PART1 A Cistanches Herba Fraction/𝛽-Sitosterol ทำให้เกิด Redox-Sensitive Induction of Mitochondrial Uncoupling and Activation Of Adenosine Monophosphate-Dependent Protein Kinase/Peroxisome Proliferator-Activated Receptor 𝛾 Coactivator-1 ใน C2C12 Myotubes: กลไกที่เป็นไปได้ภายใต้น้ำหนัก ผลการลด

Hoi Shan Wong, Jihang Chen, Pou Kuan Leong, Hoi Yan Leung, Wing Man Chan และคัมหมิงโก

Division of Life Science, Hong Kong University of Science and Technology, เกาลูน, ฮ่องกง

Correspondence should be addressed to Kam Ming Ko; bcrko@ust.hk

ได้รับ 29 สิงหาคม 2014; ยอมรับ 14 มกราคม 2015 บรรณาธิการวิชาการ: Man Li ลิขสิทธิ์ © 2015

Hoi Shan Wong et al. นี่เป็นบทความแบบเปิดที่เผยแพร่ภายใต้สัญญาอนุญาตครีเอทีฟคอมมอนส์ ซึ่งอนุญาตให้ใช้ แจกจ่าย และทำซ้ำได้ไม่จำกัดในสื่อใดๆ หากมีการอ้างถึงงานต้นฉบับอย่างเหมาะสม การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่า HCF1 ซึ่งเป็นส่วนกึ่งบริสุทธิ์ของซิสตันเชส เฮอร์บาทำให้น้ำหนักลดลงในอาหารปกติและหนูที่กินอาหารที่มีไขมันสูง การลดน้ำหนักมีความสัมพันธ์กับการกระตุ้นการคลายตัวของไมโตคอนเดรียและการเปลี่ยนแปลงของกิจกรรมของเอนไซม์เผาผลาญในกล้ามเนื้อโครงร่างของหนูเมาส์ เพื่อตรวจสอบกลไกทางชีวเคมีที่อยู่ภายใต้การชักนำให้น้ำหนักลดลงของ HCF1- ผลของ HCF1 และส่วนประกอบออกฤทธิ์ของมันคือ 𝛽-sitosterol (BSS) ต่อ myotubes C2C12 การฟักไข่ด้วย HCF1/BSS ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นของศักย์ของเยื่อหุ้มยล (MMP) ชั่วคราว โดยอาจเกิดจากการทำให้เยื่อหุ้มชั้นในของไมโตคอนเดรียฟลูอิไดซ์ การเพิ่มขึ้นของ MMP นั้นควบคู่ไปกับการเพิ่มขึ้นของการผลิตชนิดออกซิเจนปฏิกิริยาไมโตคอนเดรีย (ROS) ในทางกลับกัน Mitochondrial ROS ได้กระตุ้นการเหนี่ยวนำที่ไวต่อปฏิกิริยารีดอกซ์ของการแยกตัวของไมโตคอนเดรียด้วยโปรตีนที่แยกออก 3 (UCP3) การวิเคราะห์ทางชีวเคมีระบุว่า HCF1 สามารถกระตุ้นวิถีไคเนสโปรตีนที่ขึ้นกับอะดีโนซีนโมโนฟอสเฟต/เปอร์รอกซิโซม proliferator-activated 𝛾 coactivator-1 และด้วยเหตุนี้จึงเพิ่มการแสดงออกของไซโตโครมซีออกซิเดสและ UCP3 การศึกษาในสัตว์ทดลองโดยใช้ mitochondrial coupler ยังยืนยันถึงบทบาทของการคลายตัวของไมโตคอนเดรียในการลดน้ำหนักที่เหนี่ยวนำโดย HCF1- โดยสรุป HCF1/BSS ทำให้เกิดการเหนี่ยวนำที่ไวต่อปฏิกิริยารีดอกซ์ของการแยกตัวของไมโตคอนเดรียและการกระตุ้น AMPK/PGC-1 ใน myotubes C2C12 โดยส่งผลให้น้ำหนักตัวและความอ้วนลดลงโดยการใช้พลังงานที่เพิ่มขึ้น

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมกรุณาติดต่อ:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola มีเอฟเฟกต์มากมาย คลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

