ผลการป้องกันของ Tubuloside B ต่อการตายของเซลล์ประสาทที่เกิดจาก TNF

บทคัดย่อ

จุดมุ่งหมาย: เพื่อตรวจสอบผลทางประสาทของ tubuloside B ซึ่งเป็นหนึ่งใน phenylethanoids ที่แยกได้จากลำต้นของซิสแทนเช่ ซัลซ่าเกี่ยวกับการตายของเซลล์เนื้องอกที่เกิดจากปัจจัย-อัลฟา (TNF) ที่เกิดจากการตายของเซลล์ในเซลล์ประสาท SH-SY5Yวิธีการ: วิเคราะห์ความมีชีวิตของเซลล์โดยใช้การสอบวิเคราะห์ MTT ตรวจพบเซลล์ Apoptotic โดยใช้ Hoechst33342staining และยืนยันโดยการกระจายตัวของ DNA และการวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทริก กิจกรรมของแคสเปส-3ถูกวัดด้วยชุดทดสอบพิเศษ ความเข้มข้นของแคลเซียมภายในเซลล์อิสระถูกกำหนดด้วย probeIndo-1 โดยสเปกโตรมิเตอร์ ระดับของสปีชีส์ออกซิเจนในปฏิกิริยาภายในเซลล์และศักยภาพของเยื่อไมโทคอนเดรียถูกกำหนดหาโดยกล้องจุลทรรศน์แบบสแกนด้วยเลนส์คอนโฟคอล (LSCM) รวมกับโพรบฟลูออเรสเซนส์H2DCFDA หรือ JC-1 ตามลำดับ ผลลัพธ์: เซลล์ SH-SY5Y ที่บำบัดด้วย TNF 100 ไมโครกรัม/ลิตร เป็นเวลา 36 ชั่วโมง แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาโดยทั่วไปของการตายของเซลล์ ขั้นบันไดดีเอ็นเอสามารถสังเกตได้โดย agarose gel electrophoresis เปอร์เซ็นต์สูงสุดของเซลล์ apoptotic สะสมถึง 37.5 เปอร์เซ็นต์ หลังการรักษา 36 ชั่วโมงด้วย TNF พบว่ามีการสะสมของ ROS ภายในเซลล์และ [Ca2 plus ] I และการลดลงของศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย และพบว่ากิจกรรมของแคสเปส-3เพิ่มขึ้นประมาณห้าเท่าเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม อย่างไรก็ตาม การปรับสภาพด้วยทูบูโลไซด์บี (1, 10 หรือ 100 มก./ลิตร) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงทำให้การตายของเซลล์ตายโดย TNF ลดลง ฤทธิ์ต้านอะพอพโทซิสของทูบูโลไซด์ Bบางส่วนขึ้นอยู่กับผลกระทบของความเครียดต่อต้านอนุมูลอิสระ การรักษาการทำงานของไมโตคอนเดรีย การลดลงของความเข้มข้นของแคลเซียมภายในเซลล์อิสระ และการยับยั้งกิจกรรมของแคสเปส-3 สรุป: Tubuloside B มีความสามารถในการปกป้องระบบประสาทในการต่อต้านการตายของเซลล์ที่เกิดจาก TNF ในเซลล์ SH-SY5Y และอาจมีประโยชน์ในการรักษาโรคเกี่ยวกับระบบประสาทบางชนิด

การแนะนำ

การตายของเซลล์แบบอะพอพโทซิสมีบทบาทสำคัญต่อสภาวะสมดุลในกระบวนการเซลล์ต่างๆ รวมทั้งในการพัฒนาระบบประสาท[1] การตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมไว้อาจนำไปสู่สภาวะทางพยาธิสภาพต่างๆ เช่น สมองขาดเลือด[2,3] ความผิดปกติของระบบประสาท เช่น โรคอัลไซเมอร์ โรคพาร์กินสัน โรคฮันติงตัน และเส้นโลหิตตีบด้านข้างอะไมโอโทรฟิก[4-7]; เช่นเดียวกับโรคไข้สมองอักเสบที่ล่าช้าหลังจากพิษคาร์บอนมอนอกไซด์เฉียบพลัน[8] หลักฐานหลายบรรทัดชี้ให้เห็นอย่างชัดเจนว่าความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ความไม่สมดุลของเซลล์ระหว่างการผลิตและการกำจัดชนิดออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) ทำให้เกิดการตายของเซลล์ประสาทและเนื้อร้าย[9-11] ดังนั้นจึงควรระบุสารประกอบที่สามารถต่อต้านการกระทำที่เป็นอันตรายของ ROS และทำหน้าที่เป็นสารต้านอนุมูลอิสระในการปกป้องเซลล์ประสาทจากการตายของเซลล์

