Phoenix Dactylifera L. Seed Extract มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและลดการสร้างเม็ดสี

Huey-Chun Huang1 , Shr-Shr-Shiuan Wang2, Tsang-Chi Tsai3, วังปิงโก3 และซองมินชาง2,*

เชิงนามธรรม:ความเป็นมา: ไม่เคยมีการสำรวจวิธีการทำงานของสารสกัดจากเมล็ด Phoenix dactylifera ในผลิตภัณฑ์ดูแลผิว วิธีการ: สกัดเมล็ด P. dactylifera L. โดยการสกัดด้วยคลื่นเสียงความถี่สูง กำหนดลักษณะการต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดโดย 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) และ 2,2′-azino-di-(3-ethylbenzthiazoline sulfonic acid) (ABTS plus ) การตรวจและวิธีการกำจัด ปริมาณฟีนอลิกทั้งหมด ความจุรีดิวซ์ ไอออน-คีเลชั่นของเหล็ก (II) และความสามารถในการกำจัดออกซิเจนในเซลล์รีแอคทีฟในเซลล์ (ROS) ยังถูกตรวจสอบด้วย ผลของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ต่อการสร้างเมลาโนเจเนซิสได้รับการประเมินด้วยสเปกโตรโฟโตเมตริกโดยการทดสอบกิจกรรมไทโรซิเนสของเห็ด การกำหนดกิจกรรมของไทโรซิเนสภายในเซลล์ และปริมาณเมลานิน ระดับการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสีถูกวิเคราะห์โดย Western blotting ผลลัพธ์ : ผลปรากฏว่า ป.แดกตีลิเฟรา แอล.สารสกัดจากเมล็ดมีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระที่เห็นได้ชัดและลดปริมาณ ROS ภายในเซลล์อย่างมีนัยสำคัญที่ความเข้มข้น {{0}}.245 และ 0.49 (มก./มล.) นอกจากนี้ สารสกัดยังลดการแสดงออกของตัวรับ melanocortin 1 (MC1R), microphthalmia-associated transcription factor (MITF), ไทโรซิเนส, โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส-1 (TRP1) และโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส-2 ( TRP2) และยับยั้งการสร้างเม็ดสีในเซลล์ B16F10 สรุป: ผลลัพธ์ของเราเปิดเผยว่าสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ช่วยลดการสร้างเม็ดสีในเซลล์ B16F10 โดยการปรับลดวิถีการส่งสัญญาณของโปรตีนไคเนส A (PKA) ดังนั้นสารสกัดนี้จึงสามารถใช้เป็นสารให้ผิวขาวชนิดหนึ่งในผลิตภัณฑ์บำรุงผิวได้

คำสำคัญ: ฟีนิกซ์ dactylifera;ไทโรซิเนส; เมลานิน; โรส; PKA

ซิสแทนเช่ ฟาร์มา สเปเชียลเป็นสารให้ผิวขาวชนิดหนึ่ง

1. บทนำ

สารต้านอนุมูลอิสระถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการป้องกันหรือรักษาโรคที่เกิดจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในสาขาเครื่องสำอางและโรคผิวหนัง ในช่วงสองสามทศวรรษที่ผ่านมา สารต้านอนุมูลอิสระยังถูกใช้ในอุตสาหกรรมเครื่องสำอางเพื่อป้องกันหรือชะลอการเกิดริ้วรอยของผิว มีรายงานว่าอนุมูลอิสระและชนิดออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) เกี่ยวข้องกับโรคต่างๆ เช่น โรคชราภาพและโรคที่เกี่ยวข้องกับอายุ [1] ที่น่าสนใจคือความเสียหายจากอนุมูลอิสระบนผิวหนังที่เกิดจากความเครียดจากการฉายรังสี UV และ ROS มีบทบาทสำคัญในกระบวนการสร้างภาพผิวหนัง [2,3] มีรายงานว่าสารต้านอนุมูลอิสระรบกวนกระบวนการออกซิเดชันโดยการกำจัดอนุมูลอิสระและ ROS หรือโดยการทำคีเลตโลหะที่เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาออกซิเดชัน [4] ดังนั้นจึงมีการใช้สารต้านอนุมูลอิสระหรืออาหารเสริมที่มีสารต้านอนุมูลอิสระเพิ่มขึ้นอย่างมาก เพื่อลดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันหรือความเสียหายที่เกิดจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในร่างกาย [5,6] อย่างไรก็ตาม สารต้านอนุมูลอิสระทางเคมีบางชนิด เช่น โซเดียม แอสคอร์เบต, เติร์ต-บิวทิล ไฮดรอกซีอะนิโซล (BHA), โซเดียม เอริโธเบต และ เติร์ต-บิวทิล ไฮดรอกซีโทลูอีน (BHT) ได้รับการแสดงเพื่อส่งเสริมผลการก่อมะเร็งต่อสุขภาพของมนุษย์ [7] ดังนั้น การเติบโตอย่างรวดเร็วของการศึกษาเกี่ยวกับสารต้านอนุมูลอิสระจากธรรมชาติที่ได้จากพืชจึงเกิดขึ้นในช่วงทศวรรษที่ผ่านมา ที่สำคัญพบว่าการเพิ่มขึ้นของระดับ ROS สามารถเร่งการสร้างเม็ดสีผิวได้ ในบรรดา ROS ที่ได้จาก melanocytes และ keratinocytes ไนตริกออกไซด์ NO ช่วยกระตุ้นการสังเคราะห์เมลานินโดยเพิ่มระดับการแสดงออกของโปรตีนของไทโรซิเนสและโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส 1 (TRP1) [8,9] ผลของ ROS ต่อการผลิตเมลานินได้รับการศึกษาโดยใช้สารต้านอนุมูลอิสระหลายชนิด เช่น N-acetyl cysteine ​​เพื่อยกเลิกการกระทำของฮอร์โมนกระตุ้นเมลาโนไซต์ ( -MSH) ที่เกิดจาก UVB [10]

เมลานินถูกผลิตและหลั่งโดยเมลาโนไซต์ที่กระจายอยู่ในชั้นฐานของผิวหนังชั้นนอก [11] สองขั้นตอนแรกของเส้นทางการสร้างเม็ดสีในมนุษย์คือไฮดรอกซิเลชันของ L-tyrosine กับ 3-4-dihydroxy phenylalanine (L-DOPA) และการเกิดออกซิเดชันของ L-DOPA กับ o-dopaquinone ไทโรซิเนส (EC 1.14.18.1) เป็นเอ็นไซม์จำกัดอัตราที่เร่งปฏิกิริยาสองปฏิกิริยาแรกระหว่างการสร้างเม็ดสี [12] เมลานินมีบทบาทสำคัญในการปกป้องผิวจากการทำลายของรังสีอัลตราไวโอเลตจากแสงแดด (UV) และยังทำหน้าที่ทำสีผม ผิวหนัง และดวงตาอีกด้วย มีรายงานว่าความผิดปกติทางผิวหนังต่างๆ เช่น จุดด่างอายุ ฝ้า เมลาโนเดอร์มาหลังการอักเสบ กระ และบริเวณที่เกิดการทำลายของแอคตินิก ซึ่งเป็นผลมาจากการสะสมของเมลานินที่ผิวหนังในระดับที่มากเกินไป [13] สารยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินถูกนำมาใช้มากขึ้นในผลิตภัณฑ์ดูแลผิวสำหรับการรักษาหรือป้องกันความผิดปกติของเม็ดสีผิวมากเกินไป [14,15] นอกจากนี้ มีการใช้สารต้านอนุมูลอิสระ เช่น อาร์บูติน หรือกรดโคจิก [16] ในการรักษารอยดำ [17] เมื่อเร็ว ๆ นี้เครื่องสำอางเพื่อผิวขาวมีส่วนสำคัญในผลิตภัณฑ์เครื่องสำอาง ไม่เพียงแต่ผู้หญิงที่มีผิวคล้ำเท่านั้น แต่ยังรวมถึงผู้ที่พยายามรับมือกับจุดด่างดำบนผิวที่เกิดจากแสงยูวี การตั้งครรภ์ หรืออายุที่มากขึ้นด้วยการใช้ผลิตภัณฑ์ฟอกสีผิวเหล่านี้อย่างแพร่หลาย

