Protease-Activated Receptor 1 มีส่วนทำให้เกิดความล้มเหลวของจุลภาคและความเสียหายของท่อในการบาดเจ็บของไตขาดเลือด - Reperfusion ในหนู

หยูกวน¹ไดสุเกะ นากาโนะ,²ลี่ลี่³ห่าวเฟิง เจิ้ง,³อากิระ นิชิยามะ,²เย่เทียน ,¹และเล่ยจาง¹

เพื่อบรรเทาความล้มเหลวที่แท้จริงด้วยcistanche สมุนไพร

1. บทนำ

ดิไตไม่สามารถหลีกเลี่ยงการบาดเจ็บจากการขาดเลือดขาดเลือด-กลับ (IR) ในระหว่างการผ่าตัดไตบางส่วนและไตการปลูกถ่าย [1] ซึ่งเป็นที่ทราบกันดีว่าส่งผลให้เกิดการกักเก็บของเสียจากการเผาผลาญและนำไปสู่ภาวะเฉียบพลันไตบาดเจ็บ (อากิ) และอากิ-เรื้อรังไตโรค (AKI-CKD) [2]. จนถึงปัจจุบัน ไม่มีการรักษาด้วยยาเฉพาะทางทางคลินิกสำหรับ AKI และ AKI-CKD [3] การเปลี่ยนแปลงทางพยาธิสภาพทั่วไปหลายอย่างเกิดขึ้นใน AKI เช่น ความล้มเหลวของจุลภาค [4] รวมถึงความแออัดและการตกเลือด และเนื้อร้ายท่อเฉียบพลัน [5] ดังนั้น การศึกษาจึงมุ่งเน้นไปที่การกำหนดเป้าหมายการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาเหล่านี้ในฐานะผู้เข้ารับการบำบัดที่มีศักยภาพ ก่อนหน้านี้เราได้แสดงให้เห็นว่าการรักษาเส้นเลือดฝอยในช่องท้องหลังจากไตการบาดเจ็บของ IR ลดความแออัดของเส้นเลือดฝอยและทำให้การเปลี่ยนแปลง AKI เป็น CKD ดีขึ้น [6] เนื้อร้ายท่อเฉียบพลันอาจรักษาได้ยาก ดังนั้นการงอกใหม่ของ tubules โดยการเพิ่มจำนวนเซลล์ tubular อาจเป็นแนวทางสำคัญในการป้องกันการสูญเสียการทำงานของไตต่อไป [7]

รีเซพเตอร์ที่แอคติเวตโปรตีเอส-1 (PAR-1) เป็นของแฟมิลีโปรตีเอสที่แอกติเวตรีเซพเตอร์ (PAR) และเป็นที่ทราบกันว่าถูกกระตุ้นโดยทรอมบินเพื่อกระตุ้นการแข็งตัวของเกล็ดเลือด เมื่อเร็วๆ นี้เราแสดงให้เห็นว่า PAR-1 มีส่วนทำให้เกิดการบาดเจ็บที่ไตอย่างรุนแรง [8] นอกจากนี้ มีรายงานว่า thrombin/PAR-1 มีบทบาทในการเพิ่มจำนวนเซลล์เยื่อบุผิวและการตายของเซลล์ จากลักษณะเฉพาะเหล่านี้ เราตั้งสมมติฐานว่า PAR-1 เร่งความรุนแรงของ AKI โดยควบคุมการแข็งตัวของเลือดฝอยในช่องท้องหรือการสร้างท่อใหม่ ในการศึกษานี้ เราตรวจสอบบทบาทของ PAR-1 โดยใช้ Q-94 ซึ่งเป็น PAR-1-โมดูเลเตอร์อัลโลสเตอริกเชิงลบแบบเลือกเฉพาะในเมาส์ไตแบบจำลองการบาดเจ็บของอินฟราเรดและเซลล์ท่อของมนุษย์ที่เพาะเลี้ยงด้วยการกระตุ้นด้วยทรอมบิน

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. รุ่นเมาส์ IR ไตเฉียบพลัน

การทดลองกับสัตว์ทั้งหมดดำเนินการตามแนวทางการทดลองของคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบันของ Capital Medical University ดิไตโมเดลเมาส์ IR ถูกสร้างขึ้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [8] โดยสรุป หนูเมาส์ C57/BL6 เพศผู้อายุ 8-สัปดาห์ถูกระงับความรู้สึกโดยการฉีดเพนโตบาร์บิทัลโซเดียม (50 มก./กก.; ip) และสุ่มแบ่งออกเป็นกลุ่มต่อไปนี้: หลอก, I/R บวกด้วยกระสายยา และ I/R (ยานพาหนะ: น้ำเกลือ 10 มก./กก. iv) บวก Q94 (ตัวร้าย PAR-1 ที่ 10 มก./กก. iv) กลุ่ม (n=7–8 ในแต่ละกลุ่ม) สำหรับโพรโทคอลการบาดเจ็บ IR ที่อบอุ่นของไต หนูทดลองได้รับการผ่าตัดไตเทียมเพื่อประเมินความเสียหายต่อการทำงานของไต หลังจากผ่านไปหนึ่งสัปดาห์ ปลายขั้วของไตจะถูกยึดด้วยคลิปหลอดเลือดที่ปราศจากความเสียหายเป็นเวลา 30 นาที หลังจากคืนเลือดเป็นเวลา 48 ชั่วโมง หนูถูกสังเวย ตัวอย่างเนื้อเยื่อไตของพวกเขาถูกรวบรวมและแก้ไขในสารละลายพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์เพื่อเตรียมบล็อกพาราฟิน ได้รับพลาสมาเพื่อวัดยูเรียไนโตรเจนในเลือด (BUN) และครีเอตินีน

2.2. วัสดุ.

