PART Ⅰ: บทบาทของ SIK1 ในการเปลี่ยนจากการบาดเจ็บของไตเฉียบพลันไปสู่โรคไตเรื้อรัง

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

Jinxiu Hul, JiaoQiaot, Qun Yul, Bing Liu1 และคณะ

พื้นหลัง

ไตบาดเจ็บเฉียบพลัน(AKI) โรคทั่วไปที่มีอัตราการกรองไตลดลง (GFR) และการเพิ่มขึ้นของครีเอตินินในซีรัม [1] ถือเป็นปัจจัยเสี่ยงสำหรับการพัฒนาและความก้าวหน้าของ CKD[2,3] ล่าสุด AKI-CKD(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง) การเปลี่ยนแปลงกลายเป็นจุดสนใจในการศึกษาโรคไต แม้ว่าจะมีรายงานว่าการอักเสบ EMT และพังผืดมีบทบาทสำคัญในความก้าวหน้าของ AKI-CKD(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)การเปลี่ยนแปลง [4,5] กลไกระดับโมเลกุลที่แน่นอนของ AKI-CKD(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)การเปลี่ยนแปลงยังไม่ชัดเจน

cistanche รักษาโรคไตและป้องกันภาวะไตวาย

ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1(SIK1) เป็นสมาชิกของกลุ่มโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นด้วย AMP (AMPKs) ซึ่งมีบทบาทสำคัญในการควบคุมการเผาผลาญ การอยู่รอดของเซลล์ และการเจริญเติบโต [6, 7] จากการศึกษาพบว่าการยับยั้ง SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ส่งเสริม EMT ซึ่งนำไปสู่การอพยพและการแพร่กระจายของเนื้องอก[8-10] นอกจากนี้ยังมีรายงานว่า SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ควบคุมการกระตุ้น TLR4-ในทางลบของ NF-kB และการแสดงออกที่ลดทอนของไซโตไคน์ที่เกิดจากการอักเสบ [11] นอกจากนี้ หลักฐานที่เกิดขึ้นใหม่แสดงให้เห็นความเชื่อมโยงระหว่าง SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)และโรคไต [6,12]. ตัวอย่างเช่น การปรับ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ย้อนกลับการเพิ่มจำนวนเซลล์ mesangial ที่เหนี่ยวนำโดยกลูโคสสูงและการสะสมเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) โดยการยับยั้งการแสดงออกของ FN และ PAI-1 ซึ่งทั้งสองอย่างนี้เกี่ยวข้องกับความผิดปกติของไฟโบรติก เช่น glomerulosclerosis [6,13] ดังนั้นเราจึงสันนิษฐานว่า SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)อาจเกี่ยวข้องกับความก้าวหน้าของ AKI-CKD(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)การเปลี่ยนแปลงซึ่งเป็นลักษณะของ EMT การอักเสบและการเป็นพังผืดของไต

วิถีของ WNT/ -catenin เป็นวิถีการส่งสัญญาณที่ซับซ้อนและได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างสูง ซึ่งควบคุมกระบวนการทางชีววิทยาต่างๆ เช่น การพัฒนาอวัยวะ สภาวะสมดุลของเนื้อเยื่อ และการเกิดมะเร็ง [14, 15] แม้ว่าไตผู้ใหญ่ปกติจะเงียบ แต่พบว่าสามารถกระตุ้นได้ในโรคไตต่างๆ รวมถึงอาการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลัน โรคไตจากเบาหวาน โรคพังผืดคั่นระหว่างหน้า และโรคไตเรื้อรัง [16] นอกจากนี้ยังมีรายงานอีกด้วยว่าการปิดเสียงของทางเดิน WNT/ -catenin ช่วยรักษาภาวะพังผืดของไต ทำให้การลุกลามของ AKI-CKD ล่าช้า(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)ในการบาดเจ็บที่เกิดจาก I/R [17] แต่ไม่ว่าจะเป็น SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)สามารถเข้าร่วม AKI-CKD(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)การเปลี่ยนแปลงโดยการปรับเส้นทาง WNT/ -catenin ยังคงต้องชี้แจงเพิ่มเติม

หลักฐานที่เกิดขึ้นใหม่แสดงให้เห็นว่าหอยทากและ Twistl ซึ่งเป็นปัจจัยการถอดรหัส EMT มีบทบาทสำคัญในการเกิดโรคของพังผืดในไต[18-20] มีรายงานว่าการลบ Twistl หรือ Snail แบบมีเงื่อนไขในเซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้เคียงยับยั้ง EMT ซึ่งลดทอนการเกิดพังผืดคั่นระหว่างหน้าในการเกิดพังผืดของไตที่เกิดจากการทดลองในหนูทดลอง [21] เมื่อพิจารณาจาก Snail และ Twist1 เป็นโมเลกุลสำคัญที่อยู่ด้านล่างของเส้นทาง WNT/ -catenin เราคาดการณ์ว่าพวกมันอาจมีบทบาทสำคัญใน SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ไกล่เกลี่ย AKI-CKD(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)การเปลี่ยนแปลง

