การบาดเจ็บของ Podocyte ผ่านปฏิสัมพันธ์ระหว่าง Tlr8 กับ Ligand MiR ภายในตัวของมัน-21ในสิ่งกีดขวางและไตที่เป็นหลักประกัน

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

cistanche หย่อนสมรรถภาพทางเพศ เกี่ยวข้องกับไต

แม้ว่าโรคไตเรื้อรังจะพบมากในผู้ใหญ่ แต่มีรายงานเกี่ยวกับโรคไตอุดกั้น (ON) ในผู้ป่วยเด็กและผู้ใหญ่ ใน ON, tubulointerstitial lesions (TILs) ได้รับการตรวจสอบอย่างกว้างขวาง แต่ glomerular lesion (GLs) ส่วนใหญ่ถูกละเลย ในที่นี้ เราแสดงกลไกใหม่ที่เป็นพื้นฐานของการพัฒนา GL ใน ON ในหนูน้อยและหนูเก่า TILs พัฒนาเร็วกว่า GL เนื่องจากการแทรกซึมของเซลล์ที่มีการอักเสบใน tubulointerstitium แต่ GL จะพัฒนาตามการกระตุ้นของ Toll-like receptor 8 (Tlr8) แม้ว่าจะไม่มีเซลล์อักเสบที่แทรกซึมเข้าไปในโกลเมอรูลัสก็ตาม โปรตีน TLR8 และ interleukin 1 beta (IL1b) รวมตัวกันด้วยการลดเครื่องหมายการทำงานของ podocyte (PFMs) ซึ่งบ่งชี้ถึงการกระตุ้นการส่งสัญญาณ TLR8 ใน podocytes ที่ได้รับบาดเจ็บ นอกจากนี้ ระดับไตและซีรัมของ miR-21 ซึ่งเป็นลิแกนด์ภายในร่างกายสำหรับ Tlr8 มีค่าสูงกว่าในแบบจำลองเมาส์ ON มากกว่าในกลุ่มควบคุมหลอก การแสดงออกของไตของ Tlr8 มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับ miR-21 และไซโตไคน์ที่ปลายน้ำ Il1b และ Il6 และมีความสัมพันธ์เชิงลบกับ PFM (Nphs1 และ Synpo) นอกจากนี้เรายังแสดง colocalization ของโปรตีน TLR8 และ IL1b ด้วยการลด PFMs ทั้งในสิ่งกีดขวางและหลักประกันไตของหนูน้อยและหนูแก่ นอกจากนี้ ผลการศึกษาในหลอดทดลองยังเผยให้เห็นการแสดงออกที่สูงขึ้นของ Tlr8 และไซโตไคน์ปลายน้ำในโกลเมอรูไลจากสิ่งกีดขวางไตหลังการรักษาด้วย miR- 21 เลียนแบบมากกว่าในกลุ่มควบคุม โดยสรุป การแสดงออกที่มากเกินไปของ Tlr8 อาจทำหน้าที่เป็นกลไกที่เป็นไปได้ซึ่งอยู่ภายใต้การพัฒนา GL ใน ON ผ่านการบาดเจ็บของ podocyte

คำสำคัญ: โรคไตเรื้อรัง,โรคไตอุดกั้น, podocyte, TLR8, ไตอุดกั้นและหลักประกัน

การแนะนำ

โรคไตเรื้อรัง (CKD)ความกังวลด้านสาธารณสุขที่สำคัญมีอยู่ 8 เปอร์เซ็นต์ –13 เปอร์เซ็นต์ของประชากรทั่วไป (1) เป็นบ่อยในผู้สูงอายุเนื่องจากสังคมสูงวัย โรคไตอุดกั้น (ON) เป็นที่สนใจของแพทย์อย่างมาก เนื่องจากมีรายงานผู้ป่วยจากกลุ่มอายุต่างๆ ON รักษาได้และเปลี่ยนกลับได้ ไม่เหมือนกับ CKD อื่นๆ (2, 3) ในเด็ก พบในเด็กหนึ่งใน 1500 คน และความชุกของมันสูงถึง 1 เปอร์เซ็นต์ –5 เปอร์เซ็นต์ในประเทศที่พัฒนาแล้ว (4, 5) ในผู้ใหญ่ ความชุกของ ON มีตั้งแต่ 5 ใน 1,000 ถึง 5 ใน 10,000 คน นอกจากนี้ ความชุกของ ON ข้างเดียวเรื้อรังอยู่ที่ประมาณ 0.5 เปอร์เซ็นต์ ในขณะที่ ON ข้างเดียวแบบเฉียบพลันและเรื้อรังแบบเรื้อรังจะอยู่ที่ประมาณ 0.1 เปอร์เซ็นต์ (4-7)

ON สามารถนำไปสู่การบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลันหรือ CKD ซึ่งเกี่ยวข้องกับการลดลงอย่างต่อเนื่องในการทำงานของไตและการเปลี่ยนแปลงในโครงสร้างไตเป็นเวลานานกว่า 3 เดือน (8, 9) การอุดตันของท่อไตข้างเดียว (UUO) เป็นกลยุทธ์ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการศึกษา ON เรื้อรัง ON ในไต UUO มีลักษณะเฉพาะของการเจริญเติบโตมากเกินไป ภาวะไฮโดรเนโฟซิส การรวมตัวของเซลล์อักเสบในบริเวณคั่นระหว่างหน้า การตายของเซลล์ในท่อจากการขาดออกซิเจน และการสะสมคอลลาเจนใน tubulointerstitium ตามด้วยการพัฒนาของ tubulointerstitial fifibrosis (TF) (10)