1. บทนำ

โรคอ้วนซึ่งหมายถึงการสะสมไขมันในร่างกายอย่างผิดปกติได้กลายเป็นภัยคุกคามต่อสุขภาพของประชาชน ไม่ว่าสภาวะทางเมตาบอลิซึมจะมีสุขภาพดีหรือมีความบกพร่องทางเมตาบอลิซึมก็ตาม พบว่าโรคอ้วนมีความสัมพันธ์กับความเสี่ยงที่เพิ่มขึ้นของการเกิดโรคร่วมและการตาย [1] โรคอ้วนกลาง ความผิดปกติในโปรไฟล์คอเลสเตอรอล และระดับไตรกลีเซอไรด์ในพลาสมา ซึ่งทั้งหมดนี้เป็นลักษณะทั่วไปของคนอ้วน มีส่วนทำให้เกิดอุบัติการณ์สูงของโรคเบาหวานประเภท 2 โรคหัวใจและหลอดเลือด การเสียชีวิตจากไม่เกี่ยวกับหัวใจและหลอดเลือด และมะเร็งที่เกี่ยวข้องกับโรคอ้วนในคนอ้วน 2]. ดังนั้นการลดน้ำหนักและความอ้วนจึงถือเป็นกุญแจสำคัญในการป้องกันผลกระทบด้านสุขภาพที่เกี่ยวข้องกับโรคอ้วน การจัดการโรคอ้วนส่วนใหญ่เน้นการสร้างสมดุลพลังงานที่เหมาะสมโดยการเพิ่มการใช้พลังงานและ/หรือลดการบริโภคพลังงาน การปรับเปลี่ยนวิถีชีวิต รวมถึงการเพิ่มขึ้นของการออกกำลังกายและการพัฒนารูปแบบการกินเพื่อสุขภาพ ถือเป็นแนวทางที่ปลอดภัยในการทำให้น้ำหนักลดลง อย่างไรก็ตาม โดยทั่วไปพบว่าวิธีการดังกล่าวไม่มีประสิทธิภาพ Hindawi Publishing Corporation Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine Volume 2015, Article ID 142059, 12 pages http://dx.doi.org/10.1155/2015/1420592 Evidence-Based Complementary and ยาทางเลือกเพิ่มพลังงานหรือลดการบริโภคพลังงาน [3]. ดังนั้น กลยุทธ์ที่ยึดตามการใช้ตัวแทนทางเภสัชวิทยาจึงอยู่ระหว่างการตรวจสอบอย่างแข็งขัน ในเรื่องนี้ การค้นพบครั้งก่อนของเราได้แสดงให้เห็นว่า HCF1 ซึ่งเป็นส่วนกึ่งบริสุทธิ์ของCistanchesเฮอร์บา(พืชแห้งทั้งต้นของCistanche deserticolaYC Ma มีลักษณะเป็นยาชูกำลัง "หยางที่ทำให้ชุ่มชื่น" ในการแพทย์แผนจีน) แสดงให้เห็นว่ามีประสิทธิภาพในการป้องกันโรคอ้วนที่เกิดจากการรับประทานอาหารและความผิดปกติของการเผาผลาญที่เกี่ยวข้อง [4] การบริหารช่องปากของ HCF1 ทำให้น้ำหนักลดลงในอาหารปกติ- (ND-) และอาหารที่มีไขมันสูง- (HFD-) ที่เลี้ยงด้วยหนู ซึ่งอาจเกิดจากการเหนี่ยวนำการคลายไมโตคอนเดรียในกล้ามเนื้อโครงร่าง โดยส่งผลให้มีการใช้พลังงานเพิ่มขึ้น [4 ]. อย่างไรก็ตาม กลไกที่เป็นสาเหตุของ HCF1-การคลายตัวของไมโตคอนเดรีย (และด้วยเหตุนี้การลดน้ำหนัก) ยังคงไม่ชัดเจน การแยกตัวของไมโตคอนเดรียจะกระจายการไล่ระดับโปรตอนโดยการแนะนำวิถีการนำโปรตอนทางเลือกผ่านเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียชั้นใน (IMM) โดยส่งผลให้ศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียลดลงและการสร้าง ATP ของไมโตคอนเดรีย วัฏจักรอันไร้ผลของการขนส่งโปรตอนนี้ใช้พลังงานเมแทบอลิซึมในสัดส่วนที่สูงในเนื้อเยื่อต่างๆ และมีส่วนสำคัญในการใช้พลังงานในแต่ละวัน โดยการใช้โมเลกุลของเชื้อเพลิง (เช่น กรดไขมัน) จะเพิ่มขึ้นตามไปด้วย ส่งผลให้น้ำหนักลดลงและ ลดความอ้วน [5, 6] เพื่อยืนยันผลการคลายตัวของไมโตคอนเดรียที่เกิดจาก HCF1 ผลของ HCF1 ต่อการแสดงออกของ MMP และ UCP3 ถูกตรวจสอบใน myotubes C2C12 ซึ่งเป็นเซลล์กล้ามเนื้อที่สร้างความแตกต่างจากกล้ามเนื้อต้นขาของหนูเมาส์ C3H เป้าหมายของเราคือการตรวจสอบกลไกทางชีวเคมีที่อยู่ภายใต้การลดน้ำหนักที่ HCF1 มีให้ นอกจากนี้ยังศึกษา 𝛽-sitosterol (BSS) ซึ่งเป็นสารออกฤทธิ์ของ HCF1 เพื่อเปรียบเทียบ การมีส่วนร่วมที่เป็นไปได้ของการแยกตัวของไมโตคอนเดรียใน HCF1-การลดน้ำหนักที่เหนี่ยวนำให้เกิดการลดน้ำหนักในหนูเมาส์อ้วนที่เลี้ยงด้วย HFD ได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติมโดยการบริหารร่วมกันของ HCF1 กับตัวเชื่อมต่อทางเคมี 6-คีโตโคเลสเตนอล (kCh) โปรตีนไคเนสที่ขึ้นกับอะดีโนซีนโมโนฟอสเฟต (AMPK) ซึ่งเป็นไคเนสโปรตีนซีรีน/ทรีโอนีน-โปรตีนที่แสดงออกอย่างแพร่หลาย ถือเป็นศูนย์กลางที่สำคัญสำหรับการควบคุมการเผาผลาญพลังงานของเซลล์ เมื่อเปิดใช้งาน AMPK จะรวมสัญญาณภายใน/ภายนอกเซลล์และกระตุ้นการตอบสนองของเซลล์ผ่านตัวกลางของการส่งสัญญาณระดับเซลล์ต่างๆ [7, 8] AMPK มีความสามารถในการปรับเมแทบอลิซึมของเซลล์โดยควบคุมกิจกรรมของเอนไซม์เมตาบอลิซึมผ่านฟอสโฟรีเลชั่นโดยตรง AMPK ยังสร้างผลกระทบระยะยาวที่ระดับการถอดรหัสผ่านฟอสโฟรีเลชันของตัวรับเปอร์รอกซิโซม proliferator-activated 𝛾coactivator-1 (PGC-1) ซึ่งนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงแบบปรับตัวในการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญพลังงานและการทำงานของไมโตคอนเดรีย [9, 10]. ในเรื่องนี้ เรายังตรวจสอบผลกระทบของ HCF1/BSS ต่อเส้นทางการส่งสัญญาณ AMPK/PGC-1 ใน myotubes C2C12

cistancheประโยชน์ของ Deserticola

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. สมุนไพรสกัด.

