ส่วนที่ 1: Homoarginine Ameliorates Diabetic Nephropathy ที่ไม่ขึ้นกับ Nitric Oxide Synthase-3

ติดต่อtina.xiang@wecistanche.com

เชิงนามธรรม

เมื่อเร็ว ๆ นี้เราแสดงให้เห็นว่าการเสริมโฮโมอาร์จินีนให้การป้องกันไตในหนูเมาส์ที่เป็นโรคเบาหวาน ในการศึกษานี้ เราทดสอบว่าผลในการป้องกันของโฮโมอาร์จินีนคือการสังเคราะห์ไนตริกออกไซด์-3 (NOS3) โดยไม่ขึ้นกับโรคไตจากเบาหวาน (DN) หรือไม่ การทดลองได้ดำเนินการในหนูทดลองที่ขาด NOS3 (NOS3-7) และสัตว์ผสมพันธุ์ตามธรรมชาติของหนูโดยใช้กระสายยาหรือสเตรปโตโซโทซินในปริมาณต่ำหลายครั้ง และได้รับการบำบัดด้วยโฮโมอาร์จินีนผ่านทางน้ำดื่มเป็นเวลา 24 สัปดาห์ การเสริม Homoarginine เป็นเวลา 24 สัปดาห์ในผู้ป่วยเบาหวาน NOS3-/ หนูเมาส์ลดระดับอัลบูมินูเรียอย่างมีนัยสำคัญ เพิ่มยูเรียไนโตรเจนในเลือด การเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาและการเกิดพังผืดในไต เครื่องหมายไฟโบรติกในไต และการจัดหามาโครฟาจในไตเมื่อเปรียบเทียบกับ NOS ที่เป็นเบาหวานที่บำบัดด้วยกระสายยา3- / หนู. นอกจากนี้ การเสริมโฮโมอาร์จินีนยังช่วยฟื้นฟูการทำงานของไมโตคอนเดรียในไตหลังโรคเบาหวาน ที่สำคัญ ไม่มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในการแสดงออกของ NOS1 หรือ NOS2 mRNA ของไตระหว่างทุกกลุ่ม นอกจากนี้ การเสริมโฮโมอาร์จินีนยังช่วยปรับปรุงการทำงานของหัวใจและลดการเกิดพังผืดของหัวใจหลังเบาหวาน ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าผลการป้องกันของโฮโมอาร์จินีนไม่ขึ้นกับ NOS3 ซึ่งท้ายที่สุดจะเปลี่ยนความเข้าใจของเราเกี่ยวกับกลไกที่โฮโมอาร์จินีนกระตุ้นการป้องกันไตและหัวใจใน DN ผลการป้องกัน Homoarginine ใน DN สามารถไกล่เกลี่ยได้โดยการปรับปรุงการทำงานของไมโตคอนเดรีย