TF เป็นคุณสมบัติที่สำคัญของโรคไตวายเรื้อรังระยะสุดท้ายและเป็นปัจจัยกำหนดที่สำคัญของการบาดเจ็บที่ไตที่ลุกลาม (11) TF ได้รับการตรวจสอบอย่างกว้างขวางในแบบจำลอง ON แต่ข้อมูลเกี่ยวกับการบาดเจ็บของไต โดยเฉพาะอย่างยิ่งความผิดปกติของอุปสรรคในเลือดและปัสสาวะ (BUB) นั้นหายาก (8, 9, 12) นอกจากนี้ การศึกษาได้ตรวจสอบรอยโรคของ tubulointerstitial lesions (TILs) ในไตหลักประกันใน ON ข้างเดียว แต่ glomerular lesions (GLs) ส่วนใหญ่ถูกละเลย (12) รายงานหลายฉบับได้เปิดเผยการมีส่วนร่วมของเส้นเลือดฝอยในช่องท้องในความก้าวหน้าของ TIL ในการทดลอง ON (13, 14) อย่างไรก็ตาม glomerulus และ glomerular capillary จะระบายออกไปยังส่วน tubular ของ nephron และ peritubular capillaries ตามลำดับ ดังนั้น เราขอแนะนำว่า glomerulonephritis อาจส่งผลต่อ tubulointerstitium การศึกษาก่อนหน้านี้ของเราได้เน้นย้ำถึงการมีส่วนร่วมของการบาดเจ็บต่อเซลล์ภายในของไต ซึ่งส่วนใหญ่เป็น podocytes ต่อ GL และการพัฒนา TIL ที่ตามมาในแบบจำลองเมาส์โรคภูมิต้านตนเองอันเนื่องมาจากการแสดงออกที่มากเกินไปของตัวรับค่าโทร (TLR) ที่แตกต่างกัน (15–18)

Glomerular capillary endothelium และ podocytes เป็นตัวเฝ้าประตูที่สำคัญซึ่งประกอบด้วย BUBs ระหว่างเยื่อบุผิวทั้งสองนี้ โพโดไซต์จะได้รับสัญญาณอันตรายอย่างต่อเนื่อง รวมถึงลิแกนด์ TLR เช่น รูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับอันตราย (DAMPs) หรือรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับเชื้อโรค (PAMPs) เนื่องจากการโลคัลไลเซชันเฉพาะของพวกมันในโกลเมอรูไล (15) ดังนั้น การทำงานร่วมกันระหว่าง TLR ใน podocytes และลิแกนด์ภายในของพวกมันจึงคิดว่ามีส่วนทำให้เกิดการบาดเจ็บของ podocyte ในสภาวะที่ไม่ติดเชื้อ ในการศึกษานี้ เรามุ่งเน้นไปที่การพัฒนา GL ในไตทั้งที่อุดตันและในไตของหนูอายุน้อยและหนูสูงวัย เนื่องจากมักพบ ON ทั้งในคนอายุน้อยและคนสูงอายุ เราชี้แจงว่า GL ได้รับการพัฒนาใน ON เนื่องจากการบาดเจ็บของ podocyte ผ่านการแสดงออกของ Tlr8 ที่มากเกินไปใน podocytes จากไตที่อุดตันและหลักประกันของหนูอายุน้อยและหนูแก่

วัสดุและวิธีการ

คำชี้แจงทางจริยธรรมและการทดลองเลี้ยงสัตว์ การทดลองทั้งหมดโดยใช้สัตว์ทดลองได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบันของคณะสัตวแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยฮอกไกโด (หมายเลขอนุมัติ 16- 0124) ผู้เขียนได้ปฏิบัติตามคำแนะนำในการดูแลและการใช้สัตว์ทดลองของมหาวิทยาลัยฮอกไกโด คณะสัตวแพทยศาสตร์ (อนุมัติโดยสมาคมการประเมินและการรับรองห้องปฏิบัติการดูแลสัตว์นานาชาติ) หนู C57BL/6N อายุ 6 สัปดาห์ถูกซื้อจาก Japan SLC Inc. (ฮามามัตสึ ประเทศญี่ปุ่น) และบำรุงรักษาในสภาวะที่ปราศจากเชื้อโรคเฉพาะภายใต้สภาพแวดล้อมที่มืดและสว่าง 1:1 สัตว์ทดลองได้รับอาหารและน้ำดื่มโดยอิสระ

การออกแบบเชิงทดลอง เราใช้ทั้งหนูน้อย (9 สัปดาห์) และหนูเก่า (12 เดือน) หนูจากแต่ละกลุ่มอายุ (n=4) ได้รับการผ่าตัดหลอก (กลุ่มควบคุม) หรือ UUO (2, 7, 11 และ 21 วัน) เพื่อสร้างไตในรูปแบบ ON ตามที่อธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้านี้ของเรา (13)

หนูทดลองเตรียมตัวอย่างถูกวางยาสลบอย่างล้ำลึกด้วยส่วนผสมของยาชาตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (16) และทำการุณยฆาตโดยปากมดลูกเคลื่อน เก็บตัวอย่างเลือดผ่านทางหลอดเลือดแดงตีบเพื่อวิเคราะห์ซีรัมมาร์กเกอร์ เก็บทั้ง UUO และไตหลักประกันและหั่นเป็นชิ้นบาง ๆ ชิ้นไตได้รับการแก้ไขด้วยบัฟเฟอร์ฟอร์มาลินเป็นกลาง 10 เปอร์เซ็นต์ (NBF) พาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ (PFA) และกลูตาราลดีไฮด์ 2.5 เปอร์เซ็นต์ (GTA) สำหรับการศึกษาทางจุลพยาธิวิทยาอิมมูโนฮิสโตเคมีและอิเล็กตรอนตามลำดับ

อิมมูโนฮิสโตเคมีและอิมมูโนเฟลฟลูออเรสเซนส์ NBF-fixed พาราฟินบล็อกถูกตัดที่ความหนา 2 มม. และย้อมด้วยกรด Schiff-hematoxylin (PAS-H) เป็นระยะเพื่อตรวจชิ้นเนื้อในไต การตรวจภูมิคุ้มกันของมาร์คเกอร์ของเซลล์ได้ดำเนินการตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ (16) สำหรับบีเซลล์ (B220), ทีเซลล์ (CD3), หลอดเลือดฝอย endothelium (CD31), IL1b, มาโครฟาจ (Iba1), โพโดซิน (โพโดซินและซินแนปโทโพดิน) และ TLR8 เงื่อนไขการย้อมสีแสดงไว้ในตารางที่ 1

