีนอลิก (กรดฟีนอลและโพลีฟีนอล) ฟลาโวนอยด์ เทอร์พีนอยด์ ไกลโคโปรตีน โพลีคีไทด์ สเตียรอยด์ และอัลคาลอยด์ ถูกพบในเห็ดทั้งสองชนิดนี้ [16,17] สารประกอบเหล่านี้ทำหน้าที่เพียงอย่างเดียวหรือเสริมฤทธิ์กันเพื่อทำให้เกิดการกระทำทางเภสัชวิทยาในวงกว้างของเชื้อราเหล่านี้ มีรายงานว่าเห็ดหอมและเห็ดนางรมมีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรีย ต้านไวรัส ยาลดความดันโลหิต ภูมิคุ้มกัน และสารต้านอนุมูลอิสระ [1,18,19] ซอและคณะ [20] สรุปกลไกการออกฤทธิ์ต้านไวรัสของชีวโมเลกุลของเห็ด ซึ่งบ่งชี้ว่าการลดลงของการติดเชื้อไวรัสโดยหลักแล้วผ่านการรบกวนการดูดซึมของไวรัสเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน การจำลองแบบของมัน และการสังเคราะห์โปรตีนและเอนไซม์ของมัน นอกเหนือจากการกระตุ้น ภูมิต้านทานของร่างกาย [21]. สารต้านอนุมูลอิสระเป็นโมเลกุลที่สำคัญในการเผชิญกับชนิดของออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยาซึ่งอยู่เบื้องหลังปัญหาสุขภาพมากมาย เนื่องจากมีการยกธงสีแดงจำนวนมากขึ้นเพื่อต่อต้านการใช้สารต้านอนุมูลอิสระสังเคราะห์ การศึกษาสารธรรมชาติจึงกลายเป็นข้อบังคับ [22] ฤทธิ์ต้านเนื้องอกของผลิตภัณฑ์ในห้องเก็บเห็ดเหล่านี้เกี่ยวข้องกับชีวโมเลกุล ได้แก่ กลูแคน เออร์กอสเตอรอล โปรตีโอไกลแคน และกรดอะมิโน (อาร์จินีนและกลูตามีน)[23] กลไกที่สันนิษฐานไว้ซึ่งอยู่เบื้องหลังผลกระทบนี้อาจรวมถึงการกระตุ้นของ T-lymphocytes การปราบปรามของ neovascularization และการชักนำให้เซลล์มะเร็งตาย นอกเหนือจากการกระตุ้นการตอบสนองของภูมิคุ้มกันต่อเซลล์มะเร็ง [24,25]

โปรตีโอมิกส์ได้พิสูจน์ตัวเองว่าเป็นเครื่องมือที่มีค่าอย่างหนึ่งในการวิจัยทางชีวภาพ โดยเฉพาะอย่างยิ่งการวิจัยทางการเกษตร [26] Lindequist และคณะ [27]เป็นกลุ่มแรกที่ให้ความกระจ่างเกี่ยวกับความสำคัญของการใช้โปรตีโอมิกส์ในการวิจัยเห็ดที่กินได้ พวกเขาเน้นถึงความจำเป็นในการใช้ "omics" ในการศึกษาโมเลกุลที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพของเชื้อรา มีการใช้โปรตีโอมิกส์เพียงเล็กน้อยในการวิจัยเห็ดที่รับประทานได้กับเชื้อราที่ทำให้เกิดโรค [28] ดังนั้น การศึกษานี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อวิเคราะห์โปรตีนของเห็ดที่กินได้ทั้งสองชนิด คือ Pleurotus ostreatus และ Lentinula edodes และตรวจสอบศักยภาพของเห็ดเหล่านี้ยาต้านไวรัส, ฤทธิ์ต้านเนื้องอกและสารต้านอนุมูลอิสระ

2. ผลลัพธ์

2.1.การวิเคราะห์ Proteom1e

การวิเคราะห์โปรตีโอมดำเนินการโดยใช้การวิเคราะห์ LC-Triple TOF-MS ที่มีอัตราการค้นพบที่ผิดพลาด (FDR) ของ<5% and="" a"95%="" confidence="" of="" identification".="" for="" p.ostreatus,="" a="" total="" of="" 753="" proteins="" were="" identified,34="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" a="" total="" of="" 432="" proteins="" were="" detected="" in="" ledodes,="" 48="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" the="" recorded="" accession="" numbers="" of="" the="" proteins="" are="" included="" in="" tables="" s1="" and="" s2="" for="" p.="" ostreatus="" and="" l.edodes,="" respectively.="" in="" tables="" s1="" and="" s2,="" the="" ms-triple="" tof="" data="" were="" analyzed="" by="" proteinpilot="" with="" the="" paragon="" algorithm.="" proteins="" were="" identified="" with="" peptides="" that="" gave="" more="" than="" a="" 95%="" confidence="" of="" identification.="" bioactive="" proteins:="" rab="" gdp="" dissociation="" inhibitor,="" superoxide="" dismutase,="" thioredoxin="" reductase,="" serine="" proteinase,="" and="" lectin,="" were="" expressed="" in="" both="" p.ostreatus="" and="" l.edodes="" extracts="" [29-35].="" p.="" ostreatus="" also="" expressed="" osteolysis="" and="" pleurotolysin,="" whereas="" latch="" pin="" and="" valosin-containing="" protein="" were="" expressed="" by="" l.edodes.="" lc-triple="" tof-ms="" spectra="" of="" the="" mushroom="" extracts="" analyzed="" by="" analyst="" tf1.7.1="" (sciex="" software)="" are="" shown="" in="">

2.2. สารออกฤทธิ์ทางชีวภาพรวม สารบัญทั้งหมด

ในการประเมินเนื้อหาทั้งหมด ซึ่งรวมถึงการประเมินคาร์โบไฮเดรตทั้งหมด โปรตีน ฟีนอลและฟลาโวนอยด์ สารสกัดจาก P. ostreatus มีจำนวนคาร์โบไฮเดรตเกือบสามเท่าและเพิ่มจำนวนโปรตีนในสารสกัด L.edodes สองเท่า; อย่างไรก็ตาม สารสกัด L.edodes ตรวจพบสารฟลาโวนอยด์มากกว่าสารสกัด P. ostreatus (ตารางที่ 1)

2.3. โมเลกุลฟีนอลและฟลาโวนอยด์

สารสกัดจากเห็ดทั้งสองชนิดมีคาเทชิน (ตรวจพบในเวลาเก็บรักษา 26.48 นาที) P.ostreatus ยังรวมถึง kaempferol และ apigenin (ตรวจพบที่เวลาการเก็บรักษา 59.13 นาทีและ 59.56 นาทีตามลำดับ) ในขณะที่ L.edodes ยังมี quercetin (เวลาเก็บรักษา=56.86 นาที ตารางที่ 2; ส1).

