ผลการป้องกันของไมโครเซลล์ต้นกำเนิดบุผนังหลอดเลือดต่อการบาดเจ็บของเซลล์ไตหนูที่เกิดจาก Ang II
Mar 11, 2022
เชิงนามธรรม.ความดันโลหิตสูงเรื้อรังสามารถนำไปสู่ไตเสียหาย,เรียกว่าโรคไตจากความดันโลหิตสูงหรือโรคไตอักเสบจากความดันโลหิตสูง ความเข้าใจเพิ่มเติมเกี่ยวกับกลไกระดับโมเลกุลซึ่งทำให้เกิดโรคไตจากความดันโลหิตสูงเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการวินิจฉัยและการรักษาที่มีประสิทธิภาพ การศึกษานี้ศึกษากลไกที่เซลล์ต้นกำเนิดบุผนังหลอดเลือด (EPCs) ซ่อมแซมหนูปฐมภูมิไตเซลล์ (PRK) ELISA, Cell Counting Kit-8 และโฟลว์ cytometry assays ถูกใช้เพื่อวิเคราะห์ผลกระทบของ EPC หรือ EPC‑MV ต่อความเครียดออกซิเดชัน การอักเสบ การเพิ่มจำนวนเซลล์ การตายของเซลล์ และวัฏจักรของ PRK ที่เกิดจาก AngII แบบจำลองการบาดเจ็บของ PRK ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ angiotensin II (Ang II) หลังจากการเหนี่ยวนำ Ang II การเพิ่มจำนวน PRK ลดลง การตายแบบอะพอพโทซิสเพิ่มขึ้น และวัฏจักรของเซลล์ถูกบล็อกที่เฟส G1 ก่อนเข้าสู่เฟส S พบว่าระดับของชนิดออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยาและ malondialdehyde เพิ่มขึ้น ในขณะที่ระดับของ glutathione peroxidase และ superoxide dismutase ลดลง นอกจากนี้ ระดับของการอักเสบของไซโตไคน์ IL‑1 , IL-6 และ TNF‑ เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ดังนั้น Ang II ได้ทำลาย PRKs โดยการกระตุ้นความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและส่งเสริมการตอบสนองต่อการอักเสบ อย่างไรก็ตาม เมื่อ PRK ถูกเพาะเลี้ยงร่วมกับ EPC ความเสียหายที่เกิดจาก Ang II ลดลงอย่างมาก การศึกษาในปัจจุบันได้รวบรวม microvesicles (MVs) ที่หลั่งโดย EPC และเพาะเลี้ยงพวกมันด้วย PRK ที่เกิดจาก Ang II และระบุว่า EPC‑MVs ยังคงมีผลในการป้องกัน PRKs โดยสรุป EPCs ปกป้อง PRKs จากความเสียหายที่เกิดจาก Ang II ผ่าน MV ที่แอบซ่อน
CISTANCHE จะปรับปรุงโรคไต/โรคไต
บทนำ
ความดันโลหิตสูงเป็นปัจจัยเสี่ยงสำหรับอุบัติการณ์ของโรคหัวใจและหลอดเลือดและโรคหลอดเลือดสมอง และการเสียชีวิตที่เกี่ยวข้อง (1) ดิไตอาจทำให้เกิดความดันโลหิตสูงและเป็นหนึ่งในอวัยวะเป้าหมายของความเสียหายจากความดันโลหิตสูง (2) เรื้อรังโรคไต(CKD) เป็นหนึ่งในสาเหตุสำคัญของการเสียชีวิตที่เพิ่มขึ้นในหมู่ผู้ที่มีความดันโลหิตสูงทั่วโลกในช่วงสองทศวรรษที่ผ่านมา (3,4) ดังนั้นจึงมีความจำเป็นเร่งด่วนในการส่งเสริมการรักษาโรคไตจากความดันโลหิตสูงและศึกษากลไกทางพยาธิวิทยาของมัน การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า angiotensin II (Ang II) ก่อให้เกิดความเสียหายของหลอดเลือดและมีบทบาทสำคัญในโรคหลอดเลือดผ่านกลไกต่างๆ เช่น การกระตุ้นการตายของเซลล์ (5) การหยุดวงจรของเซลล์ (6) การเพิ่มระดับของชนิดออกซิเจนปฏิกิริยา (ROS) ( 7) ส่งเสริมการตอบสนองต่อความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันโดยการเพิ่มการหลั่งของมาลอนไดอัลดีไฮด์ (MDA) และลดการหลั่งของกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส (GSH‑Px) และซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส (SOD) (8,9) Ang II ยังส่งเสริมการผลิตปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับการอักเสบ เช่น IL‑6, IL‑1 และ TNF‑ (10-12) ความเสียหายที่เกิดจาก Ang II ได้ถูกนำมาใช้เพื่อสร้างแบบจำลองความดันโลหิตสูงในหลอดทดลอง รวมถึงในหนูทดลองด้วยไตเซลล์ (PRK) (13,14)
