เอ็กไคนาโคไซด์ป้องกันโรคพาร์กินสันได้อย่างไร

ติดต่อ: emily.li@wecistanche.com

ส่วนที่Ⅰ:กลไกของการควบคุม autophagy ในหนู PD ที่เหนี่ยวนำโดย MPTP ผ่านเส้นทางการส่งสัญญาณ MTOR โดย Echinacoside

เชิงนามธรรม:

วัตถุประสงค์: การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาผลกระทบของเอ็กไคนาโคไซด์(ECH) เกี่ยวกับตัวบ่งชี้ที่เกี่ยวข้องกับ autophagy ผ่านเส้นทางการส่งสัญญาณ mTOR โดยเฉพาะอย่างยิ่งผลกระทบต่อการกวาดล้างของ autophagy substrate P62 และ -synuclein ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ทางพยาธิวิทยาหลักของโรคพาร์กินสัน(PD) เพื่อจัดทำกลยุทธ์ใหม่ในการรักษา PD (โรคพาร์กินสัน). วิธีการ: แบบจำลองเมาส์ของ PD . กึ่งเฉียบพลัน(โรคพาร์กินสัน)ถูกสร้างขึ้นโดยการฉีดในช่องท้องของ 1-เมทิล-4-ฟีนิล-1,2,3,6-เตตระไฮโดรไพริดีน (MPTP) ขั้นแรก ประเมินอาการทางระบบประสาทในหนูเมาส์ของแต่ละกลุ่ม และวัดสารสื่อประสาทโมโนเอมีนใน striatum ในแต่ละกลุ่มด้วยเฟสของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูง การย้อมสีแบบคู่ด้วยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ถูกนำมาใช้เพื่อสังเกตการแสดงออกของไทโรซีนไฮดรอกซีเลส (TH), - ไซนิวคลีอีนและ LC3 กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านถูกใช้เพื่อสังเกตการเปลี่ยนแปลงของโครงสร้างพื้นฐานในซับสแตนเทีย นิกราและการก่อตัวของออโตฟาโกโซม จากนั้น การแสดงออกของ TH, -synuclein, Beclin 1, LC3, P62, mTOR และโปรตีนต้นน้ำ AKT ถูกตรวจพบโดย Western blot ผลลัพธ์: เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มแบบจำลอง การทำงานของระบบประสาทในสมองดีขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในอีซีเอช (เอ็กไคนาโคไซด์)กลุ่ม (P < {{0}}.01)="" พร้อมกับการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของ="" th,="" da="" และ="" dopac="" ในสมอง="" (p="">< 0.01)="">อีซีเอช (เอ็กไคนาโคไซด์)กลุ่ม ในขณะที่การแสดงออกของ Beclin 1 และ LC3-II เพิ่มขึ้น (P < 0.01) ระดับการแสดงออกของ P62 และ -synuclein ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.01)อีซีเอช (เอ็กไคนาโคไซด์)สามารถเพิ่มระดับการแสดงออกของสัญญาณการอยู่รอด p-AKT/AKT และลดการแสดงออกของ mTOR บทสรุป:อีซีเอช (เอ็กไคนาโคไซด์)สามารถเพิ่ม autophagy ได้โดยการยับยั้งการแสดงออกของ mTOR ซึ่งจะช่วยส่งเสริมการกวาดล้างของ -synuclein และการเสื่อมสภาพของ autophagy substrate P62 และออกแรงกระตุ้นการทำงานของระบบประสาท