2.4.วิตามิน

ปริมาณวิตามินที่ละลายในน้ำและที่ละลายในไขมันถูกกำหนดหาผ่านทาง HPLC (ตารางที่ 3 และรูปที่ S2 และ S3) เห็ดทั้งสองชนิดอุดมไปด้วยวิตามินซี โดยมีปริมาณวิตามิน B3, B6 และ D ที่ตรวจพบได้ ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างเห็ดทั้งสองในปริมาณของวิตามินที่เห็ดมี ในทางกลับกัน วิตามิน B1, B2, B9, A และ E ถูกตรวจไม่พบในเห็ดทั้งสองชนิด

2.5. การวิเคราะห์กรดอะมิโน

เครื่องวิเคราะห์กรดอะมิโน Sykam ใช้สำหรับการวิเคราะห์กรดอะมิโน ปริมาณกรดอะมิโนทั้งหมดเท่ากับ 5.14 และ 4.35 ใน P.ostreatus และ L.edodes ตามลำดับ ดังแสดงในตารางที่ 4 และเห็ดทั้งสองชนิดอุดมไปด้วยกรดกลูตามิก ในขณะที่ตรวจพบโพรลีนในความเข้มข้นมาก (โปรตีน 0.57 ก./100 กรัม) ในสารสกัด P. ostreatus ไม่พบในสารสกัด L.edodes ตรวจพบฮิสติดีนและกรดแอสปาร์ติกในเห็ดทั้งสองชนิด

2.6. กิจกรรมทางชีวภาพ

2.6.1.กิจกรรมต้านไวรัส

ประเมินฤทธิ์ต้านไวรัสกับไวรัสสองตัว: adenovirus และ herpes simplex-II ดังแสดงในตารางที่ 5 สารสกัด P.ostreatus แสดงฤทธิ์ต้านไวรัสอย่างมีประสิทธิภาพต่อ adenovirus โดยมีดัชนีการคัดเลือกสูงถึง 4.5 นอกจากนี้ยังมีการบันทึกฤทธิ์ต้านไวรัสที่มีแนวโน้มว่าจะเป็นสารสกัด P. ostreatus ที่ต่อต้านโรคเริม-II และสำหรับสารสกัด L.edodes ที่ต่อต้านไวรัสทั้งสองชนิด รูปที่ S4 และ S5 แสดงกราฟการตอบสนองปริมาณรังสี

2.6.2. ฤทธิ์ที่เป็นพิษต่อเซลล์ต่อ PBMC ของมนุษย์ปกติ

ความเป็นพิษต่อเซลล์น้อยที่สุด (IC50 ug/mL;66.41±3.7 และ 82.81± 2.72 สำหรับ P.ostreatus และ L. edodes ตามลำดับ) ถูกบันทึกเทียบกับ PBMC ของมนุษย์ปกติ

ต่อต้านเซลล์มะเร็ง

เซลล์มะเร็งชนิดต่างๆ ถูกใช้ในการทดสอบนี้ซึ่งรวมถึงมะเร็งต่อมลูกหมาก(DU-145 และ PC3); มะเร็งตับ (HepG2); มะเร็งลำไส้ใหญ่ (Colo-205); มะเร็งลำไส้ใหญ่ (LS-513); มะเร็งปากมดลูก (HeLa); และมะเร็งเต้านม (MDA-MB-231 และ MCF-7) Doxorubicin ถูกใช้เป็นยาควบคุมเชิงบวก (ทำให้ความสามารถในการมีชีวิตลดลงเหลือ 53 เปอร์เซ็นต์ใน HepG2; 44 เปอร์เซ็นต์ใน MDA-MB-231;39 เปอร์เซ็นต์ใน PC3;35 เปอร์เซ็นต์ใน DU-145; 29 เปอร์เซ็นต์ใน MCF -7:25 เปอร์เซ็นต์ใน LS-513;23 เปอร์เซ็นต์ใน HeLa และ 19 เปอร์เซ็นต์ในเซลล์ Colo-205) ผลลัพธ์ในรูปที่ 2 แสดงให้เห็นว่าสารสกัดจาก Ledodes และ P. ostreatus ลดความมีชีวิตของเซลล์มะเร็งที่ทดสอบแล้วของ LS-513, HepG2, DU-145 และ PC-3 ประมาณ 20 เปอร์เซ็นต์

ต่อต้านมะเร็งเม็ดเลือดขาวและมะเร็งต่อมน้ำเหลือง

สารสกัดจากเห็ดของ P.ostreatus และ L.edodes ได้รับการทดสอบสำหรับความเป็นพิษต่อเซลล์ต่อมะเร็งเม็ดเลือดขาว (CCR-CEM, NB-4, THP-1) และเซลล์มะเร็งต่อมน้ำเหลือง (U937) Doxorubicin เป็นมาตรฐานเชิงบวก ทำให้ความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์ลดลงเหลือ 29 เปอร์เซ็นต์ 25.5 เปอร์เซ็นต์ 20.3 เปอร์เซ็นต์ และ 19.1 เปอร์เซ็นต์ในเซลล์ U937, NB4, CCRF-CEM และ THIP1 ตามลำดับ สารสกัด L.edodes ลดความมีชีวิตของเซลล์ THP1 ลงเหลือ 66.02 เปอร์เซ็นต์ ในขณะที่สารสกัด P.ostreatus ลดความมีชีวิตของเซลล์ CCRF-CEM เหลือ 70.64 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 3)

2.6.3. กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ

ศึกษาผลของฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธีการประเมิน 3 วิธี คือ DPPHการกวาดล้างอย่างรุนแรงการกำจัดไอออนอนุมูลอิสระของ ABTS และการทดสอบ ORAC เมื่อเปรียบเทียบกับมาตรฐานสารต้านอนุมูลอิสระ Trolox แสดงไว้ในตารางที่ 6 และรูปที่ S6a,b ผลการวิจัยพบว่าสารสกัด P. ostreatus มีศักยภาพในการต้านอนุมูลอิสระมากกว่าสารสกัด L.edodes ตามที่ระบุโดยการทดสอบสารต้านอนุมูลอิสระทั้งสามแบบที่ใช้ รูปที่ 4 แสดงการสลายตัวของสัญญาณฟลูออเรสซีนที่เกิดจากสารสกัดในการทดสอบ ORAC

3. อภิปราย

เชื้อราเน่าขาวได้กระตุ้นความสนใจของชุมชนวิทยาศาสตร์เนื่องจากคุณสมบัติทางยา ซึ่งรวมถึงการปรับระบบภูมิคุ้มกัน ฤทธิ์ลดน้ำตาลในเลือดและต้านลิ่มเลือด และคุณสมบัติลดความดันโลหิต ต้านการอักเสบ ต้านจุลชีพ และต้านเนื้องอก ตลอดจนความสามารถในการลดระดับคอเลสเตอรอลในเลือด [ 24,36-38]. เชื้อราขาวเน่า P. ostreatus และ L.edodes เป็นเห็ดที่บริโภคได้มากที่สุดแห่งหนึ่งในหลายประเทศ [39] เห็ดสองตัวนี้ผลิตโปรตีนออกฤทธิ์ทางชีวภาพจำนวนมาก และการวิเคราะห์โปรตีนในปัจจุบันเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพที่สุดสำหรับการสร้างโปรไฟล์โปรตีน [40] ในการศึกษาปัจจุบัน การวิเคราะห์โปรตีโอมแสดงให้เห็นการแสดงออกของโปรตีนออกฤทธิ์ทางชีวภาพ ซึ่งรวมถึงตัวยับยั้งการแยกตัวของ Rab GDP, ไทโอเรดอกซินรีดักเตส, ซีรีนโปรตีเอส, ซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตสและเลกตินในเห็ดทดสอบทั้งสองชนิด ตัวยับยั้งการแยกตัวของ Rab GDP (Rab GDI) ควบคุมการทำงานของ Rab GTPases ซึ่งมีบทบาทสำคัญในการค้าเยื่อเมมเบรนในเซลล์เนื้องอก ดังนั้น การใช้ Rab GDI จึงเป็นกลยุทธ์ในการต้านมะเร็งที่มีแนวโน้มดี [29]

โปรตีนซีรีนมีส่วนช่วยในการยาต้านไวรัสกิจกรรมเห็ดกินได้ [30,31]. นอกจากนี้ Yap และคณะ (2018)รายงานความเป็นพิษต่อเซลล์ที่คัดเลือกมาอย่างแข็งแกร่งของซีรีนโปรตีเอสเมื่อเผชิญกับสายเซลล์มะเร็งต่อมลูกหมากของมนุษย์ (MCF7) และแนะนำว่ากลไกนี้เกี่ยวข้องกับผลการทำงานร่วมกันของกลไกการตายของเซลล์ทั้งภายนอกและภายใน นอกเหนือจากการกระตุ้นของแคสเปส{{ 4}} และ-9 และการยับยั้ง Bcl-2 [41]

