กรดไขมันโอเมก้า-3เพิ่มการควบคุม SIRT1/3, เปิดใช้งาน PGC-1 ผ่านการดีอะซิติเลชัน และกระตุ้นการผลิต Nrf1 ในแบบจำลองหนูไตเทียม 5/6

edmund.chen@wecistanche.com

บทนำ

ไตมีส่วนเกี่ยวข้องในการควบคุมการทำงานหลายอย่าง รวมถึงวิถีการเผาผลาญต่างๆ ความสมดุลของน้ำและอิเล็กโทรไลต์ การควบคุมความดันโลหิต และการผลิตฮอร์โมนหลายชนิด เนื่องจากฟังก์ชันเหล่านี้ใช้พลังงานมหาศาลไตอุดมไปด้วยไมโทคอนเดรีย [1] ไมโตคอนเดรียสามารถปรับให้เข้ากับสภาวะการเผาผลาญต่างๆ ผ่านการควบคุมเป้าหมายทางกลไกของราพามัยซิน (mTOR) และไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นด้วย AMP (AMPK) ซึ่งเป็นสื่อกลางในการตรวจจับสารอาหารเพื่อรักษาจำนวนไมโตคอนเดรียที่มีสุขภาพดี [2] ในบรรดาการศึกษาเกี่ยวกับไมโตคอนเดรีย จนถึงปัจจุบัน มีการศึกษาเพียงไม่กี่เรื่องเกี่ยวกับการสร้างไบโอเจเนซิสของไมโตคอนเดรีย การศึกษาส่วนใหญ่ที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเซลล์ไมโตคอนเดรียไตเนื้อเยื่อ [3,4] และการศึกษาเกี่ยวกับไตส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับเฉียบพลันอาการบาดเจ็บที่ไต(AKI) สัตว์จำลอง เซลล์ท่อส่วนต้น และโรคไตจากเบาหวาน [5–7] แม้ว่าการกำเนิดทางชีวภาพของไมโตคอนเดรียอาจเชื่อมโยงกับการเกิดโรคของความผิดปกติของไมโตคอนเดรียในผู้ป่วยเรื้อรังที่ไม่เป็นเบาหวานโรคไต (CKD) การวิจัยในหัวข้อนี้ยังจำกัดอยู่มาก CKD และ mitochondrial biogenesis เกี่ยวข้องกับโรคหัวใจและหลอดเลือด [8,9] การปรับปรุง biogenesis ของไมโตคอนเดรียอาจเป็นประโยชน์ต่อการป้องกันโรคหัวใจในไตใน CKD การศึกษาที่ระบุว่ากรดไขมันโอเมก้า-3 (FAs) อำนวยความสะดวกในการสร้างชีวภาพของไมโตคอนเดรียได้ดำเนินการโดยใช้สารที่ไม่ใช่ไตเนื้อเยื่อ [3,10]. การศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้แสดงให้เห็นบทบาทที่มีแนวโน้มของโอเมก้า-3 FAs ในการสร้างเซลล์ไมโตคอนเดรียในแบบจำลองสัตว์ที่มีโรคหลอดเลือดหัวใจและโรคเกี่ยวกับระบบประสาท [11] ดังนั้น ในการศึกษานี้ เราจึงมุ่งที่จะศึกษาการสร้างเซลล์ไมโตคอนเดรียในไตของหนูตัดไต (Nx) 5/6 ตัว นอกจากนี้ เราประเมินผลของโอเมก้า-3 FA ต่อการสร้างชีวภาพของไมโตคอนเดรียโดยใช้แบบจำลองนี้

คำสำคัญ:ปัจจัยทางเดินหายใจนิวเคลียร์ 1; ปัจจัยนิวเคลียร์ erythroid 2-ปัจจัยที่เกี่ยวข้อง 2; เซอร์ทูอิน 1; เซอร์ทูอิน 3; กรดไขมันโอเมก้า-3; ไต ไต