Q94 ถูกซื้อจาก Tocris Bioscience (Bristol, UK) ได้สารเคมีอื่นๆ จาก Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น

2.3. การทดสอบ Creatinine และ BUN

ชุดทดสอบเชิงพาณิชย์ (Creatinine Assay Kit ab65340; Abcam, Cambridge, UK) ถูกใช้เพื่อวัดค่า Creatinine ซื้อชุดทดสอบ BUN จาก ABSBio™ (ชุด UREA NITROGEN, CNHAO BIO, ปักกิ่ง, จีน)

2.4. จุล.

ก่อนฝังพาราฟิน เนื้อเยื่อไตจะถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% บล็อกพาราฟินไตถูกตัดเป็น 2 ส่วน ไมโครเมตรและติดตั้งบนสไลด์ข้ามคืนที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส หลังจากการขจัดพาราฟิน ส่วนที่ย้อมด้วยฮีมาทอกซิลินและอีโอซิน (H&E) ได้ภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ (BX-51/DP-72; Olympus, Tokyo, Japan) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [9] ความเสียหายของไต-ท่อได้รับการวินิจฉัยตามการเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาหลายอย่าง เช่น การขยายท่อ การอุดตัน/การตกเลือด การสูญเสียขอบของแปรง ความเสียหายของท่อได้คะแนนตามเปอร์เซ็นต์ของท่อที่เสียหาย: 0, ไม่มีความเสียหาย; 1,<25%; 2,="" 25–50%;="" 3,="" 51–75%;="" and="" 4,="">75 เปอร์เซ็นต์ . การให้คะแนนดำเนินการในลักษณะที่ตาบอด

2.5. อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์และอิมมูโนฮิสโตเคมี

ส่วนต่างๆ ถูกเตรียมตามที่บรรยายไว้สำหรับการสอบวิเคราะห์ทางจุลพยาธิวิทยา (H&E) และจากนั้นก็บ่มด้วยไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 0.3 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 30 นาทีเพื่อสกัดกั้นเปอร์ออกซิเดสที่เกิดภายในหลังจากการดีพาราฟินไลเซชันด้วยไซลีน สำหรับการดึงแอนติเจน ส่วนต่างๆ ถูกบ่มด้วยโปรตีเอส K (DAKO Cytomation, Glostrup, เดนมาร์ก) เป็นเวลา 10 นาที หลังจากการปิดกั้นด้วยซีรัมแพะ 10 เปอร์เซ็นต์ ส่วนต่างๆ ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิในชั่วข้ามคืนที่ 4 องศาเซลเซียส (แอนติบอดีต้านคิม 1, ab47635, Abcam; แอนติบอดีต้าน Ki67, ab15580, Abcam; แอนติบอดีต้าน PAR-1, ab32611 , แอบแคม). หลังจากการฟักไข่ด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ ส่วนต่างๆ ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ 25 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ซับสเตรต DAB (DAKO) ถูกใช้เพื่อแสดงภาพผลการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมี (IHC) ตรวจพบสัญญาณเรืองแสงโดยใช้แอนติบอดีรองที่ติดฉลาก Alexa Fluor 594- ภาพถูกจับโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ FL (BX51; Olympus) ที่มีตัวกรองที่เหมาะสม ซอฟต์แวร์ ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) ถูกใช้เพื่อวิเคราะห์ด้านบวก

2.6. PCR แบบเรียลไทม์

เพื่อประเมินการควบคุมการแสดงออกของ mRNA ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ mRNA ถูกแยกออกจากเนื้อเยื่อไต ระบบ PCR (7300 Fast Real-Time; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) และ Light Cycler Fast Start DNA Master SYBR Green I kit (Applied Biosystems) ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจจับระดับ 18S และ PAR-1 เอ็มอาร์เอ็นเอ ลำดับไพรเมอร์มีดังนี้: 18S —5′ -GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′, 5′-CCATCCAATCG GTAGTAGCG-3′; PAR-1—5′-GTTGATCGTTTCCACG GTCT-3′, 5′-GCTGCCTCTGTACCAGGACT-3′ ระดับ mRNA สัมพัทธ์ถูกกำหนดโดยใช้วิธี2−ΔΔCq ค่า ΔΔCq คำนวณโดยใช้ข้อมูลจากกลุ่มควบคุม