การสร้างเม็ดสีถูกควบคุมโดยปัจจัยหลายประการ ตัวอย่างเช่น มีการรายงานโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส-1 (TRP1), ปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับไมโครพทาลเมีย (MITF) และโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส-2 (TRP2) เพื่อควบคุมการผลิตเมลานิน [18–20 ]. ตัวรับเมลาโนคอร์ติน 1 (MC1R) ยังมีคุณสมบัติเด่นในการสังเคราะห์เมลานินที่เกิดจาก -MSH [21] มีเส้นทางการส่งสัญญาณหลายอย่างที่เกี่ยวข้องกับการผลิตเมลานิน ในบรรดาเส้นทางการส่งสัญญาณที่แตกต่างกันซึ่งควบคุมการผลิตเมลานิน การกระตุ้นโปรตีนไคเนส A (PKA) ที่เป็นสื่อกลาง AMP (cAMP) มีบทบาทสำคัญในการควบคุมการสร้างเม็ดสี [22] ในเส้นทางการส่งสัญญาณ cam-PKA ค่ายจะกระตุ้นการทำงานของ PKA [23] ซึ่งตามมาด้วยฟอสโฟรีเลชันของโปรตีนที่จับกับองค์ประกอบการตอบสนองของแคมป์ (CREB) CREB เป็นปัจจัยการถอดรหัสภายในเซลล์ที่กระตุ้นการแสดงออกของยีน microphthalmia factor (MITF) ซึ่งมีความสำคัญต่อการสร้างเม็ดสี MITF เป็นปัจจัยการถอดรหัสที่เชื่อมโยงกับบริเวณโปรโมเตอร์ของไทโรซิเนสของยีน melanogenic, TRP1 และ TRP2 ซึ่งควบคุมการแสดงออกของพวกมัน [24,25] หลังจากนั้นปริมาณเมลานินภายในเซลล์จะเพิ่มขึ้น [26] มีรายงานว่า -MSH เพิ่มระดับแคมป์และมักใช้เพื่อกระตุ้นฟอสโฟรีเลชั่นของ CREB และเพิ่มระดับโปรตีน MITF [27]

นิพจน์ MITF ถูกควบคุมโดยเส้นทางการส่งสัญญาณหลายทาง c-Jun N-terminal kinase (JNK) และ p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) เกี่ยวข้องกับการกระตุ้นการแสดงออกของ MITF และการแสดงออกของไทโรซิเนสที่เพิ่มขึ้นตามมา สัญญาณกระตุ้นไคเนสที่ตอบสนองต่อเซลล์ภายนอกเซลล์ (ERK) ยังเพิ่ม CREB phosphorylation และการแสดงออกของ MITF ที่ตามมา ซึ่งปรับการสังเคราะห์เมลานิน [28,29] ดังนั้น มีรายงานสารที่ทำให้ผิวขาวหลายตัวยับยั้งกิจกรรมการถอดรหัส MITF โดยการลดระดับการแสดงออกของโปรตีนของไทโรซิเนส, TRP1 และ TRP2 ผ่านการปรับลดของ MITF ฟอสโฟรีเลชันที่อาศัย p38MAPK นอกจากนี้ แนวทาง ERK ยังได้รับการอธิบายว่าเกี่ยวข้องกับระเบียบ MITF ในระหว่างการสร้างเมลาโนเจเนซิส [30,31] การกระตุ้น ERK phosphorylates MITF นำไปสู่การเสื่อมสภาพของ MITF ส่งผลให้ปริมาณเมลานินลดลง [32,33]

ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันอาจเป็นผลมาจากการผลิต ROS มากเกินไปหรือการป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระลดลง [1] การค้นหาและการประยุกต์ใช้สารต้านอนุมูลอิสระตามธรรมชาติยังคงเป็นประเด็นสำคัญของทีมวิจัยทั่วโลก เมื่อเร็ว ๆ นี้ มีความสนใจเพิ่มขึ้นในการวิจัยและพัฒนาไฟโตเคมิคอล เช่น สารต้านอนุมูลอิสระตามธรรมชาติและสารประกอบฟีนอลิกจากแหล่งธรรมชาติต่างๆ ซึ่งสามารถใช้เป็นอาหารเสริม เครื่องสำอางต่อต้านวัย และผลิตภัณฑ์ยาได้ [34] Phoenix dactylifera L. เป็นหนึ่งในพืชผลที่สำคัญที่ผลิตในตะวันออกกลางและแอฟริกาเหนือ [35,36] การศึกษาก่อนหน้านี้ได้รายงานว่าผลไม้ P. dactylifera L. มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ กำจัดอนุมูลอิสระ ต้านจุลชีพ และฤทธิ์ต้านการอักเสบ [37,38] สรรพคุณของ P. dactylifera L. ไม่ได้จำกัดอยู่แค่ในผลไม้เท่านั้น แต่ยังรวมถึงเมล็ดพืชด้วย ซึ่งเป็นผลพลอยได้ของผลไม้ [39,40] เนื่องจากคุณสมบัติของสารต้านอนุมูลอิสระ สารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. สามารถทำหน้าที่เป็นแหล่งของสารต้านอนุมูลอิสระที่ทำหน้าที่ต่อต้านความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน [41-43] อย่างไรก็ตาม มีการศึกษาเพียงเล็กน้อยเกี่ยวกับการใช้เมล็ด P. dactylifera L. สำหรับการพัฒนาผลิตภัณฑ์เวชสำอาง เมล็ดเหล่านี้มักจะถูกทิ้งเป็นขยะ แต่เน้นความสำคัญของพวกมันในฐานะส่วนผสมเครื่องสำอางที่ใช้งานได้จริงในที่นี้ จนถึงปัจจุบัน ยังไม่มีรายงานเกี่ยวกับกลไกการออกฤทธิ์ของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ในด้านเครื่องสำอางบำรุงผิวหรือผลกระทบของสารสกัดจากเมล็ดต่อการผลิตเมลานิน จุดเน้นของการศึกษาในปัจจุบันคือการกำหนดศักยภาพของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. เป็นตัวยับยั้งการสร้างเม็ดสีสำหรับอุตสาหกรรมเครื่องสำอาง