ดังนั้น ในการศึกษานี้ เราจึงมุ่งที่จะชี้แจงบทบาทและกลไกของ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1) ใน AKI-CKD(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)การเปลี่ยนแปลงซึ่งจะให้เป้าหมายการรักษาใหม่สำหรับการป้องกันทางคลินิกและการรักษาโรคพังผืดของไตและจะเป็นวิธีการใหม่ในการชะลอความก้าวหน้าของ AKI-CKD(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)การเปลี่ยนแปลง

cistanche รักษาโรคไต

วัสดุและวิธีการ

ผู้ป่วยและตัวอย่างเนื้อเยื่อ

การศึกษาได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยทางคลินิกของโรงพยาบาลมณฑลซานตงร่วมกับมหาวิทยาลัยชานตง เก็บตัวอย่างไตของมนุษย์จากผู้ป่วย AKI(ไตบาดเจ็บเฉียบพลัน) วินิจฉัยโดยอาศัยการตรวจชิ้นเนื้อไต และตัวอย่างไตในกลุ่มควบคุมได้มาจากเนื้อเยื่อที่เป็นพาราแคนเซอร์รัสของผู้ป่วยเนื้องอกในไตที่เข้ารับการผ่าตัด ตัวอย่างเนื้อเยื่อถูกเก็บรักษาไว้ในไนโตรเจนเหลวและผู้ป่วยทุกรายได้รับการลงนามยินยอมตามประกาศเฮลซิงกิ

การก่อสร้าง AAV9-Sik1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)

ไวรัสที่เกี่ยวข้องกับอะดีโนรีคอมบิแนนท์ (AAV9-Sik1) และการควบคุมไวรัสที่เกี่ยวข้องกับอะดีโน (AAV9-NC) ถูกสร้างขึ้นโดยยีนเคม (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) AAV รีคอมบิแนนท์9-ไวรัสเวกเตอร์ GV467 ที่เกี่ยวข้องกับอะดีโน Sik1 รวมถึงโปรโมเตอร์, บริเวณที่กำหนดรหัสแอนติบอดี, บริเวณที่กำหนดรหัสโปรตีนเรืองแสงสีเขียว EGFP และบริเวณกำหนดรหัสโปรตีนของแท็ก 3FLAG ความสามารถของเวกเตอร์ AAV9 ในการถ่ายทอดไตได้รับการตรวจสอบแล้ว (ไฟล์เพิ่มเติม 1)

สัตว์และวิธีการสร้างแบบจำลอง

โครงการทดลองสร้างแบบจำลองและติดตามผลได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของมหาวิทยาลัยชานตง หนูทดลอง C57BL/6 หนูอายุ 4-6 สัปดาห์และน้ำหนัก 15-20 ก. จัดหาให้โดยศูนย์สัตว์ทดลองของมหาวิทยาลัยซานตง และได้รับการจัดสรรแบบสุ่มเป็น 4 กลุ่ม: กลุ่มควบคุม (กลุ่มควบคุม), หนูปกติที่ได้รับการบำบัดด้วยกลุ่ม AA ( AA), หนู AA ที่บำบัดด้วย AAV9-กลุ่ม Sik1 (AAV9-Sik1 บวก AA), หนู AA ที่บำบัดด้วยกลุ่ม AAV9-NC (AAV9-NC บวก AA) . หนูเมาส์ในกลุ่ม AA ถูกฉีดด้วย AA (10 มก./กก.) ในช่องท้อง ในขณะที่หนูเมาส์ในกลุ่มควบคุมถูกฉีดด้วย PBS ในวันที่ 3, 7, 14 และ 28 หลังจากการฉีด AA ปัสสาวะ 24 ชั่วโมงของหนูถูกเก็บในกรงเมตาบอลิซึม และส่วนลอยเหนือตะกอนถูกเก็บไว้ที่ -20 องศา C หลังจากการปั่นแยก เลือดถูกหมุนเหวี่ยงที่ 3000r เป็นเวลา 10 นาที และส่วนลอยถูกเก็บไว้ที่ -20 องศา .24 ชั่วโมง โปรตีนในปัสสาวะ ครีเอตินินในซีรัม (Scr) และยูเรียไนโตรเจนในเลือด (BUN) ถูกวัดโดยเครื่องวิเคราะห์ทางชีวเคมีอัตโนมัติ ILSA ในซีรัม-1 และ TNF- ตรวจพบโดย ELSA จากนั้นหนูก็ถูกสังเวยและชั่งน้ำหนัก หลังจากนั้นไตก็ถูกตัดออกและชั่งน้ำหนัก ตัวอย่างไตทั้งหมดถูกแบ่งออกเป็นสองส่วน โดยส่วนหนึ่งได้รับการแก้ไขในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์สำหรับการย้อมสีทางเนื้อเยื่อ ในขณะที่อีกส่วนหนึ่งถูกเก็บไว้ต่ำกว่า -80 องศาสำหรับ PCR แบบเรียลไทม์และการตรวจจับ Western blot