การบริโภคของสารต้านอนุมูลอิสระเป็นกลยุทธ์การป้องกันที่เป็นมงคลกับพยาธิสรีรวิทยาที่อาศัยปฏิกิริยาออกซิเจน (ROS) ซึ่งเป็นสื่อกลาง [22] ผลลัพธ์ของเราแสดงการแสดงออกของเอ็นไซม์ของระบบป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระโดย Pleurotus ostreatus และ Lentinula edodes เอนไซม์เหล่านี้รวมถึงซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส คาตาเลส และกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดสซึ่งปรับสมดุลการผลิต ROS [32] ซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตสเริ่มต้นด้วยการเปลี่ยนซูเปอร์ออกไซด์เป็นไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ซึ่งในทางกลับกัน ถูกแปลงโดยคาตาเลสและกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดสให้เป็นน้ำ [33]

นอกจากนี้ยังตรวจพบการแสดงออกของเลกตินในเห็ดทั้งสอง นักวิจัยหลายคนรายงานโปรไฟล์ทางชีววิทยาที่หลากหลายอย่างน่าทึ่งของเลคตินด้วยกิจกรรมที่หลากหลายซึ่งรวมถึงฤทธิ์ต้านการอักเสบ ยากล่อมประสาท ยาคุมกำเนิด และยาขยายหลอดเลือด[34,35,42] เลคตินเป็นโปรตีนที่จับกับคาร์โบไฮเดรตที่มีการทำงานของเซลล์ที่หลากหลาย รวมถึงการปราบปรามในหลอดทดลองและในร่างกายของการเจริญเติบโตของเนื้องอกผ่านการผูกมัดแบบคัดเลือกกับเยื่อหุ้มเซลล์เนื้องอกหรือตัวรับของพวกมัน ส่งผลให้เกิดการกระตุ้นของโปรตีนไคเนส หรือการปรับการตอบสนองของภูมิคุ้มกันผ่านการผลิตอินเตอร์ลิวคิน [43]. นอกจากนี้ เลคตินจากเห็ดยังมีบทบาทในการกระตุ้นเส้นทางการตายของเซลล์ที่แตกต่างกัน รวมทั้งการตายของเซลล์, เนื้อร้าย และ/หรือ autophagy [42]

ข้อมูลของเราแสดงการแสดงออกของทั้ง osteolysis และ pleurotolysin ใน Pleurotus ostreatus เหล่านี้เป็นโปรตีนที่สร้างรูพรุนที่มีฤทธิ์ต้านมะเร็งที่คัดเลือกมาอย่างดี [44,45] Ostreolysin เป็นโปรตีน cytolytic 15 kDa ที่มีความสามารถในการซึมผ่านเซลล์เม็ดเลือดแดงและเซลล์อื่น ๆ ที่ความเข้มข้นย่อยไมโครโมลาร์ มันทำหน้าที่ผ่านกลไกออสโมติกคอลลอยด์และกระตุ้นการก่อตัวของรูขุมขนเมมเบรนกว้าง|46,47I นิมรี และคณะ ผลิต pleurotolysin รีคอมบิแนนท์ที่มีฤทธิ์ต้านเนื้องอกที่มีศักยภาพในการต่อต้านเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่ของมนุษย์และหนูเมาส์ [48]

ใน L.edodes แสดงโปรตีนที่มีวาโลซินและสลักสลัก ก่อนหน้านี้มีรายงานว่าโปรตีนที่ประกอบด้วยวาโลซินมีสารต้านอนุมูลอิสระคุณสมบัติซึ่งสามารถช่วยในกลุ่มอาการของเส้นประสาท เช่น โรคอัลไซเมอร์ เส้นโลหิตตีบด้านข้าง และภาวะสมองเสื่อม [49-51] Latcripin เป็นสารต้านมะเร็งที่มีศักยภาพ [50] Riaz Ud Din et al.(2020) ได้ตรวจสอบกลไกการต้านมะเร็งของสลักกับเซลล์มะเร็งเต้านม พวกเขารายงานถึงความสามารถในการกระตุ้นการตายของเซลล์เช่นเดียวกับการแตกอัตโนมัติ นอกเหนือจากผลการยับยั้งการย้ายถิ่นและการบุกรุก [52]

สารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพหลายชนิดถูกหาปริมาณในสารสกัด P.ostreatus และ L.edodes สารสกัด TPN 19.37 ± 0.39 และ 24.14 ± 1.01 มก./กรัม สำหรับ P.ostreatus และ L.edodes ตามลำดับ ถูกตรวจพบในการศึกษาปัจจุบัน ค่าเหล่านั้นสูงกว่าค่าที่ Rahimah et al. บันทึกไว้ ซึ่งใช้การทดสอบแอมโมเนียมและชิโนดะเพื่อหาปริมาณปริมาณฟลาโวนอยด์ทั้งหมดของ P. ostreatus เท่ากับ 6.67 มก./กรัมของสารสกัด [53] นอกจากนี้ ผลลัพธ์ของเรายังสูงกว่าที่พบใน Montibus et al. ซึ่งตรวจสอบ TPC ในสารสกัด L edodes โดยใช้วิธี Folin-Ciocalteu และพบว่า 0.8-1.5 เปอร์เซ็นต์ของน้ำหนักแห้ง (DW) ในตัวพิมพ์ใหญ่และ 0.8-1.1 เปอร์เซ็นต์ dw ในแถบ [54]

ตรวจพบคาเทชินทั้งในสารสกัด P. ostreatus และ L.edodes Catechin เป็นสารฟีนอลิกรองจากพืช โดยมีคุณสมบัติในการขับอนุมูลอิสระ [55] สารสกัด L.edodes พบว่ามีสารฟลาโวนอยด์เควอซิติน ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของเควอซิตินเป็นสื่อกลางผ่านการควบคุมระดับกลูตาไธโอนและการเพิ่มขึ้นของการผลิตเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระรวมถึงกลูตาไธโอนทรานสเฟอร์เรสและอัลโดคีโตรีดักเตส [56] นอกจากนี้ มีรายงานว่าเควอซิทินมีฤทธิ์ต้านเนื้องอกโดยขัดขวางวงจรเซลล์และส่งเสริมการตายของเซลล์ [57,58] ลี และคณะ รายงานว่า quercetin ทำให้เกิดการจับกุมเซลล์ในเซลล์มะเร็ง PC3, Du145 และ U937 [59] ผลลัพธ์ของเรายังเผยให้เห็นด้วยว่าพบกระชายและ apigenin ใน P.ostreatus Kaempferol และ apigenin ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและต่อต้านการงอกขยาย [60-62] พบว่ากรดกลูตามิกเป็นกรดอะมิโนที่มีมากที่สุดในสารสกัดจากเห็ดทั้งสองชนิด ในแนวทางเดียวกัน Chirinang et al. ได้วิเคราะห์ปริมาณกรดอะมิโนของ P. ostreatus และ P. major-caju และพบว่าปริมาณกรดกลูตามิกสูงที่สุด รองลงมาคือ aspartic acid และ arginine [63]

P.ostreatus และ L. edodes แสดงฤทธิ์ต้านไวรัสที่มีแนวโน้มว่าจะต่อต้าน adenovirus และ herpes simplex virus-II โดย SI ถึง 4.5 สำหรับ P. ostreatus ที่สกัดจาก adenovirus SI ถูกใช้เพื่อประเมินประสิทธิภาพและความปลอดภัยของสารสกัดในขณะที่มันประเมินหน้าต่างระหว่างกิจกรรมที่เป็นพิษต่อเซลล์และต้านไวรัส ยิ่ง SI สูง สารประกอบยิ่งปลอดภัยและมีประสิทธิภาพมากขึ้น [64,65] ข้อมูลที่เกี่ยวข้องเพิ่งแสดงโดย Urbancikova et al. โดยที่ pleuran (ที่ไม่ละลายน้ำ -1,3/1,6-อาหารเสริม D-glucan ที่แยกได้จาก P. ostreatus) ช่วยลดระยะเวลาของไวรัสเริมได้อย่างมีนัยสำคัญ -อาการ I ที่มีอาการระบบทางเดินหายใจรุนแรงน้อยกว่าในผู้ป่วยโรคเริมที่ติดเชื้อไวรัส-I-positive มากกว่ากลุ่มที่ได้รับยาหลอก โดยไม่มีผลข้างเคียงที่มีนัยสำคัญ เสนอให้เยื่อหุ้มปอดใช้ในอนาคตที่เป็นไปได้ในการรักษาโรคเริมเฉียบพลันไวรัส-I [66]