ยังไม่มีการศึกษากลไกที่เป็นสาเหตุของผลการยับยั้งของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ต่อการสร้างเม็ดสี จุดมุ่งหมายของการศึกษาในปัจจุบันคือเพื่อตรวจสอบคุณลักษณะของสารต้านอนุมูลอิสระและกลไกที่เป็นไปได้ของการทำงานของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ต่อการสร้างเม็ดสีโดยการตรวจสอบตัวควบคุมการถอดรหัส MITF และฟอสโฟรีเลชันของหน่วยงานกำกับดูแลของเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK และ PKA

cistanche สด

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. เคมีภัณฑ์และรีเอเจนต์

สารเคมีที่ใช้ในการศึกษานี้ซื้อมาจาก Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MS, USA) แอนติบอดีมาจากซานตาครูซไบโอเทค (ซานตาครูซ แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) และรีเอเจนต์ ECL มาจากเมอร์ค (บิลเลริกา แมสซาชูเซตส์ สหรัฐอเมริกา)

2.2. การเตรียมและการสกัด P. dactylifera Seed Extract

ผลไม้แห้ง P. dactylifera L. เก็บเกี่ยวใน 2019 จากร้านค้าแบบดั้งเดิมที่ตั้งอยู่ในเมืองเมดินา ประเทศซาอุดีอาระเบีย เมล็ด P. dactylifera L. ถูกล้างจนหมด ตากแดด ตากให้แห้งในอากาศเป็นเวลาหนึ่งวัน และจากนั้นทำให้แห้งที่ 80 ◦C เป็นเวลา 2 ชั่วโมงในเตาอบ เมล็ดที่แห้งแล้วถูกบดให้เป็นผงละเอียด (#50 mesh) ด้วยโรงสีที่มุ่งมั่น (Retsch Ultra Centrifugal Mill and Sieving Machine, Type ZM1, Haan, Germany) เก็บผงไว้ในขวดแก้วที่ปิดสนิทและเก็บไว้ที่ 25 ◦C จนกว่าจะใช้ ผงเมล็ด P. dactylifera L. ที่ผึ่งให้แห้งเป็นผง (2 กรัม) ถูกใส่ลงในบีกเกอร์สกัดที่มีน้ำกลั่น 10 มล. ถัดไป ทำการสกัดด้วยอัลตราโซนิกด้วยรุ่น ULTRAsonicTM 57H (250 W, C และ A Sales Industrial Supplies, Yucaipa, CA, USA) ความถี่ในการทำงานคือ 45 kHz เป็นเวลา 30 นาที หลังจากการสกัด ตัวอย่างถูกหมุนเหวี่ยงที่ 4500 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 50 นาทีที่ 25 ◦C ด้วยเครื่องหมุนเหวี่ยง Eppendorf 5810 R (ฮัมบูร์ก เยอรมนี) ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกรวบรวมและกรองด้วยตัวกรองไนลอน (ขนาดรูพรุน: 0.45 ไมโครเมตร) และสิ่งกรองถูกทำให้เข้มข้นถึง 9.8 มก./มล.

2.3. การวิเคราะห์โครมาโตกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง (UPLC) ของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera และกรด Ferulic

วิเคราะห์สารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera โดยใช้คลาส ACQUITY UPLC H กับเครื่องตรวจจับอาร์เรย์โฟโตไดโอด (Waters, Milford, MA, USA) คอลัมน์คือคอลัมน์ ACQUITY UPLC BEH C18, 130 Å, 1.7 μm, 2.1 มม. × 100 มม. เฟสเคลื่อนที่ A คือกรดอะซิติก 0.5 เปอร์เซ็นต์ และเฟสเคลื่อนที่ B คือ อะซีโตไนไทรล์ สำหรับจุดเวลา 0 และ 5 นาที อัตราร้อยละของ A/B คือ 95/5; เป็นเวลา 20 นาที อัตราร้อยละของ A/B คือ 5/95 สำหรับเวลาที่ 21 และ 25 นาที อัตราส่วนเปอร์เซ็นต์ของ A/B คือ 95/5 ใช้กรดเฟรูลิก (1 ppm) เป็นมาตรฐานเชิงบวก

2.4. การทดสอบกิจกรรมการกวาดล้าง DPPH

ในการสอบวิเคราะห์นี้ วิตามินซี ({{0}}.5 มก./มล.) และ BHA (0.1 มก./มล.) ถูกใช้เป็นมาตรฐานการต้านอนุมูลอิสระ สารสกัดเมล็ด P. dactylifera L. ที่ความเข้มข้นต่างๆ (0.0049, 0.0245 และ 0.049 มก./มล.) ถูกเติมลงในสารละลาย DPPH (60 ไมโครโมลาร์) 2.9 มล. สารต้านอนุมูลอิสระในสารสกัดจากเมล็ดสามารถบริจาคไฮโดรเจนให้กับ DPPH และเปลี่ยน DPPH ให้อยู่ในรูปที่ลดลงได้ ผลการดูดกลืนแสงที่ลดลงที่ 517 นาโนเมตรถูกบันทึกโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ UV-Vis [44]

2.5. ABTS บวก การทดสอบความสามารถในการเก็บขยะ

เปรียบเทียบความสามารถในการกำจัด ABTS บวกกับสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. กับวิตามินซี ({{0}}.9 มก./มล.) และ BHA ({{10}} 9 มก./มล.) สำหรับการทดสอบนี้ ใช้ ABTS plus แคชั่นถูกผลิตขึ้นครั้งแรกโดยทำปฏิกิริยากับสารละลายของ ABTS (7 mM) กับโพแทสเซียม เพอร์ซัลเฟต (2.45 mM) และปล่อยให้ส่วนผสมอยู่ในที่มืดเป็นเวลาอย่างน้อย 6 ชั่วโมงก่อนใช้งาน การดูดกลืนแสงที่ 734 นาโนเมตรถูกวัด 10 นาทีหลังจากผสมความเข้มข้นที่แตกต่างกันของสารสกัดเมล็ด (0.0098, 0.049 และ 0.098 มก./มล.) กับสารละลาย ABTS บวก 1 มล. [45]

2.6. การกำหนดปริมาณฟีนอลิกทั้งหมด

ปริมาณฟีนอลิกทั้งหมดถูกกำหนดโดยใช้รีเอเจนต์ Folin–Ciocalteu [46] และกรดแกลลิก (2 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ถูกใช้เป็นมาตรฐานเชิงบวก ความเข้มข้นที่แตกต่างกันของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. (0.0196, 0.098 และ 0.196 มก./มล.) ถูกเตรียมในเมทานอล 80 เปอร์เซ็นต์; สารสกัด 100 ไมโครลิตรถูกถ่ายโอนไปยังหลอดทดลองและ 0.5 มิลลิลิตรของสารทำปฏิกิริยา Folin–Ciocalteu (ที่เจือจางก่อนหน้านี้ 10-เท่าด้วยน้ำที่ปราศจากไอออน) ถูกเติมและผสม ของผสมถูกปล่อยให้ยืนที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที; 1.5 มล. ของโซเดียม คาร์บอเนต 20 เปอร์เซ็นต์ ถูกเติม หลังจากยืนที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมง จะอ่านค่าการดูดกลืนแสงที่ 760 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ UV–Vis