ซิสตันเชส เฮอร์บา, พืชแห้งทั้งต้นของCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae) ซื้อมาจากพ่อค้าสมุนไพรในท้องถิ่น (Lee Hoong Kee) สมุนไพรได้รับการรับรองโดยซัพพลายเออร์และตัวอย่างใบสำคัญ (HKUST00301) ถูกฝากไว้ในแผนกชีววิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งฮ่องกง (HKUST) อาCistanchesสารสกัดเฮอร์บาได้มาจากการสกัดเอทานอลของวัสดุสมุนไพรบดโดยให้ความร้อนภายใต้กรดไหลย้อนที่ 78∘ C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [11] โดยให้ผลผลิตเท่ากับ 14 เปอร์เซ็นต์ (w/w) สารสกัดถูกแยกส่วนเพิ่มเติมโดยใช้โครมาโตกราฟีแบบซิลิกาเจล [12] ได้รับ HCF1 ที่ผลผลิต 1.14 เปอร์เซ็นต์ (น้ำหนัก/น้ำหนัก) สารสกัดถูกทำให้แห้งโดยการระเหยตัวทำละลายภายใต้แรงดันที่ลดลงที่ 50∘ C และสารสกัดที่แห้งถูกเก็บไว้ที่ -20∘ C ก่อนใช้

2.2. เคมีภัณฑ์.

แอนติบอดีต้าน𝛽-แอคติน, BSS (CAS 83-46- 5), ค็อกเทลตัวยับยั้งโปรตีเอส และค็อกเทลสารยับยั้งฟอสฟาเตส 3 ถูกซื้อมาจากซิกมา (เซนต์หลุยส์, มิสซูรี) แอนติบอดีต้าน AMPK𝛼1/2, แอนติบอดีต้าน p-AMPK𝛼1/2, แอนติบอดีต้าน PGC-1 (H-300), แอนติบอดีต้าน UCP3 (E-18), {{16} }[4- (2-พิเพอริดีน-1-อิล-เอทอกซี)-ฟีนิล)]-3-ไพริดิน-4-อิล-ไพร์ราโซโล[1,5-a ]-pyrimidine (CC) และ 6-ketocholestanol (kCh) ถูกซื้อจาก Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) ซื้อแอนติบอดี Anti-COX จาก Cell Signaling (Danvers, MA) ซื้อแอนติบอดี Anti-lamin B1 จาก Abcam (Cambridge, MA) ซื้อน้ำยาทดสอบ Bio-Rad จาก Bio-Rad Laboratories (ริชมอนด์, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) ซื้อสารเคมีอื่นๆ ทั้งหมดจาก Sigma (St. Louis, MO, USA)

2.3. การเพาะเลี้ยงเซลล์.

C2C12 ซึ่งเป็นวัฒนธรรม myoblast ที่ได้มาจากกล้ามเนื้อโครงร่าง C3H [13] จาก American Type Culture Collection (ATCC) ได้รับความกรุณาจากศาสตราจารย์ Zhenguo Wu (แผนกวิทยาศาสตร์เพื่อชีวิต, HKUST) เซลล์เพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ Eagle's medium (DMEM) ของ Dulbecco (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, NY) เสริมด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ (v/v) fetal bovine serum (FBS), 100 IU/mL penicillin และ 100 𝜇g /มล. ของสเตรปโตมัยซิน และ NaHCO3 17 มิลลิโมลาร์ การแยกความแตกต่างของ C2C12 myoblasts กับ C2C12 myotubes ถูกเหนี่ยวนำโดยการแทนที่อาหารเลี้ยงเชื้อที่สมบูรณ์ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่ประกอบด้วย 2 เปอร์เซ็นต์ (v/v) เซรั่มม้า (HS) แทนที่จะเป็น 10 เปอร์เซ็นต์ (v/v) FBS เซลล์เติบโตภายใต้บรรยากาศ 5 เปอร์เซ็นต์ (v/v) CO2 ในอากาศที่ 37 องศาเซลเซียส

Cistancheมีผลการลดน้ำหนัก

2.4. การวิเคราะห์ทางชีวเคมีใน C2C12 Myotubes

2.4.1. เอ็มเอ็มพี

วัดศักย์ของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียโดยใช้สีย้อมแคตไอออนเรืองแสง 5,5 ,6,6 -เตตระคลอโร- 1,1 ,3,3 -เตตระเอทิลเบนซิมิดาโซลิล-คาร์โบไซยานีน ไอโอไดด์ (JC- 1) [14]. เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงที่ความหนาแน่น 10 × 104 เซลล์ในเพลตไมโครไทเตอร์ 96-หลุม หลังจากการยึดติดที่เสถียร เซลล์ถูกทำให้คงสภาพไว้ด้วย 20 𝜇M JC-1 (ละลายในอาหารเลี้ยงเชื้อ) ที่ 37∘ C เป็นเวลา 10 นาที หลังการย้อมสี เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วยสารละลายเกลือที่สมดุลของแฮงค์ (HBSS) เสริมด้วยโบวีนซีรัมอัลบูมิน (BSA) 0.1 เปอร์เซ็นต์ การวัด MMP เริ่มต้นโดยการเติมสื่อที่ประกอบด้วย HCF1/BSS ปริมาณ J-aggregate ของโมเลกุล JC-1 ซึ่งก่อตัวในเยื่อหุ้มชั้นในของไมโตคอนเดรียที่มีศักยภาพของเมมเบรนสูง ถูกกำหนดโดยการตรวจสอบการเรืองแสงสีแดงของ JC-1 (เช่น 485 nm/Em 580 nm) - ยาเสริมและยาทางเลือกพื้นฐาน 3 ที่อุณหภูมิ 37∘ C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง MMP ถูกประเมินโดยการลบความเข้มของการเรืองแสงของตัวอย่างเปล่า (กล่าวคือ มีตัวกลางเท่านั้น) ออกจากความเข้มของการเรืองแสงของตัวอย่างที่ทดสอบ ค่า MMP ของเซลล์ที่ฟักตัวด้วย HCF1/BSS ถูกทำให้เป็นมาตรฐานด้วยค่าควบคุมที่บ่มที่ไม่ใช่ HCF1/BSS ตามลำดับ และแสดงเป็นตัวควบคุมแบบเปอร์เซ็นต์