ฤทธิ์ต้านไวรัสของเห็ดส่วนใหญ่เกิดจากการรบกวนการดูดซึมของไวรัส การจำลองแบบ การทำงานของเอนไซม์ และการทำงานของเปปไทด์ ตลอดจนการกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันของโฮสต์ [67] Seo และ Choi (2021) เสนอว่า -กลูแคนในส่วนของพอลิแซ็กคาไรด์ของ P.ostreatus และ L.edodes อาจเป็นตัวกำหนดผลในการต้านโรคเริมผ่านผลก่อนและหลังการรักษา [20] ฤทธิ์ต้านเอชไอวีของสารสกัดน้ำของ P. ostreatus และ L.edodes อาจเกิดจากการยับยั้งเอนไซม์ reverse transcriptase โดยโปรตีนคล้ายยูบิควิตินและเลปตินตามลำดับ [68,69]

สารสกัดที่เป็นน้ำของเห็ดของเราแสดงให้เห็นว่าสามารถยับยั้งการมีชีวิตของเซลล์มะเร็งที่ทดสอบได้ประมาณ 20 เปอร์เซ็นต์ นอกจากนี้เรายังเห็นผลที่คล้ายกันกับเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาวและมะเร็งต่อมน้ำเหลือง โดยความสามารถในการมีชีวิตลดลงถึง 66 เปอร์เซ็นต์ด้วยสารสกัด L.edodes ต่อเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาว THP1 และ 70.6 เปอร์เซ็นต์ด้วยสารสกัด P.ostreatus ต่อเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาว CCRF-CEM ก่อนหน้านี้มีรายงานว่าสารสกัดจากเส้นใยไมซีเลียลและผลไม้ของ L.edodes มีฤทธิ์ต้านการงอกขยายและการตายของเซลล์ในเซลล์มะเร็งเต้านม MCF-7[70] เศษส่วนเอทิลอะซิเตตและ -กลูแคนของแอล.เอโดเดสส่วนใหญ่รับผิดชอบต่อการกระทำเหล่านี้[71,72] ในบริบทเดียวกัน สารสกัด P. ostreatus สามารถแสดงฤทธิ์ต้านการงอกขยายต่อ MCF-7 และ MDA-MB-231 เซลล์มะเร็งต่อมน้ำเหลืองของเต้านม [73] และ 6-เชื่อมโยงกลูแคน ของสารสกัดที่กระตุ้นความเป็นพิษต่อเซลล์ของนักฆ่าตามธรรมชาติต่อเซลล์มะเร็งเต้านมและปอด [74] ล่าสุด ยาโคโปวิช และคณะ พบว่าการเตรียมเห็ดสมุนไพรที่ประกอบด้วยเห็ด 6 และ 10 ตัว รวมทั้ง L.edodes และ P. ostreatus มีฤทธิ์ต้านการงอกขยายและโปรอะพอพโทซิสอย่างมีนัยสำคัญต่อเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่ (HCT-116, SW620) [75] ในทางตรงกันข้าม ผู้เขียนสังเกตเห็นว่าผลกระทบต่อสายเซลล์ไฟโบรบลาสต์ของมนุษย์ (WI-38) มีการงอกขยาย ซึ่งแสดงให้เห็นความจำเพาะของการเตรียมเห็ดเหล่านี้ที่มีต่อสายพันธุ์ของเซลล์เนื้องอก ในทำนองเดียวกัน เราตรวจพบว่ามีความเป็นพิษต่อเซลล์น้อยที่สุดที่เห็ดขับออกมาเทียบกับ PBMC ปกติของมนุษย์ การค้นพบนี้ยังชี้ให้เห็นถึงการใช้เห็ดของเราอย่างปลอดภัย

ความเป็นพิษต่อเซลล์ของเห็ดเกิดจากโมเลกุลที่หลากหลาย รวมทั้ง x- และ -glucans, โปรตีน, ไกลโคโปรตีน, กรดไขมัน, สารต้านนิวคลีโอไซด์, เทอร์พีนอยด์ และสารประกอบฟีนอลิก [76] อับดุลลา และคณะ (2012) เสนอว่าสารสกัดจากเห็ดยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์มะเร็งเต้านมโดยยับยั้งการทำงานของอะโรมาเทส [77] อิหม่ามและคณะ (2021) แยกอินโดล-3-กรดแลคติกออกจากเลโดเดสที่ยับยั้งการแบ่งตัวของเซลล์มะเร็งต่อมน้ำเหลืองในปอด [78] ยูคาวะและคณะ (2012) เสนอแนะว่าผลโดยตรงของการตายแบบอะพอพโทติกของ L edodes mycelia บนเซลล์ HepG2 คือผ่านการกระตุ้นของ caspase-3 และ -8 death receptor pathways [79] Wu et al. (2011) ศึกษาผลกระทบที่เป็นพิษต่อเซลล์ของสารสกัดจากโปรตีนของ P. ostreatus ต่อเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนักของมนุษย์ (SW480) และมะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิด monocytic ของมนุษย์ THP-1 (เซลล์) และรายงานการเกิด ROS อ่อนเพลีย ของกลูตาไธโอน การเปลี่ยนแปลงศักย์ของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียและการสลายตัวของดีเอ็นเอโอลิโกนิวคลีโอโซม ส่งผลให้เกิดการตายของเซลล์ SW480 [80]

เนื่องจากสารต้านอนุมูลอิสระไม่ได้กระทำโดยกลไกเดียว การประเมินความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระจึงมักจะดำเนินการโดยใช้วิธีการมากกว่าหนึ่งวิธี [81] ในการศึกษานี้ ใช้วิธีการประเมิน 3 วิธี คือ การทดสอบ DPPH, ABTS และ ORAC กลไกการต้านอนุมูลอิสระ SET (การถ่ายโอนอิเล็กตรอนเดี่ยว) ได้รับการประเมินผ่านการทดสอบ DPPH ในขณะที่การทดสอบ ABTS และ ORAC ใช้สำหรับปฏิกิริยา HAT (การถ่ายโอนอะตอมไฮโดรเจน) [81] การทดสอบ ORAC ให้ค่าประมาณที่แม่นยำยิ่งขึ้น เนื่องจากรวมเวลาการยับยั้งและระดับการยับยั้งไว้ในคำเดียว [82] ในขณะที่การทดสอบฟอสโฟโมลิบเดตมักใช้เพื่อแสดงความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระทั้งหมด (TAC) ทั้งสามวิธีก็ใช้

ในต้นฉบับนี้มีการรายงานเพื่อประเมิน TAC Munteanu และ Apetrei (2021) ในการทบทวนวิธีการที่ใช้ในการกำหนดฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ได้อธิบายการทดสอบการกำจัดอนุมูลอิสระของ ABTS ว่าเป็น "วิธีการที่ง่ายและสะดวกที่ใช้ในการวัดความจุของสารต้านอนุมูลอิสระทั้งหมด (TAC)"[83] ในการศึกษาเปรียบเทียบ Csepregi et al. (2016)เปรียบเทียบสี่วิธีที่ใช้สำหรับการประเมิน TAC ซึ่งเป็นความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระเทียบเท่า Trolox (TEAC) ศักยภาพต้านอนุมูลอิสระรีดิวซ์ของเฟอร์ริก (FRAP) 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) การทดสอบการคัดแยกแบบรุนแรงและปฏิกิริยารีเอเจนต์ของ Folin-Ciocalteu (FCR) [84] ในปี 2556 Ou et al.แนะนำ ORAC เป็นวิธีใหม่ในการประเมิน TAC [85] ในหลอดเลือดดำเดียวกัน Rubio et al. (2016 )จัดประเภทการทดสอบ ORAC ว่าเป็นหนึ่งในวิธีการโดยตรงสำหรับการกำหนด TAC ร่วมกับ TEAC [86] ผลการทดสอบ ABTS และ ORAC แสดงให้เห็นว่าสารสกัดจาก P. ostreatus และ L.edode มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระที่สูงกว่าสารต้านอนุมูลอิสระมาตรฐาน Trolox

ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของเห็ดทั้งสองอาจเกิดจากการมีส่วนประกอบที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพหลายอย่างรวมถึงฟลาโวนอยด์ฟีนอล เปปไทด์ออกฤทธิ์ทางชีวภาพ และวิตามินซี[87] เกเบอร์และคณะ เปรียบเทียบ ABTS, DPPH, พลังต้านอนุมูลอิสระรีดิวซ์ (FRAP) และ ORAC สำหรับการประเมินความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดฝรั่งและรายงานความสัมพันธ์เชิงบวกระหว่างพลังต้านอนุมูลอิสระตามที่กำหนดโดยวิธีการทั้งสี่กับปริมาณวิตามินซีและ TPN ในทางกลับกัน พวกเขาบันทึกความสัมพันธ์เชิงลบกับเนื้อหาแคโรทีนอยด์ [88] DPPH(1,1-ไดฟีนิล-2-พิคริล-ไฮดราซิล) เป็นอนุมูลอิสระที่เสถียรซึ่งมีเวเลนซ์อิเล็กตรอนที่ไม่คู่กันที่อะตอมหนึ่งของสะพานไนโตรเจน ดังนั้น การขจัดอนุมูล DPPH จึงเป็นพื้นฐานของการทดสอบสารต้านอนุมูลอิสระ DPPH ที่เป็นที่นิยม[89] 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) radical cation (ABTS) จะสูญเสียสีน้ำเงินเมื่อถูกทำให้ลดลงโดยสารต้านอนุมูลอิสระ และการเปลี่ยนแปลงสีสามารถวัดปริมาณด้วยสเปกโตรโฟโตเมตริก [90] การทดสอบ ORAC วัดการเสื่อมสภาพออกซิเดชันของโพรบเรืองแสงโดยอนุมูลอิสระที่ถูกขัดจังหวะโดยสารต้านอนุมูลอิสระ ดังนั้น ยิ่งความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระยิ่งแข็งแกร่ง เวลาที่ใช้ในการดับการเรืองแสงยิ่งสั้นลง [91] นอกจากนี้ เนื่องจากสารสกัดที่ผ่านการทดสอบแสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่มีแนวโน้มว่าจะได้ผลเมื่อทดสอบด้วยวิธีที่กล่าวมาข้างต้น จึงสรุปได้ว่าสารสกัดเหล่านี้ทำหน้าที่ผ่านการกำจัดอนุมูลอิสระ. อย่างไรก็ตาม เห็ดที่ทดสอบแล้วมีปริมาณฟลาโวนอยด์ทั้งหมด และเนื่องจากฟลาโวนอยด์เชื่อมโยงกับการกระตุ้นปัจจัยการถอดรหัส Nrf2 (2017) จึงสามารถเพิ่มเป็นกลไกสมมุติฐาน [92]

4. วัสดุและวิธีการ

4.1.การเตรียมพันธุ์เห็ดและการเพาะย่อย

ก่อนหน้านี้ได้ระบุ P. ostreatus และเห็ด L.edodes เป็นวางไข่และ/หรือออกผล จากการรวบรวมวัฒนธรรมของศูนย์วิจัยการเกษตร กรุงไคโร ประเทศอียิปต์ [93,94] ใบมีดผ่าตัดถูกนำมาใช้ในการตัดผลแบบปลอดเชื้อสำหรับการเพาะเลี้ยงย่อยจากผลเห็ด ไมซีเลียชั้นในถูกเก็บเกี่ยวโดยใช้เข็มที่ปลอดเชื้อและเพาะเลี้ยงย่อยในเพลทมันฝรั่งเดกซ์โทรส (PDA) ที่ปลอดเชื้อ (เมอร์ค, ดาร์มสตัดท์, เยอรมนี)95] ในการเพาะพันธุ์วางไข่ของเชื้อราย่อยนั้น ใช้คีมปลอดเชื้อเพื่อเด็ดเมล็ดและย้ายไปยังเพลต PDA ปลอดเชื้อ จากนั้นจึงฟักที่อุณหภูมิ 28 องศาเป็นเวลา 7 วัน และล้างส่วนที่ออกผลของแต่ละสายพันธุ์แยกกัน แต่ละไอโซเลต (500 กรัม) ถูกทิ้งไว้เป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องเพื่อให้อากาศแห้ง บดด้วยมือในเครื่องบดในครัว และเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องในบริเวณที่มีอากาศถ่ายเทดีสำหรับใช้ในอนาคต

4.2. การสกัดน้ำของ Pleurotus Ostreatus และ Lentinus Edodes

ผลไม้แห้งของไอโซเลตแต่ละชนิดถูกบดเป็นผง 500 กรัมโดยใช้เครื่องปั่นในประเทศ จากนั้นบดสามครั้งในน้ำกลั่น 7Lof ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลาสามวัน แล้วกรองด้วยอัลตราโซนิก (เครื่องทำความสะอาดอัลตราโซนิกในอังกฤษ สหราชอาณาจักร) แล้วกรอง กระบวนการหมักและการกรองซ้ำจนกว่าของเหลวจะหมด ใช้เอทานอลเพื่อเก็บผลผลิต หลังจากการระเหยของเอทานอลที่ 45 องศา แต่ละไอโซเลตทั้งหมด 500 มล. ถูกทำให้แห้งเยือกแข็งเพื่อให้ได้ผลตกค้างแบบแห้งของแต่ละสารสกัดประมาณ 20 กรัม [96]

4.3. การวิเคราะห์โปรตีน

การวิเคราะห์โปรตีโอมิกได้ดำเนินการในหน่วยโปรตีโอมิกส์และเมตาโบโลมิกส์ที่โรงพยาบาลมะเร็งเด็กอียิปต์ 57,357(CCHE) กรุงไคโร ประเทศอียิปต์ ประมาณ 600 uL จาก 8 M urea ใน 500 mM Tris (pH8.5) และ 60 uL ultra-protease (โรช , มันไฮม์ ประเทศเยอรมนี) ถูกเติมในแต่ละตัวอย่าง จากนั้นตัวอย่างถูกเขย่าอย่างแรงและหมุนเหวี่ยงที่ 10,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 30 นาที ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกรวบรวม และเศษส่วน (1 ไมโครกรัม/10 ไมโครลิตร) ถูกฉีดโดยใช้ระบบ NanoLC ระบบ TOF แบบแมสสเปกโตรเมทรี (Sciex TripleTOF 5600 plus , AB SCIEX, Concord) ถูกควบคู่กับโครมาโตกราฟีของเหลว (LC) (3 um, ChromXP C18 CL, 120 A, 150 × 0.3 มม.) ซึ่งประกอบด้วยเครื่องเก็บตัวอย่างอัตโนมัติ Eksigent nanoLC400 ที่ติดอยู่กับ ปั๊ม Ekspert nanoLC425 ที่มีอัตราการไหล 10 ไมโครลิตร/นาที เป็นเวลา 55 นาที สำหรับแต่ละตัวอย่าง [97] วิเคราะห์ข้อมูลโดย ProteinPilot (เวอร์ชัน 5.0.1.0,4895) และ Paragon Algorithm (เวอร์ชัน 5.0.1.0,4874) ลำดับโปรตีนถูกจัดแนวกับลำดับใน Swiss-Prot และฐานข้อมูล TrEMBL (Pleurotus sp. ที่มี 14,792 รายการสำหรับ P. ostreatus และ Lentinula sp. ที่มี 12603 รายการสำหรับ L.edodes)[98] โปรตีนที่ระบุโดยทั่วไประหว่างสายพันธุ์ของเห็ดแสดงตัวอย่างโดยใช้ซอฟต์แวร์ Venny2.1.0.BioinfoGP [99] (คิงส์ตันอะพอนฮัลล์, อังกฤษ, สหราชอาณาจักร)

4.4. การจำแนกลักษณะของสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพ

ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ ปริมาณคาร์โบไฮเดรตที่ละลายได้ทั้งหมดถูกกำหนดโดยใช้เทคนิคกรดฟีนอลซัลฟิวริก [100] ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) และการทดลองดำเนินการเป็นสามเท่า

ปริมาณฟีนอลิกทั้งหมด (TPC) และปริมาณฟลาโวนอยด์ทั้งหมด (TFC) ถูกกำหนดตามที่รายงานโดย Ryan et al [11]. ตัวอย่างถูกเตรียมที่ความเข้มข้น 20 มก./มล. ในน้ำ กรดแกลลิก (สารละลายสต็อค 1 มก./มล.) ถูกเตรียมในเมทานอล รูติน (สารละลายสต็อค 1 มก./มล.) ถูกเตรียมในเมทานอล มาตรฐานและตัวอย่างกรดแกลลิกถูกปิเปตในหลุมของเพลตในหกซ้ำและวัดที่ 630 นาโนเมตร มาตรฐานรูตินทั้ง 10 มาตรฐานและตัวอย่างในหกซ้ำถูกวัดที่ 420 นาโนเมตร

การวิเคราะห์ HPLC ของฟีนอลิกทั้งหมดและฟลาโวนอยด์ถูกดำเนินการตามวิธีการของ Singh และคณะ [102]. ตัวอย่างแต่ละตัวอย่างและ 10 สารละลายมาตรฐานที่แตกต่างกันถูกละลายในเมทานอลและกรองโดยใช้ตัวกรองเข็มฉีดยา 0.22 um จากนั้น 100 ไมโครลิตรของตัวอย่างแต่ละตัวอย่างและ 10 uL ของแต่ละมาตรฐานถูกฉีดโดยใช้คอลัมน์ HPLC, Waters 2690 Alliance HPLC ระบบที่ติดตั้งเครื่องตรวจจับโฟโตไดโอดอาร์เรย์ Waters 996 คอลัมน์ C18 Inertsil ODS3:4.6×250 มม.,5 um; เฟสเคลื่อนที่: บัฟเฟอร์ (กรดฟอสฟอริก 0.1 เปอร์เซ็นต์ในน้ำ); โหมดการชะของเมทานอลถูกไล่ระดับด้วยอัตราการไหล 1 มล./นาที ที่ความยาวคลื่น 280 นาโนเมตร

สำหรับการวิเคราะห์วิตามินที่ละลายในน้ำ สารสกัดจากเห็ดที่ทดสอบแล้ว (50 มก./มล.), มาตรฐานอ้างอิง(10 มก. ใน 10 มล. โซเดียมไฮดรอกไซด์ 0.05 โมลาร์) ของแต่ละ วิตามินที่ละลายในน้ำ 7 ชนิด (thiamine HCl, ascorbic acid, riboflavin, nicotinic acid, nicotinamide, pyridoxine HCl และ folic acid)[103] และวิตามินที่ละลายในไขมัน สารละลาย (50 มก./มล.) ของสารสกัดจากเห็ดสามชนิดและ เตรียมสารละลายมาตรฐานในเมทานอลของวิตามินไขมัน 3 ชนิด ได้แก่ E, D3 และ A ที่ 806.2, 114 และ 400 IU/mL ตามลำดับ จากนั้นสารละลายถูกเจือจางเป็น 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร, กรองโดยใช้ตัวกรองเข็มฉีดยา 0.22 ไมโครเมตร และ 100 ไมโครลิตรถูกฉีดลงบนคอลัมน์ HPLC, ระบบ Waters 2690 Alliance HPLC (Milford, CT, USA) ที่ติดตั้งเครื่องตรวจจับอาร์เรย์โฟโตไดโอดของ Waters 996 คอลัมน์เฉื่อย ODS 3∶4.6×250 มม.,5 ไมครอน; เฟสเคลื่อนที่: บัฟเฟอร์ (เกลือโซเดียมเฮกเซนซัลโฟนิก 0.85 กรัมในน้ำ 1000 มล. และปรับ pH เป็น 3 ด้วยกรดออร์โธฟอสฟอริก); การชะด้วยเมทานอลถูกไล่ระดับที่อัตราการไหล 1 มล./นาที ที่ความยาวคลื่น 210 นาโนเมตร [104]

4.5. การวิเคราะห์โปรตีนและกรดอะมิโน

การประเมินองค์ประกอบของกรดอะมิโนของสารสกัดจากเห็ดโดยใช้เครื่องวิเคราะห์กรดอะมิโน Sykam (Sykam GmbH ประเทศเยอรมนี) ที่ติดตั้งระบบนำส่งตัวทำละลาย S 2100 (ปั๊มควอเทอร์นารีที่มีช่วงการไหล {{ 24}}.01 ถึง 10.00 มล./นาที และความดันสูงสุดถึง 400 บาร์), เครื่องเก็บตัวอย่างอัตโนมัติ, S5200, โมดูลปฏิกิริยากรดอะมิโน, S4300 (พร้อมตัวกรองคู่ในตัว โฟโตมิเตอร์ที่ 570 นาโนเมตร) และตัวจัดสารทำความเย็น S4130 สารสกัดเห็ดแต่ละชนิดหนึ่งกรัมผสมกับเฮกเซน 5 มล. และปล่อยให้หมักเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นจึงกรองส่วนผสมโดยใช้ Whatman no. กระดาษกรอง 1 แผ่น. ส่วนที่เหลือถูกใส่ลงในหลอดทดลองที่มี 10mL6N HCl และบ่มในเตาอบที่ 110 องศาเป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากการฟักไข่ ทำการกรองโดยใช้ Whatman no. กระดาษกรอง 1 แผ่น ตามด้วยการระเหยในเครื่องระเหยแบบหมุน ส่วนที่เหลืออยู่ถูกละลายอย่างสมบูรณ์ใน 2 มล. ของบัฟเฟอร์การเจือจาง(ไตร-โซเดียม ซิเตรต ดีไฮเดรต 0.06 โมลาร์, กรดซิตริก 0.03 โมลาร์, ฟีนอล 0.02 โมลาร์, ไทโอดิไกลคอล1.4 เปอร์เซ็นต์ , HCL 32 เปอร์เซ็นต์ ) เจือจาง 1000- เท่าในบัฟเฟอร์เดียวกัน จากนั้นโหลดลงในคอลัมน์กรองแอมโมเนีย (LCA, K04/Na, 4.6×100 mm, Sykam GmbH, Erasing, Germany) ที่ติดตั้งเครื่องวิเคราะห์กรดอะมิโนอัตโนมัติ (Sykam) [105]

4.6. การเพาะเลี้ยงเซลล์

มะเร็งปากมดลูก (HeLa), มะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดเฉียบพลันกลุ่มโมโนไซต์ (Thpl), มะเร็งลำไส้ใหญ่ (Colo-205) และเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่ (LS-513) ถูกคงรักษาไว้ในอาหารเลี้ยงเชื้อ Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (ลอนซา, เมืองโคโลญจน์ ประเทศเยอรมนี) เสริมด้วยสเตรปโตมัยซิน 100 มก./มล. เพนิซิลลิน 100 หน่วย/มล. และเซรั่มโควีนในครรภ์ที่ไม่กระตุ้นด้วยความร้อน 10 เปอร์เซ็นต์ เซลล์อื่นๆ: มะเร็งเม็ดเลือดขาวของมนุษย์ (CCRF-CEM); มะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดเฉียบพลันกลุ่มโพรมัยอีโลไซติก (NB-4); มะเร็งต่อมน้ำเหลืองของมนุษย์ (U937); มะเร็งต่อมลูกหมาก (DU-145 และ PC3); มะเร็งตับ (HepG2); มะเร็งเต้านม (MCF-7 และ MDA-MB-231); เวโร; และเซลล์ Hep-2 เพาะเลี้ยงย่อยบนสื่อ Modified Eagle ของ Dulbecco (DMEM; Invitrogen, California, USA) และทำการบ่มที่ 37 องศาในบรรยากาศที่มีความชื้นโดยมีคาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ ไลน์เซลล์ได้มาจาก Nawah Scientific Inc.(Mokatam, Cairo, Egypt) ในขณะที่เซลล์โมโนนิวเคลียร์ในเลือดหลัก (PBMCs) และเซลล์มนุษย์ปกติ (ATCC PCS-800-011TM) ถูกซื้อมาจาก Viscera, Cairo, Egypt งานนี้ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการวิจัยจริยธรรมของคณะเภสัชศาสตร์มหาวิทยาลัย Ain Shams (อนุมัติฉบับที่ 294)