2.7. การกำหนดกำลังการผลิตที่ลดลง

วิตามินซี ({{0}}.008 มก./มล.) หรือ BHA (4.8 มก./มล.) ถูกใช้เป็นมาตรฐานเชิงบวกในการสอบวิเคราะห์นี้ ความสามารถในการลดลงของสารสกัดจากเมล็ดถูกกำหนดตามวิธีการที่อธิบายโดย Oyaizu [47] ความเข้มข้นต่างๆ ของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. (0.0073, 0.036, 0.073 มก./มล.) ถูกผสมกับบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (2.5 มล., 0.2 โมลาร์, pH 6.6 ) และโพแทสเซียมเฟอริไซยาไนด์ [K3Fe (CN)6] (2.5 มล., 1 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนัก) ของผสมถูกบ่มที่ 50 ◦C เป็นเวลา 20 นาที กรดไตรคลอโรอะซิติก (2.5 มล., 10 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนัก/ปริมาตร) ถูกเติมลงในของผสม, ซึ่งจากนั้นถูกหมุนเหวี่ยงที่ 1000× ก. เป็นเวลา 10 นาที ชั้นบนของสารละลาย (2.5 มล.) ถูกผสมกับน้ำกลั่น (2.5 มล.) และ FeCl3 (0.5 มล., 0.1 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนัก/ปริมาตร) และวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 700 นาโนเมตร

2.8. การวัดความจุของคีเลตไอออนของเหล็ก (II)

สำหรับการวัดค่า Fe2 plus -ion chelating capacity of P. dactylifera L. seed extract, EDTA (0.02, 0.04 และ { {10}}.08 มก./มล.) ถูกใช้เป็นมาตรฐานเชิงบวก ความเข้มข้นที่แตกต่างกันของสารสกัดเมล็ด (0.0196, 0.098 และ 0.196 มก./มล.) ถูกเติมลงในสารละลาย FeCl2 (0.05 มล., 1 มิลลิโมลาร์) ของผสมของปฏิกิริยาถูกทำปฏิกิริยากับเฟอร์โรซีน (0.1 มล., 1 มิลลิโมลาร์) จากนั้นของผสมถูกหาปริมาณเป็น 1 มล. ด้วยเมทานอลและบ่มที่ 25 ◦ซ เป็นเวลา 10 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงของของผสมปฏิกิริยาที่ 562 นาโนเมตร [48]

2.9. การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์

การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์ดำเนินการโดยใช้วิธี MTT [49] เซลล์สัมผัสกับความเข้มข้นต่างๆ ของสารสกัดเมล็ด P. dactylifera L. (0.049, 0.245 และ 0.49 มก./มล.) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 37 ◦C และ CO2 5 เปอร์เซ็นต์ในตู้อบที่มีความชื้นและเติมสารละลาย MTT ลงในหลุม อนุพันธ์ที่ไม่ละลายน้ำของ MTT ถูกละลายด้วยเอธานอล-DMSO (สารละลายผสม 1:1) วัดค่าการดูดกลืนแสงของหลุมที่ 570 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท เซลล์ B16F10 (BCRC60031) ได้มาจากศูนย์รวบรวมและวิจัยทรัพยากรชีวภาพ (BCRC) เมืองซินจู๋ ประเทศไต้หวัน เซลล์เหล่านี้ได้รับการดูแลใน DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA) ที่เสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์และยาปฏิชีวนะ 1 เปอร์เซ็นต์ นอกจากนี้ ผลของเมล็ด P. dactylifera L. ต่อความมีชีวิตของเซลล์ B16F10 ยังได้รับการประเมินโดยวิธีทดสอบการแยกสีน้ำเงินของทริปแพน หลังจากการบำบัดด้วยสารสกัดจากเมล็ดพืช เซลล์ถูกทริปซิไนซ์และหมุนเหวี่ยงเพื่อรวบรวมเม็ด เม็ดเซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ในตัวกลางเพาะเลี้ยงเซลล์ DMEM 300 ไมโครลิตร สารแขวนลอยของเซลล์จำนวนเล็กน้อย (20 ไมโครลิตร) ถูกผสมเบาๆ กับทริปแพนบลู 10 ไมโครลิตร (4 เปอร์เซ็นต์ใน PBS) จำนวนเซลล์ถูกนับ (เซลล์ที่ไม่มีชีวิตเป็นเซลล์สีน้ำเงินและเซลล์มีชีวิตที่ไม่มีการย้อมสี) โดยใช้ฮีโมไซโตมิเตอร์ใต้กล้องจุลทรรศน์

2.10. การวัดฤทธิ์ของเห็ดไทโรซิเนส

สารละลายเห็ดไทโรซิเนส (10 ไมโครลิตร, 200 หน่วย) ถูกเติมลงในไมโครเพลท 96-หลุม ของผสมปฏิกิริยาประกอบด้วย L-DOPA 5 มิลลิโมลาร์ที่ละลายในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) (50 มิลลิโมลาร์, pH 6.8) และสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. (0.049, 0.245 และ 0.49 มก./มล.), กรดโคจิก (200 มิลลิโมลาร์; 0.03 มก./มล.) หรืออาร์บูติน (2 มิลลิโมลาร์; 0.54 มก./มล.) ของผสมการสอบวิเคราะห์ถูกบ่มที่ 37 ◦C เป็นเวลา 30 นาที และการดูดกลืนแสงของโดปาโครมที่ผลิตขึ้นถูกวัดที่ 490 นาโนเมตร การวัดฤทธิ์ของไทโรซิเนสของเห็ดดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [50]

2.11. การกำหนดปริมาณเมลานิน

เซลล์ B16F10 ถูกบำบัดด้วย -MSH (100 นาโนโมลาร์) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และจากนั้นบำบัดด้วยสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. (0.0245–0.147 มก./มล.) หรืออาร์บูติน (0.54 มก./มล.) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงเพิ่มเติม หลังการบำบัด เม็ดเซลล์ถูกละลายในสารละลาย NaOH (1 N) ที่ 60 ◦C เป็นเวลา 60 นาที ปริมาณเมลานินตรวจพบที่ 405 นาโนเมตร ตามที่ Tsuboi [51] อธิบายไว้ก่อนหน้านี้

Cistanche ยับยั้งการผลิตเมลานิน

2.12. การวัดกิจกรรมไทโรซิเนสภายในเซลล์

กิจกรรมของไทโรซิเนสภายในเซลล์ถูกกำหนดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [52] เซลล์ถูกบำบัดด้วย -MSH (100 นาโนโมลาร์) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และจากนั้นด้วยสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. (00245–0.147 มก. /มล.) หรืออาร์บูติน (0.54 มก./มล.) เป็นเวลา 24 ชม. หลังการบำบัด สารสกัดเซลล์ (100 ไมโครลิตร) ถูกผสมกับสารละลาย L-DOPA ที่เตรียมใหม่ (0.1 เปอร์เซ็นต์ใน PBS) และบ่มที่ 37 ◦C และวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 490 นาโนเมตร