2.7. ขั้นตอนการผ่าตัดและการตั้งค่าการถ่ายภาพ Multiphoton ของ Vivo

หนูได้รับยาสลบด้วย isoflurane 2 เปอร์เซ็นต์ (Mylan, Osaka, Japan) หลังการตัดท่อทางเดินปัสสาวะ หลอดเลือดดำคอถูก cannulated สำหรับการฉีดสีย้อมหลอดฟลูออเรสเซนต์และการฉีดสารบำรุงรักษา fluid ซึ่งประกอบด้วย 1.0ไมโครลิตร/นาทีของอัลบูมิน 2 เปอร์เซ็นต์ในน้ำเกลือที่เติมฟอสเฟต ไตข้างซ้ายของหนูแต่ละตัวถูกผ่าออกด้วยรอยผ่าเล็ก ๆ และติดเข้ากับแผ่นปิด เวทีกล้องจุลทรรศน์และสัตว์ได้รับการอุ่นโดยใช้แผ่นความร้อนในระหว่างขั้นตอนการทดลองทั้งหมด กล้องจุลทรรศน์มัลติโฟตอนในหลอดอาหารดำเนินการโดยใช้ระบบถ่ายภาพแสงออเรสเซนซ์แบบคอนโฟตอนหลายตัวของ Olympus FV1000MPE ที่ขับเคลื่อนโดยเลเซอร์ Chameleon Ultra-II MP ที่ 860nm (Coherent, Inc., Santa Clara, CA, USA) วัตถุประสงค์ของกล้องจุลทรรศน์คือเลนส์จุ่มน้ำ 25x พร้อมรูรับแสงตัวเลข 1.05 การตั้งค่าภาพสำหรับกล้องจุลทรรศน์ (เกนและปิดสำหรับทั้งสามช่อง ได้แก่ สีน้ำเงิน สีเขียว และสีแดง) ได้รับการแก้ไขตลอดการทดลอง หลังจากระยะเวลาพักฟื้น 30 นาที โรดามีน B- 70kD เดกซ์ทรานถูกฉีดเข้าเส้นเลือดดำ และถ่ายภาพ 3-D z-stack ที่ระดับความลึก 5–50 ไมโครเมตร (ห่างกัน 2μm) จากผิวไต

2.8. การเพาะเลี้ยงเซลล์.

เซลล์ไตของมนุษย์ 2 (HK2) ได้มาจาก Cell Bank of Academy Sciences (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) และเพาะเลี้ยงตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [10] เซลล์ได้รับการเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ Eagle ดัดแปลงของ Dulbecco ที่เสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์และเพนิซิลลิน-สเตรปโตมัยซิน 1 เปอร์เซ็นต์ในบรรยากาศที่มีความชื้น 95 เปอร์เซ็นต์ของอากาศและ 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 ที่ 37 องศา

2.9. WST-1 ตรวจวิเคราะห์เพื่อประเมินการเพิ่มจำนวนเซลล์

เซลล์ HK2 ถูกเพาะในเพลต 6-หลุมที่ความหนาแน่น 1×104 เซลล์/- หลุม หลังจากกระตุ้นเซลล์ HK2 ด้วยทรอมบิน การทดสอบ WST- 1 ได้ดำเนินการตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (แค็ตตาล็อก #C0035; Beyotime, Shanghai, China) เพื่อกำหนดความสามารถในการงอกขยายของเซลล์ หลังจากการบ่ม 2 ชั่วโมงด้วยรีเอเจนต์ 100μL WST-1 ในแต่ละหลุม การดูดกลืนแสงของตัวอย่างถูกวัดโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร

2.10. แคสเปส-3 การทดสอบ

กิจกรรมของ Caspase-3 ถูกวัดโดยใช้ชุดกิจกรรม caspase-3 ที่มีขายทั่วไป (แค็ตตาล็อก #C1116; Beyotime, Shanghai, China) [11] หลังจากการฟักตัวด้วยรีเอเจนต์ชุดกิจกรรม caspase-3 การดูดกลืนแสงของตัวอย่างถูกตรวจพบโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (Spectra- Max M2, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) ที่ 405 นาโนเมตรตามคำแนะนำของผู้ผลิต

2.11. การวิเคราะห์ข้อมูลและสถิติ

การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวใช้เพื่อเปรียบเทียบหลายกลุ่ม ตามด้วยการทดสอบเปรียบเทียบหลายรายการของทูคีย์ ในการเปรียบเทียบกลุ่มบุคคลสองกลุ่ม เราใช้การทดสอบ t ของนักเรียน p < 0:05="">

Cistanche tubulosaป้องกันโรคไต

3. ผลลัพธ์

3.1. PAR-1 นิพจน์ใน IR Kidney

ก่อนอื่นเรายืนยันนิพจน์ของ PAR-1 และผลกระทบของ IR ต่อระดับการแสดงออกในไต. เราสังเกตพบว่าระดับการแสดงออกของ PAR-1 mRNA เพิ่มขึ้นเกือบ 2-เท่าเมื่อเปรียบเทียบกับระดับในหนูทดลองที่ทำศัลยกรรมหลอกที่ 48 ชั่วโมง (รูปที่ 1(a)) นอกจากนี้เรายังวัดการแสดงออกของ PAR-1 โดยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ที่ 48 ชั่วโมงหลัง IR PAR-1 ถูกแสดงออกในเมมเบรนขอบแปรงเซลล์แบบท่อ ระดับของการเรืองแสง PAR-1 FL ถูกปรับเพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับหนูเมาส์กลุ่มหลอก (รูปที่ 1(b) และ 1(c)) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าทั้งการแปลตำแหน่งของ PAR-1 ในเซลล์ท่อและระดับการแสดงออกของมันถูกควบคุมหลังจาก IR ในไต

