Phenylethanol Glycosides จาก Herba Cistanche ปรับปรุงสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก Hypoxic และเพิ่มผลกระทบของ Oxaliplatin ผ่านเส้นทางการส่งสัญญาณ HIF‑1

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

LIMEI WEN, JUNPING HU, JIAWEI ZHANG และ JIANHUA YANG

เชิงนามธรรม.

มะเร็งตับเป็นเนื้องอกชนิดร้ายแรงชนิดหนึ่งที่พบได้บ่อยที่สุด และมีลักษณะเป็นเนื้อร้ายสูง การลุกลามอย่างรวดเร็ว การเจ็บป่วยสูงและอัตราการเสียชีวิต มีรายงานว่า Oxaliplatin (OXA) มีประสิทธิภาพในการต่อต้านมะเร็งตับระยะลุกลามที่มีความเป็นพิษที่ยอมรับได้ ในเนื้องอกที่เป็นก้อน สภาวะแวดล้อมจุลภาคที่ขาดออกซิเจนจะส่งเสริมการเปลี่ยนแปลงของเยื่อบุผิว-มีเซนไคม์ (EMT) ซึ่งสามารถชักนำการดื้อยาของมะเร็งตับต่อยาแพลตตินัมได้ เฮอร์บาCistanche (Cistanche tubulosa) ถูกนำมาใช้บ่อยในการแพทย์แผนจีนและฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์จากเฮอร์บาCistanche(CPhG) เป็นส่วนประกอบสำคัญ การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาผลของ CPhG ต่อความมีชีวิต การตายของเซลล์ การย้ายถิ่น และการบุกรุกของเซลล์มะเร็งตับ เซลล์มะเร็งตับ HepG2 ถูกแบ่งออกเป็นกลุ่มควบคุม, DMSO, CoCl2, OXA, OXA บวก CoCl2 และ CPhGs บวกกับกลุ่ม OXA บวก CoCl2 ต่อมา ได้ทำการวิเคราะห์ PCR เชิงปริมาณย้อนกลับและการวิเคราะห์ western blot เพื่อกำหนดระดับการแสดงออกของปัจจัยที่ก่อให้เกิดภาวะขาดออกซิเจน 1 (HIF‑1 ), lysyl oxidase‑like 2 (LOXL2) และยีนและโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ EMT (เช่น E ‑cadherin and Twist) เพื่อตรวจสอบผลกระทบของ CPhG ต่อมะเร็งตับ ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่า CPhG สามารถเพิ่มประสิทธิภาพของ OXA ต่อมะเร็งตับ และยับยั้งการย้ายถิ่น การบุกรุก และอัตราการตายของเซลล์มะเร็งตับ นอกจากนี้ การรักษาด้วย CPhG ยังชักนำให้เกิดการปรับลด HIF‑1 , LOXL2 และ Twist และการปรับ E-cadherin อย่างมีประสิทธิภาพ การค้นพบนี้บ่งชี้ว่า CPhG กระตุ้นความไวต่อ OXA ที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญและการปราบปราม EMT ที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนในตับ

ประโยชน์ cistanche: ต่อต้านมะเร็งตับ

บทนำ

Liver cancer is a malignant tumor that usually involves the digestive system, and consists of primary and secondary types. Primary liver cancer is divided into hepatocellular carcinoma and intrahepatic cholangiocarcinoma (1,2). Notably, liver cancer is associated with a high incidence and mortality rate worldwide (3). According to the World Health Organization, it is predicted that there will be >1,000,000 การเสียชีวิตที่เกี่ยวข้องกับมะเร็งตับภายในปี 2030 และจากผู้ป่วยที่ได้รับการยืนยันใหม่ ผู้ที่อยู่ในจีนแผ่นดินใหญ่จะมีสัดส่วน 46.6 เปอร์เซ็นต์

มีรายงานว่า Oxaliplatin (OXA) มีฤทธิ์ยับยั้งการเจริญเติบโตของมะเร็งตับที่มีความเป็นพิษที่ยอมรับได้ในการตั้งค่าทางคลินิก อย่างไรก็ตาม ประสิทธิภาพโดยรวมของการบำบัดด้วยยาที่ใช้แพลตตินัมถูกขัดขวางโดยความต้านทานของเซลล์เนื้องอก (4) เป็นที่ทราบกันดีว่ามะเร็งตับมีความไวต่อเคมีบำบัดต่ำกว่าเมื่อเทียบกับมะเร็งชนิดอื่น การดื้อยาหลายชนิดของมะเร็งตับมีส่วนทำให้ดื้อต่อยารักษาโรคหลายชนิด (5) ในการศึกษาก่อนหน้านี้ Xie และ Zhong (6) รายงานว่าเซลล์ HepG2 มีความไวต่ำต่อ adriamycin, 5-fluorouracil และ cisplatin ภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน แม้ว่าข้อเท็จจริงที่ว่ายาเคมีบำบัดที่ใช้แพลตตินัมจะเป็นทางเลือกในการรักษาโรคมะเร็งที่สำคัญ แต่ผู้ป่วยยังมีการดื้อต่อยาเหล่านี้ นอกจากนี้ การพยากรณ์โรคของผู้ป่วยมะเร็งตับยังคงไม่ดี (7,8) จนถึงปัจจุบัน มีความพยายามอย่างมากในการตรวจสอบการดื้อยาและปรับปรุงความไวของยาในผู้ป่วยมะเร็งตับ

ภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน การเกิดหลอดเลือดใหม่จะเกิดขึ้นในเซลล์มะเร็ง ซึ่งสามารถนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงของเยื่อบุผิว-มีเซนไคม์ (EMT) และการเลียนแบบของหลอดเลือด (VM) EMT และ VM อาจส่งเสริมการบุกรุกและการแพร่กระจายระยะไกลในภายหลัง นอกจากนี้ ยังมีการคาดการณ์ว่า EMT จะทำหน้าที่เป็นแรงผลักดันให้เกิดการลุกลามของมะเร็ง (9) นอกจากนี้ ปัจจัยกระตุ้นการขาดออกซิเจน (HIF) ยังเกี่ยวข้องกับการสร้างเส้นเลือดใหม่ เมแทบอลิซึมของพลังงาน การเพิ่มจำนวนของเซลล์ การบุกรุก และการแพร่กระจาย (10)