CISTANCHE จะปรับปรุงโรคไต/โรคไต

2. ผลลัพธ์

2.1. การเปลี่ยนแปลงในการทำงานของไตและผลการตรวจเนื้อเยื่อ

เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม ระดับยูเรียไนโตรเจนในเลือด (BUN) ในกลุ่ม Nx และ Nx ที่บำบัดด้วยโอเมก้า{0}} กลุ่ม FA เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (กลุ่มควบคุม 17.7 ±1.5, กลุ่ม Nx 77.7 土 28.4 และ tit ด้วยโอเมก้า-3 FA group 63.9 土 17.0 mg/dL, p = 0.{{20}}07) แม้ว่าไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง Nx และ Nx ที่บำบัดด้วยกลุ่ม FA โอเมก้า-3 FA แต่ระดับ BUN นั้นต่ำกว่าตัวเลขใน Nx ที่บำบัดด้วยกลุ่ม FA โอเมก้า-3 ระดับครีเอตินินในเลือด (sCr) ในสามกลุ่มมีความคล้ายคลึงกับระดับของ BUN (กลุ่มควบคุม 0.4 th 0.U; กลุ่ม Nx, 1.3 土 0.6; omega-3 FA, 1.0 ± 0.3 มก./เดซิลิตร; y=0.008) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม พบว่าการขยายตัวของท่อและการฝ่ออย่างรุนแรงถูกสังเกตพบโดยใช้การย้อมสี PAS ในกลุ่ม Nx (รูปที่ S1) เสริม นอกจากนี้ ผลการศึกษาพบว่า Nx ที่บำบัดด้วยกลุ่ม FA ที่มีโอเมก้า-3 มีการเปลี่ยนแปลงของ tubulointerstitial น้อยกว่ากลุ่ม Nx ดิการทำงานของไตและการเปลี่ยนแปลงทางเนื้อเยื่อในทั้งสามกลุ่มได้รับการรายงานแล้วในการศึกษาก่อนหน้านี้ [12]

22 การเปลี่ยนแปลงในปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเซลล์ไมโตคอนเดรีย

2.2.1. นิพจน์ Nrf1 และ Nrf2เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม กลุ่ม Nx แสดงระดับการแสดงออกที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญของปัจจัยการหายใจด้วยนิวเคลียร์ 1 (Nefl) และปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับนิวเคลียสอีรีทรอยด์ 2-ปัจจัยที่เกี่ยวข้อง 2 (Nrf2) อย่างไรก็ตาม ในกลุ่ม Nx ที่บำบัดด้วยกลุ่มโอเมก้า-3 FA ระดับการแสดงออกของ Nrf1 และ Nrf2 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่ม Nx แต่ไม่ถึงระดับของกลุ่มควบคุม (Oigure P, รูปที่เสริม St) . ผลลัพธ์เหล่านี้ยังพบอีกด้วย cn Nrf1 mRNA การวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (รูปที่ S3) เสริม

2.2.3. การแสดงออกของปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับกิจกรรม PGC-1: pAMPK, SIRT1/3เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม กลุ่ม Nx และ Nx ที่บำบัดด้วยโอเมก้า-3แสดงระดับ AMPK ที่มีฟอสโฟรีเลตที่ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (อัตราส่วนของฟักทองต่อ AMPK) (รูปที่ 3A) นอกจากนี้ กลุ่ม Nx แสดงระดับการแสดงออกของ sirtuin 1 (SIRT1) ที่ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 3B, รูปที่ S6) อย่างไรก็ตาม หลังจากเพิ่มโอเมก้า-3 FA การแสดงออกของ SIRT1 เพิ่มขึ้นค่อนข้างมาก แต่ความแตกต่างนี้ไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ ผลลัพธ์เหล่านี้พบได้ในการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณของ SIRT1 mRNA (รูปที่ S7) เพิ่มเติม ในทางกลับกัน การแสดงออกของ sirtuin 3 (SIRT3) ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม Nx เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม ซึ่งได้รับการช่วยเหลืออย่างมีนัยสำคัญใน Nx ที่บำบัดด้วยกลุ่ม FA โอเมก้า-3 (รูปที่ 3C)