3.2. การทำงานของไตและการเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยา เราประเมินไตทำงานโดยการตรวจจับระดับ BUN และครีเอตินีนในพลาสมา I/R กระตุ้นให้ระดับ BUN และ creatinine เพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับหนูที่ได้รับการผ่าตัดหลอก นอกจากนี้ การเพิ่มขึ้นของระดับ BUN ที่เกิดจาก IR ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในหนูที่ได้รับการบำบัดด้วย Q94- (รูปที่ 2(a)) ระดับครีเอตินีนในซีรัมถูกยับยั้งใน Q94-หนูที่ได้รับการบำบัด เมื่อเทียบกับหนูที่ได้รับการผ่าตัดด้วยอินฟราเรดเท่านั้น (รูปที่ 2(b)) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการบริหาร Q94 สามารถป้องกันได้ไตทำงานหลังจากได้รับบาดเจ็บจาก IR

นอกจากนี้เรายังประเมินการเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาของไตด้วยการย้อมสี H&E IR ของไตเพิ่มการก่อการหล่อ การขยายท่อ และการสูญเสียขอบแปรงและความแออัด/การตกเลือดในหนูเมาส์ที่บำบัดด้วยกระสายยาอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับหนูทดลอง การบำบัดด้วย Q94 ยับยั้งการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้อย่างเห็นได้ชัดซึ่งเกิดจาก IR (รูปที่ 2(c) และ 3(a)) การวิเคราะห์ผลการย้อมสี H&E ระหว่างกลุ่มเผยให้เห็นคะแนนความแออัด/การตกเลือดและคะแนนความเสียหายของท่อสำหรับแต่ละกลุ่ม หนูเมาส์กลุ่ม Q94 แสดงคะแนนที่ต่ำกว่ามาก (รูปที่ 2(e) และ 3(c)) เรายังย้อม Kim-1 เป็น aไตตัวบ่งชี้การบาดเจ็บของเซลล์ท่อไตโดย IHC [12] Kim-1-พื้นที่ที่เป็นบวกเพิ่มขึ้นในบริเวณท่อไตในหนูเมาส์ที่มีการดูถูก IR ซึ่งถูกระงับอย่างมีนัยสำคัญโดย Q94 (รูปที่ 2(d) และ 2(f)) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า Q94 สามารถระงับได้ไตความเสียหายของท่อที่เกิดจากการบาดเจ็บของ IR

3.3. การไหลเวียนของเลือดผิดปกติในการถ่ายภาพใน Vivo

PAR-1 และลิแกนด์ทรอมบินมีบทบาทสำคัญในความแออัด Q94 ปรับปรุงความแออัดอย่างมีนัยสำคัญ ดังนั้นเราจึงทำการถ่ายภาพ intravital ด้วยกล้องจุลทรรศน์มัลติโฟตอน วิธีนี้ช่วยให้สามารถสังเกตเซลล์เม็ดเลือดในเส้นเลือดฝอยในช่องท้องได้แบบเรียลไทม์ในหนูที่มีชีวิต (รูปที่ 3(c)) พลาสมาถูกมองเห็นโดย 70 kDa เดกซ์ทรานที่คอนจูเกตด้วยโรดามีน บี (รูปที่ 3(d)) เซลล์เม็ดเลือดที่ไม่ก่อให้เกิดการเรืองแสง FL เพื่อตอบสนองต่อเลเซอร์ถูกใช้เพื่อกระตุ้นโรดามีนบีและแสดงเป็นเงา ดังแสดงในรูปที่ 3(e) IR ของไตขัดขวางการทำงานของเซลล์เม็ดเลือดปกติและทำให้เกิดความล้มเหลวของจุลภาค Q94 ปรับปรุงเซลล์เม็ดเลือดฝอยในช่องท้อง

3.4. การเพิ่มจำนวนเซลล์ท่อหลังจากได้รับบาดเจ็บจาก IR

มีรายงานว่าการงอกใหม่ของเซลล์ท่อมีบทบาทสำคัญในการฟื้นฟูโครงสร้างท่อและการทำงานของไตหลังจากได้รับบาดเจ็บจากอินฟราเรด PAR-1 เป็นที่รู้จักในการปรับเปลี่ยนการเพิ่มจำนวนของเซลล์เยื่อบุผิวเมื่อถูกกระตุ้นโดยทรอมบิน ดังนั้นเราจึงตรวจพบการเพิ่มจำนวนของเซลล์ท่อไตในการทดสอบ Ki-67 IHC ที่ 48 ชั่วโมงหลังจาก IR, จำนวนเซลล์ของท่อที่ให้ผลบวก Ki-67-เพิ่มจำนวนเพิ่มขึ้น Q94 ได้เพิ่มจำนวนที่เพิ่มขึ้นของ Ki-67-เซลล์ท่อที่เป็นบวกหลังจาก IR เมื่อเปรียบเทียบกับในหนูที่ได้รับการรักษาด้วย IR เท่านั้น (รูปที่ 4(a) และ 4(b)) นอกจากนี้ เราตรวจสอบว่าความสามารถในการงอกขยายของเซลล์ได้รับผลกระทบจากการยับยั้ง PAR-1 ในการทดลองในหลอดทดลองโดยใช้เซลล์ HK2 ที่ฟักด้วย thrombin ซึ่งเป็น PAR-1 อะโกนิสต์หรือไม่ กิจกรรมการงอกขยายของเซลล์ HK2 ถูกวัดโดยการสอบวิเคราะห์ WST-1 ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 4(c) การเพิ่มจำนวนของเซลล์ HK2 ถูกระงับอย่างมากหลังการบำบัดด้วยทรอมบิน อย่างไรก็ตาม การยับยั้งที่เกิดจาก thrombin นี้เกือบจะถูกยกเลิกโดย Q94 ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า PAR-1 ควบคุมการงอกของเซลล์ท่อไตในเชิงลบ ซึ่งเกือบจะถูกยกเลิกโดยตัวร้าย Q94 PAR-1