Histoplanimetry PAS-H และส่วนไตที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่องถูกแปลงเป็นสไลด์เสมือนจริงโดยใช้ Nano Zoomer 20 RS (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.; Hamamatsu, Japan) เซลล์ที่เป็นบวกถูกนับจากโกลเมอรูไล 20 อันหรือ 20 foci จาก tubulointerstitium ที่กำลังขยาย 400x โดยใช้ซอฟต์แวร์ NDP.view2 (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) ภาพของโกลเมอรูไล 20 ชิ้นจากส่วนที่ย้อมด้วย PAS-H ยังถูกจับที่ 400x จากเมาส์แต่ละตัวโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงออล-อิน-วัน BZ-X710 (คีย์เอนซ์ โอซากะ ญี่ปุ่น) พื้นที่และขนาดของเส้นโลหิตตีบถูกวัดจากภาพที่ถ่ายโดยใช้เครื่องวิเคราะห์ BZ-X (Keyence)

การแยก Glomerulus สำหรับการสกัด RNA และการเพาะเลี้ยง Glomeruli จากไตเทียมและไต UUO ถูกแยกออกตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (16) โดยสังเขป หนูได้รับการดมยาสลบอย่างล้ำลึกและผสมผ่านช่องด้านซ้ายด้วยสารละลายเกลือที่สมดุลของแฮงค์ (HBSS) 40 มล. ที่มีไดนาบีดส์ (8 × 107; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ไตถูกตัดออก

และหั่นเป็นชิ้นเล็กๆ จากนั้นเซลล์ถูกย่อยด้วยคอลลาเจนเนส A (1 มก./มล.; โรช บาเซิล สวิตเซอร์แลนด์) และดีออกซีไรโบนิวคลีเอส I (100 U/มล.; Life Technologies) ใน HBSS ที่ 37 องศาเป็นเวลา 30 นาที สารแขวนลอยที่มีเนื้อเยื่อย่อยถูกกดเบา ๆ ผ่านตัวกรองเซลล์ขนาด 100- มม. (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA) โดยใช้สากแบน สารแขวนลอยของเซลล์ที่เป็นผลลัพธ์ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 200 ×g เป็นเวลา 5 นาที และเม็ดเซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ใน HBSS 2 มล. Glomeruli ที่มี Dynabeads ถูกรวบรวมโดยใช้หัวอนุภาคแม่เหล็ก (Life Technologies) และใช้สำหรับการแยก RNA

การถอดเสียงแบบย้อนกลับและ PCR แบบเรียลไทม์RNA ทั้งหมดแยกได้จากโกลเมอรูไลโดยใช้ชุดเครื่องมือ RNeasy (เคียเกน ฮิลเดน เยอรมนี) cDNA ถูกสังเคราะห์จาก RNA ทั้งหมดโดยการถอดรหัสแบบย้อนกลับโดยใช้เอนไซม์ ReverTra Ace reverse transcriptase (Toyobo, Osaka, Japan) และไพรเมอร์ dT แบบสุ่ม (Promega) cDNA ถูกใช้ใน PCR แบบเรียลไทม์ด้วย Brilliant III SYBR Green QPCR master mix และ Mx3000P (Agilent Technologies, La Jolla, CA, USA) การแสดงออกของยีนโกลเมอรูลาร์ถูกทำให้เป็นมาตรฐานตามการแสดงออกของ Actb คู่ไพรเมอร์ที่ใช้แสดงไว้ในตารางที่ 2

การถอดเสียงแบบย้อนกลับและ PCR แบบเรียลไทม์ที่ใช้ TaqManRNA ทั้งหมด ซึ่งรวมถึง microRNA (miRNA) ในโกลเมอรูไลที่แยกได้ ถูกแยกออกโดยใช้ชุด miRNeasy (Qiagen) miRNA-specific stem-loop RT primers, reverse transcriptase, reverse transcription buffer, dNTPs และ RNase inhibitor ถูกใช้เพื่อถอดรหัส RNA ทั้งหมดตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) PCR แบบเรียลไทม์ถูกดำเนินการด้วย cDNA ที่เป็นผลลัพธ์โดยใช้ไพรเมอร์ TaqMan จำเพาะของ miR-21- และโพรบเฉพาะ (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) และ Mx3000P (Agilent Technologies)

การรักษา Glomeruli ที่แยกออกมาในหลอดทดลองด้วยการเลียนแบบGlomeruli ถูกแยกออกจากการทำศัลยกรรมหลอกและ UUOไตหลังจาก 11 วันของการอุดตัน Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) สื่อ (Fujifilm Wako, Japan) ที่มี 300 glomeruli ถูกแจกจ่ายในแต่ละหลุมของ96-จานเพาะเลี้ยงหลุม (TPP, Trasadingen, Switzerland) และ บำบัดด้วย PBS กลุ่มควบคุมเชิงลบ และ miR-21 เลียนแบบ (UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A) (Bioneer, Daejeon, เกาหลีใต้) ที่ 1 pmol/ µL เป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่ 37 องศาใน 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 การแสดงออกของ Tlr8 และไซโตไคน์ปลายน้ำถูกวัดตามที่อธิบายไว้ในส่วนก่อนหน้า