สำหรับผู้ป่วยการทำงานของไตการด้อยค่า ความเสียหายต่อเซลล์บุผนังหลอดเลือด และการฟื้นฟูและการซ่อมแซมที่ลดลงเป็นสาเหตุหลักของการสูญเสีย microvesicles ในช่องท้อง (MVs) (15) เซลล์ต้นกำเนิดเยื่อบุผนังหลอดเลือด (EPCs) ที่ได้จากไขกระดูกสามารถส่งเสริมการซ่อมแซมบุผนังหลอดเลือด (16,17) การศึกษาก่อนหน้านี้เปิดเผยว่า EPCs สามารถปรับปรุงการงอกใหม่ของหัวใจและหลอดเลือด (18) และควบคุมการสร้างเส้นเลือดใหม่ (19) รวมทั้งออกแรงผลการรักษาต่อเฉียบพลันไตการบาดเจ็บจากการกลับเป็นเลือดของกล้ามเนื้อขาดเลือด (20) และในผู้ป่วยที่การปลูกถ่ายไต(21) อย่างไรก็ตาม เท่าที่ทราบ ยังไม่มีรายงานผลของ EPC ต่อโรคไตจากความดันโลหิตสูง เราตั้งสมมติฐานว่า EPC อาจมีผลป้องกันโรคไตจากความดันโลหิตสูงในไตเซลล์. MV ถูกหลั่งออกมาอย่างต่อเนื่องโดยเซลล์ต่างๆ ในร่างกาย เช่น เซลล์เยื่อบุผิว เซลล์เนื้องอก และเซลล์ต้นกำเนิด และมีอยู่ในของเหลวในร่างกายหลายชนิด เช่น เลือด ปัสสาวะ และนม ซึ่งเป็นสื่อกลางในการทำงานทางชีววิทยา (22) หลักฐานที่สะสมได้แนะนำว่าผลการป้องกันของ EPC มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการปล่อย MVs (23,24) ในการศึกษานี้ การนำ EPC‑MV ไปใช้ในการรักษาโรคไตจากความดันโลหิตสูงนั้นได้รับการตรวจสอบโดยการศึกษาผลและกลไกการป้องกัน โดยวิธี EPC‑MVs ป้องกันการบาดเจ็บ PRK ที่เกิดจาก Ang II เพื่อให้เป็นพื้นฐานทางทฤษฎีทางชีววิทยาสำหรับการรักษาโรคไตจากความดันโลหิตสูง
คำสำคัญ:EPC‑MVs, โรคไตจากความดันโลหิตสูง, Ang II, ROS, MVs, การอักเสบ, ไต, ไต
วัสดุและวิธีการ
สัตว์.หนูที่ได้รับหนูที่ปลอดโรคเฉพาะทาง Wistar-Kyoto (WKY) เพศผู้อายุ 12 8-สัปดาห์ (น้ำหนัก 80-120 ก.) จำนวนทั้งหมด 12 8‑สัปดาห์ หนูที่ได้รับจาก Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (ใบอนุญาต หมายเลข SCXK กวางตุ้ง 2015-0063) หนูถูกวางไว้ในห้องที่มีอุณหภูมิและความชื้นคงที่ (อุณหภูมิ 23±2˚C ความชื้น 50±10 เปอร์เซ็นต์ ) ภายใต้วัฏจักรแสง/มืด 12-h โดยจำกัดการเข้าถึงอาหารและน้ำของหนูมาตรฐานใน กรงโพลีสไตรีน การทดลองกับสัตว์ทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของมหาวิทยาลัยการแพทย์ไห่หนาน (ไหโข่ว ประเทศจีน เลขที่อนุมัติ HYLL‑2021‑053) และดำเนินการตามแนวทางของสถาบันสุขภาพแห่งชาติ (25)
CISTANCHE จะปรับปรุงการทำงานของไต/ไต
การแยกตัวและวัฒนธรรมของ PRKsหนู WKY ที่สามารถเข้าถึงน้ำได้ฟรีจะอดอาหารเป็นเวลา 12 ชั่วโมงก่อนการทดลอง หนู WKY ถูกทำการุณยฆาตโดยใช้การฉีด pentobarbital sodium ในช่องท้อง (200 มก./กก. ของน้ำหนักตัว) จากนั้นให้ไตถูกเอาออกอย่างปลอดเชื้อ และส่วนคอร์เทกซ์ของไตถูกตัดออกและปลูกในบีกเกอร์ขนาดเล็ก ดิไตคอร์เทกซ์ถูกตัดเป็นชิ้นเนื้อเยื่อ ~1 มม.3 ล้างสามครั้งด้วย PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) ปั่นเหวี่ยงที่ 1,000 xg ที่ 25˚C เป็นเวลา 5 นาที และส่วนลอยเหนือตะกอนถูกทิ้ง ชิ้นส่วนเนื้อเยื่อถูกเติมเข้าไปในคอลลาเจนเนสชนิดที่ 1 (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) ที่ความเข้มข้นสุดท้ายที่ 1 ก./ล. และชิ้นส่วนเนื้อเยื่อถูกสั่นและย่อยที่ 37˚C เป็นเวลา 30 นาที หลังจากการกรองผ่านตะแกรงสเตนเลสสตีลขนาด 200 เมช (0.075 มม.) เซลล์จะถูกแยกออกโดย Ficoll (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) การหมุนเหวี่ยงเกรเดียนต์ความหนาแน่น (26) หลังจากการปั่นเหวี่ยงที่ 1,000 xg ที่ 25˚C เป็นเวลา 2 นาที สารแขวนลอยระดับกลางถูกรวบรวมและผสมกับตัวกลาง MEM/F12 (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) ที่เพาะเชื้อในจาน 6 หลุมและ เพาะเลี้ยงที่37˚Cภายใต้ 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 หลังจาก 24 ชม. นำสื่อออกและแทนที่ด้วยสื่อสดและตัวกลางที่ไม่ได้แนบไตเซลล์และเนื้อเยื่อถูกทิ้ง หลังจาก 48 ชั่วโมง ตัวกลางถูกกำจัดออกอีกครั้ง เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS และแสดงเป็น PRK (27,28); ส่วนประกอบหลักคือเซลล์ mesangial ของหนูไต PRK ได้รับการเพาะเลี้ยงเป็นเวลาสามรุ่นและบำบัดด้วย Ang II (1 µM; Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) ที่อุณหภูมิ 37˚C เป็นเวลา 24 ชั่วโมงเพื่อสร้าง PRKความเสียหายของไตแบบอย่าง. การอักเสบที่เกิดจาก Ang II ในหนูไตเซลล์เยื่อบุผิวท่อถูกดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย Nair et al (29)
PRK ถูกระบุโดยใช้การสอบวิเคราะห์อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ (IF)หลังจากล้างด้วย PBS สามครั้งและตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ที่อุณหภูมิ 25˚C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง เซลล์จะถูกฟัก (25˚C) ด้วย Triton X‑100 เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ตามด้วย BSA 5 เปอร์เซ็นต์ (ปักกิ่ง) Solar Science & Technology Co., Ltd.) ที่อุณหภูมิ 25˚C เป็นเวลา 30 นาที จากนั้น PRKs ถูกฟักตัวข้ามคืนในความมืดด้วย ‑smooth muscle actin ( ‑SMA; 1 µg/ml; cat. no. ab7817; Abcam) และ vimentin (1:250; cat. no. ab92547; Abcam) ที่อุณหภูมิ 4˚C หลังจากล้างด้วย PBS สามครั้ง เซลล์ถูกบ่มด้วย Alexa Fluor® 488‑ (1:100; cat. no. ab150077; Abcam) หรือ 647‑labeled (1:200; cat. no. ab150075; Abcam) แอนติบอดีทุติยภูมิที่ 37 ˚C นาน 1 ชม. จากนั้น เซลล์ถูกย้อมด้วย DAPI (0.5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร; Beyotime Institute of Biotechnology) ที่ 25˚C เป็นเวลา 5 นาที ในที่สุด ภาพถูกจับโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (กำลังขยาย x400; Leica Microsystems GmbH)
วัฒนธรรมและการระบุ EPCsกระดูกโคนขาของหนูและกระดูกหน้าแข้งถูกผ่าและแต่ละหลอดของไขกระดูกถูกล้างด้วย PBS ที่ปลอดเชื้อ ของผสมที่เป็นผลลัพธ์ถูกหมุนเหวี่ยง (1,000 xg; 25˚C; 15 นาที) และอนุภาคถูกแขวนลอยอีกครั้งในตัวกลาง MEM/F12 เซลล์ถูกแยกออกโดย Ficoll (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) การหมุนเหวี่ยงเกรเดียนต์ของความหนาแน่น (1,000 xg; 25˚C; 20 นาที) และใส่ในขวดเพาะเลี้ยงขนาด 25‑cm2 ที่เคลือบด้วยไฟโบรเนกติน (BD Biosciences) เซลล์ถูกคงรักษาไว้ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่สมบูรณ์ภายใต้สภาวะมาตรฐาน (37˚C; 5 เปอร์เซ็นต์ CO2) อาหารเลี้ยงเชื้อถูกเปลี่ยนหลังจาก 4 วัน และเซลล์ที่ยึดติดถูกเพาะเลี้ยงอีก 3 วัน (30) Dil complex acetylated ไลโปโปรตีนความหนาแน่นต่ำ (Dil‑Ac‑LDL) การย้อมสี (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) ใช้เพื่อระบุ EPC สำหรับระบบการเพาะเลี้ยงร่วม PRK (1x104 ) ถูกเติมลงในห้องด้านล่างของเพลตร่วม (Corning, Inc.) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและจากนั้น Ang II (1 µM) หรือ 200 µl PBS และ EPC (3x104 ) เติมไปยังห้องด้านบนและฟักที่อุณหภูมิ 37˚C เป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนทำการวิเคราะห์ฟังก์ชันของเซลล์เพิ่มเติม เมื่อทำการคัดกรอง PRK และสัดส่วนที่ดีที่สุดของ EPC สัดส่วนของจำนวนเซลล์คือ 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 และ 1:7