เพื่อบรรเทาโรคไตเรื้อรังด้วยcistanche

3.5. การตายของเซลล์ท่อไต

เราได้ตรวจสอบการตายของเซลล์ไตเพิ่มเติมโดยใช้ caspase-3 ซึ่งเป็นแคสเปสเพชฌฆาตที่สำคัญที่สุดและถูกกระตุ้นโดยวิถีทางภายในและภายนอกระหว่างการตายของเซลล์ [13] ด้วยการใช้เซลล์ HK2 ที่เพาะเลี้ยงด้วยทรอมบิน เราพบว่าทรอมบินเพิ่มกิจกรรมของแคสเปส-3 นอกจากนี้ การบริหารให้ Q94 ยับยั้งการออกฤทธิ์ของแคสเปส-3 (รูปที่ 4(d)) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการตายของเซลล์ HK2 ที่เกิดจาก thrombin ถูกยับยั้งโดยตัวต้าน Q94 PAR-1

4. การอภิปราย

ไตการบาดเจ็บจากรังสีอินฟราเรดมีลักษณะเฉพาะคือ ความแออัด/การตกเลือด, เนื้อร้ายท่อเฉียบพลัน, การอักเสบ และการสะสมของเฝือก [5] ในที่นี้ เราแสดงให้เห็นว่าการยับยั้ง PAR-1 ปรับปรุงทั้งการเปลี่ยนแปลงที่เกี่ยวข้องกับเพื่อนร่วมงานในเลือดและการเปลี่ยนแปลงของ tubulointerstitial เป็นที่ทราบกันดีว่า PAR-1 และลิแกนด์ของมัน ทรอมบิน มีบทบาทสำคัญในการแข็งตัวของเกล็ดเลือด และการแทรกแซงของระบบนี้ เช่น โดย thrombomodulin [14, 15] อาจป้องกัน AKI เราแสดงให้เห็นว่าการยับยั้ง PAR- 1 ยับยั้งความแออัดและการไหลเวียนของเลือดที่ดีขึ้นในเส้นเลือดฝอยในช่องท้องในหนูที่มีอาการบาดเจ็บที่ IR ของไต ซึ่งบ่งชี้ว่าระบบ PAR-1 ทำให้จุลภาคแย่ลง นอกจากนี้ ระดับการแสดงออกของ PAR-1 ได้รับการควบคุมใน tubules หลังจากการบาดเจ็บของ IR ของไต ซึ่งบ่งชี้ว่าระบบที่ขึ้นกับ PAR-1- ใน tubules ยังเพิ่มการบาดเจ็บของ IR ของไตอีกด้วย เป็นที่ทราบกันดีว่าการงอกใหม่ของเซลล์ท่อเป็นกระบวนการที่สำคัญในการสร้างโครงสร้างท่อขึ้นใหม่และในการฟื้นฟูการทำงานของไตหลังจากได้รับบาดเจ็บจากอินฟราเรด [16, 17] ขึ้นอยู่กับระดับของการบาดเจ็บ ความสามารถในการซ่อมแซมนี้ไม่จำกัด [18] ดังนั้นตัวเลือกการรักษาเพื่อลดความเสียหายในเซลล์ท่อหรือเร่งการแพร่กระจายจึงมีความจำเป็นอย่างเร่งด่วน การศึกษาในหลอดทดลองของเราพบว่า PAR- 1/thrombin ควบคุมการงอกของเซลล์ในหลอดในทางลบ ซึ่งในทางกลับกันก็เร่งขึ้นหลังจากการยับยั้ง PAR-1 นอกจากนี้ การบาดเจ็บของ IR ในหนูเมาส์ถูกแสดงเพื่อเพิ่มการงอกขยายของหลอดที่ 48 ชั่วโมง โดยเพิ่มขึ้นอีกหลังจากการยับยั้ง PAR-1 เราพบว่า PAR-1 เพิ่มขึ้นในเมมเบรนขอบแปรงของท่อใกล้เคียง เนื่องจากมีรายงานว่าการทำงานของสิ่งกีดขวางการกรองไตลดลงระหว่างการบาดเจ็บของ IR ของไต [19] ทรอมบินที่กรองแล้วจากโกลเมอรูไลอาจกระตุ้น PAR ที่เพิ่มขึ้น- 1 ซึ่งขัดขวางการงอกใหม่ของท่อ

ผลลัพธ์ของเราแนะนำว่าระบบ PAR-1/thrombin ยับยั้งการเพิ่มจำนวนของเซลล์ในท่อและเพิ่มการตายของเซลล์ อย่างไรก็ตาม การศึกษาอื่นแสดงผลตรงกันข้ามของ PAR-1 เมื่อกระตุ้นโดยโปรตีน C [20, 21] บทบาทที่ขัดแย้งกันอย่างเห็นได้ชัดของ PAR-1 อาจขึ้นอยู่กับวิธีการเปิดใช้งาน ในการศึกษาของเรา คำอธิบายที่เป็นไปได้สำหรับบทบาทที่เป็นที่มาของมันคือ PAR-1 ถูกเปิดใช้งานโดย thrombin ที่กรองแล้ว ขนาดของโปรตีน C มากกว่า 60 kDa ซึ่งคล้ายกับโปรตีนอัลบูมิน [22, 23] และใหญ่กว่าของทรอมบินมาก (36 kDa) นอกจากนี้ความเข้มข้นในพลาสมา (<100 nm)="" is="" less="" than="" 10%="" of="" thrombin="" (="">1 ไมโครโมลาร์) ซึ่งบ่งชี้ว่าโปรตีน C ผ่านการกรองน้อยกว่าและสร้างสัญญาณที่อ่อนแอกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับทรอมบิน

ภาวะลิ่มเลือดอุดตันเป็นปัจจัยเสี่ยงสำหรับผู้ป่วยไตวายระยะสุดท้าย [24] การศึกษาพบว่าการขาด PAR-1 ป้องกันโรค CKD [25] ในการศึกษาของเรา เราสังเกตผลของการยับยั้ง PAR-1 ต่อการทำงานของไตในระยะแรกหลัง IR ในการศึกษาเพิ่มเติม เราตั้งใจที่จะพัฒนาโรคเรื้อรังไตแบบจำลองโรคที่เกิดจาก IR [2] เพื่อประเมินความเชื่อมโยงที่เป็นไปได้ระหว่าง PAR-1 กับ CKD

โดยสรุป เราแสดงให้เห็นว่า PAR-1 ทำให้การไหลเวียนของจุลภาคแย่ลงและควบคุมการเพิ่มจำนวนของเซลล์ในท่อในทางลบ ในทางตรงกันข้าม การยับยั้ง PAR-1 มีส่วนช่วยในการปรับปรุงจุลภาคและการเพิ่มจำนวนของเซลล์ในท่อและหลังการฉายรังสี ซึ่งทำหน้าที่เป็นกลไกสำคัญในการฟื้นตัวของไต และควรได้รับการพิจารณาว่าเป็นกลยุทธ์ใหม่ในการรักษา AKI

Cistanche tubulosa ป้องกันโรคไต คลิกที่นี่เพื่อรับตัวอย่าง

1กรมระบบทางเดินปัสสาวะ โรงพยาบาลมิตรภาพปักกิ่ง มหาวิทยาลัยแพทยศาสตร์ ปักกิ่ง ประเทศจีน

2ภาควิชาเภสัชวิทยา Kagawa University, Kagawa, Japan

3แผนกปลูกถ่ายไต ภาควิชาศัลยศาสตร์ โรงพยาบาลในเครือที่สามของมหาวิทยาลัยซุนยัดเซ็น

กวางโจว ประเทศจีน

ควรส่งจดหมายโต้ตอบถึง Ye Tian kidney@ccmu.edu.cn และเล่ยจาง; leizhangkidney@gmail.com ได้รับ 1 มกราคม 2021; แก้ไขเมื่อ 25 มกราคม พ.ศ. 2564; ยอมรับ 8 กุมภาพันธ์ 2021; เผยแพร่ 23 กุมภาพันธ์ 2021

บรรณาธิการวิชาการ: Junyan Liu

ลิขสิทธิ์ © 2021 Yu Guan et al. นี่เป็นบทความแบบเปิดที่เผยแพร่ภายใต้ใบอนุญาตครีเอทีฟคอมมอนส์แสดงที่มาซึ่งอนุญาตให้ใช้ แจกจ่าย และทำซ้ำได้ไม่จำกัดในสื่อใดๆ โดยต้องอ้างอิงงานต้นฉบับอย่างเหมาะสม

Ischemia-reperfusion- (IR-) ทำให้เกิดการบาดเจ็บที่ไตเพื่อหลีกเลี่ยงในระหว่างการปลูกถ่ายไตและการผ่าตัดไตบางส่วนโดยใช้หุ่นยนต์ การบาดเจ็บของ IR ของไตมีลักษณะเฉพาะด้วยความเสียหายของท่อ ความล้มเหลวของจุลภาค และ inflamation ซึ่งประสานกันเพิ่มการบาดเจ็บของไต อย่างไรก็ตาม ไม่มีการรักษาเฉพาะสำหรับเงื่อนไขเหล่านี้ รีเซพเตอร์ที่กระตุ้นการทำงานของโปรตีเอส-1 (PAR-1) และลิแกนด์ ทรอมบิน เกี่ยวข้องกับการแข็งตัวของเลือดและแสดงให้เห็นว่าเกี่ยวข้องกับการบาดเจ็บของเซลล์เยื่อบุผิว ในที่นี้ เราตั้งสมมติฐานว่า PAR-1 ทำลายเซลล์ท่อที่เหนี่ยวนำโดย IR ที่ไตเกินจริงและความล้มเหลวของจุลภาคและการยับยั้งทางเภสัชวิทยาของ PAR-1 โดย Q94 สามารถป้องกันการบาดเจ็บเหล่านี้ได้ Renal warm IR เพิ่มการแสดงออกของ PAR-1 ในท่อไต Q94 ลดทอนการเปลี่ยนแปลงที่เกิดจาก IR ของไตและความเสียหายทางจุลพยาธิวิทยา วิเคราะห์ความล้มเหลวของจุลภาคโดยความแออัดในจุลพยาธิวิทยาและเซลล์เม็ดเลือดที่ตรวจสอบโดยกล้องจุลทรรศน์มัลติโฟตอนในช่องปากถูกระงับโดยการรักษาด้วย Q94 นอกจากนี้ Q94 ยังเพิ่มการงอกของเซลล์ท่ออย่างมากแม้ว่าความเสียหายของไตจะลดลงก็ตาม Thrombin ยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์และทำให้เกิดการตายของเซลล์ในท่อ ผลลัพธ์เหล่านี้สามารถป้องกันได้ด้วยการบำบัดด้วย Q94 เมื่อนำมารวมกัน PAR-1 มีความเกี่ยวข้องกับการบาดเจ็บของ IR ของไต การยับยั้ง PAR-1 อาการบาดเจ็บที่ดีขึ้นโดยอาจเพิ่มการไหลเวียนของจุลภาคของไตและการอยู่รอด/การเพิ่มจำนวนของเซลล์ในท่อ