มิญชวิทยาและอิมมูโนฮิสโตเคมี

หลังจากตรึงในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์แล้ว ตัวอย่างไตจะถูกทำให้แห้ง โปร่งใส ฝังอยู่ในพาราฟิน และแบ่งเป็นชิ้นหนา 4 ไมโครเมตร ต่อจากนั้น สไลด์ก็ถูกล้าง ให้น้ำ และย้อมสี สำหรับการวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อไต การย้อม HE การย้อมสี PAS และการย้อมสีไตรโครมของ Masson ถูกนำมาใช้ตามคำแนะนำของผู้ผลิต สำหรับการวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมิคัล ภาคส่วนถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่ต้าน SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)(51045-1-AP, Proteintech, USA), E-cadherin (20874-1-AP, Proteintech, USA), -SMA (ab32575, Abcam, USA), COL1(bs-10423R, Bioss กรุงปักกิ่ง ประเทศจีน)ที่อุณหภูมิ 4 องศาในชั่วข้ามคืน หลังจากการฟักไข่ด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิ DAB ถูกเติมลงไป ตามด้วยการทำสีทับทับด้วยนิวเคลียร์ด้วยฮีมาทอกซิลิน ในที่สุด ภาพถูกสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์(Leica, Germany). เปอร์เซ็นต์ของการย้อมสีที่เป็นบวกสำหรับ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1), E-cadherin, -SMA และ COLl วัดโดยใช้ซอฟต์แวร์ Image-Pro plus 6.0 เชิงปริมาณ (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) [22]

การเพาะเลี้ยงเซลล์และการรักษา

เซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้เคียงของมนุษย์ (HK2) ถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลาง DMEM (Gibco, USA) เสริมด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ของ fetal bovine serum (FBS) (Gibco, USA) และ 1 เปอร์เซ็นต์ penicillin-streptomycin (Sigma, USA) ที่ 37 องศาเซลเซียสใน บรรยากาศชื้นที่มี CO 5 เปอร์เซ็นต์,. กรด Aristolochic(AA)(Sigma, USA) ถูกละลายใน DMSO ถึง 1 มก./มล. และเซลล์ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นสุดท้ายที่ 10 ไมโครโมล/ลิตร, 20 ไมโครโมล/ลิตร, 40 ไมโครโมล/ลิตร และ 60 ไมโครโมล/ลิตร และ กลุ่มควบคุมได้รับการรักษาด้วย DMSO ในปริมาณเท่ากัน

การถ่ายโอนเวกเตอร์ Lentiviral และการถ่ายโอน siRNA lentiviral shRNA สร้างเป้าหมาย SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1), -catenin และ shRNA ที่มีสัญญาณรบกวน ตลอดจนเวคเตอร์การแสดงออกมากเกินไปของ lentiviral สำหรับ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)และเวกเตอร์ควบคุมว่างถูกสร้างขึ้นโดย Cyagen (กวางโจว ประเทศจีน) ลำดับเป้าหมายมีรายการดังต่อไปนี้: SIKI shRNA:5'-GCCGCGTGCATTGATTACTATC-3';

ประโยชน์ของ cistanche ทะเลทราย: การรักษาโรคไตเรื้อรัง

ผลลัพธ์

SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ถูกควบคุมใน AKI(ไตบาดเจ็บเฉียบพลัน)

พิจารณาว่า SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)มีบทบาทสำคัญในการบาดเจ็บที่ไต อันดับแรกเราตรวจพบการแสดงออกของ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ในเนื้อเยื่อไตของ AKI(ไตบาดเจ็บเฉียบพลัน)ผู้ป่วยและ AKI(ไตบาดเจ็บเฉียบพลัน)หนู การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีเผยให้เห็นว่า SIK1 . ไม่เพียงในผู้ป่วยแต่ในหนู(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)การแสดงออกของท่อไตในการควบคุมนั้นสูงกว่าใน AKI(ไตบาดเจ็บเฉียบพลัน)ซึ่งระบุว่า SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ถูกควบคุมในช่วง AKI(ไตบาดเจ็บเฉียบพลัน)(รูปที่.la,ข). นอกจากนี้เรายังทำการย้อมสีไตรโครมของ HE และ Masson เพื่อวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาในตัวอย่างไตของ AKI(ไตบาดเจ็บเฉียบพลัน)ผู้ป่วย (รูปที่ 1c) เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม พบว่าเซลล์เยื่อบุผิวท่อไตบวม การเสื่อมสภาพของหลอดเลือด และอาการบวมน้ำคั่นระหว่างหน้าถูกสังเกตพบในกลุ่ม AKI โดยการย้อมสี HE ยิ่งไปกว่านั้น เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมแล้ว พบว่าเซลล์ท่อที่แบนราบ เส้นขอบแปรงที่แยกออกจากกัน และผ้าลินินที่ขยายใหญ่ขึ้นในกลุ่ม AKI โดยการย้อมสีไตรโครมของ Masson เมื่อนำมารวมกันแล้ว ผลการวิจัยทั้งหมดนี้ชี้ให้เห็นว่า SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)อาจมีบทบาทในการบาดเจ็บของท่อ