4.7.กิจกรรมต้านเชื้อรา

ฤทธิ์ต้านไวรัสได้รับการทดสอบกับ adenovirus type 7(Ad7) และ herpes simplex virus type-II (HSV-2)(Nawah Scientific, Mokattam, Egypt) ฤทธิ์ต้านไวรัสได้รับการประเมินตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [106] เซลล์ Vero และ Hep-2 ถูกเพาะลงในจานเพาะเลี้ยง 96-หลุมที่ความหนาแน่น 2 × 10* เซลล์/หลุมในหนึ่งวันก่อนการติดเชื้อ อาหารเลี้ยงเซลล์ (ส่วนที่ 4.6) ถูกเอาออกในวันถัดไป และใช้น้ำเกลือที่มีบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) เพื่อล้างเซลล์ การติดเชื้อของ adenovirus ในมนุษย์และไวรัสเริมชนิด-II ถูกกำหนดโดยใช้วิธีการ sulforhodamine B (SRB) ซึ่งติดตามผลของ cytopathic (CPE) และคำนวณเปอร์เซ็นต์ของความมีชีวิตของเซลล์ [107] ฤทธิ์ต้านไวรัสคำนวณจากความสามารถของสารสกัดจากเห็ดในการยับยั้ง CPE ของไวรัส ซึ่งความเข้มข้นของพิษต่อเซลล์ 50 เปอร์เซ็นต์ (CC5o) และความเข้มข้นในการยับยั้ง 50 เปอร์เซ็นต์ (IC50) ถูกกำหนดโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad PRISM (ซอฟต์แวร์ Graph-Pad, ซานดิเอโก แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) ดัชนีการเลือก (SD) คำนวณตามที่ระบุไว้โดย Dogan et al [108] ตามสมการ (1)Selectivity Index (SI)=CC50/IC50

4.8.ความเป็นพิษต่อเซลล์ PBMC โดยใช้ MTT Assay

ความเป็นพิษต่อเซลล์ได้รับการประเมินโดยใช้การทดสอบ MTT 【109】 อะลิควอต (100 ไมโครลิตร) ของสารแขวนลอยของเซลล์ (ความหนาแน่นของเซลล์ 1.2-1.8×10* เซลล์/หลุม) ถูกเคลือบในเพลต 96-หลุม ตัวกลางที่สมบูรณ์ถูกเติมและเซลล์ถูกบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้น เซลล์ได้รับการบำบัดด้วยการเจือจางสารสกัดจากเห็ดแบบต่อเนื่องเป็นเวลา 48 ชั่วโมง สารละลาย MTT (5 มก./มล.) ใน PBS ถูกเติมลงในหลุมและบ่มเป็นเวลา 4 ชั่วโมง และค่าการดูดกลืนแสงที่ 570 นาโนเมตรถูกอ่านโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท เซลล์ที่ไม่ได้รับการรักษาถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ และเซลล์ที่บำบัดด้วย doxorubicin (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) ทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก

4.9.Ealuation ของกิจกรรม Cytotoxic UIsing SRB กับสายเซลล์มะเร็ง

ความเป็นพิษต่อเซลล์ต่อมะเร็งต่อมลูกหมาก (DU{{0}} และ PC3); มะเร็งตับ (HepG2); มะเร็งลำไส้ใหญ่ (Colo-205); มะเร็งลำไส้ใหญ่ (LS-513); มะเร็งปากมดลูก (HeLa); และมะเร็งเต้านม (MDA-MB-231 และ MCF-7) สายพันธุ์ของเซลล์ได้รับการประเมินโดยใช้การวิเคราะห์สีด้วยซัลฟอร์โฮดามีน บี (SRB) [10] สารแขวนลอยของเซลล์ในตัวกลางที่สมบูรณ์(4.6) ถูกบ่มในจาน 96-หลุมเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้น ความเข้มข้นต่างๆ (0 ถึง 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรในตัวกลางที่สมบูรณ์) ของสารสกัดจากเห็ดถูกเติมและบ่มเป็นเวลา 72 ชั่วโมง เซลล์ที่ไม่ผ่านการบำบัดถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ และเซลล์ที่บำบัดด้วยโดโซรูบิซินทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก

4.10.ความอยู่รอดของสายเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาวและมะเร็งต่อมน้ำเหลือง UIing WST-1 Assay

ความเป็นพิษต่อเซลล์ต่อมะเร็งเม็ดเลือดขาวของมนุษย์ (CCRF-CEM), มะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดเฉียบพลันกลุ่มโพรมัยอีโลไซติก (NB4), มะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดเฉียบพลันกลุ่มโมโนไซติก (THP1) และมะเร็งต่อมน้ำเหลืองของมนุษย์ (U937) ถูกกำหนดโดยเกลือเตตทราโซเลียมที่ละลายน้ำได้ (WST-1) โดยใช้ Abcamkit ( ab155902 WST-1 รีเอเจนต์การงอกขยายเซลล์ สหราชอาณาจักร) สารแขวนลอยของเซลล์ถูกบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงและจากนั้นบำบัดด้วยความเข้มข้นที่ต่างกัน(0 ถึง 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรในตัวกลางที่สมบูรณ์)ของสารสกัดจากเห็ดเป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นเซลล์ถูกบำบัดด้วยรีเอเจนต์ 10 ไมโครลิตร WST-1 เป็นเวลา 1 ชั่วโมง และอ่าน A450 โดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท [111] เซลล์ที่ไม่ได้รับการรักษาถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบและเซลล์ที่บำบัดด้วย doxorubicin (Sigma-Aldrich, Germany) ทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก

4.11.กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ

4.11.1.DPPH กิจกรรมการกวาดล้างที่รุนแรง

การทดสอบการกำจัดอนุมูล DPPH ดำเนินการตามวิธีการของ Lu et al [112]. การลดลงของสี DPPH ที่เป็นผลลัพธ์ถูกวัดที่ 540 นาโนเมตรฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์การยับยั้งโดยอ้างอิงกับกราฟการปรับเทียบ (R2=0.9903) ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD ตามสมการ (2):(เปอร์เซ็นต์การออกฤทธิ์ของสารต้านอนุมูลอิสระ=[(abs-blank-abs-sample)/abs-blank]×100)

(2) โดยที่ abs-blank และ abs-sample หมายถึงค่าการดูดกลืนแสงของช่องว่างและตัวอย่างตามลำดับ ความเข้มข้นของตัวอย่างที่ต้องการในการยับยั้งครึ่งหนึ่งของอนุมูลอิสระ (IC50) ถูกประมาณไว้

4.11.2.ABTS (2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic Acid))Radical Cation Scavenging กิจกรรม

การทดสอบดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 【113】 สารสกัดจากเห็ด (10 ไมโครลิตรของสารละลาย 0 ถึง 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ผสมกับ ABTS ที่เตรียมสดใหม่ 190 ไมโครลิตร (ซิกมา-อัลดริช เยอรมนี) ในจานหลุม96-หลุมและบ่มในที่มืดที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชม. แต่ละตัวอย่างถูกทดสอบในการจำลองสี่ครั้ง และวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 734 นาโนเมตร ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของการยับยั้ง (สมการ (1)) โดยอ้างอิงกับกราฟการปรับเทียบ (R2=0.9948)