โปรตีน Lysyl oxidase (LOX)‑like 2 (LOXL2) เป็นสมาชิกของตระกูล LOX และมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการเชื่อมโยงข้ามโควาเลนต์ของคอลลาเจนและอีลาสติน ซึ่งอาจส่งผลให้เกิดพังผืดและมีความสำคัญต่อความสมบูรณ์ของเมทริกซ์นอกเซลล์ ( 11). ในการศึกษาก่อนหน้านี้ LOXL2 ถือว่ามีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับการแพร่กระจายของเซลล์มะเร็ง (12) นอกจากนี้ LOXL2 ยังแสดงการปรับการก่อโรคและการลุกลามของมะเร็งชนิดร้ายแรงหลายชนิดผ่านทางเส้นทางภายนอกและภายในเซลล์ ซึ่งเป็นดัชนีที่สำคัญสำหรับการประเมินการพยากรณ์โรคที่ไม่ดี (13,14)Herba Cistancheเป็นสมุนไพรโทนิคที่กระจายอยู่ทั่วไปในพื้นที่ทะเลทราย ซึ่งมักใช้ในยาจีนโบราณ (15,16)Cistanche tubulosa(ซี. ทูบูโลซ่า)เป็นยาสมุนไพรธรรมชาติที่ปลูกในเขตปกครองตนเองซินเจียง phenylethanoid glycosides จาก Herba Cistanche (CPhGs) ทำหน้าที่เป็นส่วนประกอบสำคัญของ Herba Cistanche ก่อนหน้านี้ Hu et al (17) ระบุว่า CPhG สามารถลดอาการบาดเจ็บที่ตับในหนูที่มีเนื้องอก H22 และยับยั้งการเติบโตของเซลล์มะเร็ง มีข้อเสนอแนะว่ากลไกพื้นฐานอาจเกี่ยวข้องกับการลดลงของ ‑fetoprotein ในซีรัม และสามารถเพิ่มภูมิคุ้มกันในหนูทดลองได้

ในการศึกษานี้ แบบจำลองภาวะขาดออกซิเจนของเซลล์มะเร็งตับ HepG2 ถูกเหนี่ยวนำโดยใช้ CoCl2 บนพื้นฐานนี้ การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบผลกระทบของ OXA ต่อการเพิ่มจำนวน การตายของเซลล์ การย้ายถิ่น และการบุกรุกของเซลล์มะเร็งต่อหน้า CPhG ภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน นอกจากนี้ ยังตรวจพบระดับการแสดงออกของ mRNA และโปรตีนของ HIF‑1 , LOXL2, E‑cadherin และ Twist นอกจากนี้ ยังได้ตรวจสอบกลไกที่แน่นอนที่เป็นรากฐานของผลกระทบของ CPhG ต่อการเกิดโรคของมะเร็งตับ

ประโยชน์ของสารสกัด cistanche รักษามะเร็งตับ

วัสดุและวิธีการ

สายเซลล์. สายเซลล์มะเร็งตับ HepG2 ตามที่ระบุโดยใช้วิธี STR จัดทำโดยสถาบันวิจัยทางคลินิก โรงพยาบาลในเครือแห่งแรกของมหาวิทยาลัยการแพทย์ซินเจียง (อุรุมชี ประเทศจีน) เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงใน DMEM กลูโคสสูง (HyClone; Cytiva) ที่มีซีรัมของวัวในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (FBS; Hyclone; Cytiva) ที่อุณหภูมิ 37˚C ในตู้ฟักที่มีคาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์

Preparation of CPhGs. C. tubulosa extraction (CPhGs) was obtained from Hetian Dichen Biotech Co., Ltd.. The content of CPhGs was >80 เปอร์เซ็นต์ โดยมี echinacoside และ verbascose เท่ากับ 44.5 และ 16.1 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ เก็บลำต้นของ C. tubulosa (Schrenk) Wight ในเดือนตุลาคม 2016 จากซินเจียง ประเทศจีน พืชถูกระบุโดยดร. จุนผิงหู ตัวอย่างบัตรกำนัลเหล่านี้ทั้งหมด (หมายเลข 201610) ได้ฝากไว้ที่ Plant Herbarium, School of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Xinjiang, China

การออกแบบทดลอง เซลล์ HepG2 (5x104/มล.) ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นต่างๆ ของ CPhG (5, 25, 50, 100, 200 และ 500 ไมโครกรัม/มล.) เป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่ 37˚C (24 ชั่วโมงหลังจากการเพาะเมล็ด) เพื่อคัดกรองปริมาณ CPhGs‑L/M/H เซลล์ HepG2 (5x104/มล.) ถูกแบ่งออกเป็นกลุ่มต่อไปนี้: i) กลุ่มควบคุม เพาะเลี้ยงใน DMEM กลูโคสสูง; ii) กลุ่ม DMSO เพาะเลี้ยงใน DMSO 0.1 เปอร์เซ็นต์ (v/v); iii) กลุ่ม CoCl2 (กลุ่มแบบจำลองภาวะขาดออกซิเจน) เพาะเลี้ยงใน DMEM ที่ปราศจากซีรัมที่มี CoCl2 100 ไมโครโมลาร์; iv) OXA

กลุ่ม (กลุ่มควบคุมเชิงบวก) เพาะเลี้ยงใน 5 µM OXA (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.); v) กลุ่ม OXA บวก CoCl2, เพาะเลี้ยงใน 5 µM OXA รวมกับ 100 µM CoCl2; และ vi) กลุ่ม CPhGs ที่บำบัดด้วย CPhGs‑L/M/H (25, 50 และ 100 µg/ml ตามลำดับ) รวมกับ 5 µM OXA และ 100 µM CoCl2

การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์ ความมีชีวิตของเซลล์ถูกกำหนดโดยใช้การทดสอบ Cell Counting Kit‑8 (CCK‑8) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) และตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (18) เซลล์ (2.0x103 เซลล์/หลุม) ถูกเพาะในเพลต 96 หลุม ต่อมา ~24 ชั่วโมงหลังจากการเพาะ เซลล์ถูกบำบัดเป็นเวลา 48 ชั่วโมงตามสภาวะการบำบัดในแต่ละกลุ่ม จากนั้นสื่อถูกแทนที่ด้วย DMEM กลูโคสสูง 100 ไมโครลิตร ตามด้วยการเติมรีเอเจนต์ CCK‑8 10 ไมโครลิตร เซลล์ถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่37˚C วัดความหนาแน่นของแสงโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทแบบตรวจจับหลายตัว (Thermo Fisher Scientific, Inc.) ที่ 450 นาโนเมตร มีการเตรียมการทำซ้ำหกครั้งสำหรับแต่ละเงื่อนไข

การกำหนดอัตราการตายของเซลล์ อัตราการตายของเซลล์กำหนดโดยใช้ Annexin V/PI Apoptotic Detection Kit (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) เซลล์ HepG2 (5x105) ถูกเพาะเลี้ยงในจาน 6 หลุมที่ 37˚C ใน CO2 5 เปอร์เซ็นต์ ต่อมา ~24 ชั่วโมงหลังการรักษา เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงใน DMEM ที่ปราศจากซีรัมเป็นเวลา 4 ชั่วโมง จากนั้นเซลล์จะถูกย่อยโดยใช้ทริปซิไนซ์ 0.25 เปอร์เซ็นต์ (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) ตามด้วยการล้างอย่างน้อยสามครั้งด้วย PBS ที่ระบายความร้อนล่วงหน้า เมื่อหมุนเหวี่ยงที่ 167.7 xg เป็นเวลา 5 นาทีที่ 4˚C เซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ด้วยบัฟเฟอร์การจับ 1X และปรับความเข้มข้นเป็น 1~5x106/มล. จากนั้นย้อมด้วย Annexin V‑FITC 5 µl และ PI 5 µl เป็นเวลา 15 นาที ที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นเซลล์จะได้รับโฟลว์ไซโตเมทรีโดยใช้เครื่องวัดการไหลของ BD LSRFortessa (BD Biosciences) และ FlowJo

ซอฟต์แวร์ 10.6.2 (Tree Star, Inc.)

การทดสอบการรักษาบาดแผล ผลการยับยั้งของ CPhG ต่อการย้ายเซลล์ถูกตรวจสอบโดยการทดสอบการรักษาบาดแผล (19) เซลล์ถูกเพาะลงในเพลต 6 หลุมจนกระทั่งได้รับโมโนเลเยอร์ที่ไหลมารวมกัน 100 เปอร์เซ็นต์ ต่อจากนั้น เซลล์ได้รับบาดเจ็บโดยใช้ปิเปตทิปขนาด 200 ไมโครลิตร ล้างด้วย PBS และบ่มด้วยการบำบัดในตัวกลางที่ปราศจากซีรั่ม หลังจากการรักษาด้วยยา ความเร็วของการรักษาบาดแผลจะถูกวัดที่ 0, 12, 24 และ 48 h ตามลำดับ ได้ภาพบาดแผลโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (Nikon Ti‑S, Japan) ภายใต้กำลังขยาย x10 การปิดแผลวัดโดยระยะห่างของแผลในแต่ละช่วงและแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของระยะห่างของแผลเริ่มต้นที่ 0 ชั่วโมง

การตรวจทรานส์เวลล์ การบุกรุกของเซลล์ถูกประเมินโดยการวิเคราะห์ของทรานส์เวลล์ เซลล์ (1x105 เซลล์/มล.) ถูกแขวนลอยใน DMEM กลูโคสสูง 200 ไมโครลิตรโดยไม่มี FBS จากนั้นเซลล์ถูกเพาะลงบนหลุมบนที่เคลือบด้วย Matrigel ที่หุ้มด้วยเมมเบรนกรองพอลิเอทิลีนเทเรฟทาเลต (ขนาดรูพรุน 8.0 µm) DMEM กลูโคสสูง 500 ไมโครลิตรทั้งหมดที่มี FBS 10 เปอร์เซ็นต์วางอยู่ในห้องด้านล่าง ใช้สำลีพันก้านเพื่อขจัดเซลล์บนพื้นผิวด้านบนของตัวกรองหลังจาก 48 ชั่วโมงที่ 37˚C เซลล์ที่บุกรุกผ่านเมมเบรนได้รับการแก้ไขด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 30 นาที ต่อจากนั้น เซลล์ถูกย้อมด้วยคริสตัลไวโอเล็ต 0.1 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ที่บุกรุกถูกตรวจพบภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (Nikon Ti‑S) ด้วยกำลังขยาย x100

การถอดรหัส PCR เชิงปริมาณย้อนกลับ (RT‑qPCR) RNA ทั้งหมดถูกสกัดจากเซลล์ HepG2 โดยใช้รีเอเจนต์ TRIzol® (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) และทำการสังเคราะห์ cDNA โดยใช้ชุดรีเอเจนต์ PrimeScript RT (Takara Bio, Inc.) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต qPCR ดำเนินการบนระบบ 7500 Real‑Time PCR (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) โดยใช้ TB green™ Premix Ex Taq™ (Takara Bio, Inc.) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ qPCR แสดงอยู่ในตารางที่ 1 สภาวะ PCR ประกอบด้วยการเสื่อมสภาพที่95˚C เป็นเวลา 30 วินาที ตามด้วย 40 รอบของการเปลี่ยนสภาพที่95˚C เป็นเวลา 5 วินาที และการหลอมที่อุณหภูมิ 60˚C เป็นเวลา 30 วินาที สุดท้าย วิเคราะห์ผลการขยายสัญญาณโดยใช้วิธี2‑ΔΔCq (20)