Tubuloside B เป็นหนึ่งใน phenylethanoids ที่แยกได้จากลำต้นของซิสแทนเช่ ซัลซ่ายาสมุนไพรจีนซึ่งเป็นยาดิบสำคัญที่ใช้ทั้งต่อต้านซีลีเนียมและสารต้านความเมื่อยล้า[12] ฟีนิลทานอยด์หลายชนิดแสดงให้เห็นว่ามีคุณสมบัติในการขับอนุมูลอิสระและป้องกันการบาดเจ็บที่เป็นพิษที่เกิดจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน[13-15] Tumor necrosis factor-alpha (TNF ) เป็นสารรบกวนที่เป็นพิษเนื่องจากมีบทบาทสำคัญในโรคทางระบบประสาท พบการเสียชีวิตจากเนื้อร้ายหรือการตายของเซลล์จากการตอบสนองต่อ TNF [16] การศึกษาจำนวนมากแนะนำว่าความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันมีบทบาทสำคัญในกลไกของการตายของเซลล์ที่เกิดจาก TNF ระดับ ROS ที่เพิ่มขึ้นได้รับการบันทึกไว้ในเซลล์หลังการรักษาด้วย TNF [17,18] และการเสียชีวิตจาก TNF สามารถยับยั้งได้โดยอนุมูลอิสระ [19] ดังนั้นเราจึงศึกษาว่า tubuloside Bcan ป้องกันการตายของเซลล์ที่เกิดจาก TNF และความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในเซลล์ประสาท SH-SY5Y ที่เพาะเลี้ยงได้หรือไม่

วัสดุและวิธีการ

รีเอเจนต์

Modified Eagle's medium (MEM) และ fetal bovine serum (FBS) ถูกซื้อจาก GIBCO/BRL สีย้อมโครมาติน บิสเบนซิไมด์ (Hoechst 33342), โพลี-แอล-ไลซีน, 3-(4,5-ไดเมทิลไทอาซาล-z-อิล)-2,5-ไดฟีนิลเตตราโซเลียม (MTT), TNF , และ 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) ได้รับจาก Sigma Chemical Company (St Louis, MO, USA) ชุดตรวจหาอะพอพโทซิสของแอนเนกซิน-V fluorescein isothiocyanate (FITC) ถูกซื้อจาก Boehringer Mannheim (อินเดียนาโพลิส IN เยอรมนี) 5,5´,6,6´-Tetrachloral-1,1´,3,3´-tetraethyl benzimidazole carbocyanine iodide (JC-1) และ Indo-1/AM ถูกซื้อจากโมเลกุล โพรบส์ (ไลเดน, เนเธอร์แลนด์). Caspase-3 assay และชุดสกัด DNA ได้มาจาก Promega (USA) Tubuloside B จากซิสแทนเช่ ซัลซ่าได้รับความเมตตาจาก Dr. Peng-fei TU (ศูนย์วิจัยการแพทย์แผนจีนสมัยใหม่ของมหาวิทยาลัยปักกิ่ง) ความบริสุทธิ์ของสารประกอบมากกว่า 98 เปอร์เซ็นต์ในโครมาโตกราฟีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูง (HPLC) น้ำยาหรือยาอื่นๆ ทั้งหมดมีระดับการวิเคราะห์

การเพาะเลี้ยงเซลล์และการรักษา

SH-SY5Ycells ของเซลล์ประสาทที่ได้รับจาก ATCC ถูกคงรักษาไว้ใน MEM ที่เสริมด้วย FBS 10 เปอร์เซ็นต์, 100 KU/L benzylpenicillin และ 100 มก./ลิตร streptomycins ในขวดเพาะเชื้อที่เคลือบด้วย สื่อวัฒนธรรมได้รับการต่ออายุทุก 2 ถึง 3 วัน เซลล์ถูกบำบัดก่อนด้วยความเข้มข้นต่างๆ ของทูบูโลไซด์ บี (1, 10 หรือ 100 มก./ลิตร) เป็นเวลา 2 ชั่วโมง และจากนั้นบำบัดด้วย TNF 100 ไมโครกรัม/ลิตร เป็นเวลา 36 ชั่วโมงก่อนการวิเคราะห์ เซลล์ปกติถือเป็นตัวควบคุม