รูปที่ 1 SIK1 ถูกควบคุมใน AKI(ไตบาดเจ็บเฉียบพลัน).ภาพการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีที่เป็นตัวแทนของ SIK1 ใน Control และ AKI(ไตบาดเจ็บเฉียบพลัน)ผู้ป่วย. แถบมาตราส่วน=50 μm กราฟแสดงการวิเคราะห์เชิงปริมาณของ SIK1 ในส่วนที่ย้อมด้วยอิมมูโนฮิสโตเคมี b ภาพการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีตัวแทนของ SIK1 ในการควบคุมและ AKI(ไตบาดเจ็บเฉียบพลัน)หนู แถบมาตราส่วน=50 μm กราฟแสดงการวิเคราะห์เชิงปริมาณของ SIK1 ในส่วนที่ย้อมด้วยอิมมูโนฮิสโตเคมี c ภาพตัวแทนของการย้อมสีไตรโครมของ HE และ Masson ในเนื้อเยื่อไตของ AKI(ไตบาดเจ็บเฉียบพลัน)ผู้ป่วย. แถบมาตราส่วน=10 μm ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±sd *P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ถูกควบคุมใน AKI-CKD . ที่เกิดจาก AA(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)หนูการเปลี่ยนแปลง

เพื่อให้ได้หนูรุ่น AKI-CKD(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)การเปลี่ยนแปลง เราฉีด AA เข้าไปในช่องท้องของหนู เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม หนูที่ได้รับการรักษาด้วย AA แสดงการผลิตที่เพิ่มขึ้นของปัจจัยการอักเสบ EMT และพังผืดของไต (รูปที่ 2a-d) นอกจากนี้ ดัชนีไต ซีรั่ม Scr, BUN และโปรตีนในปัสสาวะตลอด 24 ชั่วโมงที่เสริมด้วยการรักษาด้วย AA (รูปที่ 2e) นอกจากนี้ AA ทำให้โครงสร้างของไตบกพร่อง ส่งผลให้เซลล์เยื่อบุผิวท่อไตเสื่อม การขยายตัวของไลม์ และระดับที่แตกต่างกันของการสะสมของเส้นใยคอลลาเจนใน tubulointerstitium (รูปที่ 2f) ทั้งหมดข้างต้นบ่งชี้ว่า AKI-CKD . ที่เกิดจาก AA(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)สร้างแบบจำลองการเปลี่ยนแปลงสำเร็จแล้ว เพื่อสำรวจบทบาทของ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ใน AKI-CKD . ที่เกิดจาก AA(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง) การเปลี่ยนแปลง เราประเมินการแสดงออกในตัวอย่างไตของหนูที่ฉีดด้วย AA เราพบ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)และ p-SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)(Thr182) ลดลงในลักษณะที่ขึ้นกับเวลาหลังจากการฉีด AA (รูปที่ 2g) ซึ่งบ่งชี้ถึงบทบาทที่เป็นไปได้สำหรับ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ในการควบคุม AKI-CKD . ที่เกิดจาก AA(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)การเปลี่ยนแปลง

รูปที่ 2 SIK1 ถูกควบคุมใน AKI-CKD . ที่เกิดจาก AA(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)หนูการเปลี่ยนแปลงการวิเคราะห์ ELISA ของ IL-1 และการแสดงออกของ TNF- ในกลุ่มหนูต่างๆ b Western blot และการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ของการอักเสบและตัวบ่งชี้การเกิดพังผืด (การแสดงออกของ Caspase1/p20/p10, FN และ COL1); c Western blot และการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ของนิพจน์ EMT (E-cadherin, Vimentin และ -SMA) d ภาพการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีที่เป็นตัวแทนของ E-cadherin ในหนูกลุ่มต่างๆ แถบมาตราส่วน=50 μm กราฟแสดงการวิเคราะห์เชิงปริมาณของ E-cadherin ในส่วนที่ย้อมด้วยอิมมูโนฮิสโตเคมี e ดัชนีไต, Scr, BUN และระดับโปรตีนในปัสสาวะ 24 ชั่วโมงในกลุ่มหนูต่างๆ f การย้อมสีเนื้อเยื่อที่เป็นตัวแทน (HE, PAS และการย้อมสีไตรโครมของ Masson) ของเนื้อเยื่อไตในกลุ่มหนูต่างๆ แถบมาตราส่วน=50 μm. g การวิเคราะห์ Western blot ของระดับโปรตีน SIK1 และ p-SIK (Thr182) ในหนูเมาส์ C57BL/6 ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±sd *P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

การแสดงออกมากเกินไปของ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)บรรเทา AKI-CKD . ที่เกิดจาก AA(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)การเปลี่ยนแปลง