การเตรียม EPC‑MVs. EPC ถูกเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 7 วันตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (30) ล้างสองครั้งด้วย PBS และซีรั่มที่อดอาหารเป็นเวลา 12 ชั่วโมง ต่อมา ตัวกลาง MEM/F12 ที่มี EPC ที่เพาะเลี้ยงถูกรวบรวมและหมุนเหวี่ยงที่ 4˚C (1,000 xg; 15 นาที) และส่วนลอยเหนือตะกอนถูกสกัดที่ 4˚C (100,000 xg; 60 นาที) สำหรับการรวบรวม EPC‑MVs ที่ซ่อนไว้ หลังจากการฝังในอีพอกซีเรซิน Pon 812 (Structure Probe, Inc.) มันถูกวางที่อุณหภูมิ 37˚C ในชั่วข้ามคืน จากนั้นจึงเพิ่มโซลูชันการตรึงกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (หวู่ฮั่นเซอร์วิสเทคโนโลยี จำกัด) เป็นเวลา 4 ชั่วโมงและยูเรเนียมอะซิเตท (2 เปอร์เซ็นต์; หวู่ฮั่นเซอร์วิสเทคโนโลยี จำกัด ) และตะกั่วซิเตรต (หวู่ฮั่นเซอร์วิสเทคโนโลยี จำกัด ) ถูกย้อมที่ 25˚C เป็นเวลา 15 นาที MV ได้รับการยืนยันผ่านกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน ในระบบการเพาะเลี้ยงร่วม EPC‑MVs 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (31) ถูกเติมไปยังห้องด้านบนของแผ่นทดสอบ Transwell และพาร์กถูกเพิ่มไปที่ห้องด้านล่างตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ และบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง
การทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์PRK ถูกย่อยด้วยทริปซิน เพาะเชื้อในเพลต 96 หลุมที่ความหนาแน่น 3x103 เซลล์/หลุม และเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ความหนาแน่นของแสงที่ 450 นาโนเมตร วัดโดยใช้รีเอเจนต์ 10 µl Cell Counting Kit‑8 (CCK‑8; Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) ที่อุณหภูมิ 37˚C เป็นเวลา 60 นาที ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เพื่อประเมิน อัตราการแพร่กระจายของเซลล์
CISTANCHE จะช่วยเพิ่มอาการปวดไต/ไต
การทดสอบการตายของเซลล์การทดสอบการตายของเซลล์ทำได้โดยใช้ชุดตรวจหาการตายของเซลล์ Annexin V‑FITC (BD Biosciences) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต PRK ถูกเก็บเกี่ยว ล้างสองครั้งด้วย PBS เย็นจัด (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) และแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์การจับ 500 ไมโครลิตร จากนั้น PRK ที่แขวนลอยใหม่ถูกบ่มด้วย Annexin V‑FITC 5 µl และ PI 5 µl ในความมืดเป็นเวลา 15 นาทีที่ 23±2˚C การตายของเซลล์ถูกประเมินโดยใช้โฟลว์ไซโตเมทรี (FCM; FACSCanto II; ซอฟต์แวร์ BD FACSChorus™ เวอร์ชัน: 1.0; BD Biosciences)
ฟิวชั่น EPC‑MV และ PRKเพื่อสังเกตว่า EPC‑MVs ถูกหลอมรวมกับ PRKs หรือไม่ EPC‑MVs จะถูกติดฉลากด้วยสีย้อมเรืองแสงที่ฝังด้วยเยื่อลิปิด (PKH26) ก่อนการฟักตัวร่วม โดยสังเขป EPC‑MV 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรถูกรวมเข้ากับ PKH26 2 มิลลิลิตร (2x10‑6 M; Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) และผสมที่อุณหภูมิ 23±2˚C เป็นเวลา 5 นาที ของผสมที่ติดฉลากถูกเติมลงใน 2 มล. 1 เปอร์เซ็นต์ BSA (v) และหมุนเหวี่ยงที่ 100,000 xg ที่ 4˚C เป็นเวลา 60 นาที, จากนั้นล้างด้วย PBS เย็น ตะกอนถูกแขวนลอยในตัวกลาง MEM/F12 1 มิลลิลิตร เติมไปยัง PRK และบ่มที่ 37˚C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง สุดท้าย DAPI 1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรถูกเติมสำหรับการย้อมด้วยนิวเคลียร์ที่ 25˚C เป็นเวลา 15 นาที ภาพเซลล์ได้มาโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (กำลังขยาย, x400; Leica Microsystems GmbH)