2.4.2. การเปิดใช้งานอะดีโนซีนโมโนฟอสเฟตขึ้นอยู่กับโปรตีนไคเนส (AMPK)

ไมโอทิวบ์ C2C12 ถูกเพาะ (1.5 × 105 เซลล์) ในไมโครไทเตอร์เพลต 6-หลุม หลังจากการยึดติดที่เสถียร เซลล์ถูกบ่มล่วงหน้าด้วยตัวกลางที่ประกอบด้วย HCF1/BSS เป็นเวลา 8 ชั่วโมง จากนั้นเซลล์ที่ฟักไว้ล่วงหน้าถูก lysed ด้วย 300 𝜇L ของโซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต- (SDS-) ไลซิสบัฟเฟอร์ (20 มิลลิโมลาร์ Tris-Cl, 2 มิลลิโมลาร์ กรดเอทิลีนไดอะมีนเตตระอะซิติก (EDTA), 3 มิลลิโมลาร์ของกรดเอทิลีนไกลคอลเตตระอะซิติก (EGTA), 1 เปอร์เซ็นต์ (w/ v) Triton X- 100, กลีเซอรอล 10 เปอร์เซ็นต์ (w/v), SDS 5 เปอร์เซ็นต์, ไดไทโอไทรอิทอล 1 มิลลิโมลาร์ (DTT), ค็อกเทลตัวยับยั้งโปรตีเอส และค็อกเทลสารยับยั้งฟอสฟาเตส 3, pH 7.5) ไลเซตถูกหมุนเหวี่ยงเพิ่มเติมที่ 12000 ×g ที่ 4∘ C เป็นเวลา 10 นาทีเพื่อขจัดเศษเซลล์ ขอบเขตของการกระตุ้น AMPK ประเมินจากอัตราส่วนสัมพัทธ์ของฟอสเฟอร์-AMPK𝛼 (p-AMPK) และ AMPK𝛼 โดยการวิเคราะห์ Western blot โดยใช้แอนติบอดีต้าน p-AMPK𝛼1/2 และแอนติบอดีต้าน AMPK𝛼1/2 หลังการวิเคราะห์ SDS-PAGE ด้วย เจลแยกสารอะคริลาไมด์ 10 เปอร์เซ็นต์ (v/v) เซลล์ไลเซท (20 ไมโครกรัม) ถูกโหลดและ 𝛽- แอคตินถูกใช้เป็นเครื่องหมายอ้างอิง แถบโปรตีนที่ย้อมภูมิคุ้มกันถูกวิเคราะห์โดยการวัดความหนาแน่น (Quantiscan, Biosoft) และปริมาณ (หน่วยตามอำเภอใจ) ของ p-AMPK𝛼 และ AMPK𝛼 ถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดยอ้างอิงถึงระดับ 𝛽-แอคติน (หน่วยตามอำเภอใจ) ในตัวอย่าง

2.4.3. PGC-1 การเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์

ไมโอทิวบ์ C2C12 ถูกเพาะเลี้ยงที่ความหนาแน่น 20×106 เซลล์ในเพลตเพาะเลี้ยง 100 มม. หลังจาก 8 ชม. เซลล์ก่อนการบ่ม HCF1/BSS ถูกทริปซิไนซ์และบ่มด้วยบัฟเฟอร์ไฮโปโทนิกที่เย็นด้วยน้ำแข็ง 1 มล. (10 mM HEPES, 1.5 mM KCl และ 1.5 mM MgCl2, pH 7.9) ที่ 4∘C เป็นเวลา 10 นาที หลังจากการฟักตัว เซลล์ถูกรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 500 ×g ที่ 4∘ C เป็นเวลา 10 นาที เซลล์ที่เก็บรวบรวมถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์ไฮโปโทนิก 300 ไมโครลิตร เสริมด้วย DTT 0.5 มิลลิโมลาร์, โนนิล ฟีนอกซี-โพลีเอทอกซีเอธานอล 0.1 เปอร์เซ็นต์ (น้ำหนัก/ปริมาตร) (NP-40} เปอร์เซ็นต์ (w/v) และค็อกเทลสารยับยั้งโปรตีเอสเพื่อช่วยอำนวยความสะดวกในการสกัดโปรตีน cytosolic ที่ละลายได้ . ไลเซตที่เป็นผลลัพธ์ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 12000 × g ที่ 4∘ C เป็นเวลา 1 นาทีเพื่อให้ได้เศษส่วนของไซโตซอล (supernatant) และนิวเคลียร์ (เม็ด) การแยกโปรตีนนิวเคลียร์ทำได้สำเร็จโดยการบ่มเม็ดด้วยบัฟเฟอร์ไฮเปอร์โทนิกที่เย็นด้วยน้ำแข็ง 25 𝜇L (20 mM HEPES, 25 เปอร์เซ็นต์ (w/v) กลีเซอรอล, 400 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT และ protease inhibitor cocktail, pH 7.9) ที่ 4∘ C เป็นเวลา 30 นาที ตามด้วยการหมุนเหวี่ยงที่ 12000 ×g ที่ 4∘ C เป็นเวลา 5 นาที ขอบเขตของการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ PGC-1 ประเมินจากอัตราส่วนสัมพัทธ์ของระดับ PGC-1 ในเศษส่วนไซโตซอลและนิวเคลียร์โดยใช้การวิเคราะห์ Western blot ตามการวิเคราะห์ SDS-PAGE ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น โหลดทั้งเศษส่วนไซโตซอลและนิวเคลียร์ (20 ไมโครกรัม) โดย 𝛽-แอคตินและลามิน B1 ถูกใช้เป็นเครื่องหมายอ้างอิงไซโตซอลและนิวเคลียร์ตามลำดับ ปริมาณ (หน่วยโดยพลการ) ของ PGC-1 ถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดยอ้างอิงถึงระดับ 𝛽-actin และ lamin B1 ตามลำดับ (หน่วยโดยพลการ) ในตัวอย่าง