2.2.4. Keap1, mTOR, FoxO1 และ FoxO3 Expression เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม การแสดงออกของโปรตีน 1 ที่เกี่ยวข้องกับ EC H คล้าย Kelch (Keap1) และโปรตีน Forkhead box O1 และ O3 (FoxO1/3) เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม Nx . ในกลุ่ม Nx ที่บำบัดด้วยกลุ่ม FA โอเมก้า-3 ระดับการแสดงออกของ Keap1 และ FoxO1/3 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่ม Nx (รูปที่ 4C,E,F) เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม การแสดงออกของ mTOR ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม Nx อย่างไรก็ตาม ในกลุ่ม Nx ที่บำบัดด้วยกลุ่ม FA โอเมก้า-3 นิพจน์ mTOR ได้รับการช่วยเหลือแต่ไม่ถึงระดับในกลุ่มควบคุม (รูปที่ 4B)

2.2.5. เนื้อหาของไมโทคอนเดรียดีเอ็นเอ (mtDNA) พบการลดลงอย่างมีนัยสำคัญของ mtDNA ในกลุ่ม Nx เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม อย่างไรก็ตาม ปริมาณการลดลงของ mtDNA ถูกนำกลับคืนมาอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม Nx ที่บำบัดด้วย Nx-3 Nx (รูปที่ S9) เสริม

3. อภิปราย

PGC-1 ซึ่งถูกกระตุ้นผ่านฟอสโฟรีเลชันและดีอะซีทิเลชัน เป็นตัวควบคุมหลักของการสร้างชีวภาพและการผลิตพลังงานของไมโตคอนเดรีย เราพบว่าการแสดงออกและการดีอะซีไทเลชันของ PGC-1 ลดลงในแบบจำลอง CKD เป็นที่น่าสังเกตว่าการลด PGC-1 deacetylation เป็นกลไกหลักที่เอื้อต่อการสร้างเซลล์ไมโตคอนเดรียที่ผิดปกติและการผลิตพลังงานที่ลดลงใน CKD AMPK กระตุ้น PGC-1 ผ่านทางฟอสโฟรีเลตติ้งทรีโอนีนหรือซีรีนที่ตกค้าง [13,14] AMPK จะทำงานเมื่อเกิดฟอสโฟรีเลชันเช่นกันเมื่ออัตราส่วน AMP/ATP สูง อย่างไรก็ตาม เป็นที่ทราบกันว่า AMPK ถูกปิดใช้งานใน CKD เนื่องจากการตรวจจับระดับ AMP สูงผิดปกติ [15,16] คล้ายกับการศึกษาก่อนหน้านี้ เราแสดงให้เห็นว่า AMPK phosphorylation ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในไตเนื้อเยื่อของกลุ่ม Nx แม้ว่า pPGC-1/PGC-1 จะเพิ่มขึ้นในระดับหนึ่งในกลุ่ม Nx แต่ก็ไม่น่าเป็นไปได้ที่ระดับของ PGC-1 ฟอสโฟรีเลชันจะเพิ่มขึ้นเนื่องจาก PGC ลดลง{{3 }} การแสดงออก. นอกจากนี้ Nx ที่บำบัดด้วยกลุ่ม FA โอเมก้า-3 ยังแสดงผลที่คล้ายกันกับกลุ่ม Nx ซึ่งบ่งชี้ว่าการให้โอเมก้า-3 FA ไม่ส่งผลต่อฟอสโฟรีเลชันของ AMPK และ PGC{{6} } . Deacetylation สามารถเกิดขึ้นได้ในลำดับทั้งหมดของ PGC-1 และ SIRT1 และ 3 มีบทบาทสำคัญในกระบวนการ deacetylation [13,14] หลังจากให้โอเมก้า-3 FA ระดับการแสดงออกของ PGC-1 , SIRT1 และ 3 เพิ่มขึ้น ส่งผลให้สามารถช่วยชีวิตของ PGC ที่เลิกใช้ออกซิเจนได้-1 ให้อยู่ในระดับเดียวกับกลุ่มควบคุมปกติ . การช่วยเหลือในระดับการแสดงออกของ Nrf1 และ Nrf2 ซึ่งแสดงให้เห็นใน Nx ที่บำบัดด้วยกลุ่ม FA โอเมก้า-3 เกี่ยวข้องโดยตรงกับระดับการแสดงออกของ SIRT1 และ 3 ที่เพิ่มขึ้น ซึ่งนำไปสู่การลดระดับของ PGC{ {22}} .