คีย์เวิร์ด: การทำงานของหัวใจ, โรคไตจากเบาหวาน, โฮโมอาร์จินีน, NOS3

คลิกเพื่อเรียนรู้ว่า cistanche ใช้สำหรับอะไร

1. บทนำ

โรคเบาหวานเป็นสาเหตุการเจ็บป่วยและการตายที่ร้ายแรงและแพร่หลายมากขึ้นในสหรัฐอเมริกา โดยประมาณ 12-14 เปอร์เซ็นต์ของผู้ใหญ่ที่เป็นเบาหวาน โดยมีอัตราที่สูงขึ้นในกลุ่มชาติพันธุ์ (Gao et al, 2016; Menke et al, 2015) . การสูญเสียทางเศรษฐกิจและผลผลิตอันเนื่องมาจากภาวะแทรกซ้อนของโรคเบาหวานมีมูลค่ากว่า 245 พันล้านดอลลาร์และนำไปสู่ผลกระทบทางสรีรวิทยาและจิตวิทยารวมทั้งระบบการอักเสบ, การทำงานของไตและหัวใจบกพร่องภาวะซึมเศร้าและความวิตกกังวลทางสังคม (Jha et al.,2018; Menke et al, 2015; Moreno et al.,2018; Tao et al.2015; Vanstone et al., 2015) โรคไตจากเบาหวาน (Diabetic nephropathy - DN) เป็นโรคเรื้อรังที่ลุกลามจนนำไปสู่การเสื่อมลงอย่างรวดเร็วและไตวายระยะสุดท้าย ในช่วงทศวรรษที่ผ่านมา อุบัติการณ์ของภาวะไตวายเนื่องจากโรคเบาหวานเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่า การรักษาแบบดั้งเดิม ซึ่งรวมถึงความดันโลหิตและการควบคุมระดับน้ำตาลในเลือด และการเปลี่ยนแปลงวิถีชีวิตอื่นๆ ประสบความสำเร็จเพียงเล็กน้อยในการชะลอการลุกลามของภาวะไตวาย ดังนั้นจึงเป็นสิ่งสำคัญที่จะระบุกลไกที่เกี่ยวข้องกับการพัฒนาและความก้าวหน้าของโรคเบาหวานโรคไต. Cistanche deserticolaเป็นยาจีนโบราณและเป็นยาบำรุงไต ส่วนใหญ่ใช้สำหรับภาวะขาดหยินของไต เช่น ปวดหลัง ปวดหลัง ความอ่อนแอ ฯลฯ อย่างไรก็ตาม ผู้ป่วยโรคเบาหวานส่วนใหญ่มีภาวะขาดหยิน และหากพวกเขามีภาวะขาดหยาง ก็สามารถรับประทานได้อย่างเหมาะสม อย่างไรก็ตาม ควรใช้ด้วยความระมัดระวังเมื่อมีอาการร้อนในเชิงลบ เช่น กลัวความร้อนและเหงื่อออกตอนกลางคืน และปากแห้ง ปรึกษาแพทย์ก่อนนะครับ