การทดสอบวัฏจักรของเซลล์การทดสอบวัฏจักรเซลล์ดำเนินการโดยใช้ชุดตรวจหาวัฏจักรเซลล์ (BD Biosciences) EPC หรือ PRKs (1x106 ) ถูกเก็บเกี่ยว ล้างสองครั้งด้วย PBS และจากนั้นตรึงในเอทานอลที่เย็นจัดด้วยน้ำแข็ง 500 ไมโครลิตร 70 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 25˚C จากนั้นเซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS เย็นและบ่มใน PI (400 ไมโครลิตร) และ RNase (100 ไมโครลิตร) เป็นเวลา 30 นาทีที่ 37˚C ในความมืด ตรวจพบสัญญาณ PI โดยใช้ FCM (FACSCanto II) เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ในระยะ G1, S และ G2 ถูกนับและเปรียบเทียบโดยใช้ซอฟต์แวร์ FlowJo (เวอร์ชัน 10.0.6; FlowJo LLC)
การวัด ROS โดย FCMPRKs ถูกเพาะเลี้ยงถึง 60‑70 เปอร์เซ็นต์ที่บรรจบกันและเก็บเกี่ยวผ่านทริปซิไนเซชัน เซลล์ทั้งหมดถูกบ่มด้วยไดอะซิเตต 1.0 µM 2',7'‑dichlorodihydrofluorescein เป็นเวลา 15 นาทีที่37˚C จากนั้นเซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS และวิเคราะห์ผ่าน FCM เพื่อตรวจจับ ROS โดยใช้เลเซอร์ 488 นาโนเมตรสำหรับการกระตุ้นและเลเซอร์ 535 นาโนเมตรสำหรับการตรวจจับ
เอลิซ่า.หลังจากการปั่นแยก (1,000 xg; 25˚C; 5 นาที) เซลล์ supernatant ของแต่ละกลุ่มย่อยจะถูกรวบรวมเพื่อวิเคราะห์ระดับของ MDA, GSH‑Px, SOD และปัจจัยการอักเสบ IL-6, IL‑ 1 และ TNF- ชุดทดสอบต่อไปนี้ถูกใช้ตามคำแนะนำของผู้ผลิต: ชุดทดสอบ Micro MDA (cat. no. BC0020; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), GSH‑Px assay kit (cat. no. BC1195; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), ชุดตรวจจับกิจกรรม SOD (cat. no. BC0170; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), หนู IL‑1 ELISA kit (cat. no. RLB{ {13}}; R&D Systems, Inc.), หนู IL‑6 Quantikine ELISA kit (cat. no. R6000B; R&D Systems, Inc.) และหนู TNF Quantikine ELISA kit (cat. no. RTA00; R&D Systems, Inc. ).
การวิเคราะห์ทางสถิติ.การทดลองทั้งหมดทำซ้ำสามครั้ง และข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS เวอร์ชัน 210 (IBM Corp.) ความแตกต่างระหว่างหลายกลุ่มได้รับการประเมินโดยใช้ ANOVA ทางเดียวและการทดสอบ post hoc ของ Dunnett พี<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
ผลลัพธ์
Identification of isolated EPCs and PRKs. The isolated EPCs were identified using Dil‑Ac‑LDL staining (Fig. 1A). Microscopic counting revealed that the degree of coincidence between red (Dil‑Ac‑LDL staining) and blue (nuclear staining with DAPI) fluorescence was >90 เปอร์เซ็นต์ ยืนยันว่า EPC แยกได้สำเร็จ PRK ที่แยกได้ถูกวิเคราะห์โดย IF (vimentin/ ‑SMA) ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าระดับการแสดงออกของ vimentin/ ‑SMA ใน PRKs สูงและเป็นบวก ซึ่งบ่งชี้ว่าการแยก PRK ที่ประสบความสำเร็จ (รูปที่ 1B)