CISTANCHE จะปรับปรุงการทำงานของไต/ไต

การศึกษาล่าสุดเกี่ยวกับไมโตคอนเดรียในโรคไตได้แสดงให้เห็นว่าการเพิ่มขึ้นของระดับการแสดงออกของ PGC- 1 หรือ SIRT ผ่านการแทรกแซงทางพันธุกรรมหรือทางเภสัชวิทยาดีขึ้นไตเสียหายในโมเดลสัตว์ AKI [5–7,17,18] กลไกพื้นฐานเกี่ยวข้องกับผลของการปรับปรุงในการเกิดออกซิเดชันของ FA หรือการตอบสนองของสารต้านอนุมูลอิสระ การศึกษาก่อนหน้านี้รายงานว่าการให้โอเมก้า-3 FA ช่วยปรับปรุงไมโตคอนเดรีย FA beta-oxidation และแสดงผลสารต้านอนุมูลอิสระในแบบจำลองหนูทดลอง 5/6 Nx [19] นอกจากนี้ยังมีรายงานที่ชี้ให้เห็นว่าโอเมก้า-3 FA เพิ่มการแสดงออกของ PGC-1 , Nrf1 และ SIRT1 ในเซลล์กล้ามเนื้อ มาโครฟาจ และเซลล์ประสาท [3,10,11] เนื่องจากยังไม่มีการรายงานผลกระทบของ FAs ของโอเมก้า-3 ต่อไมโตคอนเดรียในแบบจำลอง CKD เราแสดงให้เห็นว่าโอเมก้า-3 FA มีประสิทธิภาพในการฟื้นฟูโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับไมโตคอนเดรียและ mtDNA โดยใช้แบบจำลอง CKD ในเรื่องนี้ ศึกษา.

ทั้ง mTOR และ AMPK เกี่ยวข้องกับการสร้างเซลล์ไมโตคอนเดรีย แต่บทบาทของพวกมันแตกต่างกันไปตามสถานะทางโภชนาการ mTOR ซึ่งเป็นเป้าหมายของ rapamycin complex 1 (mTOC1) สามารถกระตุ้นได้ด้วยการกระตุ้นพลังงาน เช่น กรดอะมิโนหรือกลูโคส และสามารถกระตุ้นเส้นทางที่นำไปสู่กระบวนการ anabolic และการสร้าง mitochondrial biogenesis ในทางกลับกัน AMPK สามารถกระตุ้นได้ด้วยการขาดออกซิเจนและภาวะขาดสารอาหาร ซึ่งนำไปสู่การกระตุ้นกระบวนการ catabolic และการสร้าง biogenesis ของไมโตคอนเดรีย และยับยั้งการใช้พลังงานผ่าน mTOC1 [2] ในการศึกษานี้ เราไม่เพียงแสดงให้เห็นการลดลงของ pAMPK/AMPK เท่านั้น แต่ยังแสดงให้เห็นการลดลงของ mTOR ในแบบจำลอง CKD ด้วย นอกจากนี้ การบริหารให้โอเมก้า-3 FA นำไปสู่การฟื้นตัวของนิพจน์ mTOR ที่ใกล้จะฟื้นตัวแต่ไม่มีการฟื้นตัวของ pAMPK/AMPK ที่ลดลง ดังนั้น โอเมก้า-3 FA อาจบรรเทาการสร้างไบโอเจเนซิสของยลที่ลดลงโดยการเพิ่มการแสดงออกของ mTOR ในไตของแบบจำลองสัตว์ CKD อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อชี้แจงว่า mTOR ลดลงในผู้ป่วย CKD หรือไม่ และการเพิ่มขึ้นของการแสดงออกของ mTOR ผ่านการรักษาด้วยโอเมก้า-3 FA จะส่งผลต่อสุขภาพยลและการลุกลามของ CKD อย่างไร