Homoarginine ซึ่งเป็นแอนะล็อกอาร์จินีนภายในตัวซึ่งไม่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์โปรตีน ได้กลายเป็นผู้เล่นใหม่ในด้านสุขภาพและโรค (Pilz et al., 2015) Homoarginine ถูกสังเคราะห์โดย mitochondrial arginine: glycine amidinotransferase (AGAT) ในไตโดยใช้ L-arginine และ L-lysine เป็นสารตั้งต้น (Choe et al., 2013; Ryan & Wells, 1964) และ catabolized โดยใช้ alanine: glyoxylate aminotransferase 2(AGXT2) (Rodionov et al.2016). ความเข้มข้นของโฮโมอาร์จินีนในพลาสมามีความสัมพันธ์ผกผันกับความเสี่ยงของโรคหัวใจและหลอดเลือดและอัตราการเสียชีวิตโดยรวม (Jud et al.,2018; Marz et al, 2010) ความเสี่ยงที่เพิ่มขึ้นสำหรับโรคหลอดเลือดสมอง (Haghikia et al.,2017) ภาวะหัวใจล้มเหลว และ กระเป๋าหน้าท้องยั่วยวนซ้าย (Atzler et al.,2013,2017; Bahls et al., 2018; Pilz, Edelmann, et al.,2014), ความชรา (Atzler, Schwedhelm, et al.,2014; Marz et al., 2010) , การสูบบุหรี่ (Atzler, Gore, et al, 2014; Sobczaket al.,2014; Vogler al,2015; Zwan et al.,2013), ดัชนีมวลกาย (Atzler, Gore, et al.,2014; Marz et al.2010 ; Pilz, Teerlink, et al., 2014) และการตั้งครรภ์ (Valtonen et al, 2008) ระดับโฮโมอาร์จินีนต่ำทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ความผิดปกติของหัวใจ โดยมีไดเมทิลอาร์จินีนที่ไม่สมมาตร (ADMA) ในระดับสูงที่เกี่ยวข้อง (Atzler, Schwedhelm, et al.,2014; Jud et al.,2018; Kayacelebiet al.,2014; Pilzet al.,2015 ; Vogler al, 2015). ผลกระทบของโฮโมอาร์จินีนต่ำต่อการผลิต/การกระทำของไนตริกออกไซด์ (NO) เชื่อมโยงกับความเสี่ยงที่เพิ่มขึ้นของโรคหลอดเลือดสมองและหลอดเลือด (Haghikia et al, 2017) ไนตริกออกไซด์ที่บุผนังหลอดเลือด (NOS3) แสดงออกอย่างเป็นส่วนประกอบในเซลล์บุผนังหลอดเลือด และทำหน้าที่ปรับระดับ NO ในเซลล์เพื่อตอบสนองต่อระดับแคลเซียม (Zanchi et al., 2000) Homoarginine อาจมีส่วนช่วยในการสังเคราะห์ NO โดยทำหน้าที่เป็นสารตั้งต้นสำหรับ NOS เนื่องจาก Homoarginine แม้ว่าจะมีความสัมพันธ์ที่อ่อนแอกว่ากับ NOS เมื่อเทียบกับ arginine ก็สามารถเผาผลาญเป็น NO และ homocitrulline (Drechsler et al., 2011) ในไต homoarginine ต่ำ เป็นปัจจัยเสี่ยงที่สำคัญสำหรับการเสียชีวิตอย่างกะทันหันของหัวใจและการเสียชีวิตเนื่องจากภาวะหัวใจล้มเหลวในผู้ป่วยไตเทียม (Drechsler et al.,2011) นอกจากนี้ ระดับโฮโมอาร์จินีนที่ต่ำยังสัมพันธ์กับความเสี่ยงโรคหัวใจและหลอดเลือดที่เพิ่มขึ้นในผู้ป่วยที่ได้รับการปลูกถ่ายไต (Kayacelebi et al.,2017) ในสัตว์ทั้งสอง (Banchaabouchi et al.,2001; Tofuku et al., 1985)และมนุษย์ (Drechsler et al. 2013) ด้วยอาการบาดเจ็บที่ไตเรื้อรัง ระดับโฮโมอาร์จินีนลดลงและระดับโฮโมอาร์จินีนในพลาสมาต่ำมีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญกับอัตราการกรองไตที่ลดลง (GFR) และโปรตีนในปัสสาวะ (Ravani et al., 2013) แม้ว่าข้อมูลทางระบาดวิทยาแสดงให้เห็นว่าระดับโฮโมอาร์จินีนที่ลดลงนั้นสัมพันธ์กับการตายที่เพิ่มขึ้นในโรคไตและโรคหัวใจและหลอดเลือด (Drechsler et al.,2015; Jud et al.,2018; Marz et al, 2010; Ravani et al.,2013) กลไกทางสรีรวิทยาโดยตรงของโฮโมอาร์จินีนยังคงไม่ชัดเจน ก่อนหน้านี้เราแสดงให้เห็นว่าโฮโมอาร์จินีนเป็นวิธีการรักษา DN ที่มีประสิทธิภาพ (Wetzel et al., 2019) อย่างไรก็ตาม กลไกการทำงานของโฮโมอาร์จินีนในไตและความผิดปกติของหัวใจยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด

ในการศึกษาปัจจุบัน เราทดสอบสมมติฐานที่ว่าผลการป้องกันของโฮโมอาร์จินีนในการทำงานของไตและหัวใจในโรคเบาหวานนั้นไม่ขึ้นกับ NOS3 ผลลัพธ์ของเราระบุว่าโฮโมอาร์จินีนเป็นสื่อกลางในการปกป้องไตและหัวใจใน NOS ที่เป็นเบาหวาน3-一mice ซึ่งท้ายที่สุดแล้วจะเปลี่ยนความเข้าใจของเราเกี่ยวกับกลไกที่โฮโมอาร์จินีนช่วยบรรเทาอาการบาดเจ็บที่ไตจากเบาหวานได้ ผลการป้องกันของโฮโมอาร์จินีนใน DN สามารถไกล่เกลี่ยได้โดยการปรับปรุงการทำงานของไมโตคอนเดรีย