4.11.3. การทดสอบความสามารถในการดูดซับออกซิเจน (ORAC)

การวิเคราะห์ดำเนินการตามที่กำหนดไว้ก่อนหน้านี้ [62] โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย โดยสังเขป 12.5 ไมโครลิตรของสารสกัดจากเห็ดในสามเท่า ถูกบ่มด้วย 75 ไมโครลิตรของ fluorescein (10 นาโนเมตร) เป็นเวลา 30 นาทีที่ 37 องศา การวัดการเรืองแสง (485 EX, 520 EM, nm) ดำเนินการเป็นเวลาสามรอบ （รอบเวลา=90} วินาที） หลังจากนั้น 12.5 ไมโครลิตรของสารละลาย 240 มม. ที่เตรียมใหม่ขนาด 2,2'-Azobis 2- อะมิดิโนโพรเพนไดไฮโดรคลอไรด์ (AAPH) (Ab-cam, Cambridge, UK) ถูกเติมในแต่ละหลุมทันทีและการวัดการเรืองแสงยังคงดำเนินต่อไปเป็นเวลา 2.5 ชั่วโมง (85 รอบแต่ละ 90 วินาที) การทดสอบจะวัดการสูญเสียฟลูออเรสเซนของฟลูออเรสเซนต์เมื่อเวลาผ่านไปเป็นผล ของการเกิด peroxyl-radical โดยการสลายตัวของ AAPH Trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid), วิตามินอีที่ละลายน้ำได้ แอนะล็อกทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมเชิงบวกที่ยับยั้งการสลายตัวของฟลูออเรสซีนในลักษณะที่ขึ้นกับขนานยา ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของการยับยั้ง (สมการ(1)โดยอ้างอิงกับกราฟการปรับเทียบ (R2= 0.9957)

4.12.การวิเคราะห์ทางสถิติ

ทำการทดสอบทางเคมีสามเท่า และผลลัพธ์ถูกแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดย ANOVA ทางเดียว

ความสำคัญของความแตกต่างระหว่างวิธีการได้รับการประเมินด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Tukey-Kramer ค่า p ที่น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ การประเมินทางสถิติถูกกำหนดโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad PRISM (ซอฟต์แวร์ Graph-Pad, ซานดิเอโก, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา)

5. สรุปผลการวิจัย

เห็ด P. ostreatus และ L.edodes มีสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพมากมาย การวิเคราะห์โปรตีนแสดงให้เห็นการแสดงออกของโมเลกุลที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพหลายตัวพร้อมกิจกรรมทางชีวภาพมากมาย สารสกัดน้ำของเห็ดมีแนวโน้มดียาต้านไวรัสกิจกรรมต่อต้าน adenovirus type7 และ herpes simplex virus type-II.CPEs ถูกตรวจพบในสายพันธุ์ของเซลล์มะเร็ง แต่ไม่ต่อต้าน PBMC ของมนุษย์ปกติ การศึกษานี้สนับสนุนการใช้เห็ดเหล่านี้เพื่อวัตถุประสงค์ทางเภสัชวิทยาในแง่ของความเป็นพิษต่อเซลล์ต่ำต่อ PBMC ปกติ นอกเหนือจากความสามารถในการต้านไวรัส ต้านเนื้องอก และต้านอนุมูลอิสระ

อ้างอิง

1. Bertéli, MBD; Oliveira Filho, OBQ; ไฟรทัส, JDS; Bertolucci, สุขา; ซิลวา จีอาร์; กาซิม ZC; ลิเวโร, ไกล; โลวาโต, ECW; วัลเล เจเอส; ลินเด้, จอร์เจีย; และคณะ Lentinus crinitus basidiocarp stipe และpilus: องค์ประกอบทางเคมี ความเป็นพิษต่อเซลล์ และฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ยูโร ความละเอียดของอาหาร เทคโนโลยี 2564, 247, 1355–1366. [ข้ามอ้างอิง]

2. Ragupathi, V.; สตีเฟน, A.; Arivoli, D.; Kumaresan, S. ฤทธิ์ต้านแบคทีเรีย, ศักยภาพในการต้านอนุมูลอิสระในหลอดทดลอง และการกำหนดลักษณะ GC-MS ของสารสกัดเมทานอลของ Gymnopilus Junius เห็ดป่าจาก Southern Western Ghats ประเทศอินเดีย ยูโร เจ. ไบโอเมด. 2018, 5, 650–657.

3. Atila, F.; โอเวด มินนิโซตา; Shariati, MA ประโยชน์ทางโภชนาการและการแพทย์ของ Agaricus bisporus: บทวิจารณ์ เจ. ไมโครไบโอล. เทคโนโลยีชีวภาพ อาหารวิทย์. 2017, 7, 281–286. [ข้ามอ้างอิง]

4. Gaitán-Hernández, R.; Cortés, GMN การปรับปรุงผลผลิตของเห็ดที่กินได้และเป็นยารักษาโรค Lentinula edodes บนฟางข้าวสาลีโดยใช้การวางไข่เสริม บราซ เจ. ไมโครไบโอล. 2014, 45, 467–474. [CrossRef] [PubMed]

5. Smânia, A.; Delle Monache, F.; Smânia, E.; กิล, ม.; เบญจฤทธิ์, ล.; Cruz, F. ฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียของสารที่ผลิตโดยเชื้อรา Pycnoporus sanguineus (คุณพ่อ) Murr. เจ. เอธโนฟาร์มาคอล. 1995, 45, 177–181. [ข้ามอ้างอิง]

6. อิชิกาว่า NK; Kasuya, MCM; Vanetti, MCD ฤทธิ์ต้านแบคทีเรียของ Lentinula edodes ที่ปลูกในตัวกลางที่เป็นของเหลว บราซ เจ. ไมโครไบโอล. 2001, 32, 206–210. [ข้ามอ้างอิง]

7. Hwang, H.-J.; คิม เซาท์เวสต์; ลิม, เจ.-เอ็ม.; จู, เจ.-เอช.; คิม, H.-O.; คิม H.-M.; ยุน, เจ.-ดับบลิว. ฤทธิ์ลดน้ำตาลในเลือดของ exopolysaccharides ดิบที่ผลิตโดยเห็ดสมุนไพร Phellinus baumii ในหนูเบาหวานที่เกิดจากสเตรปโตโซโตซิน วิทย์ชีวิต. 2548, 76, 3069–3080. [CrossRef] [PubMed]

8. เฮิร์สต์, อาร์.; เนลสัน, ดี.; McCollum, G.; มิลลาร์ BC; มาเอดะ, วาย.; ช่างทอง CE; รูนีย์, พีเจ; Loughrey, A.; เรา, เจ.; Moore, JE การตรวจสอบคุณสมบัติต้านเชื้อแบคทีเรียและเชื้อราของเห็ดหอม (Lentinula edodes) และเห็ดนางรม (Pleurotus ostreatus) เสริม. เธอ. คลินิก ปฏิบัติ 2552, 15, 5-7. [ข้ามอ้างอิง]

9. Zervakis, G.; Philippoussis, A.; Ioannidou, S.; Diamantopoulou, P. Mycelium จลนพลศาสตร์การเจริญเติบโตและสภาวะอุณหภูมิที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการเพาะพันธุ์เห็ดที่กินได้บนพื้นผิวลิกโนเซลลูโลส โฟเลีย ไมโครไบโอล. 2001, 46, 231–234. [ข้ามอ้างอิง]

10. Sánchez, C. การเพาะปลูกของ Pleurotus ostreatus และเห็ดที่กินได้อื่น ๆ แอปพลิเค ไมโครไบโอล เทคโนโลยีชีวภาพ 2552, 85, 1321–1337. [ข้ามอ้างอิง]