2.4.4. Mitochondrial Uncoupling Protein 3 (UCP3) และการแสดงออกของ Cytochrome c Oxidase (COX)

C2C12 myotubes ถูกเพาะ (2.0 × 106 เซลล์) ในจานเพาะเลี้ยง 100 มม. หลังจากการยึดติดที่เสถียร เซลล์ถูกบ่มล่วงหน้าด้วย HCF1/BSS ที่มีตัวกลางที่ 37 C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง หลังการกำจัดตัวกลางที่ประกอบด้วย HCF1/BSS เซลล์ถูกทริปซิไนซ์และสลายโดยการเติมบัฟเฟอร์ SDS-lysis 300 มล. เซลล์ไลเซตถูกหมุนเหวี่ยงที่ 12000 ×g ที่ 4∘ C เป็นเวลา 10 นาทีเพื่อขจัดเศษเซลล์ ระดับ UCP3 และ COX ในส่วนลอยเหนือตะกอนถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์ Western blot โดยใช้แอนติบอดีต้าน UCP3 (E- 18) และแอนติบอดีต้าน COX ตามการวิเคราะห์ SDS-PAGE ตามที่อธิบายข้างต้น เซลล์ไลเซต (50 ไมโครกรัม) ถูกโหลดและ 𝛽-แอคตินถูกใช้เป็นเครื่องหมายอ้างอิง ปริมาณ (หน่วยตามอำเภอใจ) ของ UCP3 และ COX ถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดยอ้างอิงถึงระดับ 𝛽-แอคติน (หน่วยตามอำเภอใจ) ในตัวอย่าง

2.5. การดูแลสัตว์.

หนูเมาส์ ICR (8 สัปดาห์; 30 ถึง 35 กรัมสำหรับผู้ชายและ 25 ถึง 30 กรัมสำหรับเพศเมีย) ได้รับการดูแลภายใต้วงจรมืด/แสง 12 ชั่วโมงในสภาพแวดล้อมที่ควบคุมด้วยอากาศ/ความชื้นที่อุณหภูมิประมาณ 22∘ C และอนุญาตให้อาหารและน้ำโดยไม่จำกัด ในสถานดูแลสัตว์และพืช (APCF) ที่มหาวิทยาลัยวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีฮ่องกง (HKUST) ขั้นตอนการทดลองทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการปฏิบัติการวิจัย (HKUST) (การอนุมัติโปรโตคอลสำหรับสัตว์หมายเลข 2013049 วันที่อนุมัติ: 25 กันยายน 2013 ระยะเวลาการทดลอง: 3 ปี)

2.6. โปรโตคอลการรักษา

เพื่อตรวจสอบผลของ 6-keto-cholestanol (kCh) ต่อ HCF1-ที่เหนี่ยวนำให้น้ำหนักลดลงในหนูที่ได้รับ HFD สัตว์ได้รับการสุ่มให้เป็น 6 กลุ่ม โดยมีหนู 10-15 ตัวในแต่ละกลุ่ม: (1 ) อาหารปกติ (ND, พลังงาน 13 เปอร์เซ็นต์ที่ได้จากไขมัน, ซื้อจาก LabDiet, ผลิตภัณฑ์หมายเลข 5010) ควบคุม; (2) ND บวก kCh (ในขนาดรายวัน 9 มก./กก.); (3) HFD (พลังงาน 60 เปอร์เซ็นต์มาจากไขมัน ซื้อจาก Research Diet Inc. หมายเลขผลิตภัณฑ์ D12492) (4) HFD บวก HCF1 (ในขนาดรายวัน 45 มก./กก.); (5) HFD บวก kCh; และ (6) HFD บวก HCF1 บวก kCh HCF1 ที่ขนาดยารายวันที่ 45 มก./กก. แสดงให้เห็นว่าทำให้น้ำหนักลดลงอย่างมีนัยสำคัญในหนูเพศผู้ [4] ในขณะที่พบว่า kCh ที่ขนาดยาต่อวัน 9 มก./กก. จะยกเลิก HCF1- ทำให้เกิดผลการคลายตัวในไมโตคอนเดรียที่แยกได้จากกล้ามเนื้อโครงร่างของหนูเมาส์ (ไม่แสดงข้อมูล) สัตว์ถูกบริหารให้ในกระเพาะอาหาร kCh, HCF1 หรือ HCF1/kCh, 5 วันต่อสัปดาห์ เป็นเวลา 8 สัปดาห์ (กล่าวคือ สำหรับขนาดยาทั้งหมด 40 ขนาด) หนูควบคุมได้รับรถ (น้ำมันมะกอก) เท่านั้น น้ำหนักตัวและการบริโภคอาหารของหนูได้รับการตรวจสอบทุกสัปดาห์ระหว่างการทดลอง การเปลี่ยนแปลงของน้ำหนักตัวถูกหาปริมาณโดยการคำนวณพื้นที่ใต้เส้นโค้ง (AUC) ของกราฟที่แสดงเปอร์เซ็นต์น้ำหนักตัวเริ่มต้นเทียบกับเวลา (สัปดาห์ที่ 1 ถึง 8) และแสดงเป็นหน่วยตามอำเภอใจ หนูเมาส์ถูกสังเวยโดยปากมดลูกเคลื่อน 24 ชั่วโมงหลังจากการให้ยาครั้งสุดท้าย (ที่มี kCh, HCF1 หรือ HCF1/kCh) หลังจากการอดอาหารข้ามคืน ตัวอย่างของกล้ามเนื้อน่องถูกตัดออกเพื่อวัดการหายใจของไมโตคอนเดรีย แผ่นไขมัน (อวัยวะสืบพันธุ์ ไขมันช่องท้อง และไขมันในช่องท้อง) ถูกผ่าและชั่งน้ำหนัก อัตราส่วนของน้ำหนักแผ่นไขมันเฉพาะต่อน้ำหนักตัวถูกประมาณและแสดงเป็น "ดัชนีแผ่นไขมัน"