คำสำคัญ: โรคพาร์กินสันเอ็มพีทีพีเอ็กไคนาโคไซด์, -synuclein, P62, autophagy, mTOR

Cistanche สามารถรักษาโรคพาร์กินสันได้

บทนำ

โรคพาร์กินสัน (PD)เป็นโรคทางระบบประสาทที่เรื้อรังและก้าวหน้า ลักษณะทางพยาธิวิทยาทั่วไปของPD(โรคพาร์กินสัน)คือการก่อตัวของร่างกาย Lewy และ -synuclein และ ubiquitin เป็นส่วนประกอบหลักของร่างกาย Lewy มีหลักฐานมากขึ้นเรื่อยๆ ที่แสดงให้เห็นว่าในที่สุดความผิดปกติของการควบคุม autophagy จะนำไปสู่การสะสมของโปรตีนที่พับผิดและออร์แกเนลล์ที่ได้รับบาดเจ็บ54 วิถีทาง autophagy-lysosome ไม่เพียงแต่สามารถย่อยสลายโปรตีนที่ไม่สามารถย่อยสลายได้ด้วยวิถีทางยูบิควิติน-โปรตีอาโซมเท่านั้น แต่ยังรวมถึงวิถีทางด้วย สามารถย่อยสลาย -synuclein ดังนั้นกฎระเบียบของ autophagy อาจให้กลยุทธ์ใหม่สำหรับการรักษาPD (โรคพาร์กินสัน). Autophagy เป็นเส้นทางหลักในการย่อยสลายมวลรวมภายในเซลล์ และ mTOR kinase เป็นไซต์ควบคุมที่สำคัญสำหรับ autophagy ดังนั้นจึงมีความสำคัญทั้งทางทฤษฎีและทางปฏิบัติที่จะอธิบายความสัมพันธ์ระหว่างPD(โรคพาร์กินสัน) และ autophagy ควบคุมโดยเส้นทางการส่งสัญญาณ mTOR เนื่องจากการสลายตัวของ -synuclein ส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับระบบ autophagy-lysosomal ด้วยการกำจัดโปรตีนผิดปกติเป็นเป้าหมาย การพัฒนายาป้องกันระบบประสาทที่สามารถควบคุม autophagy อาจเป็นแนวทางในการรักษาโรคเกี่ยวกับระบบประสาท อีซีเอช (เอ็กไคนาโคไซด์) มีสูตรโมเลกุล C35 H46 O20 เป็นส่วนประกอบหลักของยาจีน Cistanche phenylethanoid glycosides มันถูกแยกออกเป็นครั้งแรกโดย Stoll et al จากรากของEchinaceaแองกัสติโฟเลีย ดี.ซี.อีซีเอช (เอ็กไคนาโคไซด์)มีผลทางเภสัชวิทยาที่หลากหลาย มีฤทธิ์ต้านการอักเสบ ต่อต้านอนุมูลอิสระ ป้องกันเส้นประสาท ปรับปรุงการเรียนรู้และความจำ การป้องกันตับ การควบคุมภูมิคุ้มกัน และฤทธิ์ต้านเนื้องอก การศึกษานี้เริ่มต้นจากกลไกทางพยาธิวิทยาหลักของ PD(โรคพาร์กินสัน), มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบกฎระเบียบของผลกระทบต่อระบบประสาทของอีซีเอช (เอ็กไคนาโคไซด์)ในเมาส์PD(โรคพาร์กินสัน)แบบจำลองที่เกิดจาก MPTP จากวิถี autophagy-lysosomal

วัสดุและอุปกรณ์

สัตว์ทดลอง

กลุ่มทดลองประกอบด้วยหนู C57BL/6J เพศผู้ 108 ตัวที่มีระดับ SPF อายุแปดสัปดาห์น้ำหนัก 20–22 กรัม หนูสี่ตัวต่อกรง เก็บไว้ที่อุณหภูมิ 22-25 องศา หนูถูกจัดเตรียมโดย Shanghai Center for Laboratory Animal, Chinese Academy of Sciences ซึ่งตั้งอยู่ที่มหาวิทยาลัย Nanjing University of Chinese Medicine และสัตว์เหล่านี้ได้รับการดูแลอย่างมีมนุษยธรรมตามแนวทางของ National Institutes of Health ในห้องเกรด SPF ที่มีอุณหภูมิ 22– 25 องศา ความชื้นสัมพัทธ์ 55 เปอร์เซ็นต์ และต่ำกว่า 12-ชั่วโมง circadian rhythm หนูมีอิสระที่จะมีอาหารและน้ำ