FoxO1 และ 3 เชื่อมโยงกับโปรโมเตอร์ PGC-1 และปรับปรุงการถอดรหัส [20,21] อย่างไรก็ตาม ในการศึกษานี้พบว่า FoxO1 และ 3 เพิ่มขึ้นในกลุ่ม Nx และลดลงในกลุ่มควบคุม และ Nx ที่บำบัดด้วยกลุ่ม FA โอเมก้า-3 ดังนั้นจึงสันนิษฐานว่าการแสดงออกของ FoxO1 และ 3 เกี่ยวข้องกับการตอบสนองการชดเชยเพื่อลด PGC-1 ใน CKD หรือเพิ่ม PGC-1 ผ่านการบริหาร FA ของโอเมก้า-3 Nrf2 มีบทบาทสำคัญในการสร้างสมดุลรีดอกซ์ของเซลล์และการสร้างเซลล์ไมโตคอนเดรีย มีสามระบบ ubiquitin ligase ที่เกี่ยวข้องกับการเสื่อมสภาพของ Nrf2 (Keap1, -transducin โปรตีนที่ประกอบด้วยโปรตีนซ้ำ และ E3 ubiquitin ligase synovial) [22] ในการศึกษานี้ เราแสดงให้เห็นการลดลงอย่างมีนัยสำคัญใน Nrf2 และการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน Keap1 ในกลุ่ม Nx เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม d อย่างไรก็ตาม ในกลุ่ม Nx ที่ได้รับโอเมก้า-3 FA พบว่าการแสดงออกของ Keap1 จะลดลงและ Nrf2 เพิ่มขึ้น ผลการวิจัยชี้ให้เห็นว่าผลการต้านอนุมูลอิสระที่ดีขึ้นของการบริหาร FA ของโอเมก้า-3ในแบบจำลองหนู CKD อาจเกี่ยวข้องกับการลดลงของการแสดงออกของ Keap1 และการย่อยสลาย Nrf2 ซึ่งอาจช่วยเพิ่มการสร้างชีวภาพของไมโตคอนเดรีย จากผลการศึกษาที่ได้รับในการศึกษานี้ จำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่ออธิบายความสัมพันธ์เชิงสาเหตุระหว่าง FoxO1/3 และ Nrf2 ในสภาพแวดล้อม CKD และผลของการให้โอเมก้า-3 FA

CISTANCHE จะปรับปรุงการติดเชื้อในไต/ไต

น้ำหนักโมเลกุลของ Nrf2 อยู่ที่ 68 กิโลดาลตัน (kDa) ในการศึกษานี้และการศึกษาล่าสุดอื่นๆ [23,24] อย่างไรก็ตาม การศึกษาก่อนหน้านี้ระบุว่าน้ำหนักโมเลกุลที่เกี่ยวข้องทางชีวภาพของ Nrf2 คือ 95–110 kDa พร้อมหลักฐาน [25,26] นอกจากนี้เรายังพบแถบคาดที่สงสัยว่ามีความเกี่ยวข้องทางชีวภาพ Nrf2 (รูปที่ S8) เสริม จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อค้นหาน้ำหนักโมเลกุลของ Nrf2 ที่มีความสำคัญทางชีววิทยา ในการศึกษาก่อนหน้านี้ มีรายงานการเปลี่ยนแปลงของไมโตคอนเดรียในวันที่ 28 หลังจาก 5/6 Nx ซึ่งบ่งชี้ว่ายีนหรือการแสดงออกของโปรตีนลดลงที่เกี่ยวข้องกับเบตา-ออกซิเดชัน ออกซิเดชันฟอสโฟรีเลชัน และโปรตีนโครงสร้างเยื่อหุ้มชั้นใน แต่ไม่มีผลลัพธ์ เกี่ยวข้องกับการแสดงออกของ PGC-1 [27,28] ในการศึกษานี้ เรายืนยันว่าโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับการสร้างชีวภาพของไมโตคอนเดรียและ mtDNA ที่สะท้อนการสร้างชีวภาพของไมโตคอนเดรียถูกมอดูเลตในระหว่างระยะเรื้อรัง เนื่องจากการเปลี่ยนแปลงถูกสังเกตพบในวันที่ 45 หลังจาก 5/6 Nx ในหนูแรท แม้จะมีการปรับปรุงทางจุลพยาธิวิทยาและชีวภาพ การรักษาด้วยโอเมก้า-3 FA ไม่ได้ส่งผลให้การฟื้นฟูสมรรถภาพของไตเทียบกับรุ่น Nx ดังนั้น จำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่อพิจารณาว่าโอเมก้า-3 FAs มีประสิทธิภาพในการฟื้นฟูหรือไม่การทำงานของไตโดยการกระตุ้นผลกระทบที่อาจปรับปรุงการทำงานของไมโตคอนเดรีย มีข้อ จำกัด หลายประการในการศึกษานี้ ประการแรก เราไม่ได้ประเมินกิจกรรมการสังเคราะห์ซิเตรตและการเกิดซูเปอร์ออกไซด์ในห่วงโซ่การหายใจของไมโตคอนเดรีย ประการที่สอง เราไม่ได้ทำการทดลองกับส่วนประกอบ FA ของ Omacor ที่ได้รับผลกระทบส่วนใหญ่ในโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเซลล์ไมโตคอนเดรีย ประการที่สาม เราไม่ได้แสดงให้เห็นถึงกลไกที่ชัดเจนในการปรับปรุงโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับการสร้างชีวภาพของไมโตคอนเดรีย เราแค่แนะนำว่าฤทธิ์ต้านการอักเสบ การลดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและกรดไขมันโอเมก้า-3ในฐานะสารประกอบเมตาบอลิซึมอาจเกี่ยวข้องกับกลไกนี้