การสแกนด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนสำหรับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดเป็นประจำ (SEM) ขนาดเล็กไต ชิ้นได้รับการแก้ไขด้วย GTA 2.5 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 4 ชั่วโมงและหลังการแก้ไขด้วย osmium tetroxide 1 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตามด้วยการบำบัดด้วยกรดแทนนิก 1 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นตัวอย่างจะถูกตรึงด้วย osmium tetroxide 1 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 1 ชั่วโมงและบำบัดด้วย 0.5 เปอร์เซ็นต์และกรดแทนนิก 1 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 10 นาทีและ 1 ชั่วโมงตามลำดับไตชิ้นถูกทำให้แห้งด้วยแอลกอฮอล์จากน้อยไปมาก ถ่ายโอนไปยัง 3-เมทิล บิวทิล อะซิเตต และสุดท้ายถูกทำให้แห้งด้วยเครื่องทำแห้งแบบจุดวิกฤต HCP-2 (ฮิตาชิ โตเกียว ญี่ปุ่น) ชิ้นงานทดสอบถูกไอออนสปัตเตอร์ จากนั้นตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด S-4100 ที่แรงดันไฟฟ้าเร่ง 12 kV

การวิเคราะห์ทางสถิติค่าต่างๆ จะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ความคลาดเคลื่อนมาตรฐาน (se) ผลลัพธ์ถูกวิเคราะห์ทางสถิติโดยใช้ Mann– Whitney U-test แบบไม่อิงพารามิเตอร์ (P < 0.05)="" การทดสอบ="" kruskal-wallis="" ใช้เพื่อเปรียบเทียบประชากรตั้งแต่สามกลุ่มขึ้นไป="" และการเปรียบเทียบหลายรายการได้ดำเนินการโดยใช้วิธีของ="" scheffe="" เมื่อสังเกตเห็นความแตกต่างที่มีนัยสำคัญ="" (p="">< 0.05)="" วิเคราะห์ความสัมพันธ์ระหว่างพารามิเตอร์ทั้งสองโดยใช้การทดสอบสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์อันดับของสเปียร์แมน="" (p=""><>

ผลลัพธ์

TILs และ GLs ในไตอุดตันของหนูน้อยเราตรวจสอบ TIL และ GL เป็นครั้งแรกในไตเทียมและไต UUO ของหนูตัวน้อยที่ถูกกีดขวางในช่วงเวลาต่างๆ ในขณะที่ไตที่ผ่าตัดหลอกแสดง tubulointerstitium ปกติ (รูปที่ 1A) ไตที่อุดกั้นหลังจาก UUO 2 วันแสดง TIL และมีลักษณะเฉพาะโดยการขยายของ tubules; ท่อบางตัวมีท่อปัสสาวะด้วย รอยโรคดังกล่าวเพิ่มขึ้นตามความก้าวหน้าของการอุดตัน (รูปที่ 1A) GLs ซึ่งส่วนใหญ่เป็น glomerulosclerosis ถูกสังเกตพบในระยะสุดท้ายที่ 21 วันหลัง UUO และมีลักษณะเฉพาะโดยการสะสมของสารที่เป็นกรด-Schiff (PAS) เป็นระยะๆ โครงสร้างไตเป็นปกติทั้งในไตเทียมและ UUO ระยะแรก (2, 7 และ 11 วัน) (รูปที่ 1B) จำนวนเซลล์ไตมีแนวโน้มเพิ่มขึ้นจนถึงวันที่-11หลังจากการอุดตันและมีแนวโน้มลดลงในวันที่-21ในไต UUO (รูปที่ 1C) Glomerular mesangial accumulation มีแนวโน้มเพิ่มขึ้นจาก 7 วันหลังจากการอุดกั้น (รูปที่ 1D)

ไม่อยู่ที่ศูนย์กลางของโกลเมอรูไลของไต UUO ที่ 21 วันหลังจากการอุดตัน (รูปที่ 1F) ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสเผยให้เห็นการลดลงอย่างมีนัยสำคัญใน PFMs (Nphs1 และ Synpo) ในไต UUO 21 วันหลังจากการอุดตัน (รูปที่ 1G) นอกจากนี้ การวิเคราะห์ SEM ยังเผยให้เห็นกระบวนการของ podocyte foot (PFPs) ตามปกติในไตที่ผ่าตัดโดยเสแสร้ง อย่างไรก็ตาม รายงานการเกิด PFP และโครงสร้างคล้าย microvillous ในไต UUO 21 วันหลังจากเกิดการอุดตัน (รูปที่ 1H) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นถึงการเกิดการบาดเจ็บของ podocyte ในไตที่อุดกั้นใน 21 วันหลังจากการอุดกั้น

เซลล์ภูมิคุ้มกันที่แทรกซึมนั้นไม่มีอยู่ในไตที่ถูกอุดกั้น ดังนั้นเราจึงตรวจสอบการแทรกซึมของ B- และ T-cells รวมถึงมาโครฟาจใน TIL และ GL ของไตเทียมและ UUO (รูปที่ 2) พบการแทรกซึมของ B-, T-cell และมาโครฟาจจำนวนมากใน TIL ของไต UUO ทุกวันหลังจากการอุดตัน แต่พวกมันเกือบจะหายไปหรือแทบไม่มีในโกลเมอรูไลของไตเทียมและไต UUO (รูปที่ 2A–E) จำนวน B-, T-cells และมาโครฟาจมีน้อยมากในโกลเมอรูลัส (ไม่แสดงข้อมูล) แต่สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญใน

tubulointerstitium ของไต 2-, 7-, 11- และ 21-วัน เมื่อเปรียบเทียบกับไตเทียม (รูปที่ 2F) ดังนั้นการแทรกซึมเซลล์ภูมิคุ้มกันอาจนำไปสู่การพัฒนา TILs ในไตที่อุดกั้น อย่างไรก็ตาม ปัจจัยอื่นๆ อาจเกี่ยวข้องกับการพัฒนา GL