การวิเคราะห์ความมีชีวิตของเซลล์

ความมีชีวิตของเซลล์ถูกกำหนดหาโดยการใช้การสอบวิเคราะห์ MTT[20] เซลล์ถูกเพาะในเพลต 96-หลุมที่ 1×104 เซลล์ต่อหลุมและเติบโตถึง 70 เปอร์เซ็นต์ที่บรรจบกันในอาหารเลี้ยงเชื้อ สื่อถูกแทนที่ด้วยอาหารกลางที่มีความเข้มข้นต่างๆ ของทูบูโลไซด์ B เป็นเวลา 2 ชั่วโมง และจากนั้นด้วย TNF เป็นเวลา 36 ชั่วโมง MTT ทั้งหมด 5 กรัม/ลิตรถูกเติมในแต่ละหลุมหลังจาก 36 ชั่วโมง และการเพาะเลี้ยงยังคงฟักตัวต่อไปอีก 4 ชั่วโมงที่37 ºC หลังจากที่ตัวกลางถูกกำจัดออก เซลล์และผลึกของสีย้อมถูกละลายด้วยไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (Me2SO) 200 ไมโครลิตร และค่าการดูดกลืนแสงถูกวัดที่ 570 นาโนเมตรโดยใช้แบบจำลอง ELX-800 เครื่องอ่านการทดสอบไมโครเพลท (One Lambda Inc)

Hoechst 33342 การย้อมสี

หลังการบำบัดด้วยทูบูโลไซด์บีและ/หรือ TNF เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวและตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 30 นาทีที่ 25 ºC จากนั้นล้างด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์บัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) ก่อนแช่เย็นสามครั้งและสัมผัสกับ 10 มก./ลิตร Hoechst33342 ที่ห้อง อุณหภูมิในที่มืดเป็นเวลา 10 นาที ตัวอย่างถูกสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (Olympus RX 400)[21]

การวิเคราะห์การกระจายตัวของดีเอ็นเอ

สกัด DNA โดยใช้ชุดสกัด DNA (Promega) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยย่อ ตัวอย่างดีเอ็นเอ 10µL ถูกบรรจุลงบนเจลอากาโรสแนวนอน 1.5 เปอร์เซ็นต์ที่มีเอทิเดียมโบรไมด์ เจลถูกเรียกใช้ที่ 60 V เป็นเวลา 1 ชั่วโมง และมองเห็นชิ้นส่วนดีเอ็นเอโดยใช้แสงยูวี [22]

การทดลองผูกพัน Annexin-V

ชุดตรวจหาการตายของเซลล์ AnnexinV-FITC ใช้เพื่อจับ annexin-V ซึ่งมีความสัมพันธ์ที่ดีกับ phosphatidylserine และสามารถตรวจสอบการตายของเซลล์ได้[23] โดยสังเขป เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวและแขวนลอยในบัฟเฟอร์การจับที่ความเข้มข้นของเซลล์สุดท้ายที่ 1×106 เซลล์/มล. ประมาณ 1×105 เซลล์ถูกฟักในที่มืดด้วยแอนเนกซิน-V และโพรพิเดียมไอโอไดด์เป็นเวลา 15 นาที จากนั้นจึงวิเคราะห์ระบบกันกระเทือนด้วยการใช้เครื่องสแกนโฟลว์ไซโตมิเตอร์ (เบคตัน ดิกคินสัน เมืองไฮเดลเบิร์ก ประเทศเยอรมนี) Annexin-VFITC และฟลูออเรสเซนส์ที่เกี่ยวข้องกับโพรพิเดียมไอโอไดด์ถูกบันทึกบนฟิลเตอร์ FL1-H (525 นาโนเมตร) และ FL2-H (575 นาโนเมตร) ตามลำดับ