เพื่อระบุหน้าที่ของ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ใน AKI-CKD . ที่เกิดจาก AA(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)เปลี่ยน เราฉีด AAV9-SikI เข้าไปในหลอดเลือดดำส่วนหางของหนูเพื่อแสดง SIK1 มากเกินไป(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1). เราพบว่าหลังจากฉีด AAV9-Sik1 ความผิดปกติของไตที่เกิดจาก AA ดีขึ้นอย่างเห็นได้ชัด โดยสังเกตได้จากระดับดัชนีไต-ไต, Scr, BUN และโปรตีนในปัสสาวะ 24 ชั่วโมงที่ลดลง (รูปที่ 3a) PCR แบบเรียลไทม์เปิดเผยว่า AAV9-Sik1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)การตอบสนองการอักเสบที่เกิดจาก AA โล่งใจ (รูปที่ 3b) นอกจากนี้ AAV9-Sik1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ปรับปรุงความเสียหายทางจุลพยาธิวิทยาที่เกิดจาก AA อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 3c) นอกจากนี้ ผลการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมียังชี้ให้เห็นว่า AAV9-Sik1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)บรรเทาพังผืดคั่นระหว่างหน้าและ EMT ในกระบวนการของ AKI-CKD . ที่เกิดจาก AA(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)การเปลี่ยนแปลง (รูปที่ 3d) โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)มีบทบาทในการป้องกัน AKI-CKD . ที่เกิดจาก AA(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)การเปลี่ยนแปลง

ประโยชน์ต่อสุขภาพของ cistanche: ปรับปรุงการทำงานของไต

SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ถูกควบคุมน้อยลงในเซลล์ HK2 ที่ได้รับการรักษาด้วย AA จากการศึกษาจำนวนมากแสดงให้เห็นว่าท่อไตส่วนต้นของไตเป็นหนึ่งในเป้าหมายหลักของการบาดเจ็บใน AKI(ไตบาดเจ็บเฉียบพลัน)และการบาดเจ็บของท่อนำไข่อาจมีบทบาทสำคัญทางพยาธิสรีรวิทยาในการพัฒนา AKI-CKD(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)การเปลี่ยนแปลง เพื่อประเมินเพิ่มเติมว่า SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ถูกควบคุมในหลอดทดลอง เรามุ่งเน้นไปที่เซลล์ HK2 ในการศึกษานี้ โดยทำการทดสอบ CCK8 เราเลือก 10 ไมโครโมล/ลิตร AA เป็นความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการทดลองในครั้งต่อไป (ไฟล์เพิ่มเติม 2) อย่างต่อเนื่อง การรักษาด้วย AA แสดงการอักเสบที่เพิ่มขึ้น EMT และการเกิดพังผืดในเซลล์ HK2 (รูปที่ 4a-c) ซึ่งบ่งชี้ว่าเซลล์ HK2 ที่เหนี่ยวนำโดย AA ได้รับบาดเจ็บในหลอดทดลอง ต่อมาเราตรวจสอบระดับโปรตีนของ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)และพบว่า SIK1 . ลดลงอย่างเห็นได้ชัด(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)และ p-SIK1(Thr182) ในเซลล์ HK2 ต่อหน้า AA (รูปที่ 4d) นอกจากนี้เรายังตรวจพบตำแหน่งของ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)โปรตีนในเซลล์ HK2 ก่อนและหลังการสัมผัสกับ AA โดยการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ ในเซลล์ที่ไม่ถูกกระตุ้น SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)พบทั้งในนิวเคลียสและไซโตพลาสซึม เมื่อรักษาด้วย AA การแสดงออกของ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ลดลงและ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ค่อยๆ ตรวจพบในนิวเคลียส (ไฟล์เพิ่มเติม 3) โดยรวม ผลลัพธ์เหล่านี้อธิบายว่า SIK1 เกี่ยวข้องกับการบาดเจ็บของเซลล์ HK2 ที่เกิดจาก AA

รูปที่ 3 การแสดงออกที่มากเกินไปของ SIK1 บรรเทา AKI-CKD . ที่เกิดจาก AA(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)การเปลี่ยนแปลงก. ดัชนีไต, Scr, BUN และระดับโปรตีนในปัสสาวะ 24 ชั่วโมงในกลุ่มหนูต่างๆ b การวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ของระดับ Caspase 1 และ IL-1 mRNA ในกลุ่มหนูต่างๆ c HE, PAS และการย้อมสีไตรโครมของ Masson ถูกใช้เพื่อประเมินการเปลี่ยนแปลงทางเนื้อเยื่อวิทยาและขอบเขตของการเกิดพังผืดของ tubulointerstitial แถบมาตราส่วน=50 µm d ภาพการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีที่เป็นตัวแทนของโปรตีน E-cadherin, -SMA และ COLI ในหนูกลุ่มต่างๆ แถบมาตราส่วน=50 µm กราฟแสดงการวิเคราะห์เชิงปริมาณของ E-cadherin, -SMA และ COL1 ในส่วนที่ย้อมด้วยอิมมูโนฮิสโตเคมี ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± sd *P< 0.05="" vs="" control,="">< 0.05="" vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