Cistancheเป็นสมุนไพรธรรมชาติที่มีผลการลดน้ำหนัก

2.7. การวิเคราะห์ทางชีวเคมีในหนู

2.7.1. การเตรียมตัวอย่าง

เนื้อเยื่อของกล้ามเนื้อน่องบดละเอียดถูกผสมกับสารละลายคอลลาเจนเนส 10 มิลลิลิตร (0.075 เปอร์เซ็นต์ (w/v)) ในบัฟเฟอร์ (100 มิลลิโมลาร์ KCl, 50 มิลลิโมลาร์ MOPS, pH 7.2) และของผสมถูก ฟักที่ 4∘ C เป็นเวลา 20 นาที ของผสมเนื้อเยื่อที่ถูกย่อยถูกหมุนเหวี่ยงที่ 600 ×g ที่ 4∘ C เป็นเวลา 20 นาที supernatant ถูกลบออก; เนื้อเยื่อที่ย่อยแล้วผสมกับบัฟเฟอร์ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันเย็น 20 มล. (ซูโครส 50 มิลลิโมลาร์, แมนนิทอล 200 มิลลิโมลาร์, KH2PO4 5 มิลลิโมลาร์, EGTA 1 มิลลิโมลาร์, และ MOPS 5 มิลลิโมลาร์, pH 7.2) และถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันบนน้ำแข็งด้วยเครื่องผสมแก้วเทฟลอน ที่ 4000 รอบต่อนาทีสำหรับ 25 ถึง 30 จังหวะที่สมบูรณ์ จากนั้นโฮโมจีเนตถูกหมุนเหวี่ยงที่ 600 ×g ที่ 4∘ C เป็นเวลา 10 นาที โดยได้เศษส่วนที่ไม่มีนิวเคลียส (ส่วนลอยเหนือตะกอน) เม็ดไมโตคอนเดรียถูกเตรียมจากการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันของกล้ามเนื้อโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 9200 × g ที่ 4∘ C เป็นเวลา 30 นาที เศษส่วนของไมโตคอนเดรียได้มาจากการแขวนตะกอนไว้ในบัฟเฟอร์ที่มี 125 mM KCl, 10 mM Tris-Base, 2 mM KH2PO4, 0.5 mM EGTA และ 20 mM MOPS, pH 7.5 [15]

2.7.2. การหายใจของไมโตคอนเดรีย

อัตราการหายใจในไมโตคอนเดรียที่แยกได้จากกล้ามเนื้อโครงร่างของเมาส์ถูกกำหนดตามที่ Wong และ Ko [12] อธิบาย โดยสังเขป การหายใจของไมโตคอนเดรียถูกวัดแบบโพลาโรกราฟิกโดยใช้อิเล็กโทรดชนิดคลาร์ก (Hansatech Instruments, Norfolk) ที่ 30 C เศษส่วนของไมโตคอนเดรีย (โปรตีน 1 มก./มล.) ถูกบ่มในบัฟเฟอร์การหายใจ (3{{17} } mM KCl, 6 mM MgCl2, 75 mM ซูโครส, 1 mM EDTA และ 20 mM KH2PO4, pH 7.0) สารละลายของพื้นผิวที่มีโซเดียม ไพรูเวต 15 มิลลิโมลาร์และโซเดียม มาเลต 5 มิลลิโมลาร์ถูกเติมลงไป หลังจากการปรับสมดุล การหายใจในสภาวะที่ 3 เริ่มต้นขึ้นโดยการเพิ่ม ADP (ความเข้มข้นสุดท้าย 0.6 mM) เมื่อใช้ ADP ที่เพิ่มทั้งหมดสำหรับการสร้าง ATP แล้ว oligomycin จะถูกเติมเพื่อกระตุ้นการหายใจในสถานะที่ 4 อัตราส่วนการควบคุมการหายใจ (RCR) ประเมินโดยการคำนวณอัตราส่วนของรัฐ 3 ต่อ 4 อัตราการหายใจ [16]

2.7.3. การแสดงออกของ Mitochondrial UCP3 ในกล้ามเนื้อโครงร่างของเมาส์

ระดับ UCP3 ของไมโตคอนเดรียถูกประเมินโดยการวิเคราะห์ Western blot โดยใช้แอนติบอดีต้าน UCP3 (E-18) ตามการวิเคราะห์ SDS PAGE ของเศษไมโตคอนเดรีย โดยใช้เจลแยกสารอะคริลาไมด์ 10 เปอร์เซ็นต์ เศษส่วนของไมโตคอนเดรียที่แยกได้จากกล้ามเนื้อโครงร่างของหนูเมาส์ (∼60 𝜇g) ถูกนำไปใช้กับเจลและไซโตโครม ซี ออกซิเดส (COX) ถูกใช้เป็นเครื่องหมายอ้างอิง แถบโปรตีนที่ย้อมภูมิคุ้มกันถูกวิเคราะห์โดย densitometry และปริมาณ (หน่วยโดยพลการ) ของ UCP3 ทำให้เป็นมาตรฐานโดยอ้างอิงถึงระดับ COX (หน่วยโดยพลการ) ในตัวอย่าง