4. วัสดุและวิธีการกำเนิดทางชีวภาพของไมโตคอนเดรีย

4.1. การออกแบบสัตว์และการทดลองการศึกษาได้ดำเนินการกับหนู Sprague-Dawley เพศผู้ (9-สัปดาห์) ที่ซื้อจาก Japan SLC, Inc. (ชิซูโอกะ ประเทศญี่ปุ่น) หนูทุกตัวอยู่ภายใต้การควบคุมหลอกอย่างใดอย่างหนึ่งหรือ 5/6 Nx ขั้นตอนทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับสัตว์ได้ดำเนินการตามการอนุมัติของคณะกรรมการการดูแลสัตว์ประจำสถาบันของมหาวิทยาลัย Dong-A (DIACUC-14-4) หนูอยู่ภายใต้สภาวะมาตรฐานและอนุญาตให้เข้าถึงน้ำประปาและอาหารมาตรฐานได้ฟรี หนูทั้งหมดถูกกำหนดให้กับกลุ่มต่อไปนี้: กลุ่มที่ 1 (กลุ่มควบคุมหลอก, n=6), หนูควบคุมที่เลี้ยงในน้ำเกลือ (1 มล./กก./วัน โดยการล้างกระเพาะ); กลุ่มที่ 2 (กลุ่ม Nx, n=6), หนู Nx เก็บในน้ำเกลือ (1 มล./กก./วัน โดยการล้างกระเพาะ); กลุ่มที่ 3 (กลุ่มโอเมก้า-3 FA), หนู Nx ที่บำบัดด้วยโอเมก้า-3 FAs ปริมาณและเส้นทางการบริหารของโอเมก้า-3 FAs (Omacor, 300 มก./กก./วัน โดย gastric gavage, Pronova Biocare, Sandefjord, นอร์เวย์) ถูกกำหนดจากการศึกษาก่อนหน้านี้ [19] Omacor เป็นโอเมก้าที่มีต้นกำเนิดจากทะเล-3 FA และประกอบด้วยกรดไอโคซาเพนทาอีโนอิก (EPA) 460 มก. และกรดโดโคซาเฮกซาอีโนอิก (DHA) 380 มก. ใน Omacor 1 กรัม Omacor มักถูกกำหนดไว้สำหรับการป้องกันทุติยภูมิหลังกล้ามเนื้อหัวใจตายและการรักษาภาวะไตรกลีเซอไรด์ในเลือดสูง [29] โอเมก้า-3 FAs (EPA plus DHA) สองชนิดเป็นส่วนประกอบหลัก (84 เปอร์เซ็นต์) และส่วนประกอบสำคัญของ Omacor ซึ่งเตรียมทางเภสัชกรรม

องค์ประกอบเอาชนะส่วนประกอบย่อย (ร้อยละ 16 ) เราเลือก Omacor สำหรับการเสริมโอเมก้า-3 FA ที่มีฤทธิ์ต้านการอักเสบและลดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน เนื่องจากช่วยลดความเสี่ยงของโรคหัวใจและหลอดเลือดในการศึกษาทางคลินิก [30] หนูได้รับอาหารอย่างสม่ำเสมอและสังเกตน้ำหนักของพวกมันทุกวัน หนูได้รับอนุญาตให้เข้าถึงน้ำประปาได้ฟรีเป็นเวลา 15 สัปดาห์หลังการผ่าตัด จากนั้นจึงทำการุณยฆาตภายใต้การดมยาสลบด้วยไดเอทิล อีเทอร์ เมื่อเสียชีวิต เก็บตัวอย่างเลือดเอออร์ตาแล้วหมุนเหวี่ยงที่ 3000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที เพื่อระบุการเปลี่ยนแปลงในการทำงานของไตวัดระดับ BUN และ sCr โดยใช้เครื่องวิเคราะห์อัตโนมัติ (โรช ประเทศเยอรมนี)