อัตราส่วนที่เหมาะสมของ EPC ต่อ PRKผลของการรวมสัดส่วนที่แตกต่างกันของ PRKs/EPCs ในระบบการเพาะเลี้ยงร่วมได้รับการตรวจสอบ และพบว่า PRK ที่เติบโตในอัตราส่วน 1:3 PRKs/EPCs ไม่มีอัตราการงอกเพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับ PRK ที่เติบโตด้วย 2: อัตราส่วน 1, 1:1 หรือ 1:2 ของ PRKs/EPCs (รูปที่ 1C) นอกจากนี้ สัดส่วนที่เพิ่มขึ้นของ EPC (1:4, 1:5, 1:6 และ 1:7) ส่งผลให้การแพร่กระจายของ PRK เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับ EPC (1:3) ดังนั้น จึงเลือกอัตราส่วน 1:3 PRKs/EPCs สำหรับการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อป้องกันการรบกวนที่อาจเกิดขึ้นจาก EPC ที่มากเกินไปในการทดลองครั้งต่อๆ ไป
ผลของวัฒนธรรมร่วม EPC ต่อความเสียหายที่เกิดจาก Ang IIPRK (1x104 ) ถูกฉีดวัคซีนล่วงหน้า 24 ชั่วโมงในช่องด้านล่างของเพลต Transwell ห้องด้านบนมี 200 ไมโครลิตร PBS ในกลุ่มควบคุมและ 200 ไมโครลิตร EPC (3x104 ) ในกลุ่มทดลอง สู่โมเดลความเสียหายของไต,1 µM Ang II ถูกเพิ่มไปยังช่องด้านล่าง หลังจาก 24 ชั่วโมง การทดสอบ CCK‑8 และ FCM ถูกดำเนินการเพื่อวัดอัตราการงอกของ PRK PRK ที่ได้รับ Ang II ในกรณีที่ไม่มี EPC ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (P<0.05) proliferation="" rate="" (fig.="" 1d),="" and="" increased="" apoptosis="" rate="" (fig.="" 1e)="" and="" cell="" cycle="" arrest="" in="" the="" g1="" phase="" (fig.="" 1f)="" compared="" with="" the="" control="" group,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" receiving="" ang="" ii="" showed="" the="" reverse="" effects.="" these="" results="" indicated="" that="" co‑culture="" with="" epcs="" can="" reduce="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" a="" rat="">ไตโมเดลเซลล์
EPCs ปกป้อง PRKs จากความเสียหายที่เกิดจาก Ang II ระดับของความเครียดออกซิเดชันที่เกิดจาก Ang II ใน PRKs ที่เพาะร่วมกับ EPC ถูกตรวจสอบ ผลจากการทดสอบ FCM พบว่า Ang II เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (P<0.05) the="" levels="" of="" ros="" in="" prks="" in="" the="" absence="" of="" epcs,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" had="" comparatively="" lower="" ros="" levels="" (fig.="" 2a).="" similarly,="" the="" elisa="" results="" indicated="" that="" the="" levels="" of="" secreted="" mda="" (fig.="" 2b)="" were="" increased="" and="" gsh="" and="" sod="" (fig.="" 2c="" and="" d)="" levels="" were="" decreased="" in="" prks="" receiving="" ang="" ii,="" while="" prks="" receiving="" ang="" ii="" and="" co‑cultured="" with="" epcs="">
Figure 1. Recovery of PRKs by co‑culture with EPCs following injury induced by Ang II. (A) Confirmation of the isolation of EPCs via Dil‑Ac‑LDL staining. Magnification, x100. (B) Confirmation of the isolation of PRKs using an immunofluorescence assay. Magnification, x400. (C) CCK‑8 analysis of the effects of different proportions of co‑cultured EPCs on the proliferation of PRKs. NS P>0.05 เทียบกับ PRKs:EPCs, 2:1 กลุ่ม; * พี<0.05 vs.="" prks:epcs,="" 2:1="" group.="" (d)="" cck‑8="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" proliferation="" rate="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" fcm="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" (e)="" apoptosis="" and="" (f)="" cell="" cycle="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" *=""><0.05 vs.="" control;="" #=""><0.05 vs.="" ang="" ii.="" ang="" ii,="" angiotensin="" ii;="" epcs,="" endothelial="" progenitor="" cells;="" prks,="" primary="" rat="">ไตเซลล์; FCM, โฟลว์ไซโตเมทรี; CCK‑8, ชุดนับเซลล์‑8; Dil‑Ac‑LDL, Dil complex acetylated ไลโปโปรตีนความหนาแน่นต่ำ; OD ความหนาแน่นของแสง –SMA, – แอกตินของกล้ามเนื้อเรียบ; นศ. ไม่สำคัญ ผลลัพธ์ตรงกันข้ามกับการหลั่งของเอนไซม์เหล่านี้ ดังนั้น การสร้าง ROS จึงอาจเกี่ยวข้องกับความเสียหายของเซลล์ที่เกิดจาก Ang II และสามารถแก้ไขให้ดีขึ้นได้ด้วยการเพาะเลี้ยงร่วมกับ EPC