การวิเคราะห์ blot แบบตะวันตก โปรตีนถูกสกัดจากเซลล์ที่บำบัดเป็นเวลา 48 ชั่วโมงโดยการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์ RIPA lysis buffer (Thermo Fisher Scientific, Inc.) ที่มีสารยับยั้งโปรตีเอสและฟอสฟาเตส ปริมาณโปรตีนของเซลล์ถูกกำหนดหาโดยใช้วิธี BCA จากนั้นโปรตีน (40 ไมโครกรัม) ถูกแยกโดย SDS‑PAGE บนเจล 10 เปอร์เซ็นต์และถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF เมมเบรนถูกปิดกั้นในนมที่ไม่มีไขมันร้อยละ 5 เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4˚C และฟักด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิต่อไปนี้: ‑actin (1:5,000; cat. no. bs‑0061R; BIOSS), HIF -1 (1:1,000; cat. no. ab179483; Abcam), LOXL2 (1:500; cat. no. ab179810; Abcam), E‑cadherin (1:1,000 ; cat. no. bs‑10009R; BIOSS) และ Twist1 (1:500; cat. no. bs‑2441R; BIOSS) ค้างคืนที่อุณหภูมิ 4˚C จากนั้น เมมเบรนถูกบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิ IgG H&L ที่ต้านกระต่ายของแพะ (1:2,000; cat. no. ab205718; Abcam) เป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้างด้วย TBS‑0.05 เปอร์เซ็นต์ Tween‑20 แล้ว จะเห็นรอยเปื้อนโดยใช้ระบบ Enhanced Chemiluminescence (Amersham; Cytiva) ความเข้มสัมพัทธ์ของแถบความถี่ถูกวัดกึ่งเชิงปริมาณโดยการวิเคราะห์ densitometric โดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ2x (เวอร์ชัน 2.1.4.7; Rawak Software Inc.) และแผนภาพวัดความหนาแน่นของผลลัพธ์ได้รับการปรับให้เป็นมาตรฐานตามความเข้มข้นของ ‑actin

การวิเคราะห์ทางสถิติ. ซอฟต์แวร์ SPSS 19.0 (SPSS, Inc.) ถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูล ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน และวิเคราะห์โดย ANOVA แบบทางเดียว ตามด้วยการทดสอบ post hoc ของ Tukey พี<0.05 was="">ถือว่าบ่งชี้ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติ การทดลองทั้งหมดดำเนินการอย่างน้อยสามเท่า

ผลลัพธ์

ผลของ CPhG ต่อความมีชีวิตของเซลล์ เซลล์ HepG2 ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นต่างๆ ของ CPhG (5, 25, 50, 100, 200 และ 500 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง (24 ชั่วโมงหลังจากการเพาะเมล็ด) ดังแสดงในรูปที่ 1 ความอยู่รอดของเซลล์ที่บำบัดด้วย CPhG 200 และ 500 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (P<0.05). these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" could="" modulate="" cell="" viability="" in="" a="" dose‑dependent="">

CPhG ช่วยเพิ่มผลของ OXA ต่อมะเร็งตับ ผลของ CPhG ต่อความมีชีวิตของเซลล์ HepG2 ที่มอดูเลตด้วย OXA ได้รับการประเมินในภายหลัง (รูปที่ 2) หลังจาก ~ 48 ชั่วโมง การรวมกันของ CPhG และ OXA จะลดความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์ HepG2 ลงอย่างมากเมื่อเทียบกับใน OXA plusกลุ่ม CoCl2 โดยเฉพาะ CPhGs‑M บวก OXA บวก CoCl2 และ CPhGs‑H บวก OXA บวก CoCl2 ยับยั้งการมีชีวิตของเซลล์ HepG2 อย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับในกลุ่ม OXA plus CoCl2 (P<0.05 and=""><0.01,>

CPhGs ยับยั้งการย้ายถิ่นและการบุกรุกของเซลล์มะเร็งตับ เพื่อศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับศักยภาพในการแพร่กระจายและความสามารถในการเคลื่อนย้ายของเซลล์มะเร็งตับหลังการรักษาด้วย CPhGs และ OXA ได้ทำการทดสอบการรักษาบาดแผลและการตรวจ Transwell การทดสอบการรักษาบาดแผลระบุว่า เมื่อเทียบกับในกลุ่ม DMSO การย้ายถิ่นของเซลล์ HepG2 ลดลงหลังการรักษาด้วย CoCl2, OXA และ CPhG (200 หรือ 500 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) (P<0.05; fig.="" 3a="" and="" b).="" for="" the="" transwell="" assay,="" the="" invasive="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="" inhibited="" in="" the="" co-treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2)="" compared="" with="" that="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 3c="" and="" d).="" conversely,="" in="" the="" co‑treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2),="" the="" invasive="" potential="" and="" migratory="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="">

ผลของ CPhG และ OXA ต่อการตายของเซลล์ หลังการรักษาด้วยการใช้ CPhG และ OXA for . ร่วมกัน