4.2. การตรวจทางจุลพยาธิวิทยาฟอร์มาลินคงที่ไตเนื้อเยื่อถูกฝังในพาราฟิน หั่นเป็นชิ้น (4 ไมโครเมตร) และย้อมด้วยกรดชิฟฟ์เป็นระยะ พบการเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาด้วย Aperio ScanScope (Aperio Technologies, Vista, CA, USA)

4.3. การแยก RNA และการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณRNA ทั้งหมดถูกสกัดจากไตเนื้อเยื่อโดยใช้รีเอเจนต์ TRIzol จากนั้น RNA ทั้งหมด 1 ไมโครกรัมถูกแปลงเป็น cDNA แบบสายเดี่ยวโดยใช้ชุดการสังเคราะห์ M-MLV cDNA (เอ็นไซโนมิกส์ แดจอน เกาหลี) ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบจากลำดับยีนตามลำดับโดยใช้ซอฟต์แวร์ Primer3 และ mfold สำหรับการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ cDNA อยู่ภายใต้การขยาย PCR โดยใช้ไพรเมอร์เฉพาะยีน: หนู PGC1 50- CCG AGA ATT CAT GGA GCA AT-30(ความรู้สึก), 50- GTG TGA GGA GGG TCA TCG TT-30(แอนติเซนส์); หนู Nrf1 50- GTT TCA TGG ACC CAA GCA TT-30 (ความรู้สึก), 50- GGT GGC CTG AGT TTG TGT CT-30 (แอนติเซนส์); หนู SIRT3, 50- GAG ACT TGG TGG GGT CCT TT -30 (ความรู้สึก), 50- ATC CTG CAG CTC TTG TGT CC -30 (antisense); หนู SIRT1, 50- CAG GTT GCA GGA ATC CAA AG -30(ความรู้สึก), 50- CTC CAC GAA CAG CTT CAC AA -30 (antisense); หนู -แอกติน, 50- GCG CAA GTA CTC TGT GTG GA -30 (ความรู้สึก), 50- CAT CGT ACT CCT GCT TGC TG -30 (แอนติเซนส์) PCR แบบเรียลไทม์ดำเนินการโดยใช้ SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ด้วยเครื่องมือ ABI 7500 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)