Ang II สามารถทำลายเซลล์ได้ด้วยการส่งเสริมการหลั่งของ cytokines ที่มีการอักเสบ ในขณะที่ EPC สามารถป้องกันการอักเสบได้ (32) ต่อไป ได้มีการตรวจสอบว่า Ang II ส่งเสริมการหลั่งของ inflammatory cytokines ใน PRKs หรือไม่ และ EPCs สามารถทำหน้าที่ป้องกันโดยการยับยั้งการหลั่งของ inflammatory cytokines หรือไม่ การหลั่งของ IL-1 , IL-6 และ TNF‑ ถูกควบคุมอย่างมีนัยสำคัญใน PRK โดยการเพิ่ม Ang II ในทางตรงกันข้าม ใน PRKs ที่เพาะเลี้ยงร่วมกับ EPC ระดับของ IL‑1 , IL‑6 และ TNF‑ (รูปที่ 2E‑G) ค่อนข้างต่ำกว่า (P<0.05) than="" those="" in="" prks="" cultured="" alone.="" therefore,="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" prks="" was="" also="" associated="" with="" pro‑inflammatory="" cytokines,="" and="" co‑culture="" with="" epcs="" exerted="" protective="" effects="" by="" reducing="" the="" secretion="" of="" these="">
เอฟเฟกต์การป้องกันของ EPC นั้นกระทำผ่าน MVกลไกที่ EPC ให้ผลในการป้องกันกับ Ang II ที่เหนี่ยวนำไตเซลล์ถูกวิเคราะห์เพิ่มเติมโดยการแยก MV ออกจาก EPC (รูปที่ 3A) EPC‑MV ติดฉลากด้วย PKH26 และเพิ่มลงใน PRK พร้อมกับ Ang II ในจาน Transwell ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ตรวจพบสารเรืองแสง PKH26 ในไซโตพลาสซึมของ PRK (รูปที่ 3B) ซึ่งบ่งชี้ว่า EPC‑MV หลอมรวมกับ PRK จากนั้น พบว่าอัตราการงอกที่ลดลงที่เกิดจาก Ang II ส่งเสริมการตายของเซลล์และหยุดวงจรในระยะ G1 ถูกยับยั้งโดย EPC‑MV (รูปที่ 3C‑E) คล้ายกับ PRKs ที่เพาะเลี้ยงร่วมกับ EPCs PRKs ที่เติบโตต่อหน้า EPC‑MVs และสัมผัสกับ Ang II มีระดับ ROS และ MDA ที่ลดลง (รูปที่ 4A และ B) เพิ่มระดับ GSH และ SOD (รูปที่ 4C และ D) และลดการหลั่งของไซโตไคน์อักเสบ IL‑1 , IL‑6 และ TNF‑ (รูปที่ 4E‑G) ลดลง เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม Ang II
การอภิปราย
จากความรู้ที่ดีที่สุดของเรา การศึกษานี้แสดงให้เห็นเป็นครั้งแรกว่า EPC สามารถป้องกัน PRKs จากความเสียหายของเซลล์ที่เกิดจาก Ang II ผลกระทบในการป้องกันนี้ อย่างน้อยส่วนหนึ่ง ถูกสื่อกลางโดย MV ที่ EPC หลั่งออกมาและหลอมรวมกับ PRK ในระหว่างการเพาะเลี้ยงร่วมกัน โดยการเพิ่ม MV ที่เสริมสมรรถนะให้กับ PRKs ที่สัมผัสกับ Ang II พบว่า EPC‑MV เพียงอย่างเดียวสามารถปกป้อง PRKs จากความเสียหายที่เกิดจาก Ang II ได้โดยการยับยั้งความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการอักเสบ MV ถูกกำหนดให้เป็นเมมเบรนนาโนเดบริส (0.05‑1 µm) (33) และถูกขับออกจากผิวเซลล์หลังจากการกระตุ้น ความเครียด หรือการตายของเซลล์ นอกจากนี้ MV สามารถได้มาจากเซลล์ประเภทต่างๆ เช่น เกล็ดเลือด เซลล์บุผนังหลอดเลือด EPC และเซลล์เม็ดเลือดขาว (34,35) MV แสดงเครื่องหมายที่ผิวเซลล์จำเพาะ ซึ่งแปรผันตามเซลล์ต้นกำเนิดและการก่อตัว และสามารถออกฤทธิ์ต้านการอักเสบ สารต้านการแข็งตัวของเลือด และการสร้างเส้นเลือดใหม่ได้ (36) MV ที่ปล่อยออกมาจาก EPC