48 ชั่วโมง, เซลล์ HepG2 ถูกย้อมด้วย Annexin V‑FITC และ PI ตามด้วยโฟลว์ไซโตเมทรีเพื่อกำหนดหาการตายของเซลล์ ดังแสดงในรูปที่ 4A กลุ่มการรักษาร่วม (CPhGs‑L/M/H บวก OXA บวก CoCl2) แสดงการยกระดับในสัดส่วนของเซลล์ apoptotic ที่มีความเข้มข้นของ CPhG เพิ่มขึ้น เซลล์ส่วนใหญ่ที่บำบัดด้วย CPhG และ OXA ได้รับการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นในภูมิภาค Q4 ซึ่งบ่งชี้ว่าการรวมกันของ CPhG และ OXA ทำให้เกิดการตายของเซลล์ในระยะแรก เมื่อเทียบกับในกลุ่ม OXA บวก CoCl2 พบว่ามีการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในอัตรา apoptotic ของเซลล์ในกลุ่มที่ได้รับ OXA, CoCl2 และ CPhG ในปริมาณปานกลางหรือสูง (P<0.01; fig.="" 4b).="" these="" findings="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" oxa="" and="" cphgs="" may="" contribute="" to="" the="" apoptosis="" of="" hepg2="">

mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist following CPhGs and OXA co‑incubation. There were no statistical differences in the mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist between the control and DMSO groups (P>0.05; รูปที่ 5A‑D) ในทางกลับกัน CoCl2 ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในระดับการแสดงออกของ mRNA ของ LOXL2, HIF‑1 และ Twist เมื่อเทียบกับระดับใน DMSOกลุ่ม (ป<0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group,="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" loxl2,="" hif‑1α="" and="" twist="" were="" significantly="" enhanced="" in="" the="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups=""><0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" by="" contrast,="" cocl2="" induced="" a="" significant="" downregulation="" in="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" dmso="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" all="" concentrations="" of="" cphgs="" combined="" with="" oxa="" and="" cocl2="" were="" able="" to="" upregulate="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" these="" results="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" cphgs="" and="" oxa="" effectively="" inhibited="" the="" emt="" under="" hypoxic="">

ระดับการแสดงออกของโปรตีน HIF‑1 , LOXL2, E‑cadherin และ Twist หลังจาก CPhGs และ OXA ร่วมฟักไข่ ผลลัพธ์ของ Western blotting เปิดเผยว่าระดับการแสดงออกของโปรตีนของ HIF‑1 , LOXL2 และ Twist ได้รับการควบคุมภายใต้สภาวะขาดออกซิเจนเมื่อเทียบกับระดับในกลุ่ม DMSO ตรงกันข้าม,

ระดับการแสดงออกของโปรตีนของ E-cadherin ถูกปรับลดลงภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน (P<0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" notably,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" hif‑1α,="" loxl2,="" and="" twist="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" cphgs‑m="" +="" oxa="" +="" cocl2="" or="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" compared="" with="" dmso="" group,="" cocl2="" treatment="" significantly="" decreased="" the="" expression="" level="" of="" e‑cadherin.="" in="" the="" cphgs="" groups,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6b).="" these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" treatment="" could="" effectively="" inhibit="" the="" downregulation="" of="" e‑cadherin,="" and="" the="" upregulation="" of="" hif‑1α,="" loxl2="" and="" twist="" induced="" by="">

การอภิปราย

ภาวะขาดออกซิเจนเป็นลักษณะทั่วไปในสภาพแวดล้อมจุลภาคของมะเร็ง นี้ส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับความจริงที่ว่าการแพร่กระจายของเซลล์มะเร็งนั้นเร็วกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับการสร้างหลอดเลือดของนีโอเวสเซลที่ผิดปกติ นอกจากนี้ กระบวนการทางชีววิทยาอื่น ๆ รวมถึงการเพิ่มจำนวน การแพร่กระจาย และความไวต่อยาได้รับผลกระทบจากการขาดออกซิเจน (21) สภาวะแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกขาดออกซิเจนมีความสำคัญต่อการเกิดโรคและการลุกลามของมะเร็ง และยังมีความสำคัญในการดื้อยาและการเกิดหลอดเลือดของมะเร็งตับ (22)

ในการศึกษานี้ เซลล์ HepG2 ได้รับการบำบัดด้วย CPhG ที่มีความเข้มข้นต่างๆ โดยที่ CPhG (200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) อาจทำให้ความมีชีวิตของเซลล์ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง CPhG สามารถปรับเปลี่ยนความมีชีวิตของเซลล์ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา ภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน การรวมกันของ OXA และ CPhG (50 หรือ 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ยับยั้งการมีชีวิตของเซลล์ HepG2 อย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับการรักษาด้วย OXA เพียงอย่างเดียว แนวโน้มที่ขึ้นกับขนาดยาที่คล้ายคลึงกันถูกสังเกตพบในการตรวจการย้ายถิ่นและการบุกรุกของเซลล์มะเร็งตับ ในปัจจุบัน มีการศึกษาอย่างกว้างขวางเพื่อตรวจสอบบทบาทของการตายของเซลล์มะเร็งในการเกิดโรคของตับ (23‑26) มีการพัฒนากลยุทธ์หลายอย่างในการรักษามะเร็งตับโดยส่งเสริมการตายของเซลล์ (27-29); ดังนั้นการรบกวนใน

การตายของเซลล์ HepG2 อาจทำหน้าที่เป็นตัวเลือกที่มีแนวโน้มในการป้องกันและรักษามะเร็งตับ การตายของเซลล์ HepG2 ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการรักษาด้วยการรวมกันของ CPhGs‑M/-H และ OXA เมื่อเทียบกับเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วย OXA เพียงอย่างเดียว ดังนั้นจึงบ่งชี้ว่า CPhG สามารถเพิ่มประสิทธิภาพการต่อต้านเนื้องอกของ OXA ได้อย่างมีนัยสำคัญ

HIF-1 สามารถเพิ่มระดับการแสดงออกของ E-cadherin, N-cadherin และ Vimentin ตลอดจนปัจจัยการถอดรหัสบางอย่าง เช่น Snail1/2, Zeb1 และ Twist1 ต่อจากนั้น อาจนำไปสู่การสูญเสียขั้วของเซลล์ การคลายการเชื่อมต่อของเซลล์-เซลล์ การเปลี่ยนแปลงของโปรตีนในโครงร่าง การย้ายและการบุกรุกของเซลล์มะเร็ง ซึ่งอาจส่งผลให้มีการเคลื่อนย้ายเซลล์มะเร็งไปยังระบบไหลเวียนโลหิตผ่านเยื่อบาซิลาร์ และการแพร่กระจายที่ตามมา (30) ในการศึกษานี้ CoCl2 ถูกใช้เพื่อกระตุ้นแบบจำลองของภาวะขาดออกซิเจน ซึ่งกระตุ้นความมีชีวิตของเซลล์ HepG2 ที่เพิ่มขึ้น ตลอดจนการย้ายและการบุกรุกของเซลล์ นอกจากนี้ mRNA และระดับการแสดงออกของโปรตีนของ HIF‑1 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งบ่งชี้ว่า CoCl2 เหนี่ยวนำให้เกิดการสร้าง