2. วัสดุและวิธีการ

2.1 รุ่นเมาส์เบาหวาน

การทดลองกับสัตว์ทั้งหมดดำเนินการในหนูเมาส์เพศผู้6-สัปดาห์ (The Jackson Laboratory, Bar C57BL/6J or NOS3-1-Harbor, ME) หนูถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 23 องศาเซลเซียสและวงจรมืด 12:12 พร้อมการเข้าถึงอาหารมาตรฐานและน้ำฟรี โรคเบาหวานเกิดจากการฉีดสเตรปโตโซโตซิน (STZ) 50 มก./กก. หรือการควบคุมน้ำเกลือภายในช่องท้องเป็นเวลา 5 วันติดต่อกัน ขั้นตอนทั้งหมดทำในตอนเช้าตลอดการศึกษา ระดับน้ำตาลในเลือดวัดจากหนูที่ไม่อดอาหารโดยใช้เครื่องวัดกลูโคมิเตอร์ Contour Next EZ ที่มีแถบ Contour Next จากหลอดเลือดดำส่วนหางของหนู โดยที่หนูที่เป็นโรคเบาหวานถูกกำหนดให้มีระดับน้ำตาลในเลือดมากกว่า 350 มก./ดล. L-Homoarginine (Sigma, St. Louis MO, Cat #: H1007) ถูกเสริมในน้ำดื่มที่ความเข้มข้น 50 มก./ลิตร ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Wetzel et al., 2019) และเปลี่ยนทุก 4 วัน เมื่อสิ้นสุดการศึกษา (24 สัปดาห์) เก็บตัวอย่างปัสสาวะ 24-ชม. หนูเมาส์ถูกการุณยฆาตโดยใช้การฉีดคีตามีน/ไซลาซีนค็อกเทลในช่องท้อง ได้พลาสมาโดยการเจาะหัวใจ และนำไตและหัวใจออกเพื่อการศึกษาต่อไป สำหรับการเก็บปัสสาวะ หนูถูกวางแยกกันในกรงเมตาบอลิซึมเป็นเวลา 16 ชั่วโมงโดยสามารถเข้าถึงน้ำดื่มได้ฟรี และเก็บปัสสาวะในท่อรวบรวมที่มีน้ำมันแร่ 200 ul ที่ป้องกันการระเหยของปัสสาวะ เก็บเลือดโดยการเจาะหัวใจและหมุนเหวี่ยงที่ 3000 กรัมเป็นเวลา 3 นาทีที่ 4 องศาเพื่อแยกพลาสมา การติดตามการเก็บตัวอย่างทั้งหมดถูกเก็บไว้ที่ -80 องศา C จนกระทั่งทำการวิเคราะห์ จำนวนหนูต่อกลุ่มได้รับในตารางที่ 1 ตัวอย่างที่ได้จากหนู Ins2Aita ได้รับตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (คุณและคณะ, 2015) การทดลองกับสัตว์ทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากศูนย์วิทยาศาสตร์สุขภาพมหาวิทยาลัยเท็กซัสที่คณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของสถาบันซานอันโตนิโอ

2.2 อิมมูโนฮิสโตเคมี

เนื้อเยื่อไตของหนูเมาส์ถูกตรึงในฟอร์มาลิน 10 เปอร์เซ็นต์และฝังอยู่ในพาราฟิน และตัดส่วน 3-μm อิมมูโนฮิสโตเคมีดำเนินการบนส่วนที่ฝังด้วยพาราฟินด้วยแอนติบอดี Mac-2 ต้านเมาส์ (โคลน M3/38; Cedarlane, Burlington, NC) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Youet al.,2013,2014) รูปภาพถูกถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์ Olympus BX60 และกล้องดิจิตอล Olympus Q-Color3 โดยใช้ซอฟต์แวร์ภาพ Q-capture Pro 7 จำนวนของ glomerular macrophages ถูกนับใน 20 glomeruli/section (จำนวน macrophages ใน glomeruli หารด้วยจำนวน glomeruli) ในลักษณะปิดตาภายใต้กำลังขยาย 40 เท่า และหาค่าเฉลี่ยตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Morris et al.,2011; Wetzel et al.,2019; You et al.,2013, 2014).

2.3 จุลพยาธิวิทยาของไตและหัวใจ

ไตและหัวใจได้รับการแก้ไขในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ ฝังในพาราฟิน และตัดส่วน 5-μum ส่วนต่างๆ ถูกย้อมด้วยคราบ Trichrome หรือคราบกรด Schiff (PAS) ของ Masson ตรวจสอบในลักษณะที่ตาบอดและให้คะแนนโดยเฉลี่ย เพื่อหาเปอร์เซ็นต์พื้นที่ของการเกิดพังผืด รูปภาพไตรโครมของ Masson ได้มาที่ 10x และวิเคราะห์ใน ImageJ เพื่อวัดเปอร์เซ็นต์พื้นที่ของการเกิดพังผืด ภาพตัวอย่างถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์ Olympus BX60 และกล้องดิจิตอล Olympus Q-Color3 โดยใช้ซอฟต์แวร์ภาพ Q-capture Pro 7 วัดลักษณะของไตโดยใช้ซอฟต์แวร์ Bioquant Osteo (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN) และคำนวณดัชนีเปอร์เซ็นต์การบาดเจ็บตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Mohan et al., 2008) สำหรับแต่ละไต เราได้รับ 12 ภาพและวิเคราะห์โกลเมอรูลัสสำหรับแต่ละฟิลด์เพื่อนำมาหาค่าเฉลี่ยสำหรับสัตว์แต่ละตัวสำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติ

2.4 วิธีการวิเคราะห์

ความเข้มข้นของอัลบูมินในปัสสาวะวัดโดย ELISA โดยใช้ชุด Albuwell M (Excell, Philadelphia, PA) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Awad, You, Gao, Gvritishvili, et al.,2015) ครีเอตินินในปัสสาวะถูกวัดโดยใช้ Diazyme Creatinine Assay (Diazyme Laboratories, Poway, CA) (Awad et al, 2011; Awad, You, Gao, Cooper, et al., 2015) ยูเรียไนโตรเจนในเลือด (BUN) ถูกกำหนดโดยใช้ชุดทดสอบ QuantiChrom urea (BioAssay Systems, Hayward, CA) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (You et al.,2017) วัดความดันซิสโตลิกของเมาส์โดยใช้ระบบความดันโลหิตแบบไม่รุกรานของ CODA (Kent Scientific Corporation, Torrington CT) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Awad, You, Gao, Gvritishvili, et al.,2015) หนูเคยชินกับสภาพเป็นเวลา 10 นาทีที่ 26 องศาก่อนที่จะเริ่มการอ่าน การอ่านถูกนำมาในเวลาเดียวกันของวันสำหรับทุกกลุ่มเพื่อป้องกันการเปลี่ยนแปลงในแต่ละวัน

2.5 การวัดการทำงานของหัวใจ

การตรวจคลื่นไฟฟ้าหัวใจแบบ Serial B-Mode และ M-Mode ดำเนินการโดยใช้ Vevo 2100 Imaging Platform (VisualSonics, โตรอนโต, แคนาดา) โดยใช้ตัวแปลงสัญญาณเชิงเส้น 30-MHz เพื่อตรวจสอบพารามิเตอร์การไหลเวียนโลหิตของหัวใจอย่างแม่นยำและประเมินโครงสร้างหัวใจของหนูหลังจากผ่านไป 22 สัปดาห์ ของการรักษาโฮโมอาร์จินีน เศษส่วนดีดออกของกระเป๋าหน้าท้องด้านซ้าย (EF) และการหดตัวเศษส่วนช่องซ้าย (FS) ถูกหาปริมาณโดยใช้โหมด M ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (lorga et al., 2016,2018)