2.8. การทดสอบโปรตีน

ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดหาโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน Bio-Rad อะลิควอต (10 ไมโครลิตร) ของตัวอย่างไมโตคอนเดรีย/เซลล์ไลเซตถูกเจือจางด้วยน้ำ 40 ไมโครลิตร จากนั้นจึงเติมส่วนลิควอต (10 𝜇L) ของตัวอย่างที่เจือจางลงในหลุมของเพลตไมโครไตเตอร์ 96-หลุม ตามด้วยการเพิ่ม 200 𝜇L ของรีเอเจนต์สำหรับการสอบวิเคราะห์ Bio-Rad ที่เจือจาง (5-การเจือจางแบบเท่า) ของผสมถูกปล่อยให้ยืนที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที และจากนั้นวัดค่าการดูดกลืนแสงของของผสมปฏิกิริยาที่ 570 นาโนเมตร ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดจากกราฟการปรับเทียบโดยใช้ bovine serum albumin (BSA) เป็นมาตรฐาน

2.9. การวิเคราะห์ทางสถิติ.

ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ข้อผิดพลาดมาตรฐานของค่าเฉลี่ย (SEM) เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น วิเคราะห์ข้อมูลโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA ทางเดียว) เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น และตรวจพบความแตกต่างระหว่างกลุ่มโดยใช้การทดสอบช่วง Tukey ด้วย 𝑃<>

CistancheDeserticola มีเอฟเฟกต์มากมาย

3. ผลลัพธ์

3.1. ผลของ HCF1/BSS ต่อ MMP ใน C2C12 Myotubes

การฟักตัวของตัวแยกสารเคมี คาร์บอนิล ไซยาไนด์ {{0}} (ไตรฟลูออโรเมทอกซี) ฟีนิลไฮดราโซน (FCCP) ที่ความเข้มข้น 1 𝜇M ทำให้เกิดการลดลงที่ขึ้นกับเวลาใน MMP โดยมีขอบเขตการลดลงอยู่ที่ 29 เปอร์เซ็นต์ที่ จุดสิ้นสุดของการวัด (รูปที่ 1 และ 2) ในทางตรงกันข้าม HCF1 และ BSS ที่ความเข้มข้น 30 ng/mL และ 10 𝜇M เพิ่ม MMP ขึ้น 5 และ 4 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับในช่วง 10 นาทีแรกของการฟักตัวของ HCF1/BSS (รูปที่ 1 และ 2) . การเพิ่มขึ้นที่เกิดจาก HCF1/BSS เริ่มต้นตามมาด้วยการลดลงทีละน้อยใน MMP เป็น 95 และ 93 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับของค่าเริ่มต้นตามลำดับเมื่อสิ้นสุดการวัด (60 นาที HCF1/BSS incubation) (รูปที่ 1 และ 2) การเปลี่ยนแปลงที่เกิดจาก HCF1/BSS ใน MMP มีลักษณะเฉพาะโดยการใช้สารยับยั้งจำเพาะ Rotenone (0.1 nM) สารยับยั้ง mitochondrial complex I และคอเลสเตอรอล (0.3 𝜇M) ซึ่งเป็นตัวเสริมความแข็งแกร่งของเมมเบรน ยับยั้งการเปลี่ยนแปลง MMP ที่เกิดจาก HCF1/BSS ตลอดการวัด (รูปที่ 1 และ 2) ในทางกลับกัน การสร้างเหรียญร่วมกับตัวยับยั้งเฉพาะของ UCPs, GDP, ตัวเชื่อมต่อเคมี, 6-ketocholestanol (kCh) หรือสารต้านอนุมูลอิสระ, dimethyl thiourea (DMTU) ได้ลด HCF1- ที่เหนี่ยวนำให้ลดลงใน MMP ภายหลังการฟักตัวของ HCF1 (รูปที่ 1) GDP, kCh และ DMTU ยังลดการลดลงของ MMP ที่เกิดจาก BSS ในเวลาต่อมาของการฟักตัวของ BSS โดยมีค่า MMP เท่ากับ 110 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเทียบกับการควบคุมที่จับคู่เวลาตามลำดับ (รูปที่ 2)

3.2. ผลของ HCF1/BSS ต่อการเปิดใช้งาน AMPK ใน C2C12 Myotubes

ตรวจสอบผลกระทบของ HCF1 ต่อ AMPK โดยการวัดอัตราส่วนของ AMPK𝛼 ที่มีฟอสโฟรีเลต (p-AMPK𝛼) ต่อ AMPK𝛼 ทั้งหมด (AMPK𝛼) ซึ่งระบุขอบเขตของการเปิดใช้งาน AMPK การฟักตัวด้วย HCF1 ที่ความเข้มข้น 30 และ 100 ng/mL ทำให้เกิดการกระตุ้น AMPK ที่เพิ่มขึ้นตามเวลา โดยขอบเขตของการเพิ่มขึ้นเหล่านี้เป็น 32 และ 43 เปอร์เซ็นต์ที่ 8 ชั่วโมงของการฟักตัว HCF1 ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับเวลาตามลำดับ การควบคุมที่ตรงกัน (รูปที่ 3) ควบคู่ไปกับ HCF1 การฟักไข่ล่วงหน้าด้วย BSS (10 𝜇M) เพิ่มขอบเขตการเปิดใช้งาน AMPK อย่างมีนัยสำคัญ 25 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้ฟักก่อน (รูปที่ 5) การเปิดใช้งาน AMPK ที่เกิดจาก HCF1/BSS ใน myotubes C2C12 ถูกยกเลิกโดยสมบูรณ์โดยการสร้างเหรียญร่วมกับ kCh (ตัวแยกสัญญาณ) หรือ DMTU (รูปที่ 4 และ 5 ตารางที่ 1 และ 2 ของวัสดุเสริมที่มีออนไลน์