2.13. การทดลองซับแบบตะวันตก

เซลล์ถูกบำบัดด้วยสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ({{0}}.0245, 0.0368, 0.{ {14}}49 และ 0.147 มก./มล.) หรืออาร์บูติน (0.54 มก./มล.) แล้วไลซ์ใน PBS ที่มี nondiet P—40 (1 เปอร์เซ็นต์ ), โซเดียม ดีออกซีโคเลต (0.5 เปอร์เซ็นต์ ), โซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต (SDS, 0.1 เปอร์เซ็นต์ ), aprotinin (5 ug/mL), phenylmethylsulfonyl fluoride (100 ug/mL), pepstatin A (1 ug/mL) และ EDTA (1 mM) ที่ 4 ◦C เป็นเวลา 20 นาที ไลเซททั้งหมดถูกหาปริมาณโดยใช้ชุดไมโคร BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) โปรตีน (30 ไมโครกรัม) ได้รับการแก้ไขโดยอิเล็กโตรโฟรีซิสแบบเจล SDS-โพลีอะคริลาไมด์และถ่ายโอนอิเล็กโตรโฟเรติกไปยังเมมเบรนโพลีไวนิลลิดีนฟลูออไรด์ เมมเบรนถูกบล็อกในนมปราศจากไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์ใน PBST (PBS ที่มีทวีน 0.05 เปอร์เซ็นต์-20) และฟักที่อุณหภูมิ 4 ◦C ในชั่วข้ามคืนด้วยแอนติบอดีหลักต่อไปนี้เจือจางใน PBST: MITF Ab (1:1000), TRP1 Ab (1:6000), TRP2 Ab (1:1000), MC1R Ab (1:500), GAPDH Ab (1:1500), tyrosinase Ab (1:2000), p-p38 Ab (1:500), p38 Ab (1:500), p-JNK Ab (1:500), JNK Ab (1:500), p-ERK Ab (1:500), ERK Ab (1:500), p-CERB Ab (1: 500) และ CERB Ab (1:200) ทั้งหมดจาก Santa Cruz Biotech (Dallas, TX, USA)) แอนติบอดีที่ถูกผูกไว้ถูกตรวจพบโดยแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตจากพืชชนิดหนึ่ง peroxidase (Amersham Corp.) ตามด้วยระบบตรวจจับ ECL (Amersham) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต

2.14. การทดสอบสารยับยั้ง PKA

เซลล์ถูกบำบัดด้วย -MSH (100 นาโนโมลาร์) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงตามด้วยการเติม 10 ไมโครโมลาร์ของตัวควบคุม PKA H89 เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังการรักษา สารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. (0.147 มก./มล.) และ H89 ถูกเติมไปยังเซลล์และบ่มเป็นเวลาเพิ่มเติม 23 ชั่วโมง ปริมาณเมลานินถูกกำหนดตามที่อธิบายไว้ข้างต้น

2.15. การวิเคราะห์ทางสถิติ

การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้การทดสอบเฉพาะกิจของ Tukey ซึ่งใช้สำหรับการเปรียบเทียบข้อมูลที่วัดได้ โดยใช้ Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) เวอร์ชัน 220 ซอฟต์แวร์ทางสถิติ (SPSS Inc., Chicago, IL, สหรัฐอเมริกา). * p < 005="" ถือว่ามีนัยสำคัญ="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p=""><>

3. ผลลัพธ์

3.1. การวิเคราะห์ UPLC ของ P. dactylifera L. Seed Extract

ผลการวิเคราะห์ UPLC ถูกแสดงไว้ในรูปที่ 1A, B. รูปที่ 1A วาดให้เห็นจุดสูงสุดที่ทับซ้อนกันของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. และกรด ferulic ที่ 330 นาโนเมตร รูปที่ 1B แสดงสเปกตรัมการสแกนที่คล้ายกันระหว่าง 220 ถึง 500 นาโนเมตรสำหรับสารสกัดเมล็ด P. dactylifera L. และกรด ferulic

3.2. ลักษณะการต้านอนุมูลอิสระของ P. dactylifera L. Seed Extract

ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ในหลอดทดลอง เผยให้เห็นถึงศักยภาพในการต้านอนุมูลอิสระ ในการทดสอบ DPPH วิตามินซี ({{0}}.05 mM; 0.53 mg/mL) และ tert-butyl hydroxyanisole (BHA) (0 .1 มก./มล.) ใช้เป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่เป็นมาตรฐาน ความสามารถในการกำจัด DPPH ของสารสกัดคือ 49.97 ± 2.9 เปอร์เซ็นต์ , 81.36 ± 0.56 เปอร์เซ็นต์ และ 78.53 ± 3.83 เปอร์เซ็นต์ของตัวควบคุมสำหรับความเข้มข้นของสารสกัด 0.0{{ 31}}49, 0.0245 และ 0.049 (มก./มล.) ตามลำดับ ในการเปรียบเทียบ ความสามารถในการกำจัดของวิตามินซีและ BHA เท่ากับ 90.12 ± 0.31 เปอร์เซ็นต์ และ 90.44 ± 0.49 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ (รูปที่ 2A)

ไอออนอนุมูลอิสระของ ABTS นี้มีสีฟ้าและมีปฏิกิริยาต่อสารต้านอนุมูลอิสระส่วนใหญ่ ในระหว่างปฏิกิริยานี้ ไอออนอนุมูลอิสระของ ABTS สีฟ้าจะถูกแปลงกลับเป็นรูปแบบที่เป็นกลางไม่มีสี ปฏิกิริยาถูกเฝ้าติดตามด้วยสเปกโตรโฟโตเมตริก ความสามารถในการกำจัดของ ABTS บวกกับสารสกัดคือ 5.69 ± 1.36 เปอร์เซ็นต์ , 18.81 ± 0.68 เปอร์เซ็นต์ และ 66.82 ± 8.51 เปอร์เซ็นต์ของสารควบคุมที่ความเข้มข้น 0.0{{16 }}98, 0.{{20}}49 และ 0.098 มก./มล. ตามลำดับ ในทางตรงกันข้าม ABTS บวกกับความสามารถในการกำจัดของวิตามินซี (0.9 มก./มล.) และ BHA (0.9 มก./มล.) เท่ากับ 95.52 ± 0.12 เปอร์เซ็นต์ และ 40.3 ± 0.83 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ ผลลัพธ์ในรูปที่ 2B บ่งชี้ว่าสารสกัดจากเมล็ดพืชกำจัด ABTS บวกอนุมูลในปริมาณที่มีนัยสำคัญ

เพื่อตรวจสอบปริมาณฟีนอลิกทั้งหมดของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. กรดแกลลิก (2 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ถูกใช้เป็นมาตรฐานเชิงบวก ผลลัพธ์ในรูปที่ 2C ระบุว่าเนื้อหาฟีนอลทั้งหมดใน 0.0196, 0.{{20}}98 และ 0 196 (มิลลิกรัม/มิลลิลิตร) ของสารสกัดคือ 33.43 ± 2.33 เปอร์เซ็นต์ , 117.22 ± 7.81 เปอร์เซ็นต์ และ 195.4 ± 10.91 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ ค่าเทียบเท่ากรดแกลลิก (GAE) ของความเข้มข้นดังกล่าวของสารสกัดจากเมล็ดคือ 0.068 ± 0.01, 0.365 ± 0.01 และ 0.642 ± 0.03 ตามลำดับ (รูปที่ 2C)

3.3. ผลการยับยั้งของ P. dactylifera L. Seed Extract ต่อการสร้างเม็ดสี

ผลลัพธ์ที่แสดงในรูปที่ 4A แสดงให้เห็นว่า 0.049 มก./มล. ของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L.ไม่ออกฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนสในเห็ด ในทางกลับกัน เปอร์เซ็นต์การยับยั้งเอนไซม์เท่ากับ 8.34 ± 2.67 เปอร์เซ็นต์ และ 33 ± 2.36 เปอร์เซ็นต์ของกลุ่มควบคุมสำหรับ 0.245 และ 0.49 มก./มล.สารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ตามลำดับ นอกจากนี้ เปอร์เซ็นต์การยับยั้งไทโรซิเนสของกรดโคจิก (200 μM; 0.03 มก./มล.) และอาร์บูติน (2 mM; 0.54 มก./มล. ) คือ 56.26 ± 5.06 เปอร์เซ็นต์ และ 64.56 ± 2.88 เปอร์เซ็นต์ของกลุ่มควบคุม ตามลำดับ (รูปที่ 4A) ดังนั้น ความเข้มข้นที่สูงขึ้นของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. (0.245 และ 0.49 มก./มล.) อาจแสดงถึงระดับการยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ด