Caspase-3 การทดสอบกิจกรรม

ตรวจพบกิจกรรมของ Caspase-3 โดยใช้ชุดทดสอบ Apo-ONETM HomogeneousCapase-3 (Promega) โดยสังเขป เซลล์ถูกเพาะไปในจาน 96-หลุมที่ 1×104 เซลล์/หลุม หลังจากสัมผัสกับความเข้มข้นต่างๆ ของ tubulosideB และ/หรือ TNF เซลล์ถูกล้างด้วย PBS ที่เย็นจัด จากนั้น, 1 ไมโครลิตร Z-DEVD-R110 และบัฟเฟอร์แคสเปส 99 ไมโครลิตรถูกผสมเพื่อสร้างรีเอเจนต์ของแคสเปสที่เป็นเนื้อเดียวกัน-3 แคสเปสที่เป็นเนื้อเดียวกันทั้งหมด-3 รีเอเจนต์รวม 100 ไมโครลิตรถูกเติมลงในแต่ละหลุม เนื้อหาถูกผสมเบา ๆ และฟักเป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องในที่มืด ความเข้มของการเรืองแสงของซับสเตรต Z-DEVD-R110 ถูกวัดที่ความยาวคลื่นกระตุ้นที่ 498 นาโนเมตร และความยาวคลื่นการปล่อย 521 นาโนเมตรโดยใช้ไมโครเพลทสเปกโตรฟลูออโรมิเตอร์ (Wallac Victor2TM 1420 Multilabel Counter, USA)

การกำหนดระดับ ROS ภายในเซลล์ ภายในเซลล์

ระดับ ROS ถูกวัดโดยใช้วิธีการย้อมสี H2DCFDA ของสีย้อมเรืองแสง[24] H2DCFDA เป็นสารประกอบที่ไม่มีขั้วซึ่งถูกแปลงเป็นอนุพันธ์ขั้วไม่เรืองแสง (H2DCF) โดยเอสเทอเรสของเซลล์หลังจากรวมเข้ากับเซลล์ H2DCF เป็นเมมเบรนที่ซึมผ่านไม่ได้และถูกออกซิไดซ์อย่างรวดเร็วไปยัง 2,7-dichlorofluorescein (DCF) ที่มีฟลูออเรสเซนต์สูง (DCF) เมื่อมี ROS ภายในเซลล์[25] เซลล์ที่เพาะเลี้ยงบนฝาครอบแก้วในทุกกลุ่มถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่37 ºC โดยที่ H2DCFDA 20 µmo/L ละลายใน PBS จากนั้นล้างใบปะหน้าด้วย PBS สามครั้งและวิเคราะห์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์แบบคอนโฟคอล (ไลก้า ประเทศเยอรมนี) DCF ตื่นเต้นที่ 488 นาโนเมตร และตัวกรองการแผ่รังสีคือตัวกรองกั้น 510 นาโนเมตร ความเข้มของแสงฟลูออเรสเซนต์และภาพกล้องจุลทรรศน์แบบเลเซอร์คอนโฟคอลถูกรักษาที่ค่าคงที่เพื่อให้สามารถเปรียบเทียบความเข้มของการเรืองแสงสัมพัทธ์ระหว่างเซลล์ควบคุมและเซลล์ทดลอง

การทดสอบศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย

ฉันแน่ใจว่ามีศักยภาพของเยื่อหุ้มเซลล์ยลด้วยการใช้โพรบ JC-1[26] JC-1 สามารถเข้าสู่ไมโตคอนเดรียอย่างเฉพาะเจาะจง ซึ่งปรากฏเป็นสีเขียวที่ความเข้มข้นต่ำหรือมีศักยภาพของเมมเบรนต่ำในรูปของโมโนเมอร์ อย่างไรก็ตาม ที่ความเข้มข้นสูง ไมโทคอนเดรียจะแสดงเป็นมวลรวมเรืองแสงสีแดง JC-1 มีความไวต่อศักย์ของเยื่อหุ้มยลและการเปลี่ยนแปลงในอัตราส่วนระหว่างการเรืองแสงสีเขียวและสีแดงสามารถให้ข้อมูลเกี่ยวกับศักย์ของเยื่อหุ้มยล หลังจากที่เซลล์ที่บำบัดถูกโหลดด้วย JC-1 1 µmol/L เป็นเวลา 10 นาทีที่ 37 ºC, สีย้อมเรืองแสงถูกตื่นเต้นที่ 490 นาโนเมตร และความเข้มของการเรืองแสงของทั้งโมโนเมอร์และโมเลกุลที่รวมกันถูกบันทึกที่ 590 นาโนเมตรภายใต้คอนโฟคอล กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกน

[Ca2 plus ]i หน่วยวัด

ความเข้มข้นของแคลเซียมภายในเซลล์อิสระ ([Ca2 บวก ]i) ของเซลล์ SHSYY ถูกกำหนดหาด้วยโพรบอินโด-1 โดยทำตามวิธีที่อธิบายโดย Rego et al[27] หลังการบำบัดด้วย TNF (โดยมีหรือไม่มีทูบูโลไซด์บี) เซลล์ SHSYY ถูกโหลดด้วยอินโด 3 ไมโครโมล-1/AM ใน MEM เป็นเวลา 45 นาที ที่ 37 ºC และบ่มต่อไปอีกเป็นเวลา 15 นาทีใน MEM เพื่อให้เกิดการไฮโดรไลซิสของ สารตั้งต้นของสารตั้งต้น acetoxymethyl ester ของโพรบ หลังจากการชะล้างด้วยน้ำเกลือโซเดียม (ด้วย 1.5 มิลลิโมล/ลิตร CaCl2) การเรืองแสงของเซลล์ถูกวัดที่ 37 ºC ในสเปกโตรมิเตอร์การเรืองแสง ด้วยการกระตุ้นที่ 335 นาโนเมตร และการเปล่งแสงที่ 410 นาโนเมตร [Ca2 plus ] ฉันคำนวณตามสมการ:

[Ca2 บวก ]ผม=250 nmol/L×[(F-Fmin)/(Fmax-F)] (nmol/L),

โดยที่ 250 nmol/L สอดคล้องกับค่าคงที่การแยกตัวของอินโดเชิงซ้อน-1–Ca2 plus , Fmax คือการเรืองแสงสูงสุดที่ได้จากการเติม 3 ¦Ìmol/Lionomycin และ Fmin คือการเรืองแสงขั้นต่ำที่กำหนดตามสมการ: Fmin =AF บวก 1/12(Fmax-AF) โดยที่ AF คือออโตฟลูออเรสเซนซ์ที่ได้รับจากการเติม 3 mmol/L MnCl2

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ผลลัพธ์แสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD ของค่าสามเท่าสำหรับการทดลองแต่ละครั้ง การเปรียบเทียบทางสถิติเกี่ยวข้องกับการใช้ Student-S-test พี<0.05 was="" considered="" to="" be="" statistically="">

ผลลัพธ์

ผลของทูบูโลไซด์บีต่อสัณฐานวิทยาของเซลล์นิวเคลียร์

การย้อมสี Hoechst 33342 ที่มีความไวต่อ DNA ถูกใช้เพื่อประเมินการเปลี่ยนแปลงในสัณฐานวิทยาของนิวเคลียร์หลังการบำบัดด้วย tubuloside B และ TNF นิวเคลียสในเซลล์ปกติเป็นปกติและแสดงการย้อมสีแบบกระจายของโครมาติน (รูปที่ 1A) อย่างไรก็ตาม หลังจากการสัมผัสกับ TNF 100 ไมโครกรัม/ลิตร เป็นเวลา 36 ชั่วโมง SH-SY5Ycells ได้รับการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาโดยทั่วไปของการตายของเซลล์ เช่น โครมาตินที่ควบแน่นและนิวเคลียสที่หดตัว (รูปที่ 1B) การลดลงอย่างเห็นได้ชัดถูกสังเกตพบในเซลล์ที่ปรับสภาพด้วยทูบูโลไซด์ B (รูปที่ 1C-1E)

ผลต่อระบบประสาทของทูบูโลไซด์ บี ต่อความมีชีวิตของเซลล์

หลังจากการฟักตัวด้วย TNF ประมาณร้อยละ 45.6 ของเซลล์ได้รับการตายของเซลล์แบบอะพอพโทซิส การรักษาด้วย tubuloside B ก่อน (1, 10 หรือ 100 มก./ลิตร) ลดอัตราการตายของเซลล์ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (อัตราการตายของเซลล์เท่ากับ 30 เปอร์เซ็นต์ 19.5 เปอร์เซ็นต์ และ 6.2 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ รูปที่ 2) แต่ ทูบูโลไซด์บีเพียงอย่างเดียวไม่ก่อให้เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์ (ไม่แสดงข้อมูล)