สภาพแวดล้อมขนาดเล็กที่เป็นพิษ การรักษาด้วยการรวมกันของ CPhG และ OXA ยับยั้ง mRNA และระดับการแสดงออกของโปรตีนของ HIF‑1 ที่เกิดจากการขาดออกซิเจนอย่างเห็นได้ชัด การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่า CPhG สามารถลดสภาวะแวดล้อมจุลภาคของมะเร็งตับในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา

E‑cadherin เป็นโมเลกุลการยึดเกาะที่ขึ้นกับ Ca2 plus ซึ่งมีบทบาทสำคัญในการยึดเกาะของเซลล์เซลล์ การรักษาความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อและการส่งสัญญาณ ในกรณีของการปรับลดหรือสูญเสียฟังก์ชันการยึดเกาะ เซลล์มะเร็งอาจแสดงการเพิ่มจำนวนและการแยกความแตกต่างที่ไม่สามารถควบคุมได้ ซึ่งอาจส่งเสริมการบุกรุกที่เพิ่มขึ้นของเซลล์มะเร็งและการแพร่กระจายที่ตามมา (31) นอกจากนี้ E-cadherin ยังมีความสำคัญต่อการยับยั้ง EMT ของเซลล์มะเร็ง ซึ่งสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับความแตกต่าง การบุกรุก การแพร่กระจายและการพยากรณ์โรคมะเร็งเยื่อบุผิวหลายชนิด ปัจจัยการถอดรหัสที่เหนี่ยวนำด้วย EMT (EMT‑TF) เช่น Twist, Snail และ Zeb มีความสำคัญต่อ EMT มีรายงานภาวะขาดออกซิเจนเพื่อกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณที่กระตุ้นการแสดงออกของ EMT‑TF โดยเฉพาะอย่างยิ่ง มันสามารถส่งเสริม EMT ได้โดยตรงผ่านการเปิดใช้การถอดรหัสของปัจจัยเหล่านี้ (32) เกลียวเป็นเกลียวเกลียวที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างดี

ปัจจัยการถอดความที่ได้รับการระบุใหม่ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา ตรวจพบการแสดงออกของ High Twist ในเซลล์มะเร็งหลายชนิด (33) ดังนั้นจึงเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่างการแสดงออกของ Twist และการย้ายถิ่นหรือการแพร่กระจายของเซลล์มะเร็งตลอดจนการป้องกันทางคลินิกและการรักษาการแพร่กระจาย (34) ในการศึกษานี้ พบว่าระดับการแสดงออกของ mRNA และโปรตีนของ E-cadherin ลดลงเมื่อมีภาวะขาดออกซิเจน ในขณะที่ระดับ mRNA และการแสดงออกของโปรตีนของ Twist สูงขึ้น การค้นพบนี้สอดคล้องกับผลการทดสอบการบุกรุกและการย้ายถิ่น ซึ่งหมายความว่าการขาดออกซิเจนอาจส่งผลต่อการเกิด EMT หลังการรักษาด้วย OXA ระดับการแสดงออกของโปรตีนของ E-cadherin ลดลง สิ่งนี้บ่งชี้ว่า OXA มีประสิทธิภาพต่ำในการยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์มะเร็งตับ ในขณะที่มันสามารถส่งเสริม EMT อย่างไรก็ตาม เมื่อใช้ร่วมกับ CPhG ความไวของเซลล์ HepG2 ต่อ OXA แสดงให้เห็นการปรับปรุงอย่างเห็นได้ชัดเมื่อมีภาวะขาดออกซิเจน นอกจากนี้ การบำบัดด้วย CPhG และ OXA สามารถยับยั้งความมีชีวิตของเซลล์ การย้ายถิ่น และการบุกรุกของเซลล์ HepG2 ตรวจพบการศึกษาในปัจจุบันเท่านั้น

การแสดงออกของ Twist และ E‑cadherin; ดังนั้น การศึกษาในอนาคตจึงมุ่งเป้าไปที่เครื่องหมายที่เกี่ยวข้องกับ EMT มากขึ้น เพื่อประเมินผลการยับยั้งของ CPhG ต่อ EMT ที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนในมะเร็งตับ

มีรายงาน HIF-1 เพื่อส่งเสริมการแสดงออกของ LOXL2 และเพื่อเพิ่มการย้ายและการบุกรุกของเซลล์มะเร็งตับ ซึ่งอาจเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับการพยากรณ์โรคมะเร็งตับที่ไม่ดี (30) ในการศึกษาก่อนหน้านี้ ระดับการแสดงออกของ LOXL2 ในเนื้อเยื่อมะเร็งตับที่อยู่ติดกันเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดเมื่อเทียบกับระดับในเนื้อเยื่อมะเร็ง (35) นอกจากนี้ยังมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการบุกรุกและการแพร่กระจายของมะเร็งตับ การปิดเสียงของยีน LOXL2 โดย RNA ที่รบกวนขนาดเล็กยับยั้งการแพร่กระจายของเซลล์ HepG2 และ SMCC‑7721 ซึ่งส่งผลให้มีการหยุดวงจรของเซลล์มะเร็งและเพิ่มการตายของเซลล์ (36) Shao et al (35) ได้ตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่าง LOXL2 ในตัวอย่างมะเร็งตับและปัจจัยทางคลินิก VM และการพยากรณ์โรคใน 201 รายที่ได้รับการผ่าตัดเพื่อรักษา มีการตั้งสมมติฐานว่า LOXL2 มีบทบาทสำคัญในการก่อโรคและการลุกลามของมะเร็งตับ ซึ่งอาจใช้เป็นเป้าหมายในการพัฒนายา นอกจากนี้ Peng et al (37) แสดงให้เห็นว่า LOXL2 สามารถกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณไคเนส Snail/E‑cadherin และ Src kinase/Focal adhesion kinase ซึ่งอาจส่งผลต่อการเกิดโรคและความก้าวหน้าของ EMT ของเซลล์มะเร็งกระเพาะอาหาร ในการศึกษานี้ ภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน ระดับการแสดงออกของ mRNA และโปรตีนของ LOXL2 เพิ่มขึ้น ในขณะที่การแสดงออกของมันถูกควบคุมลงหลังจากการรักษาด้วย OXA นอกจากนี้ การรักษาด้วยการรวมกันของ CPhG และ OXA ส่งผลให้มีการปรับการแสดงออกของ LOXL2 ที่ลดลงอย่างเห็นได้ชัด ซึ่งอาจช่วยผลต้านเนื้องอกของ OXA ต่อมะเร็งตับได้อย่างมีประสิทธิภาพ