ในรูปที่ 4B ผลลัพธ์ระบุว่ามีเพียง 0.147 มก./มล. ของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. เท่านั้นที่สามารถลดปริมาณเมลานินในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16F10 ได้อย่างมีนัยสำคัญ หลังการรักษา ปริมาณเมลานินในเซลล์ B16F10 คือ 80.66 ± 5.43 เปอร์เซ็นต์ของกลุ่มควบคุม สำหรับมาตรฐานเชิงบวก อาร์บูติน (0.54 มก./มล.) ปริมาณเมลานินภายในเซลล์ที่เหลือคือ 61.19 ± 8.17 เปอร์เซ็นต์ของสารควบคุม ผลการวิจัยพบว่าสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. 0.147 มก./มล. มีผลน้อยกว่าอาร์บูติน ค่ากิจกรรมไทโรซิเนสภายในเซลล์ที่เหลือเท่ากับ 85.1 ± 8.1 เปอร์เซ็นต์ และ 73.7 ± 11.9 เปอร์เซ็นต์ สำหรับสารสกัดเมล็ด P. dactylifera L. 0.098 และ 0.147 มก./มล. ตามลำดับ กิจกรรมของไทโรซิเนสภายในเซลล์ที่เหลือคือ 64.3 ± 14.9 เปอร์เซ็นต์ของกลุ่มควบคุมหลังจากที่เซลล์ถูกบำบัดด้วยอาร์บูติน (รูปที่ 4C) ผลการวิจัยพบว่าความเข้มข้นที่สูงขึ้นของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ยังคงมีผลยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสที่เกิดจาก -MSH ในเซลล์ B16F10 น้อยกว่าอาร์บูติน

3.4. P. dactylifera L. seed Extract ยับยั้งระดับการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสีเมลานิน

Western blots ถูกใช้เพื่อตรวจสอบระดับการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสีในเซลล์ B16F10 (รูปที่ 5A) ผลการวิจัยพบว่าการรักษาด้วยสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ที่ความเข้มข้นต่างๆ ทำให้ระดับ MC1R, MITF, tyrosinase, TRP1 และ TRP2 ลดลง ผลการยับยั้งของสารสกัดต่อการแสดงออกของโปรตีนมีความชัดเจนที่ความเข้มข้น {{0}}.147 มก./มล. การเปลี่ยนแปลงเท่าของระดับการแสดงออกของโปรตีนสำหรับ MC1R คือ 0.74 ± 0.02; สำหรับ MITF คือ {{20}}.51 ± 0.03; สำหรับไทโรซิเนสคือ 0.54 ± 0.26; สำหรับ TRP-1 คือ 0.57 ± 0.15; และสำหรับ TRP-2 คือ 0.49 ± 0.1 (รูปที่ 5B)

ระดับการแสดงออกของโปรตีนการส่งสัญญาณที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสีถูกตรวจสอบโดยใช้ Western blots (รูปที่ 5C) ผลการวิจัยระบุว่า 0.147 มก./มล. ของการรักษาด้วยสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ทำให้ระดับ p-p38, p-JNK, p-ERK และ p-CREB ลดลง การเปลี่ยนแปลงเท่าของระดับการแสดงออกของโปรตีนสำหรับ p-p38 คือ 0.88 ± 0.15; สำหรับ p-JNK คือ 0.68 ± 0.39; สำหรับ p-ERK คือ 0.65 ± 0.23; และสำหรับ p-CREB มันคือ 0.44 ± 0.07 (รูปที่ 5D)

3.5. P. dactylifera L. Seed Extract ไม่มีผลต่อ Tyrosinase, TRP1, TRP2 หรือ MITF Gene Expression

ระดับการแสดงออกของยีนของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสี เช่น tyrosinase, TRP1, TRP2 และ MITF ถูกตรวจสอบโดยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (RT-PCR) ระดับการแสดงออกที่เป็นมาตรฐานสัมพัทธ์ของไทโรซิเนส/GAPDH สำหรับ 0.0367, 0.049 และ 0.147 มก./มล. ของ P การบำบัดด้วยสารสกัดจากเมล็ด dactylifera L. มีค่า 3.51 ± 0.52, 2.38 ± 0.24 และ 1.64 ± 0.55 ตามลำดับ สำหรับ TRP-1/GAPDH ระดับนิพจน์ที่ทำให้เป็นมาตรฐานสัมพัทธ์สำหรับ 0.0367, 0.049 และ {{4{{43} }}}.147 มก./มล. ของการบำบัดด้วยสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. คือ 1.64 ± 0.2, 1.15 ± 0.02 และ 0 89 ± 007 ตามลำดับ ระดับการแสดงออกที่เป็นมาตรฐานสัมพัทธ์ของ TRP-2/GAPDH สำหรับ 0.0367, 0.049 และ 0.147 มก. /มล. ของสารสกัดเมล็ด P. dactylifera L. คือ 1.08 ± 0.13, 0.85 ± 0.01 และ 0.7 ± 0.05 ตามลำดับ สำหรับ MITF/GAPDH ระดับการแสดงออกที่เป็นมาตรฐานสัมพัทธ์สำหรับ 0.0367, 0.049 และ 0.147 มก./มล. ของการบำบัดด้วยสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. คือ 1.48 ± 0.19, 1.03 ± 0.02 และ 0.74 ± 0.05 ตามลำดับ (รูปที่ 6)

4. การอภิปราย

มีรายงานว่าการสร้างเมลาโนเจเนซิสเพิ่มความเครียดจากการเกิดออกซิเดชันของเซลล์ นอกจากนี้ สารต้านอนุมูลอิสระหลายชนิด สารกำจัด ROS สารยับยั้งสารยับยั้ง และสารยับยั้ง อาจยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินที่อาศัยรังสี UV [54] ดังนั้น สารต้านอนุมูลอิสระ สารกำจัด ROS และสารยับยั้งการสร้างเม็ดสีจึงถูกนำมาใช้มากขึ้นในเครื่องสำอางที่ทำให้ผิวขาวขึ้นเพื่อป้องกันรอยดำที่ไม่พึงประสงค์ของผิวหนัง [14] นอกจากนี้ยังพบว่าการกระตุ้นของ metallothionein ซึ่งเป็นสารต้านอนุมูลอิสระภายในร่างกายสามารถยับยั้งการสร้างเม็ดสีในเมลาโนไซต์ได้ [55] ผิวหนังของมนุษย์มักสัมผัสกับสารมลพิษที่ออกซิไดซ์จากสิ่งแวดล้อมหรือแสงยูวี และได้รับความเสียหายจากปัจจัยแวดล้อมภายนอก โดยเฉพาะอย่างยิ่ง รายงานการฉายรังสี UV ได้กระตุ้นให้เกิดการสร้าง ROS ในผิวหนังและส่งเสริมการเกิด lipid peroxidation ของเยื่อหุ้มเซลล์ [56] เพื่อต่อต้านความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ผิวได้รับการติดตั้งระบบต้านอนุมูลอิสระโดยเฉพาะ [57]