Data Aวาอิลอะบีility

ผู้เขียนยืนยันว่าข้อมูลที่สนับสนุนการค้นพบของการศึกษานี้มีอยู่ในบทความ

Cบนพลิกcts of Interest

ผู้เขียนทุกคนได้ประกาศว่าพวกเขาไม่มีส่วนได้เสียในการแข่งขัน

Autโฮrs' Cบนtriบูtiบนs

Yu Guan และ Daisuke Nakano เขียนต้นฉบับและทำการทดลองกับสัตว์ Lei Li ทำการทดลองในหลอดทดลอง Haofeng Zheng ทำการวิเคราะห์ทางสถิติ อากิระ นิชิยามะ แก้ไขต้นฉบับ Lei Zhang และ Ye Tian ออกแบบการศึกษานี้

Acคนรู้จักowledgmenทสึ

การศึกษานี้ได้รับการสนับสนุนโดยมูลนิธิวิทยาศาสตร์ธรรมชาติแห่งชาติของจีน (หมายเลข 82000712) และมูลนิธิวิทยาศาสตร์หลังปริญญาเอกของจีน (หมายเลข 2020M670385)

อ้างอิง

[1] MN Simmons, MJ Schreiber และ IS Gill "ภาวะไตขาดเลือดในการผ่าตัด: ภาพรวมร่วมสมัย" The Journal of Urology., vol. 180 ไม่ 1 หน้า 19-30, 2551.

[2] Y. Guan, D. Nakano, Y. Zhang, L. Li, Y. Tian และ A. Nishiyama "แบบจำลองเมาส์ของการเกิดพังผืดของไตเพื่อเอาชนะความแปรปรวนทางเทคนิคในการบาดเจ็บของการขาดเลือดขาดเลือด/การกลับเป็นเลือดของผู้ปฏิบัติงาน" Scientific รายงานฉบับที่ 9 ไม่ใช่ 1, น. 10435, 2019. 7 BioMed Research International

[3] M. Joannidis และ PGH Metnitz, "ระบาดวิทยาและประวัติธรรมชาติของภาวะไตวายเฉียบพลันในห้องไอซียู" Critical Care Clinics, vol. 21 ไม่ 2, หน้า 239–249, 2005.

[4] D. Nakano, K. Doi, H. Kitamura, et al., "การลดอัตราการไหลของท่อเป็นกลไกของ oliguria ในระยะแรกของ endotoxemia ที่เปิดเผยโดยการถ่ายภาพ intravital" Journal of Ameri can Society of Nephrology ฉบับที่ 26 ไม่ 12, น. 3035–3044, 2558.

[5] D. Nakano และ A. Nishiyama, "การถ่ายภาพ Multiphoton ของพยาธิสรีรวิทยาของไต" Journal of Pharmacological Sciences, vol. 132 หมายเลข 1, หน้า 1-5, 2016.

[6] Y. Zhang, D. Nakano, Y. Guan, et al., "ตัวยับยั้ง cotransporter 2 ของโซเดียม - กลูโคสช่วยลดการบาดเจ็บของเส้นเลือดฝอยในไตและการเกิดพังผืดโดยทางเดินที่ขึ้นกับปัจจัยการเจริญเติบโตของเยื่อบุผนังหลอดเลือดหลังจากได้รับบาดเจ็บที่ไตในหนู" ไต นานาชาติ ฉบับที่. 94 หมายเลข 3, น. 524–535, 2018.

[7] S. Nishioka, D. Nakano, K. Kitada, et al., "ตัวยับยั้งไคเนสที่ขึ้นกับ cyclin p21 เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับผลดีของการปรับสภาพไตขาดเลือดล่วงหน้าในภาวะไตขาดเลือด / อาการบาดเจ็บที่การกลับเป็นซ้ำในหนู" Kidney International, ฉบับ 85 ไม่ใช่ 4, หน้า 871–879, 2014.

[8] Y. Guan, D. Nakano, Y. Zhang, et al., "ตัวรับที่กระตุ้นการทำงานของโปรตีเอส-1 ตัวรับที่ป้องกันการบาดเจ็บของ podocyte ในรูปแบบเมาส์ของโรคไต" Journal of Pharmacological Sciences, vol. 135 หมายเลข 2, หน้า 81–88, 2017.

[9] M. Jiang, Q. Wei, G. Dong, M. Komatsu, Y. Su และ Z. Dong, "Autophagy in proximal tubules ป้องกันการบาดเจ็บของไตเฉียบพลัน" Kidney International, vol. 82 หมายเลข 12, หน้า 1271–1283, 2555.