สารสกัดจากซิสแทนเช่: ปรับปรุงการทำงานของไต

การแสดงออกมากเกินไปของ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)การบาดเจ็บของเซลล์ HK2 ที่เกิดจาก AA ดีขึ้น

เพื่อชี้แจงบทบาทของ SIK1 . เพิ่มเติม(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ในการบาดเจ็บของเซลล์ HK2 ที่เกิดจาก AA เราสร้างสายเซลล์ที่ควบคุม SIK1 . ได้อย่างเสถียร(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)โดยการติดเชื้อ lentivirus ของเซลล์ HK2 (ไฟล์เพิ่มเติม 4) การแสดงออกของ SIK1 มากเกินไปทำให้ E-cadherin เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญและยับยั้ง Caspasel/p20/p10, Vimentin, COLI และ Fspl เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ควบคุมที่กระตุ้นด้วย AA เพียงอย่างเดียว (รูปที่ 4e, f) นอกจากนี้ การแสดงออกของ SIK1 . มากเกินไป(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ยับยั้งความสามารถในการย้ายของเซลล์ HK2 ที่เหนี่ยวนำโดย AA (รูปที่ 4g) การค้นพบนี้ร่วมกันแสดงให้เห็นว่า SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ป้องกันการบาดเจ็บที่เกิดจาก AA ในเซลล์ HK2

รูปที่ 4 SIK1 ถูกควบคุมในเซลล์ HK2 ที่ได้รับการรักษาด้วย AA และการแสดงออกที่มากเกินไปของ SIK1 ปรับปรุงการบาดเจ็บของเซลล์ HK2 ที่เกิดจาก AA ได้ดีขึ้นก. การตรวจหา ELISA ของระดับ IL{{0}} และ TNF- ในส่วนลอยเหนือตะกอนของเซลล์ HK2 ที่บำบัดด้วย 10 μmol/L AA เป็นเวลา 0 ชั่วโมง, 24 ชั่วโมง, 48 ชั่วโมง และ 72 ชม. b การวิเคราะห์ Western blot ของ Caspase 1/p20/p10, E-cadherin, ZO-1, ระดับโปรตีน Vimentin และ -SMA ในเซลล์ HK2 ที่บำบัดด้วย 10 μmol/L AA เป็นเวลา 0 ชั่วโมง, 24 ชั่วโมง, 48 ชั่วโมง, และ 72 ชั่วโมง โดยให้ผลสูงสุดหลังการรักษา 72 ชั่วโมง - แอคตินถูกใช้เป็นตัวควบคุม c การวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ของตัวบ่งชี้การเกิดพังผืดระยะแรก (COLI, PAI-1 และ MMP9) ระดับ mRNA ในเซลล์ HK2 ที่บำบัดด้วย 10 ไมโครโมล/ลิตร AA เป็นเวลา 72 ชั่วโมง d การวิเคราะห์ Western blot ของระดับ p-SIK1 (Thr182) และ SIK1 ในเซลล์ HK2 ที่บำบัดด้วย 10 μmol/L AA เป็นเวลา 0 h, 24 h, 48 h และ 72 h e การวิเคราะห์ Western blot ของ Caspase1/p20/p10, E-cadherin, Vimentin, Fsp1 และ COL1 ในเซลล์ HK2 ที่ได้รับการบำบัดด้วยเวกเตอร์ SIK1 (SIK1 lentiviral overexpression vector) ต่อหน้า 10 µmol/L AA หรือรับการรักษาด้วย 10 µmol /L AA เพียงอย่างเดียวเป็นเวลา 72 ชั่วโมง f ภาพตัวแทนอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ของ E-cadherin และ Vimentin ในเซลล์ HK2 แถบมาตราส่วน=50 μm g ผลการโยกย้ายตัวแทนของเซลล์ HK2 แถบมาตราส่วน=50 μm ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±sd *P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

สารสกัด cistanche deserticola: การรักษาโรคไต

SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)เส้นทางการส่งสัญญาณ WNT/ -catenin ที่มีการควบคุม ในร่างกาย และ ในหลอดทดลอง