เพื่อชี้แจงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L., DPPH และ ABTS บวกกับกิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระ, ปริมาณฟีนอลิกทั้งหมด, ความจุในการลด และความสามารถในการคีเลตไอออนของโลหะของสารสกัดถูกกำหนดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [47,48] สารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระอย่างมากในการศึกษาเชิงวิเคราะห์ทั้งหมดที่กล่าวมา ผลการศึกษาแสดงให้เห็นถึงศักยภาพในการต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ในช่วงต่างๆ โดยมีประสิทธิภาพที่แตกต่างกัน ฤทธิ์ในการขจัด DPPH ของสารสกัดจากเมล็ดถูกแสดงไว้ในรูปที่ 2A แตกต่างจากของ ABTS บวกที่แสดงในรูปที่ 2B ซึ่งอาจเป็นผลมาจากกลไกต่างๆ ของปฏิกิริยาต่อสารต้านอนุมูลอิสระและอนุมูลอิสระ นอกจากนี้ ปริมาณสัมพันธ์ของปฏิกิริยาระหว่างส่วนประกอบต้านอนุมูลอิสระในสารสกัดจากเมล็ดอาจแตกต่างกันไป ซึ่งส่งผลให้ความสามารถในการกำจัดอนุมูลอิสระแตกต่างกัน [58] สารต้านอนุมูลอิสระที่มีศักยภาพในสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. สามารถแปลงสารเชิงซ้อน Fe3 plus /ferricyanide ให้อยู่ในรูปแบบเหล็ก และความสามารถในการลดทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดจากเมล็ดที่แสดงในรูปที่ 2D พบว่ากรดโคจิก [59] ทำหน้าที่เป็นตัวยับยั้งไทโรซิเนสเนื่องจากกรดโคจิกทำหน้าที่เป็นตัวคีเลเตอร์โลหะเพื่อคีเลตไอออนของทองแดงและยับยั้งไอออนเหล่านั้นที่เข้าสู่ไซต์ที่ทำงานของไทโรซิเนส ดังนั้น สารต้านอนุมูลอิสระในสารสกัดจากเมล็ดพืชอาจก่อตัวเป็นสารประกอบเชิงซ้อนของโลหะที่ไม่ละลายน้ำกับไอออนของเหล็ก แล้วยับยั้งปฏิกิริยาระหว่างไอออนของโลหะกับลิพิด ความสามารถในการคีเลตของโลหะไอออนที่สูงขึ้นของสารสกัดจากเมล็ดบ่งชี้ถึงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่อาจเกิดขึ้นและผลในการยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนส (รูปที่ 2E)

หลักการของการทดสอบ ROS ภายในเซลล์คือ DCFH-DA แพร่กระจายผ่านเยื่อหุ้มเซลล์และถูกไฮโดรไลซ์ด้วยเอนไซม์เป็น DCFH โดยเอสเทอเรส จากนั้น DCFH จะทำปฏิกิริยากับ ROS (เช่น H2O2) เพื่อให้เกิด DCF การเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วของ DCF บ่งชี้ถึงการเกิดออกซิเดชันของ DCFH โดยอนุมูลภายในเซลล์ [60] แนวคิดเบื้องหลังการค้นหาสารต้านอนุมูลอิสระแบบใหม่สำหรับกิจกรรมการฟอกสีผิวนั้นอยู่ในสมมติฐานที่ว่าความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่เกิดจากการฉายรังสี UV อาจมีส่วนช่วยกระตุ้นการสังเคราะห์เมลานิน มีรายงานการฉายรังสี UV เพื่อสร้าง ROS ในเนื้อเยื่อผิวหนังที่อาจกระตุ้นการผลิตเมลานินโดยการกระตุ้นไทโรซิเนส [61] นอกจากนี้ มีรายงานว่าสารฟอกสีผิวหลายชนิดสามารถยับยั้งการสร้างเม็ดสีโดยทำปฏิกิริยากับไอออนของทองแดงที่บริเวณที่ทำงานของไทโรซิเนสหรือกับโอ-ควิโนนเพื่อขัดขวางการเกิดพอลิเมอไรเซชันของตัวกลางในวิถีการสังเคราะห์เมลานิน [62] นอกจากนี้ วิตามินซีหรือวิตามินอีสามารถลดการเกิดออกซิเดชันของอนุภาคเมลานินที่มีอยู่ก่อนได้ ดังนั้น วิตามินเหล่านี้จึงถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในผลิตภัณฑ์เพื่อผิวขาว [63] ที่น่าสนใจ ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นถึงคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ซึ่งบ่งชี้ว่าสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. สามารถทำหน้าที่เป็นส่วนผสมในการทำให้ผิวขาวในเครื่องสำอาง

การทดสอบ MTT เป็นการทดสอบสีที่รู้จักกันดีซึ่งวัดการทำงานของเอนไซม์ออกซิโดเรดักเตสที่ขึ้นกับ NADH/NADPH ของเซลล์ ซึ่งลด MTT เป็นสีย้อมฟอร์มาซานสีม่วง การทดสอบนี้สามารถนำไปใช้เพื่อตรวจสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ที่อาจเกิดขึ้นของสารยาและวัสดุที่เป็นพิษ เนื่องจากสารเหล่านี้เพิ่มหรือยับยั้งความมีชีวิตของเซลล์ ผลลัพธ์ที่แสดงในรูปที่ 3A เป็นไปตามการทดสอบการแยกตัวของ Trypan blue ในรูปที่ 3B ซึ่งบ่งชี้ว่าสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ไม่มีผลต่อความมีชีวิตของเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16F10