ผลของทูบูโลไซด์บีต่อการกระจายตัวของดีเอ็นเอ

หลังจากได้รับเซลล์ SH-SY5Y กับ TNF เป็นเวลา 36 ชั่วโมง โดยทั่วไปจะสังเกตเห็นการแลดเดอร์ของ DNA ที่เด่นชัด อย่างไรก็ตาม เซลล์ปรับสภาพด้วยทูบูโลไซด์ B ยับยั้งการแลดเดอร์ของ DNA ที่อาศัย TNF โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่ความเข้มข้น 100 มก./ลิตร ซึ่งยับยั้งการแตกตัวของดีเอ็นเออย่างสมบูรณ์ (รูปที่ 3)

ผลของทูบูโลไซด์บีต่อการได้รับฟอสโฟลิปิดฟอสฟาติดิลซีรีน

ฤทธิ์ต้านอะพอพโทซิสของทูบูโลไซด์บียังได้รับการยืนยันโดยการวัดการปรากฏตัวของฟอสฟาติดิลซีรีนบนเยื่อหุ้มเซลล์ชั้นนอก ในกลุ่มควบคุม ประมาณ 96.3 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์มีสุขภาพแข็งแรง รูปที่ 4 แสดงผลของการทดลองจับแอนเนกซิน-V เพื่อวัดการมีอยู่ของฟอสฟาติดิลซีรีนบนเยื่อหุ้มเซลล์ชั้นนอก เปอร์เซ็นต์ของการตายของเซลล์เท่ากับ 37.5 เปอร์เซ็นต์หลังการรักษาด้วย TNF (รูปที่ 4B) แต่สัดส่วนลดลงเป็น 28.2 เปอร์เซ็นต์ , 19.29 เปอร์เซ็นต์ และ 7.9 เปอร์เซ็นต์ ด้วยการปรับสภาพ tubulosideB 1, 10 หรือ 100 มก./ลิตร ตามลำดับ (รูปที่ 4C-4 จ)

ผลการยับยั้งของ tubuloside B ต่อการเกิด ROS

ในการศึกษานี้ ไมโครกราฟเลเซอร์คอนโฟคอลทั่วไปได้มาจากเซลล์ SH-SY5Y เป็นเวลา 36 ชั่วโมงในกรณีที่ไม่มี TNF และทูบูโลไซด์บี ระดับของ ROS ที่สร้างขึ้นในเซลล์ที่เหนี่ยวนำโดย TNF เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 5B) อย่างไรก็ตาม ความเข้มของการเรืองแสงในเซลล์ที่ได้รับการบำบัดด้วยทูบูโลไซด์ บี ลดลง 16.2 เปอร์เซ็นต์ , 56.4 เปอร์เซ็นต์ และ 89.7 เปอร์เซ็นต์ ด้วยการรักษา 1,10 หรือ 100 มก./ลิตร ทูบูโลไซด์ บี เมื่อเทียบกับเซลล์ที่บำบัดด้วย TNF ตามลำดับ (รูปที่ 5C-5 จ)

ผลของทูบูโลไซด์บีต่อศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย

เซลล์ควบคุมที่ไม่ผ่านการบำบัดแสดงไมโตคอนเดรียที่ย้อมสีสว่างจำนวนมากซึ่งเปล่งแสงเรืองแสงสีส้มและอัตราส่วนสีแดง/เขียวคือ5.97±0.21 ซึ่งบ่งชี้ว่ามีศักยภาพของเมมเบรนสูงปกติ (รูปที่ 5A) TNF - การบำบัดทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในการซึมผ่านของไมโตคอนเดรียและการสูญเสียศักยภาพของเมมเบรนอย่างมีนัยสำคัญ (อัตราส่วนสีแดง/สีเขียวคือ 0.35±0.02) (รูปที่ 5B) การรักษาด้วย TubulosideB ยับยั้งการล่มสลายของศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียที่เกิดจาก TNF ใน SH-SY5Ycells ด้วยปริมาณที่เพิ่มขึ้น Tubuloside B ค่อยๆ กลับมาสร้างศักย์ของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียด้วยความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นตามที่ระบุไว้ผ่านการปรากฏตัวอีกครั้งของการย้อมสีแดงของไมโตคอนเดรีย (รูปที่ 6C-6E)ผลของทูบูโลไซด์ บี ต่อกิจกรรมของแคสเปส-3 กิจกรรม