การแสดงออกของสมาชิกที่แตกต่างกันของตระกูล TLR และ Cytokines ปลายน้ำในไตที่ถูกควบคุมโดย Sham-Operated และ Obstructed Kidneys of Young Mice การศึกษาก่อนหน้านี้ได้เปิดเผยการแสดงออกที่สูงขึ้นของ TLRs ที่แตกต่างกันใน podocytes ของไตที่เป็นโรค (15, 16, 19, 20) น่าสนใจ ข้อมูลของเราเผยให้เห็นการแสดงออกของ Tlr8 และ Tlr9 ที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในโกลเมอรูไลที่แยกได้จากกลุ่ม UUO 21-วัน มากกว่าในโกลเมอรูไลของกลุ่มหลอกลวง (รูปที่ 3A) นอกจากนี้ เรายังตรวจสอบการแสดงออกของไซโตไคน์ดาวน์สตรีมของสมาชิกในครอบครัว TLR ในกลุ่มโกลเมอรูลีจากกลุ่มเสแสร้งและ UUO 21-วัน และพบว่ามีการควบคุมที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในการแสดงออกของยีนที่เข้ารหัสทั้งอินเตอร์ลิวคิน 1 เบต้า (Il1b) และอินเตอร์ลิวคิน 6 (Il6) ในกลุ่ม UUO เทียบกับกลุ่มหลอกลวง (รูปที่ 3B)

TLR8 Co-Localized กับ PFM เนื่องจากการแสดงออกของ Tlr8 และ Tlr9 นั้นสูงใน glomeruli ที่แยกได้จากไตที่อุดกั้น เราจึงตรวจสอบการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นโดยการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ ตรวจไม่พบโปรตีน TLR8 ในไตที่ทำการผ่าตัดหลอก (รูปที่ 4A) แต่ถูกทำให้เป็นโคโลคัลไลซ์ด้วย PFM synaptopodin ในไต UUO (รูปที่ 4B) นอกจากนี้ เรายังตรวจไม่พบการแสดงออกของโปรตีน TLR9 ในไตจากหนูทดลองหรือหนูทดลอง UUO (ไม่แสดงข้อมูล)

การผลิต IL1b จาก Podocytes ในไตที่ถูกกีดขวางของหนูหนุ่มดังแสดงในรูปที่ 3B การแสดงออกของ Il1b ของไต (ไซโตไคน์ปลายน้ำของตระกูล TLR) มีค่าสูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในไต UUO ที่ 21 วันมากกว่าในไตเทียม ดังนั้นเราจึงตรวจสอบแหล่งที่มาของ IL1b ในโกลเมอรูไลของไต UUO โดยการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ ไม่พบการแสดงออกของโปรตีน IL1b ในโกลเมอรูไลของไตปลอม แต่ถูกสังเกตพบในโกลเมอรูไลของไต UUO (รูปที่ 4C, D) นอกจากนี้ IL1b ถูกรวมเข้ากับ PFM podocin (รูปที่ 4D)

ใน UUOไตที่ 21 วันกว่านั้นในชามไต.ดังนั้นเราจึงตรวจสอบแหล่งที่มาของ IL1b ในโกลเมอรูไลของไต UUO โดยการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ ไม่พบการแสดงออกของโปรตีน IL1b ใน glomeruli ของ shamไตแต่สังเกตได้จากโกลเมอรูไลของ UUOไต(รูปที่ 4C, D). นอกจากนี้ IL1b ถูกรวมเข้ากับ PFM podocin (รูปที่ 4D)

ระดับที่เพิ่มขึ้นของแกนด์ Tlr8 ภายนอกสมมุติในหนูทดลอง ON รุ่น A การศึกษาก่อนหน้านี้พบว่า miR-21 ทำหน้าที่เป็นลิแกนด์สำหรับ TLR8 (21) ดังนั้นเราจึงเปรียบเทียบทั้งระดับไตและระดับซีรัมของ miR-21 ระหว่างกลุ่มเสแสร้งและกลุ่ม UUO 21-วัน ที่น่าสนใจคือ กลุ่มวัน UUO 21-วันแสดงระดับ miR ของไตที่สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ-21 มากกว่าในกลุ่มหลอก (P < 0.05)="" อย่างไรก็ตาม="" แนวโน้มของ="" mir="" ในซีรัมเพิ่มขึ้น{="" {10}}="" ถูกสังเกตในกลุ่มเดิมมากกว่ากลุ่มหลัง="" (p="0.06)" (รูปที่="">

ความสัมพันธ์ของการแสดงออก Tlr8 กับ Ligand miR-21 และ PFM ในสิ่งกีดขวางไตตามที่แสดงในตารางที่ 3 เราสังเกตเห็นความสัมพันธ์เชิงบวกที่มีนัยสำคัญระหว่างการแสดงออกของไตของ Tlr8 mRNA และลิแกนด์ภายใน (miR-21) รวมทั้งไซโตไคน์ที่ปลายน้ำ Il1b และ Il6 ในทางกลับกัน มีความสัมพันธ์เชิงลบอย่างชัดเจนระหว่าง Tlr8 mRNA กับ PFMs Nphs1 และ Synpo

In Vitro Stimulation of Glomeruli With miR{{0}} Mimic Activates the Expression of Tlr8 and its downstream Cytokines การแสดงออกของ Tlr8 มีแนวโน้มที่จะเพิ่มขึ้น (P=0.06) แต่ ไซโตไคน์ปลายน้ำของมัน (Ifng และ Il1b) มีนัยสำคัญ (P < 0.05 และ 0.01) เพิ่มขึ้นในโกลเมอรูไลของหนูหลอกตามมา

การบำบัดด้วยการเลียนแบบ miR-21 เมื่อเปรียบเทียบกับการเลียนแบบในโกลเมอรูไลของหนูเมาส์ที่บำบัดด้วย PBS และการเลียนแบบกลุ่มควบคุมเชิงลบ (รูปที่ 5A) อย่างไรก็ตาม ไม่พบความสัมพันธ์ที่มีนัยสำคัญระหว่างการแสดงออกของ Tlr8 และไซโตไคน์ที่ปลายน้ำในโกลเมอรูไลของหนูหลอกหลังการรักษาด้วยการเลียนแบบ (ตารางที่ 4) การแสดงออกของ Tlr8 และไซโตไคน์ปลายน้ำของมันนั้นสูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในโกลเมอรูไลของ UUOไต, หลังการรักษาด้วย miR-21 เลียนแบบกว่าใน glomeruli ของ UUOไตบำบัดด้วย PBS และการเลียนแบบกลุ่มควบคุมเชิงลบ (รูปที่ 5B) ตรวจพบความสัมพันธ์ที่มีนัยสำคัญระหว่างการแสดงออกของ Tlr8 และไซโตไคน์ที่ปลายน้ำของมันในโกลเมอรูไลของไต UUO หลังการรักษาด้วยการเลียนแบบ ซึ่งบ่งชี้ถึงการกระตุ้นที่สูงขึ้นของวิถีทางนิวเคลียร์ที่อาศัย Tlr8-สื่อกลาง แคปปา บี (NF-kB) และ การหลั่งของ proinflammatory cytokines ในไตที่อุดตัน (ตารางที่ 4)