[10] X. Hu, M. Su, J. Lin, et al., "Corin ถูกควบคุมในภาวะไตขาดเลือดขาดเลือด/อาการบาดเจ็บที่การกลับเป็นซ้ำ และสัมพันธ์กับการทำงานของการรับสินบนที่ล่าช้าหลังการปลูกถ่ายไต" Disease Markers, vol. 2019, รหัสบทความ 9429323, 8 หน้า, 2019.

[11] P. Wang, H. Wang, Q. Huang, et al., "Exosomes จาก M1- มาโครฟาจแบบโพลาไรซ์ช่วยเพิ่มฤทธิ์ต้านเนื้องอกของ paclitaxel โดยกระตุ้นการอักเสบที่เกิดจาก macrophages" Theranostics, vol. 9 ไม่ใช่ 6, หน้า 1714–1727, 2019.

[12] L. Yang, CR Brooks, S. Xiao, et al., "KIM-1-ไกล่เกลี่ย phagocytosis ช่วยลดการบาดเจ็บเฉียบพลันที่ไต" The Journal of Clinical Investigation, vol. 125 ไม่ 4, pp. 1620–1636, 2015.

[13] L. Xu, X. Li, F. Zhang, L. Wu, Z. Dong และ D. Zhang, "EGFR ขับเคลื่อนความก้าวหน้าของ AKI เป็น CKD ผ่าน HIPK2 overexpression" Theranostics., vol. 9 ไม่ใช่ 9, หน้า 2712–2726, 2019.

[14] T. Hifumi, D. Nakano, J. Chiba, et al., "การบำบัดแบบผสมผสานกับ gas gangrene antitoxin และ recombinant thrombomodulin ที่ละลายได้ของมนุษย์สำหรับ _Clostridium perfringens_ sepsis ในแบบจำลองหนู สารพิษ, เล่มที่. 141, หน้า 112–117, 2018.

[15] N. Hayase, K. Doi, T. Hiruma, et al., "Recombinant thrombomodulin ป้องกันการบาดเจ็บที่ปอดเฉียบพลันที่เกิดจากการบาดเจ็บของไต 10 ไม่ 1, น. 289, 2020.

[16] E. Lazzeri, ML Angelotti, A. Paired et al., "การเจริญเติบโตมากเกินไปของเซลล์ท่อที่เกี่ยวข้องกับ Endocycle และการแพร่กระจายของต้นกำเนิดช่วยฟื้นฟูการทำงานของไตหลังจากได้รับบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลัน" Nature Communications, vol. 9 ไม่ใช่ 1, น. 1344, 2561.

[17] K. Takaori, J. Nakamura, S. Yamamoto, et al., "ความรุนแรงและความถี่ของการบาดเจ็บที่ท่อใกล้เคียงเป็นตัวกำหนดการคาดการณ์ของไต" วารสาร American Society of Nephrology: JASN, vol. 27 ไม่ 8 น. 2393–2406, 2559.

[18] BD Humphreys, MT Valerius, A. Kobayashi, et al., "Intrinsic epithelial cells, ซ่อมแซมไตหลังได้รับบาดเจ็บ" Cell Stem Cell, vol. 2 ไม่ 3, หน้า 284–291, 2008.

[19] R. Wakasaki, K. Matsushita, K. Golgotiu, et al., "Glomerular filtrate proteins in Acute cardiorenal syndrome" JCI Insight, vol. 19. 4 ไม่ 4, 2019.

[20] M. Riewald, RJ Petrovan, A. Donner, BM Mueller และ W. Ruf "การเปิดใช้งานตัวรับโปรตีเอสที่กระตุ้นการทำงานของเซลล์บุผนังหลอดเลือด 1 โดยวิถีโปรตีน C" Science, vol. 296 ไม่ใช่ 5574, pp. 1880–1882, 2002.

[21] MJ Ludeman, H. Kataoka, Y. Srinivasan, NL Esmon, CT Esmon และ SR Coughlin "ความแตกแยก PAR1 และการส่งสัญญาณในการตอบสนองต่อโปรตีน C และ thrombin∗ ที่กระตุ้น" The Journal of Biological Chemistry, vol. 280 ไม่ใช่ 13, น. 13122–13128,

2005.

[22] JH Griffin, BV Zlokovic และ LO Mosnier, "Activated protein C: biased for Translation" Blood, vol. 125 ไม่ 19 น. 2898–2907, 2015.

[23] R. Essalmani, D. Susan-Resiga, J. Guillemot, et al., "การกระตุ้น Thrombin ของโปรตีน C จำเป็นต้องมีการประมวลผลก่อนโดย proprotein convertase ของตับ" The Journal of Biological Chemistry, vol. 292 ไม่ใช่ 25 หน้า 10564–10573 2017

[24] S. Van Laecke และ W. Van Biesen, "ความดันโลหิตสูงอย่างรุนแรงด้วย microangiopathy ลิ่มเลือดในไต: เกิดอะไรขึ้นกับผู้ต้องสงสัยตามปกติ" Kidney International, vol. 91 ไม่ใช่ 6, หน้า 1271–1274, 2017.

[25] M. Waasdorp, J. Duitman, S. Florquin และ CA Spek, "Protease-activated receptor-1 Deficiency ช่วยป้องกันโรคไตจากเบาหวานที่เกิดจากสเตรปโตโซโตซินในหนูทดลอง" Scientific Reports, vol. 6 ไม่ 1, น. 33030, 2016.