กิจกรรมของแคสเปส-3เพิ่มขึ้นประมาณห้าเท่าเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมหลังการสัมผัส TNF (รูปที่ 7) ในทางตรงกันข้าม เซลล์ SH-SY5Y ซึ่งถูกปรับสภาพก่อนด้วยทูบูโลไซด์ B 1, 10 หรือ 100 มก./ลิตร แสดง a การลดลงอย่างมีนัยสำคัญในกิจกรรม caspase-3 เมื่อเทียบกับเซลล์ที่สร้าง TNF ที่จุดเวลาเดียวกัน (รูปที่ 7)

ผลของ tubuloside B ต่อระดับของ [Ca2 plus ]i

ระดับของ [Ca2 plus ] I ในเซลล์ที่เกิดจาก TNF เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (กลุ่มควบคุม: 105.5±11.2nmol/L; 100 µg/L TNF : 238.4±18.9 nmol/L) ซึ่งลดลงบางส่วนโดยปรับสภาพด้วยทูบูโลไซด์ B(10 หรือ 100 มก./ลิตร) (รูปที่ 8)

อภิปรายผล

Cistanchesซัลซ่า(CA Mey) G Beck หนึ่งสายพันธุ์ของCistanchesที่อยู่ในวงศ์ Orobanchaceae เป็นพืชกาฝากที่มีถิ่นกำเนิดอยู่ทางตะวันตกเฉียงเหนือของจีน ลำต้นของพืชชนิดนี้เป็นยาแผนโบราณที่สำคัญของจีน และใช้สำหรับโรคไต ภาวะมีบุตรยากของเพศหญิง ตกขาวผิดปกติ โรคประสาทอ่อน และอาการท้องผูกในวัยชราอันเนื่องมาจากความเฉื่อยของลำไส้ใหญ่ ส่วนประกอบสำคัญของสมุนไพรนี้คือฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์[28] ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา ผลการศึกษาหลายชิ้นเน้นย้ำถึงหน้าที่ของทูบูโลไซด์บีในการส่งเสริมกิจกรรมทางเภสัชวิทยาและชีวภาพต่างๆ[13-15] อย่างไรก็ตาม กลไกระดับเซลล์และโมเลกุลที่รองรับการกระทำนั้นยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้ การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่า tubuloside B มีผลในการป้องกันระบบประสาทอย่างมีนัยสำคัญต่อการตายของเซลล์ที่เกิดจาก TNF ในเซลล์ SH-SY5Yneuronal โดยคงการทำงานของไมโตคอนเดรีย ลดการสร้าง ROS ลดระดับแคลเซียมภายในเซลล์ และยับยั้งการทำงานของแคสเปส-3 กลไกการต้านอนุมูลอิสระ กลไกเหล่านี้อาจเกิดจากฤทธิ์ป้องกันระบบประสาทของทูบูโลไซด์ บี หรือการมีปฏิสัมพันธ์กับปัจจัยอื่นๆ และจากนั้นอาจทำให้อัตราส่วนของการตายของเซลล์ในเซลล์ลดลง

การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่าสารออกซิแดนท์หรือโปรออกซิแดนท์เป็นตัวควบคุมสำคัญของการตายของเซลล์และสามารถทำให้เกิดการตายของเซลล์[29,30] ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันเป็นองค์ประกอบทั่วไปของการตายของเซลล์ที่เกิดจากอะพอพโทซิสซึ่งเกิดจากสิ่งเร้าต่างๆ เช่น TNF และการสัมผัสสารพิษจากสิ่งแวดล้อม ซึ่งโดยปกติแล้วจะไม่ออกแรงออกซิไดซ์โดยตรง บทบาทสำคัญของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในการตายของเซลล์ได้รับการสนับสนุนอย่างมากจากความสามารถของสารต้านอนุมูลอิสระในเซลล์ต่างๆ ในการสกัดกั้นการตายของเซลล์จากกระบวนการอะพอพโทซิสที่เกิดจากสารที่หลากหลาย[31] สารประกอบที่มีคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระอาจมีผลในการป้องกันในสถานการณ์ต่างๆ ของความผิดปกติของเซลล์ผ่านการขับอนุมูลอิสระ[32] นอกจากนี้ มีรายงานว่าไกลโคไซด์ฟีนิลโพรพานอยด์หลายชนิดมีคุณสมบัติในการขับอนุมูลอิสระและป้องกันการบาดเจ็บที่เป็นพิษที่เกิดจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ตามแนวคิดนี้ เราพบว่าทูบูโลไซด์ บี ลดระดับ ROS ที่เกิดจาก TNF ซึ่งอาจปกป้องเซลล์ประสาทจากการตายแบบอะพอพโทซิสโดยการกำจัดออกซิเจนชนิดปฏิกิริยาภายในเซลล์โดยตรง