TLR8 Localization และ Podocyte Injury ใน Collateral Kidneys of Young Miceไตที่ผ่าตัดหลอกแสดงโกลเมอรูลัสปกติ ในขณะที่ไตหลักประกันมีไตโตมากเกินไป จำนวนเซลล์ไตเพิ่มขึ้น และเส้นเลือดฝอยในไตขยายตัว (รูปที่ 6A) โกลเมอรูไลจากไตที่ผ่าตัดหลอกให้ผลบวกสำหรับการแสดงออกของไซแนปโทโพดินและขาดการแสดงออกของ TLR8 (รูปที่ 6B) ในทางกลับกัน ไตที่มีหลักประกันสูญเสียการแสดงออกของไซแนปโทโพดินที่ศูนย์กลางของโกลเมอรูลี แต่แสดงการแสดงออกของ TLR8 ตามอัตราของไต (รูปที่ 6C) นอกจากนี้ โปรตีน TLR8 ถูกโลคัลไลซ์ร่วมกับซินแนปโทโพดิน (รูปที่ 6C) ไตเทียมแสดงการแสดงออกตามปกติของโพโดซิน แต่ไม่มีการแสดงออกของ IL1b ในโกลเมอรูลี (รูปที่ 6D) อย่างไรก็ตาม โกลเมอรูไลภายในไตหลักประกันสูญเสียการแสดงออกของโพโดซินที่ศูนย์กลาง แต่มีการแสดงออกของ IL1b ตามอัตราของไต (รูปที่ 6E) นอกจากนี้ โปรตีน IL1b ถูก colocalized กับ podocin (รูปที่ 6E) การวิเคราะห์ SEM เผยให้เห็น PFP ปกติในไตของหนูเมาส์ที่ทำการทดลองหลอก แต่การหลุดลอกของ PFP และโครงสร้างที่คล้ายจุลภาคนั้นมองเห็นได้ในไตที่มีหลักประกัน (รูปที่ 6F)

การโลคัลไลเซชัน TLR8 และการบาดเจ็บของ Podocyte ในไตที่ถูกกีดขวางและหลักประกันของหนูสูงอายุไตเทียมแสดงการแสดงออกตามปกติของซินแนปโทโพดินแต่ไม่พบการย้อมสีสำหรับโปรตีน TLR8 ภายในโกลเมอรูไลของพวกมัน (รูปที่ 7A) ที่น่าสนใจคือ ไตทั้งหลักประกันและ UUO แสดงการสูญเสียการแสดงออกของไซแนปโทโพดินที่ศูนย์กลางของโกลเมอรูไล แต่คงการแสดงออกของ TLR8 ไว้ตามแนวริดสีดวงทวาร (รูปที่ 7B, C) โปรตีน TLR8 ถูก colocalized ด้วย synaptopodin ในหลักประกันและไต UUO (รูปที่ 7B, C) ไตที่ผ่าตัดหลอกในทำนองเดียวกันแสดงการแสดงออกของโพโดซินปกติ แต่ไม่มีการแสดงออกของ IL1b ในโกลเมอรูไลของพวกมัน (รูปที่ 7D) ในอีกทางหนึ่ง ทั้งหลักประกันและไต UUO สูญเสียการแสดงออกของโพโดซินที่ศูนย์กลางของโกลเมอรูลี แต่แสดงการแสดงออกของ IL1b ตามแนวริดสีดวงทวาร (รูปที่ 7E, F) พบว่าการย้อมสีที่เป็นบวกถูกรวมเข้ากับโพโดซินในโกลเมอรูไลของหลักประกันและไต UUO (รูปที่ 7E, F) การตรวจ SEM พบว่ามี PFP ปกติในไตของหนูเมาส์ที่ทำการทดลองหลอก การหลุดของ PFP และโครงสร้างที่คล้ายจุลภาคในไตทั้งหลักประกันและ UUO ของหนูตัวเก่า (รูปที่ 7G)