สามารถส่งข้อมูลทางชีววิทยาของเซลล์ต้นกำเนิด และทำหน้าที่คล้ายคลึงกันบนเซลล์เป้าหมาย (33) ตัวอย่างเช่น EPC‑MVs ปกป้อง cardiomyocytes จากการเจริญเติบโตมากเกินไปและการตายของเซลล์ที่เกิดจาก Ang II (28) ปรับปรุงการทำงานของบุผนังหลอดเลือดและความสามารถในการควบคุมการสร้างเส้นเลือด (37) และบรรเทาความผิดปกติของเยื่อบุผนังหลอดเลือดที่เกิดจากความเครียดออกซิเดชัน (38) อย่างไรก็ตาม เท่าที่ทราบ ยังไม่มีรายงานผลของ EPC‑MVs ต่อโรคไตจากความดันโลหิตสูง ดังนั้น การศึกษานี้จึงมุ่งที่จะศึกษาผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นจาก EPCs และ EPC‑MVs ในการบาดเจ็บของเซลล์ไต
ในการศึกษานี้ แบบจำลองการบาดเจ็บของ PRK ถูกสร้างขึ้นโดยการกระตุ้นความเสียหายด้วย Ang II สอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้ (26,39) Ang II ลดการแพร่กระจายของ PRK เพิ่มการตายของเซลล์ และจับวงจรของเซลล์ที่ระยะ G1 ก่อนเข้าสู่ระยะ S จากตัวบ่งชี้ที่เกี่ยวข้องกับความดันโลหิตสูงเหล่านี้ ได้ข้อสรุปว่าการสร้างแบบจำลองความตึงเครียดสูง PRK ที่เกิดจาก Ang II สำเร็จแล้ว นอกจากนี้ยังมีการพิจารณาว่าการเพาะเลี้ยงร่วมกับ EPC ช่วยป้องกัน PRKs จากความเสียหายที่เกิดจาก Ang II หลังจากการบ่มร่วมกันของ EPC กับ PRK บวก Ang II ระดับของเอนไซม์ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและปัจจัยการอักเสบใน PRKs ลดลง ดังนั้น กลไกที่อาจเกิดขึ้นโดยที่ EPC ออกแรงป้องกันต่อ PRK อาจเกี่ยวข้องกับการควบคุมความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการอักเสบ จากความรู้ที่ดีที่สุดของเรา การศึกษาในปัจจุบันแสดงให้เห็นเป็นครั้งแรกว่า EPC สามารถปรับปรุงการตอบสนองต่อความเครียดออกซิเดชันที่เกิดจาก Ang II และการอักเสบใน PRKs ได้
EPCs ปกป้องอย่างมีประสิทธิภาพการทำงานของไตใน CKD (40) และมีบทบาทสำคัญในการรักษาความสมบูรณ์ของหลอดเลือดและการซ่อมแซมการบาดเจ็บที่บุผนังหลอดเลือด (15) รวมทั้งลดการรั่วไหลของหลอดเลือด ปรับปรุงการทำงานของอวัยวะ และเพิ่มอัตราการรอดชีวิตในภาวะติดเชื้อ (41) หลักฐานที่สะสมบ่งชี้ว่า EPC อาจทำหน้าที่ป้องกันผ่านการหลั่ง MVs (37,42,43) เพื่อทดสอบผลการป้องกันของ EPC‑MVs ใน PRKs EPC‑MVs ถูกแยกและติดฉลากด้วย PKH26 จากนั้น MV ที่ติดฉลากถูกบ่มร่วมกับ PRK บวก Ang II EPC‑MVs ผสมกับ PRK และยับยั้งการตอบสนองความเครียดออกซิเดชันและการอักเสบที่เกิดจาก Ang II อย่างมีนัยสำคัญ และผลลัพธ์เหล่านี้คล้ายกับของ Fu et al (44) ผลการยับยั้งของ EPC‑MVs ต่อระดับของเอนไซม์ความเครียดออกซิเดชันนั้นมากกว่า EPC เพียงอย่างเดียว นี้สามารถนำมาประกอบกับ MV ที่มีอยู่ในความเข้มข้นที่สูงกว่าใน PRKs ที่บำบัดด้วย EPC-MVs มากกว่าในวัฒนธรรมร่วมกับ EPCs การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าผลการป้องกันของ EPC ต่อ PRK ต่อความเสียหายของเซลล์ที่เกิดจาก Ang II อาจขึ้นอยู่กับ MV ที่หลั่งออกมา ข้อจำกัดของการศึกษาในปัจจุบันคือกลไกที่เป็นไปได้ซึ่ง EPC‑MVs ควบคุม microRNAs/mRNAs/แกนการถ่ายทอดสัญญาณไม่ได้ตรวจสอบอย่างเต็มที่ บทบาทและกลไกที่ EPC‑MVs ใช้ป้องกันไตเสียหายควรได้รับการประเมินในรูปแบบของโรคไตจากความดันโลหิตสูงซึ่งเป็นแนวทางที่มีแนวโน้มสำหรับการวิจัยในอนาคต โดยสรุป การศึกษาในปัจจุบันแสดงให้เห็นว่า EPC สามารถปกป้อง PRKs จากความเครียดออกซิเดชันที่เกิดจาก Ang II และเพิ่มการอักเสบผ่านการหลั่งของ MV นี่เป็นแนวทางใหม่ในการรักษาโรคไตจากความดันโลหิตสูงและสร้างแบบจำลองในหลอดทดลองเพื่อการศึกษาอาการบาดเจ็บที่ไต