หลักฐานจำนวนมากชี้ให้เห็นว่าการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในการทำงานของไมโตคอนเดรียมีส่วนอย่างยิ่งในกระบวนการอะพอพโทติก[33] ความผิดปกติของสภาวะสมดุลของแคลเซียมและการเปลี่ยนแปลงของศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียพบว่ากระตุ้นการเปิดรูพรุนการเปลี่ยนผ่านของไมโตคอนเดรีย (MPTP) หรือกระตุ้นการปลดปล่อยไซโตโครมซีผ่านกลไกที่ไม่ขึ้นกับ MPTP ซึ่งรับผิดชอบโดยตรงในการกระตุ้นน้ำตก apoptotic และอาจนำหน้านิวเคลียร์ สัญญาณของการตายของเซลล์[34]. การเปลี่ยนแปลงทางชีวเคมีเหล่านี้อาจเป็นผลมาจากการเปลี่ยนแปลงในการทำงานของไมโตคอนเดรีย[35] ข้อเท็จจริงที่ว่า tubuloside B ยับยั้งการลดศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียและลดการเพิ่มขึ้นของแคลเซียมภายในเซลล์ที่เกิดจาก TNF ชี้ให้เห็นว่าทูบูโลไซด์บีอาจมีความสามารถในการต่อต้านความเป็นพิษของ TNF โดยการยับยั้งการเปิด MPTP และยับยั้งความผิดปกติของไมโตคอนเดรีย

สิ่งเร้าภายนอกสามารถเริ่มต้นกระบวนการอะพอพโทซิสได้ผ่านกลไกข้างต้น และอาจมาบรรจบกันบนเส้นทางแคสเปสเพื่อดำเนินการขั้นตอนสุดท้ายของกระบวนการอะพอพโทติก[36] โปรตีเอสในตระกูลแคสเปสประกอบด้วยสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมอย่างน้อย 14 ตัวที่แสดงออกในเซลล์เกือบทุกประเภทเป็นโพรเอ็นไซม์ที่ไม่ออกฤทธิ์ (ไซโมเจน) ซึ่งได้รับการประมวลผลและกระตุ้นเพื่อตอบสนองต่อสิ่งเร้าโปรอะพอพโทซิสที่หลากหลาย[37] แคสเปส{{4 }} เป็นสมาชิกปลายน้ำของ caspase cascade และทำหน้าที่เป็นตัวกลางในเฟสการดำเนินการ เมื่อแคสเปส-3 สารตั้งต้นโปรตีน CPP32 ถูกกระตุ้นโดยสัญญาณต้นน้ำ เช่น การปลดปล่อยไซโตโครมซีของไมโตคอนเดรีย แคสเปสที่ออกฤทธิ์-3จะแยกสารตกค้างของแอสพาเทตที่จำเพาะในโปรตีนด้วยฟังก์ชันโครงสร้าง การดูแลทำความสะอาด และการควบคุมต่างๆ[{{ 8}}]. เหตุการณ์สลายโปรตีนเหล่านี้สามารถนำไปสู่การตายของเซลล์และนำไปสู่การกระจายตัวของดีเอ็นเอและการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของนิวเคลียร์ ดังนั้น สารที่สามารถยับยั้งการทำงานของแคสเปส-3 อาจปกป้องเซลล์จากการตายของเซลล์[2,31] เนื่องจากทูบูโลไซด์บียับยั้งการทำงานของแคสเปส-3ในเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วย TNF อย่างเห็นได้ชัด จึงมีความสามารถในการป้องกันระบบประสาท

โดยสรุป tubuloside B มีผลป้องกันแบบมัลติฟังก์ชั่นต่อเซลล์ประสาทที่เสียหาย เนื่องจากมีฤทธิ์ต้านการเกิดอะพอพโทซิสและความเครียดจากสารต้านอนุมูลอิสระ จึงอาจใช้สำหรับทางคลินิกในความพิการทางระบบประสาทและทางระบบประสาทที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ประสาท