พิจารณาบทบาทที่สำคัญของเส้นทาง WNT/ -catenin ใน AKI-CKD(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)การเปลี่ยนแปลง เราสำรวจว่า SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ควบคุมเส้นทาง WNT/ -catenin ในการทดลองในร่างกาย เราสังเกตว่าการแสดงออกของ SIK1 . มากเกินไป(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ยับยั้งระดับโปรตีนของ WNT1, p- -catenin (Y654) และ-catenin นิวเคลียร์ใน AKI-CKD ที่เกิดจาก AA(ไตวายเฉียบพลันเป็นโรคไตเรื้อรัง)หนู (รูปที่ 5a) เพื่อสำรวจเพิ่มเติมว่า SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ควบคุมเส้นทาง WNT/ -catenin ในหลอดทดลอง เราปิดการแสดงออกของ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)โดย shRNA ในเซลล์ HK2 (ไฟล์เพิ่มเติม 5) สอดคล้องกับผลลัพธ์ในร่างกาย การปิดเสียงของ SIK1 ส่งผลให้ระดับ mRNA -catenin, TCF4 และ LEF1 เพิ่มขึ้นอย่างเด่นชัด (รูปที่ 5b) นอกจากนี้ การน็อคดาวน์ของ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)เพิ่มระดับโปรตีนของ -catenin และ p- -catenin(Y654)(รูปที่ 5c) นอกจากนี้ การน็อคดาวน์ของ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ส่งเสริมการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ของ -catenin (รูปที่ 5d) โดยรวมแล้ว ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ควบคุมเส้นทาง WNT/ -catenin ในร่างกาย และ ในหลอดทดลอง

รูปที่ 5 SIK1 ควบคุมเส้นทาง WNT/ -catenin ในร่างกาย และ ในหลอดทดลองก. การวิเคราะห์ Western blot ของ SIK1, WNT1,p- -catenin (Y654) และระดับโปรตีนนิวเคลียส-คาเทนินในกลุ่มหนูต่างๆ b การวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ของ -catenin, TCF4 และLEF1 ใน HK2cells ที่บำบัดด้วย SIK1 shRNA หรือ Scramble shRNA c การวิเคราะห์ Western blot -catenin และ p- -catenin(Y654) ในเซลล์ HK2 ที่บำบัดด้วย SIK1 shRNA หรือ Scramble shRNA.d ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ตัวแทนของ -catenin ในเซลล์ HK2 แถบมาตราส่วน=50 อืม ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±sd*P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

เส้นทางการส่งสัญญาณ WNT/ -catenin เกี่ยวข้องกับการบาดเจ็บของเซลล์ HK2 ที่เกิดจาก AA

เพื่อสำรวจว่าเส้นทางของ WNT/ -catenin มีบทบาทในการบาดเจ็บของเซลล์ HK2 ที่เกิดจาก AA หรือไม่ เราได้ทดสอบระดับการแสดงออกของ WNT1, นิวเคลียส -คาเทนิน และ p- -catenin(Y654) หลังการรักษาด้วย AA ผลลัพธ์ของ Western blot แสดงให้เห็นว่า WNT1, นิวเคลียส -คาเทนิน และพี- -คาเทนิน(Y654) เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการกระตุ้น AA(ไฟล์เพิ่มเติม 6a) นอกจากนี้ การย้อมด้วยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์เผยให้เห็นการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ของ -catenin (ไฟล์เพิ่มเติม 6b) ซึ่งชี้ให้เห็นว่าการกระตุ้น AA สามารถกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณ WNT/ -catenin เมื่อพิจารณาว่า -catenin เป็นองค์ประกอบหลักของเส้นทาง WNT/ -catenin เราสงสัยว่ากฎระเบียบของ -catenin ควบคุมการบาดเจ็บของเซลล์ HK2 ที่เกิดจาก AA หรือไม่ ดังนั้นเราจึงล้มลง -catenin โดย shRNA lentivirus ในเซลล์ HK2 อย่างเสถียร (ไฟล์เพิ่มเติม 6c) และเราสังเกตว่า -catenin knockdown บั่นทอนการแสดงออกของ Caspasel ที่เกิดจาก AA, IL-1 , Vimentin, PAI-1 และ MMP9 และการแสดงออกของ E-cadherin ที่ได้รับการส่งเสริม (รูปที่ 6a, b) นอกจากนี้ เซลล์ -catenin shRNA ที่ถูกกระตุ้นด้วย AA แสดงการย้ายที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ควบคุม -catenin ที่กระตุ้นด้วย AA เพียงอย่างเดียว (รูปที่ 6c) เมื่อนำมารวมกัน การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าเส้นทาง WNT/ -catenin เกี่ยวข้องกับการบาดเจ็บของเซลล์ HK2 ที่เกิดจาก AA

รูปที่ 6 เส้นทางการส่งสัญญาณ WNT/B-catenin เกี่ยวข้องกับการบาดเจ็บของ HK2cells ที่เกิดจาก AAเซลล์ HK2 ถูกบำบัดด้วย B-catenin shRNA หรือ Scramble shRNA ต่อหน้า 10 umol/LAA.real-time การวิเคราะห์ PCR ของ Caspase1.L-1BE-cadherin.Vimentin, PA/-1 และ ระดับ MMP9 mRNA ในเซลล์ HK2 b ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ตัวแทนของ E-cadherin และ Vimentin ใน HK2cells แถบมาตราส่วน=50 um.c ผลการโยกย้ายตัวแทนของเซลล์ HK2 แถบมาตราส่วน=50 อืม ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±sd*P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