ไทโรซิเนสจากเห็ดมักใช้เป็นเอนไซม์เป้าหมายในการตรวจคัดกรองสารยับยั้งการสร้างเมลาโนเจเนซิสที่อาจเกิดขึ้นได้ พบครั้งแรกว่าช่วงการให้ยา ({{0}}.049–0.49 มก./มล.) ของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. สามารถยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสเห็ด ผลลัพธ์ที่แสดงในรูปที่ 4A ระบุว่าสารสกัดจากเมล็ดมีผลยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสของเห็ดน้อยกว่ากรดโคจิก ไทโรซิเนสมีบทบาทสำคัญในสองขั้นตอนแรกของเส้นทางการสร้างเม็ดสี เพื่อชี้แจงผลการยับยั้งที่แท้จริงของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ต่อการผลิตเมลานิน จึงมีการกำหนดปริมาณเมลานิน B16F10 และกิจกรรมของไทโรซิเนสภายในเซลล์ ผลลัพธ์ที่นำเสนอในรูปที่ 4B บ่งชี้ว่าความเข้มข้นที่สูงขึ้นของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. มีผลในการยับยั้งการสร้างเมลานินอย่างชัดเจน ข้อมูลแสดงให้เห็นว่าสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. สามารถยับยั้งการสร้างเม็ดสีในเซลล์มะเร็งผิวหนังได้อย่างแท้จริง ด้วยเหตุนี้ ผลลัพธ์ที่แสดงไว้ในรูปที่ 4C จึงเป็นไปตามผลลัพธ์ที่แสดงไว้ในรูปที่ 4B ในการทดลองเซลล์ดังกล่าว -MSH ถูกใช้เป็นตัวกระตุ้นเพื่อกระตุ้นการสังเคราะห์เมลานิน -MSH ได้รับรายงานเพื่อจับตัวรับ melanocortin 1 (MC1R) และกระตุ้นอะดีนิเลตไซคเลสภายในเซลล์ ซึ่งจะกระตุ้น ATP ไปที่แคมป์และกระตุ้น PKA ที่ขึ้นกับแคมป์ ผลลัพธ์ในรูปที่ 5A เปิดเผยว่าสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ยับยั้งการแสดงออกของ MC1R ดังนั้นจึงขัดขวางการผลิตเมลานินที่เหนี่ยวนำโดย -MSH ซึ่งเป็นสื่อกลางในการปรับค่า cAMP ของเซลล์ นอกจากนี้ วิถีการส่งสัญญาณ PKA ที่เป็นสื่อกลางของแคมป์ถูกปิดใช้งานและยับยั้งการสร้างเม็ดสี เพื่อยืนยันการอนุมาน เราได้ทำการทดลองสารยับยั้ง PKA และข้อมูลที่แสดงในรูปที่ 4D ระบุผลการยับยั้งของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. (0.147 มก./มล.) ต่อการสร้างเม็ดสีในเซลล์ B16F10 ถูกระงับโดย H{{ 24}}การรักษา H89 (N-[2-p-bromocinnamylamino-ethyl]-5-isoquinolinesulphonamide) เป็นตัวยับยั้งการคัดเลือกและมีศักยภาพของ PKA ผลการวิจัยระบุว่าการส่งสัญญาณ PKA ที่เป็นสื่อกลางในแคมป์ได้รับผลกระทบจากสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L.

Tyrosinase, TRP1 และ TRP2 เป็นเอนไซม์หลักสามตัวที่ควบคุมการสังเคราะห์เมลานินในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม [64] นอกจากนี้ MITF ยังเป็นตัวควบคุมการถอดรหัสที่สำคัญของ tyrosinase, TRP1 และ TRP2 และเป็นตัวควบคุมที่สำคัญที่สุดของการสร้างเม็ดสีเมลาโนไซต์ [65] ผลลัพธ์ในรูปที่ 5A ระบุว่าสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ลดระดับการแสดงออกของโปรตีนของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสี ยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนส และลดปริมาณเมลานินในเซลล์ B16F10

ในการศึกษานี้ สารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ยับยั้ง CREB phosphorylation และการกระตุ้น PKA ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าวิถีของ cAMP-PKA อาจเป็นสาเหตุของการต่อต้านการสร้างเม็ดสีที่เกิดจากสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. (รูปที่ 5C)

มีการรายงาน MAPK เพื่อปรับการสร้างเม็ดสี [66] ตระกูล MAPK ประกอบด้วยไคเนสโปรตีนสามประเภท รวมถึงไคเนสที่ตอบสนองต่อเซลล์ภายนอก (ERK), ไคเนสที่ปลาย c-Jun N (JNK) และ p38 MAPK p38 MAPK สามารถกระตุ้นโปรตีนที่จับกับองค์ประกอบการตอบสนองของแคมป์ (CREB และ CREB กระตุ้นการแสดงออกของ MITF ซึ่งมีส่วนช่วยในการสังเคราะห์เมลานินในทางบวก [67] ผลลัพธ์ในรูปที่ 5C ให้หลักฐานว่าสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. สามารถยับยั้ง CREB, ในทางกลับกัน JNK และ p38 จะยับยั้งการแสดงออกของ MITF (รูปที่ 5A) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า dactylifera L. ฤทธิ์ต้านการเกิดมะเร็งที่เกิดจากเมล็ดพืชอาจเป็นสื่อกลางโดยการปรับลดวิถีทางของ PKA นอกจากนี้ ยังมีรายงานว่ามีการฉายรังสี UV ด้วย มีลักษณะเด่นชัดในการเริ่มต้นของความผิดปกติของผิวหนังหลายอย่าง รวมถึงการขูดขีด รอยย่น และรอยดำ [68] ผลการวิจัยชี้ให้เห็นว่าสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ลดการผลิตเมลานินซึ่งอาจเกิดจากการพร่องของ ROS ภายในเซลล์

เพื่อประเมินผลของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ต่อการผลิตเมลานินของเซลล์ เราได้กำหนดระดับ mRNA ในเซลล์ B16F10 ที่บำบัดด้วย -MSH และสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. เซลล์ที่บำบัดด้วย -MSH แสดงระดับที่เพิ่มขึ้นของ MITF, ไทโรซิเนส, TRP-1 และ TRP-2 ตามที่คาดไว้ ที่น่าสนใจคือ เซลล์ที่บำบัดด้วยสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. แสดงการลดลงของการแสดงออกของ mRNA ของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสีเหล่านี้ อย่างไรก็ตาม ไม่มีความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติระหว่างคอลัมน์ ซึ่งบ่งชี้ว่าสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ไม่ส่งผลต่อระดับการแสดงออกของยีนของ MITF ไทโรซิเนส TRP1 และ TRP2

นี่คือผลิตภัณฑ์ของเรา

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม กรุณาคลิกที่นี่

มีรายงานว่ากรดฟีนอลิกที่สำคัญที่พบในเมล็ด P. dactylifera L. คือกรด ferulic [69] กรด Ferulic แสดงให้เห็นแล้วว่าสามารถยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16 เมลาโนมาได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยการยับยั้งเคซีนไคเนส 2-ที่เหนี่ยวนำให้เกิดฟอสโฟรีเลชั่นของไทโรซิเนสในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา [70] รายงานเหล่านี้สนับสนุนผลลัพธ์ของเราที่แสดงในรูปที่ 1—กรด ferulic ในสารสกัดจากน้ำของเมล็ด P. dactylifera L. มีส่วนในการยับยั้งการสร้างเม็ดสีในเซลล์ B16F10 แน่นอนว่าควรมีการตรวจสอบส่วนประกอบการทำงานอื่นๆ ในสารสกัดจากเมล็ดในอนาคตอันใกล้นี้

ผลลัพธ์ของเราระบุว่าสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ยับยั้งการสร้างเม็ดสีในเซลล์ B16F10 โดยการปรับลดวิถีการส่งสัญญาณ PKA ดังนั้นสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. จึงสามารถใช้เป็นสารฟอกสีผิวได้อย่างมีประสิทธิภาพ

5. สรุปผลการวิจัย

นี่เป็นรายงานฉบับแรกเกี่ยวกับกลไกการออกฤทธิ์ของสารสกัดน้ำจากเมล็ด P. dactylifera L. ในการสังเคราะห์เมลานิน การศึกษานี้แสดงให้เห็นการมีส่วนร่วมของวิถี cAMP/PKA/CREB ในผลการขจัดเม็ดสีของสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ผลลัพธ์ของเราระบุว่าสารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. ยับยั้งการสร้างเม็ดสีในเซลล์ B16F10 โดยการปรับลดเส้นทางการส่งสัญญาณ PKA ดังนั้น สารสกัดจากเมล็ด P. dactylifera L. จึงสามารถใช้เป็นสารต้านการเกิดมะเร็งผิวหนังที่แปลกใหม่และสารฟอกสีผิวที่มีประสิทธิภาพ