มีข้อ จำกัด บางประการในการศึกษาในปัจจุบัน การศึกษานี้ควรใช้สายเซลล์มะเร็งตับเพิ่มอีกสองสาย รวมทั้งสายเซลล์ SMCC‑7721 แต่ไม่สามารถนำมาใช้ได้ เนื่องจากไม่สามารถซื้อสายเซลล์เหล่านี้ได้เนื่องจากระบุผิดพลาดและได้มาจากเซลล์ HeLa นอกจากนี้ การศึกษานี้ไม่ได้วิเคราะห์ผลของสารต้านอนุมูลอิสระของความเข้มข้นของ CPhG ที่ต่างกันในเซลล์

โดยสรุป CPhG สามารถสลับสภาวะแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกที่ขาดออกซิเจนของเซลล์มะเร็งตับผ่านการปรับเส้นทางการส่งสัญญาณ HIF‑1 นอกจากนี้ ความไวของเซลล์มะเร็งตับต่อ OXA ยังเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในการตอบสนองต่อการรักษาด้วยการใช้ CPhG และ OXA ร่วมกัน การค้นพบนี้อาจให้กลยุทธ์การรักษาแบบใหม่ในการปรับปรุงความไวของมะเร็งตับต่อเคมีบำบัด

รับทราบ

ไม่สามารถใช้ได้.

เงินทุน

การศึกษานี้ได้รับการสนับสนุนจาก Xinjiang Key Laboratory of Natural Drug Active Components and Drug Release Technology (grant no. XJDX1713), the Reserve Candidate Project for the Leader of Scientific and Technological Innovation in Xinjiang Uygur Autonomous Region (grant no. 2019XS14), มูลนิธิวิทยาศาสตร์ธรรมชาติแห่งชาติของจีน (หมายเลข 81860735) และมูลนิธิ Bethune Charitable

มูลนิธิ 'Bethune·Quest‑สร้างศักยภาพการวิจัยทางวิทยาศาสตร์เภสัชกรรม' (หมายเลข B‑19‑H‑20200622)

ความพร้อมใช้งานของข้อมูลและวัสดุ

ชุดข้อมูลที่ใช้และ/หรือวิเคราะห์ระหว่างการศึกษาปัจจุบันมีให้จากผู้เขียนที่เกี่ยวข้องตามคำขอที่สมเหตุสมผล

ผลงานของผู้เขียน

LMW และ JWZ ทำการทดลอง ร่างต้นฉบับ และยืนยันความถูกต้องของข้อมูลดิบทั้งหมด JPH และ JHY ออกแบบการศึกษาในปัจจุบัน ผู้เขียนทั้งหมดอ่านและได้รับการอนุมัติต้นฉบับสุดท้าย.

การอนุมัติจริยธรรมและการยินยอมให้เข้าร่วม

ไม่สามารถใช้ได้.

ความยินยอมของผู้ป่วยสำหรับการเผยแพร่

ไม่สามารถใช้ได้.

การแข่งขันความสนใจ

ผู้เขียนประกาศว่าพวกเขาไม่มีส่วนได้เสียในการแข่งขัน

อ้างอิง

1. มะเร็งตับ Nat Rev Dis ไพรเมอร์ 2: 16019, 2016.

2. Gingold JA, Zhu D, Lee DF, Kaseb A และ Chen J: การทำโปรไฟล์จีโนมและสภาวะสมดุลการเผาผลาญในมะเร็งตับระยะแรก เทรนด์ Mol Med 24: 395‑411, 2018

3. McGuire S: World Cancer report 2014. เจนีวา, สวิตเซอร์แลนด์: องค์การอนามัยโลก, หน่วยงานระหว่างประเทศเพื่อการวิจัยโรคมะเร็ง, WHO press, 2015. Adv Nutr 7: 418‑419, 2016.

4. Gholamreza K, Jadidi‑Niaragh F, Jahromi AS, Zandi K และ Hojjat‑Farsangi M: กลไกของการดื้อต่อเซลล์เนื้องอกต่อยารักษาเป้าหมายในปัจจุบัน Tumor Biol 37: 10021‑10039, 2016.

5. Dong X และ Mumper RJ: กลยุทธ์ Nanomedicinal ในการรักษาเนื้องอกที่ดื้อต่อยาหลายตัว: ความคืบหน้าในปัจจุบัน นาโนเมดิซีน (Lond) 5: 597‑615, 2010.