จำเป็นต้องมีเส้นทางการส่งสัญญาณ WNT/ -catenin สำหรับ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)การบาดเจ็บของเซลล์ HK2 ที่เป็นสื่อกลางที่เกิดจาก AA

เพื่อศึกษาว่า SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)การบาดเจ็บของเซลล์ HK2 ที่เกิดจาก AA ที่ได้รับการควบคุมผ่านเส้นทางการส่งสัญญาณ WNT/ -catenin, -catenin ลดลงอีกใน SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ล้มลง HK2 เซลล์ เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ล้มลง SIK1 การล้มลงของ -catenin เพิ่มเติมจะลดระดับ mRNA ของ Caspasel, COLl และ Vimentin ในขณะที่เพิ่มระดับ mRNA ของ E-cadherin (รูปที่ 7a) ผลลัพธ์ของ West-ern blot นั้นสอดคล้องกับ PCR แบบเรียลไทม์ โดยแสดงการหยุดเสียงของ -catenin และ SIK1 กลับด้านการปรับลด E-cadherin การปรับเพิ่มของ Caspasel/p20/p10 และ Vimentin ที่เหนี่ยวนำโดย SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)ล้มลง (รูปที่ 7b)

โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าการยับยั้ง -catenin ย้อนกลับการตอบสนองต่อการอักเสบ, EMT และการเกิดพังผืดที่ลุกลามโดย SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)การล้มลงซึ่งแสดงให้เห็นอย่างชัดเจนว่าจำเป็นต้องมีเส้นทาง WNT/ -catenin สำหรับ SIK1(ไคเนสที่เหนี่ยวนำด้วยเกลือ 1)การบาดเจ็บของเซลล์ HK2 ที่เป็นสื่อกลางที่เกิดจาก AA

รูปที่ 7 เส้นทาง WNT/ -catenin จำเป็นสำหรับการบาดเจ็บของเซลล์ HK2 ที่เป็นสื่อกลาง SIK1 ที่เกิดจาก AAเซลล์ HK-2 ถูกทรานส์เฟกร่วมกับ SIK1 และ B-catenin shRNA หรือทรานส์เฟกด้วย SIK1 หรือ -catenin shRNA เพียงอย่างเดียว และจากนั้นบำบัดด้วย 10 umol/L AA สำหรับการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ 72 เฮกตาร์ของ Caspase1, COL1 E-cadherin และนิพจน์ Vimentin ข. การวิเคราะห์ Western blot ของนิพจน์ Caspase1/p20/p10, E-cadherin และ Vimentin ข้อมูลแสดงเป็นค่ากลาง±sd*P<0.05 vs=""><0.05 vs="" sik1="" shrna,=""><0.05vs β-catenin="" shrna.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

บทบาทของ Twist1 ในการบาดเจ็บของเซลล์ HK2 ที่เกิดจาก AA

ทำหน้าที่เป็น EMT-TFs Twistl สามารถส่งเสริม EMT และการเกิดพังผืดในไต ในการศึกษานี้ เราพบว่า AA ส่งเสริมการแสดงออกของโปรตีนและ mRNA ของ Snail และ Twist1 ในขณะที่ knockdown -catenin ยับยั้งการแสดงออกของ Snail และ Twist1 ที่เกิดจาก AA (รูปที่ 8a) ซึ่งบ่งชี้ว่า Snail และ Twist1 อยู่ที่ปลายน้ำของ -catenin และเล่น บทบาทในการบาดเจ็บของเซลล์ HK2 ที่เกิดจาก AA เพื่อตรวจสอบสมมติฐานของเรา เราล้มลง Twist1 โดย siRNA (ไฟล์เพิ่มเติม 7) และดำเนินการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์และ Western blot ตามที่คาดไว้ เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ควบคุมที่กระตุ้นด้วย AA เพียงอย่างเดียว การแสดงออกของ Vimentin และ COLI ลดลงในขณะที่ ZO-1 เพิ่มขึ้นในเซลล์ Twist1 siRNA ต่อหน้า AA ซึ่งบ่งชี้ว่าการเงียบของ Twist1 ช่วยลดการเกิด EMT และความก้าวหน้าของการเกิดพังผืดในไตที่เกิดจาก AA (รูปที่ 8b และ c)

รูปที่ 8 บทบาทของ Twist ในการบาดเจ็บของเซลล์ HK2 ที่เกิดจาก AAWestern blot และการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ของหอยทากและระดับ Twist1 ในเซลล์ HK2 b การวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ของระดับ Twist1, COL1, ZO-1 และ Vimentin ในเซลล์ HK2 ที่บำบัดด้วย Twist1 siRNA หรือ NC siRNA.c การวิเคราะห์ Western blot ของระดับ Twist1, ZO-1 และวิเมนตินในเซลล์ HK2 ที่บำบัดด้วย Twist1 siRNA หรือ NC siRNA ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±sd*P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

คลิกที่นี่เพื่อเป็นส่วนหนึ่ง Ⅱ