CISTANCHE จะช่วยเพิ่มอาการปวดไต/ไต

4.4. Western Blotting และ ImmunoprecipitationWestern blotting ได้รับการวิเคราะห์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยมีการดัดแปลงเล็กน้อย [10]ไตเนื้อเยื่อถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันโดยบัฟเฟอร์สลาย (สารละลายการสกัดโปรตีน PRO-PREP) บ่ม (30 นาทีที่ 4 ◦C) และหมุนเหวี่ยง (14,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 20 นาทีที่ 4 ◦C) ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยรีเอเจนต์การทดสอบโปรตีนของแบรดฟอร์ด (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ตัวอย่างโปรตีนที่เท่ากันถูกโหลดบน SDS-PAGE 7.5–15 เปอร์เซ็นต์ และถ่ายโอนไปยังเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลส (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) จากนั้น โปรตีนถูกอิมมูโนบล็อตกับแอนติบอดีแต่ละตัว แอนติบอดีต้าน PGC-1 และ SIRT1 ได้มาจากเทคโนโลยีชีวภาพของซานตาครูซ (ซานตาครูซ แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) ซื้อแอนติบอดีที่ต่อต้าน AMPK, pAMPK, Nrf1, SIRT3, FoxO1, FoxO3a และ mTOR จาก Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) ซื้อแอนติบอดีต้าน Nrf2, Keap1 (โมโนเมอร์) และ -actin จาก Abcam (Cambridge, MA, USA) และ Sigma (St. Louis, MO, USA) สำหรับการตกตะกอนทางภูมิคุ้มกัน โปรตีนทั้งหมด 500 ไมโครกรัมถูกบ่มด้วยแอนติบอดี PGC-1 (เทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ, ซานตาครูซ, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) และโปรตีน A/G บวก-อะกาโรสบีด (เทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ, ซานตาครูซ, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) และปล่อยให้ผสมที่อุณหภูมิ 4 ◦C ค้างคืน อิมมูโนพรีซิพิเทตถูกแยกออกโดยใช้อิเล็กโตรโฟรีซิส SDS-PAG และอิมมูโนบล็อตโดยใช้อะเซทิล-ไลซีน (เทคโนโลยีการส่งสัญญาณของเซลล์, เบเวอร์ลี, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) และแอนติบอดีฟอสโฟเซอรีน (เมอร์คมิลลิพอร์, เบอร์ลิงตัน, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) ต่อมา เยื่อหุ้มเซลล์ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ควบคู่กับฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดสเป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ระดับโปรตีนถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดย -แอกติน (ImageJ เวอร์ชัน 1.48q) การวิเคราะห์ Western blotting และ immunoprecipitation ด้วยแอนติบอดีดำเนินการโดยใช้สารตั้งต้นเคมีลูมิเนสเซนซ์ที่ปรับปรุง Super Signal West Pico (Thermo Scientific, Hudson, NH, USA) และตรวจพบโดยใช้ LAS-3000 Plus (Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)

4.5 การวัดเนื้อหา mtDNAqPCR ถูกใช้เพื่อกำหนดเนื้อหาสัมพัทธ์ของ mtDNA ปฏิกิริยาถูกดำเนินการผ่านทางเคมีสีเขียว SYBR โดยใช้ DNA ทั้งหมด 3 ng เป็นแม่แบบและไพรเมอร์ต่อไปนี้: หนู mtDNA 5'-GGTTCTTACTTCAGGGCCATCA-3' (ความรู้สึก), 5,-TGATTAGACCCGTTACCA TCGA-3' ( แอนติเซน); หนู p-actin, 5'- CCCAGCCATGTACGTAGCCCA (ความรู้สึก), C- CGTCTC- CGGAGTCCATCAC f (แอนติเซนส์). มีรายงานเนื้อหา mtDNA ที่สัมพันธ์กับ DNA นิวเคลียร์ใน [31]

4.6 การวิเคราะห์ทางสถิติการวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS 180 (IBM Corp., Armonk, NYP USA) ผลลัพธ์จะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย 土 SD ค่าเฉลี่ยสำหรับกลุ่มเปรียบเทียบโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวน ตามด้วยการเปรียบเทียบหลายรายการของทูคีย์ p e 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ

5. สรุปผลการวิจัย

โดยสรุป การมอดูเลตที่มีนัยสำคัญในการแสดงออกของผู้ไกล่เกลี่ยที่เกี่ยวข้องกับการสร้างชีวภาพของไมโตคอนเดรียถูกสังเกตพบในแบบจำลองหนูแรท CKD Omega-3 FA อาจปรับปรุงการสร้างชีวภาพของไมโตคอนเดรียโดยการปรับเพิ่ม Nrf1 และ Nrf2 กลไกการป้องกันนี้อาจเริ่มต้นได้โดยการเพิ่มการแสดงออกของ PGC-1 และการลดความเข้มข้นของ PGC-1 ซึ่งถูกกระตุ้นโดยการผลิต SIRT1/3 ที่เพิ่มขึ้น (รูปที่ 5) รูปที่ 5. ผลของโอเมก้า-3 FA ต่อการสร้างชีวภาพของไมโตคอนเดรียใน CKD ลูกศรสีดำตัวหนาบ่งบอกถึงการแสดงออกของผู้ไกล่เกลี่ยที่เกี่ยวข้องกับการสร้างชีวภาพของไมโตคอนเดรียในแบบจำลองหนู CKD ลูกศรสีแดงแสดงถึงการแสดงออกของผู้ไกล่เกลี่ยหลังการให้โอเมก้า-3 FA ลูกศรขึ้น / ลงแสดงถึงการเพิ่มขึ้นและลดลงในการแสดงออกของผู้ไกล่เกลี่ย