6. Xie Y และ Zhong DW: AEG‑1 สัมพันธ์กับเคมีบำบัดมะเร็งตับที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนผ่านการควบคุมวิถีทาง PI3K/AKT/HIF‑1alpha/MDR‑1 ยกเว้น จ. 15: 745-757 ปี 2559

7. Xiong H, Ni Z, He J, Jiang S, Li X, He J, Gong W, Zheng L, Chen S, Li B, et al: LncRNA HULC กระตุ้น autophagy ผ่านการทำให้เสถียร Sirt1 และลดความไวทางเคมีของเซลล์ HCC เนื้องอก 36: 3528-3540, 2017

8. Gade TPF, Tucker E, Nakazawa MS, Hunt SJ, Wong W, Krock B, Weber CN, Nadolski GJ, Clark TWI, Soulen MC, et al: ภาวะขาดเลือดทำให้เกิดภาวะหยุดนิ่งและการพึ่งพา autophagy ในมะเร็งตับ รังสีวิทยา 283: 702‑710, 2017.

9. Siegel RL, Miller KD และ Jemal A: Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin 67: 7-30, 2017

10. Dong LQ, Shen BQ และ Ma Y: ความคืบหน้าของการวิจัยภาวะแวดล้อมจุลภาคที่ขาดออกซิเจนในมะเร็งตับ Zhong Guo Pu Wai Ji Chu Yu Lin Chuang Za Zhi 25: 1254‑1258, 2018 (ภาษาจีน)

11. Moon HJ, Finney J, Ronnebaum T และ Mure M: Human lysyl oxidase‑like 2. Bioorg Chem 57: 231-241, 2014.

12. Ferreira S, Saraiva N, Rijo P และ Fernandes AS: สารยับยั้ง LOXL2 และความก้าวหน้าของมะเร็งเต้านม สารต้านอนุมูลอิสระ (บาเซิล) 10: 312, 2021

13. Philp CJ, Siebeke I, Clements D, Miller S, Habgood A, John AE, Navaratnam V, Hubbard RB, Jenkins G และ Johnson SR: การเชื่อมขวางของเมทริกซ์นอกเซลล์ช่วยเพิ่มการเจริญเติบโตของไฟโบรบลาสต์และป้องกันการย่อยของเมทริกซ์ในปอดพังผืด Am J Respir Cell Mol Biol 58: 594‑603, 2018.

14. Galván JA, Zlobec I, Wartenberg M, Lugli A, Gloor B, Perren A และ Karamitopoulou E: การแสดงออกของ E-cadherin repressors SNAIL, ZEB1 และ ZEB2 โดยเนื้องอกและเซลล์ stromal มีอิทธิพลต่อฟีโนไทป์ของเนื้องอกและแสดงให้เห็นความแตกต่างของ stromal เซลล์ในมะเร็งตับอ่อน Br J Cancer 112: 1944-1950, 2015.

15. Gu C, Yang X และ Huang L: Cistanches herba: การทบทวนทางเภสัชวิทยา หน้า Pharmacol 7: 289, 2016.

16. Fu Z, Fan X, Wang X และ Gao X: Cistanches Herba: ภาพรวมของคุณสมบัติทางเคมี เภสัชวิทยา และเภสัชจลนศาสตร์ J Ethnopharmacol 219: 233‑247, 2018.

17. Hu Q, You SP, Liu T, Wang B, Liu X และ Jiang Y: การสอบสวนฤทธิ์ต้านมะเร็งตับของ cistanche สารก่อมะเร็ง Teratog Mutagen 30: 194‑199, 2018

18. Mao J, Tian Y, Wang C, Jiang K, Li R, Yao Y, Zhang R, Sun D, ​​Liang R, Gao Z, et al: CBX2 ควบคุมการเพิ่มจำนวนและการตายของเซลล์ผ่านทางฟอสโฟรีเลชั่นของ YAP ในมะเร็งตับ เจ แคนเซอร์ 10: 2706‑2719, 2019.

19. Qin Y, Liu HJ, Li M, Zhai DH, Tang YH, Yang L, Qiao KL, Yang JH, Zhong WL, Zhang Q, et al: Salidroside ปรับปรุงสภาวะแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกที่ขาดออกซิเจนและย้อนกลับการดื้อยาของยาแพลตตินั่มผ่านทาง เส้นทางการส่งสัญญาณ HIF-1 EBioMedicine 38: 25‑36, 2018.

20. Livak KJ และ Schmittgen TD: การวิเคราะห์ข้อมูลการแสดงออกของยีนสัมพัทธ์โดยใช้ PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์และวิธี 2(-Delta Delta C(T)) วิธีที่ 25: 402-408, 2001

21. Vaupel P: สรีรวิทยา microenvironmental ของเนื้องอกและความหมายสำหรับมะเร็งวิทยาการฉายรังสี เซมิน เรเดียต ออนคอล 14: 198‑206, 2004.

22. Chen C และ Lou T: ปัจจัยกระตุ้นการขาดออกซิเจนในมะเร็งตับ Oncotarget 8: 46691‑46703, 2017.

23. Schwabe RF and Luedde T: Apoptosis and necroptosis in the liver: เรื่องของความเป็นและความตาย. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 15: 738‑752, 2018.

24. Kanda T, Matsuoka S, Yamazaki M, Shibata T, Nirei K, Takahashi H, Kaneko T, Fujisawa M, Higuchi T, Nakamura H, et al: Apoptosis และโรคตับไขมันที่ไม่มีแอลกอฮอล์ World J Gastroenterol 24: 2661‑2672, 2018.

25 Pittala S, Kremlin Y และ Shoshan‑Barmatz V: การกำหนดเป้าหมายมะเร็งตับและพยาธิสภาพที่เกี่ยวข้องในหนูที่มีเปปไทด์จากไมโตคอนเดรีย VDAC1 Neoplasia 20: 594‑609, 2018.

26. Jing ZT, Liu W, Xue CR, Wu SX, Chen WN, Lin XJ และ Lin X: AKT activator SC79 ปกป้องเซลล์ตับจากการตายของเซลล์ที่เกิดจาก TNF- ‑ ‑-mediated และบรรเทาอาการบาดเจ็บที่ตับที่เกิดจาก d-Gal/LPS Am J Physiol ระบบทางเดินอาหารของตับ Physiol 316: G387‑G396, 2019