2.6 การแยก RNA และ PCR แบบเรียลไทม์

RNA แยกได้โดยการสกัด Trizol จากส่วนไตทั้งหมดและแปลงกลับเป็น cDNA โดยใช้ชุดการสังเคราะห์ DNA สคริปต์ Bio-Rad (Hercules, CA) PCR แบบเรียลไทม์ดำเนินการบน CFX384 ระบบเรียลไทม์ (Bio-Rad,Hercules, CA) โดยใช้ไพรเมอร์ Tagman สำหรับ MCU ของเมาส์ (Mm0116873_m1), ไฟโบรเนกติน (Mm01256744_m1), การเติบโตของเนื้องอก แฟกเตอร์ (TGF , Mm01178820_m1), NOS1(Mm00435175_m1), NOS2(Mm00440502_m1), และ Rn18S (Mm03928990_gl)(Thermo Fisher, วอลแทม แมสซาชูเซตส์) ค่า Ct ถูกทำให้เป็น 18S และเปรียบเทียบกับตัวอย่าง NOS3 ไพรเมอร์สำหรับแอคตินของกล้ามเนื้อเรียบ(FW:5'-CTGCCGTTTTCCCCTCTCTG-3', RV:5'-TTGCTTCCTCCTCCTTG-3'),E-cadherin (FW: 5'-TGAGTGTGTGGGTGCTGA-3',RV:5'-CGGTTTC AATGGCTTACCTTTTCC-3') และ -actin (FW:5'-GC TGGTTGTGTAAGGTAAGGTGTGC-3',RV: 5'-GAGG GGGTTGAGGTGTTGAGG-3) ได้มาจาก Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) ตัวอย่าง cDNA ถูกวิเคราะห์โดยใช้ SYBR Green Master Mix (Thermo Scientific, Rockford IL) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Morris et al.,2011) และทำให้เป็นมาตรฐาน ถึง -actin เพื่อเปรียบเทียบกับ NOS3-/- ตัวอย่าง

2.7 ซับตะวันตก

เนื้อเยื่อไตถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์ RIPA ที่มี {0}}.1 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100 เสริมด้วยสารยับยั้งโปรตีเอส (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) และล้างโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 10{{4} } g เป็นเวลา 10 นาที ที่ 4 องศา และรวบรวม supernatant ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยการทดสอบกรดบิซินโชนิก(บีซีเอ)(Thermo Scientific, Waltham, MA) ตัวอย่าง 50 ugs ของไต lysate ถูกแยกบน 4-12 เปอร์เซ็นต์ Bis-Tris gel (Life Technologies, Carlsbad, CA) และถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF ก่อนที่จะปิดกั้นด้วยนมแห้ง 5 เปอร์เซ็นต์ Western blots ถูกดำเนินการโดยใช้แอนติบอดีต่อไปนี้: MiCU1(0.4 ug/ml; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) และ -actin(1:1000; Cell Signaling, Danvers, MA)แอนติบอดี Western blots ถูกหาปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ (NIH, Bethesda, MD) และทำให้การแสดงออกของโปรตีน -actin เป็นปกติ

2.8 การวิเคราะห์ทางสถิติ

การเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มทั้งหมดดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism (เวอร์ชัน 7.04, San Diego, CA) ผลลัพธ์แสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SEM การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวตามด้วยการทดสอบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญน้อยที่สุดของฟิชเชอร์เพื่อเปรียบเทียบนัยสำคัญระหว่างกลุ่ม ค่าของ p<0.05 represented="" a="" significant="">