3.3. ผลของ HCF1/BSS ต่อ PGC-1 การเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ใน C2C12 Myotubes

การกระตุ้น PGC-1 สามารถวัดโดยอ้อมตามขอบเขตของการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ PGC-1 การฟักไข่ล่วงหน้าด้วย HCF1 และ BSS ช่วยเพิ่ม PGC-1 การเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์อย่างมีนัยสำคัญ 25 และ 28 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ โดยเห็นได้จากอัตราส่วนที่เพิ่มขึ้นของ PGC-1 ในนิวเคลียสต่อไซโตพลาสซึม (รูปที่ 6 และ 7) ตัวยับยั้งจำเพาะของ AMPK, 6-[4-(2-piperidine-1-yl-ethoxy)-phenyl)]-3-pyridin-4-ylpyrrazolo[ 1,5-a]-pyrimidine (CC) ที่ความเข้มข้น 10 𝜇M ยับยั้งการเพิ่มขึ้นจาก HCF1/BSS ใน PGC-1 การเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์โดย 156 และ 235 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับใน C2C12 myotubes ( ตารางที่ 1 และ 2) การโยกย้ายนิวเคลียร์ที่เหนี่ยวนำโดย HCF1/BSS ของ PGC-1 ยังป้องกันได้โดยการสร้างเหรียญกษาปณ์ด้วย kCh หรือ DMTU (รูปที่ 6 และ 7, ตารางที่ 1 และ 2 ของวัสดุเสริม)

3.4. ผลของ HCF1/BSS ต่อการแสดงออกของ Mitochondrial UCP3 และ Cytochrome c Oxidase (COX) ใน Myotubes C2C12

เพื่อตรวจสอบความสำคัญของการกระตุ้นที่เกิดจาก HCF1/BSS ในวิถี AMPK/PGC-1 ผลของ HCF1/BSS ต่อการคลายไมโตคอนเดรียและการสร้างชีวภาพ โดยประเมินโดยระดับของ UCP3 และ COX (ตัวบ่งชี้ที่เชื่อถือได้ของมวลไมโตคอนเดรีย ในเซลล์) ตามลำดับ ถูกตรวจสอบ การฟักไข่ล่วงหน้าด้วย HCF1/BSS จะเพิ่มระดับ UCP3 และ COX ของไมโตคอนเดรียอย่างมีนัยสำคัญ โดยเพิ่มขึ้น 37 และ 23 เปอร์เซ็นต์ (ใน myotubes ที่ฟักแล้วของ HCF1-) (รูปที่ 8) และ 52 และ 24 เปอร์เซ็นต์ (ใน myotubes ที่บ่มด้วย BSS ) (รูปที่ 9) ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้ฟักก่อนตามลำดับ HCF1/BSS ที่เหนี่ยวนำให้เกิดระดับ UCP3 และ COX ได้รับการป้องกันอย่างสมบูรณ์โดยการสร้าง HCF1 ร่วมกับ kCh, DMTU หรือ

CC (ตารางที่ 1 และ 2 ของวัสดุเสริม) ควรสังเกตว่าความเข้มข้นของ kCh และ CC ที่ใช้ในการทดลองนี้ถูกปรับเป็น 20 และ 1 𝜇M ตามลำดับ เพื่อหลีกเลี่ยงผลกระทบที่เป็นพิษต่อเซลล์ของ kCh และ CC ต่อ C2C12 myotubes (การสังเกตที่ไม่ได้เผยแพร่)

3.5. บทบาทของการแยกตัวของไมโตคอนเดรียใน HCF1-การลดน้ำหนักที่เหนี่ยวนำในหนูอ้วนที่เกิดจาก HFD

บทบาทที่เป็นไปได้ของการคลายไมโตคอนเดรียในการลดน้ำหนักที่เกิดจาก HCF1- ถูกตรวจสอบเพิ่มเติมโดยการใช้ตัวเชื่อมเคมี kCh (ตารางที่ 3 ของวัสดุเสริม) HCF1 กระตุ้นให้เกิดการคลายตัวของไมโตคอนเดรียในกล้ามเนื้อโครงร่างของหนู โดยเห็นได้จากการลดลงของอัตราส่วนการควบคุมการหายใจของไมโตคอนเดรีย (RCR) และการเพิ่มขึ้นของการแสดงออกของ UCP3 ของไมโตคอนเดรียในหนูที่เลี้ยงด้วย ND และ HFD kCh per se (ในขนาดรายวัน 9 มก./กก.) ช่วยเพิ่ม mitochondrial RCR ได้อย่างมีนัยสำคัญถึง 23 เปอร์เซ็นต์ในหนูที่ได้รับ ND-fed (แต่ไม่ใช่ในหนู HFDfed) การแยกตัวของไมโตคอนเดรียที่เหนี่ยวนำโดย HCF1-ในหนูเมาส์ที่เลี้ยงด้วย HFD ถูกยับยั้งอย่างสมบูรณ์โดยการบำบัดด้วย kCh HCF1 ทำให้น้ำหนักลดลงทั้งในหนูที่เลี้ยงด้วย ND- และ HFD ผลกระทบนี้สัมพันธ์กับการปราบปรามการเพิ่มขึ้นของดัชนีไขมันในช่องท้องที่เกิดจาก HFD ตรงกันข้ามกับ HCF1 kCh ไม่มีผลต่อการเพิ่มของน้ำหนักในสัตว์ ND- และ HFD ในระหว่าง 8- สัปดาห์ของการทดลอง การบริหาร kCh ร่วมกับ HCF1 ร่วมกันทำให้ HCF1- เกิดผลกดทับต่อ HFD ที่กระตุ้นให้น้ำหนักตัวเพิ่มขึ้นและดัชนีไขมันในช่องท้องในหนูทดลอง (ตารางที่ 3 ของวัสดุเสริม)