อภิปรายผลบน

ความชุกพบได้บ่อยในทารกและในผู้สูงอายุ (4-7) ดังนั้นเราจึงให้ UUO หนูตัวน้อยและหนูแก่เพื่อเลียนแบบสภาพ ON ของบุคคลในกลุ่มอายุต่างๆ และตรวจสอบ TIL และ GL ในไตที่อุดกั้น ความก้าวหน้าของ TILs นั้นชัดเจนในระยะก่อนหน้าของการอุดตัน (2 วัน); อย่างไรก็ตาม ความก้าวหน้าของ GL ร่วมกับการบาดเจ็บของ podocyte ถูกสังเกตในระยะต่อมา ไตหลักประกันแสดงให้เห็น GLs และการบาดเจ็บของ podocyte ในเวลาเดียวกัน การสังเกตนี้บ่งชี้ว่าการบาดเจ็บของ podocyte เกิดขึ้นทั้งในไตที่อุดกั้นและไตข้างเคียง แม้ว่าการดูถูกครั้งแรกอาจแตกต่างกันไป การศึกษาก่อนหน้านี้ของเราได้เน้นถึงความสัมพันธ์ระหว่างการบาดเจ็บของ podocyte และการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกันใน glomerulus (13, 16, 18) อย่างไรก็ตาม การศึกษานี้ไม่พบการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกันเข้าไปในโกลเมอรูไลของไตเทียมหรือไตที่อุดกั้น ดังนั้นเราจึงพิจารณาการมีส่วนร่วมของปัจจัยอื่น ๆ ในการบาดเจ็บของ podocyte ในไตที่อุดกั้น เราตั้งสมมติฐานว่าสัญญาณอันตราย (DAMPs หรือ PAMPs) ไม่ว่าจะมาจากแหล่งกำเนิดของการไหลเวียนโลหิตหรือเกิดจากเยื่อบุผิวท่อที่เสียหาย อาจมีส่วนทำให้เกิดการบาดเจ็บที่ podocyte ใน ON เนื่องจากตำแหน่งเฉพาะในโกลเมอรูลัส ที่สำคัญ ปฏิสัมพันธ์ระหว่าง DAMPs และ TLRs แสดงให้เห็นว่ามีบทบาทสำคัญในการก่อโรคของโรคไม่ติดเชื้อ (15) สมาชิกที่แตกต่างกันของตระกูล TLR จะแสดงบนเมมเบรนพลาสมาของเซลล์หรือถุงน้ำภายในเซลล์ (22) และมีลักษณะเฉพาะเป็นเซ็นเซอร์ภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดที่จำแนก DAMP หรือ PAMP ได้อย่างมีประสิทธิภาพ เมื่อเปิดใช้งานโดย DAMP หรือ PAMP ที่เกี่ยวข้อง TLR จะปรับปรุงการแสดงออกของไซโตไคน์ดาวน์สตรีมผ่านเส้นทาง NF-kB และกระตุ้นระบบป้องกันโฮสต์ (22) นอกจากนี้ DAMPs ยังถ่ายทอดการปรากฏตัวของการบาดเจ็บของเนื้อเยื่อไปยังเซลล์ภูมิคุ้มกันหรือเซลล์ภายในท้องถิ่น และทำให้เนื้อเยื่อเสียหายรุนแรงขึ้น (23–26) ที่สำคัญ TLR ทั้งหมดกระตุ้นเส้นทาง NF-kB ที่ควบคุมการแสดงออกของยีนไซโตไคน์ที่ทำให้เกิดการอักเสบ (27) นอกจากนี้ การกระตุ้น TLR ยังส่งสัญญาณถึงเส้นทางปลายทางของพวกมันเพื่อกระตุ้น NF-kB ซึ่งมีหน้าที่ในการอักเสบและเชื่อมโยงกับการเกิดโรคของเนื้อเยื่อที่เสียหาย (28) ชิชิตาและคณะ เปิดเผยปฏิสัมพันธ์ทางพยาธิวิทยาระหว่างลิแกนด์ภายในร่างกายกับ TLR2 หรือ TLR4 ซึ่งนำไปสู่การบาดเจ็บที่สมองขาดเลือด (25) การศึกษาก่อนหน้านี้ยังแสดงให้เห็นถึงความสามารถของสมาชิกของตระกูล TLR ในการกระตุ้นให้ TIL ในไต (TLR2, 4, 5, 7 และ 11) และ GLs (TLR1–6, 8 และ 9) (17, 29–33 ). ในการศึกษานี้ เราพบการบาดเจ็บของ podocyte ในไตที่อุดตันและเป็นหลักประกัน และชี้แจง

บทบาทของสมาชิกกลุ่มต่างๆ ของตระกูล TLR ที่อาจมีส่วนทำให้เกิดการบาดเจ็บของ podocyte (15, 16, 19, 20) ในขณะที่เราตั้งสมมติฐาน การแสดงออกของไตของ Tlr8 และ Tlr9 นั้นสูงกว่าใน glomeruli ที่แยกได้จากไต UUO มากกว่าในหนูที่ได้รับการผ่าตัดหลอก นอกจากนี้ การแสดงออกของไตของไซโตไคน์ที่ทำให้เกิดการอักเสบที่เกี่ยวข้องกับวิถีทาง NF-kB รวมถึง Il1b และ Il6 นั้นสูงขึ้นในไต UUO ที่ 21 วันหลังการอุดตัน ดังนั้นเราจึงสรุปได้ว่าวิถีทาง NF-kB ที่อาศัย TLR มีบทบาทสำคัญในการก่อโรคของ GL ในไตอุดกั้น TLR8 และ TLR9 ต่างจากสมาชิกรายอื่นในตระกูล TLR ในเอ็นโดโซมของเซลล์ TLR8 รู้จัก RNA สายเดี่ยวและ RNA สองสายสั้นจากจุลินทรีย์และกระตุ้นการผลิตไซโตไคน์ที่อาศัย NF-kB หลายตัว (22) ในทางกลับกัน TLR9 จดจำ DNA ที่มีสายคู่และกระตุ้นเส้นทาง NF-kB เพื่อผลิตไซโตไคน์ที่ปลายน้ำ (16, 34) ในการศึกษานี้ เราจำเฉพาะการทำให้เป็นโคโลคัลไลเซชันของโปรตีน TLR8 ร่วมกับ PFM synaptopodin ในโกลเมอรูลี การศึกษาก่อนหน้านี้ของเรายังแสดงให้เห็นว่าทั้ง TLR8 และ TLR9 รวมกลุ่มกับ PFM และกระตุ้นการผลิตไซโตไคน์ที่อักเสบโดยอาศัย NF-kB เพื่อกระตุ้นการบาดเจ็บของ podocyte (15, 16) นอกจากนี้ การศึกษาอื่น ๆ ได้แสดงให้เห็นความสัมพันธ์ทางพยาธิวิทยาระหว่างวิถีที่อาศัย TLR และการบาดเจ็บของ podocyte ในหลอดทดลอง (34, 35) บานัสและคณะ เปิดเผยปฏิสัมพันธ์ของ TLR4 ใน podocytes กับระบบภูมิคุ้มกันระหว่างการพัฒนา GL (35) ดังนั้น โพโดไซต์อาจมีส่วนช่วยในการเฝ้าระวังภูมิคุ้มกันผ่านวิถีทางที่อาศัย TLR ในการศึกษานี้ เราแสดงให้เห็นทั้งการแสดงออกของยีน TLR8 และการแปลโปรตีนในพอดไซต์ของไตที่อุดกั้น เช่นเดียวกับการแสดงออกที่สูงขึ้นของไซโตไคน์ที่ปลายน้ำในโกลเมอรูลัส ดังนั้นเราจึงสรุปได้ว่าเส้นทางที่เป็นสื่อกลางของ TLR8-มีส่วนทำให้เกิดการพัฒนา GL ผ่านการบาดเจ็บของพอดไซต์ในไตที่อุดกั้น

การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า miR-21 ซึ่งเป็นลิแกนด์ภายในตัวของ TLR8 สามารถเอื้อมถึงและจับกับ TLR8 ในเอนโดโซมของเซลล์ ที่ซึ่งมันสามารถกระตุ้นการกระตุ้น TLR8-โดยอาศัยสื่อกลางของวิถี NFkB และการหลั่งของไซโตไคน์ที่มีการอักเสบ (21) ในการศึกษานี้ เราพบว่าระดับ miR ของไต -21 ในเลือดสูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญและระดับ miR ในไตในไต UUO สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ และแสดงให้เห็นถึงความสัมพันธ์กับการแสดงออกของไตของ Tlr8 . สิ่งที่น่าสนใจคือ glomeruli จากไต UUO ที่บำบัดด้วย miR-21 mimic แสดงการแสดงออกที่สูงกว่าของ Tlr8 และ cytokines ที่ปลายน้ำเมื่อเทียบกับไตใน glomeruli จากหนูทดลองที่บำบัดด้วย miR-21 mimic ซึ่งบ่งชี้ว่าความพร้อมของ miR ภายนอกที่เพิ่มขึ้น -21 จากเนื้อเยื่อที่เสียหายในไตที่อุดกั้นและการกระตุ้นการแสดงออกของ Tlr8 ในไต UUO ที่มากเกินไปเมื่อเปรียบเทียบกับของปลอม เมื่อรวมกันแล้ว เราสรุปได้ว่าปริมาณ miR-21 ในไตที่อุดตันสูงขึ้นไปถึงเอ็นโดโซมในพอดไซต์และกระตุ้นการกระตุ้นด้วย Tlr8-โดยอาศัยสื่อกลางของวิถี NF-kB และการหลั่งของไซโตไคน์ที่มีการอักเสบ ในทางกลับกัน cytokines เหล่านี้มีส่วนร่วมในการพัฒนา GL ผ่านการบาดเจ็บของ podocyte

IL1b เป็นหนึ่งในไซโตไคน์ปลายน้ำที่สำคัญของวิถี NF-kB ซึ่งส่วนใหญ่ผลิตโดยพอดไซต์ในโกลเมอรูลัสภายใต้สภาวะของโรค การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่า IL1b ก่อให้เกิดการบาดเจ็บของ podocyte โดยการลด PFMs (36, 37) ในการศึกษานี้ เราแสดงการแสดงออกของไตที่สูงขึ้นของ Il1b และการรวมกลุ่มของ Il1b ด้วย PFM ซึ่งแสดงการแสดงออกที่ลดลง นอกจากนี้ การแสดงออกของไตของ Il1b มีความสัมพันธ์กับ Tlr8 และมีแนวโน้มที่จะสัมพันธ์กับการแสดงออกของ PFM (Nphs1 และ Synpo) ดังนั้น ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าปัจจัยที่ปลายน้ำของ Tlr8 รวมถึง Il1b และ Il6 อาจทำให้เกิดการบาดเจ็บของ podocyte ในไตที่อุดกั้นโดยการลดการแสดงออกของ PFM

ไตที่เป็นหลักประกันของหนูยังแสดงให้เห็น GLs และการสูญเสีย PFMs ผลลัพธ์นี้ได้รับการยืนยันโดย SEM ซึ่งเผยให้เห็นการบาดเจ็บของ podocyte ในไตหลักประกัน นอกจากนี้เรายังพบระดับ miR ในซีรัมที่สูงขึ้น-21ในแบบจำลองเมาส์ ON นอกจากนี้ โปรตีน IL1b ถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นร่วมกับ PFM ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า miR ในซีรัม-21มีปฏิสัมพันธ์กับ TLR8 ใน podocytes ของไตหลักประกัน และกระตุ้นการผลิตไซโตไคน์ที่ปลายน้ำ ซึ่งจะลดการทำงานของ podocyte และการบาดเจ็บของ podocyte นอกจากนี้ยังพบอาการบาดเจ็บของ Podocyte ในไตที่ถูกกีดขวางและเป็นหลักประกันของหนูตัวเก่าผ่านกลไกที่คล้ายกับที่พบในหนูตัวเล็ก

โดยสรุป (รูปที่ 8) การแสดงออกของ glomerular miR-21 ถูกยกระดับหลังจากการอุดกั้นท่อไตข้างเดียว ที่ซึ่งมันโต้ตอบกับ TLR8 ใน podocytes และกระตุ้นการผลิตไซโตไคน์ที่ปลายน้ำ (Il1b และ Il6) ซึ่งเสนอแนะการเปิดใช้งานของวิถี NF-kB ระดับไซโตไคน์ที่สูงขึ้นจะลด PFMs ส่งผลให้เกิดการบาดเจ็บที่พอดไซต์และการพัฒนาของ GL ในภายหลัง ระดับ miR ในซีรัมที่เพิ่มขึ้น-21 กระตุ้น TLR8 ในพอดไซต์ของไตหลักประกัน และกระตุ้น GLs ผ่านการบาดเจ็บของ podocyte ดังนั้น การศึกษานี้จึงแสดงให้เห็นอย่างชัดเจนถึงการพัฒนาของ GL ในไตที่ถูกกีดขวางและยึดหลักผ่านการบาดเจ็บของ podocyte หลังจากการแสดงออกของ Tlr8 มากเกินไป