รีเอเจนต์หลัก

MPTP (Sigma Company), แอนติบอดีต่อต้านหนู -TH โมโนโคลนอล (Sigma Company), Alexa Fluor 555 แอนตี้ - กระต่ายต่อต้านกระต่าย (สถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Biyuntian), แอนติบอดีต่อต้านกระต่าย Alexa Fluor 488 (สถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Biyuntian), HRP -goat anti-rabbit antibody รอง (Biyuntian Institute of Biotechnology), กระต่าย polyclonal - synuclein antibody (Cell Signaling Technology Company), HRP-goat anti-mice secondary antibody (Biyuntian Institute of Biotechnology),ECH(เอ็กไคนาโคไซด์) (Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), แอนติบอดี anti-p-AKT (Ser473) ของกระต่าย (Cell Signaling Technology Company), Rapamycin (Cell Signaling Technology Company), Chloroquine (Sigma Company), Wortmannin (Sigma Company), โพลีโคลนัลกระต่าย แอนติบอดี LC3 (บริษัท Abcam), แอนติบอดีโพลีโคลนัล P62 ของกระต่าย (Enzo Life Science Company), โมโนโคลนัล -แอกตินแอนติบอดีในหนูเมาส์ (บริษัทซานตาครูซ), โพลีโคลนอลแอนติบอดี Beclin 1 (บริษัท Abcam)

ข้อมูลวัสดุ:

MPTP (อเมริกา, บริษัท Sigma), โมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อต้าน TH ของหนู (อเมริกา, บริษัท Sigma), แอนติบอดีโพลีโคลนอล -synuclein กระต่าย (อเมริกา, บริษัท เทคโนโลยีการส่งสัญญาณเซลล์), แอนติบอดีรอง HRP-goat ต่อต้านหนู (จีน, สถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Biyuntian ),ECH(เอ็กไคนาโคไซด์) (จีน, Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), แอนติบอดี anti-p-AKT (Ser473) ของกระต่าย (อเมริกา, บริษัท เทคโนโลยีการส่งสัญญาณเซลล์), Rapamycin (อเมริกา, บริษัท เทคโนโลยีการส่งสัญญาณเซลล์), Chloroquine (อเมริกา, บริษัท ซิกมา), Wortmannin (อเมริกา, บริษัท Sigma), แอนติบอดีโพลีโคลนัล LC3 ของกระต่าย (อเมริกา, บริษัท Abcam), แอนติบอดีโพลีโคลนัล P62 ของกระต่าย (อเมริกา, บริษัท Enzo Life Science), โมโนโคลนอลของหนู - แอคตินแอนติบอดี (อเมริกา, บริษัทซานตาครูซ), โพลีโคลนอลแอนติบอดี Beclin 1 ( อเมริกา บริษัท Abcam)

การรักษาด้วย Echinacosideโรคพาร์กินสัน

วิธีการทดลอง

การจัดกลุ่มสัตว์ทดลอง

หนูเมาส์ C57BL/6J 108 ตัวถูกสุ่มแบ่งออกเป็นหกกลุ่ม โดยมีหนู 18 ตัวในแต่ละกลุ่ม โดยมีรายละเอียดดังนี้ กลุ่มควบคุมปกติ (กลุ่มน้ำเกลือปกติ กลุ่ม N) กลุ่มรุ่น (กลุ่ม MPTP กลุ่มเอ็ม) กลุ่มตัวอย่างECH(เอ็กไคนาโคไซด์) กลุ่ม (MPTP plusอีซีเอช (เอ็กไคนาโคไซด์), กลุ่ม EH), กลุ่ม autophagy ที่เหนี่ยวนำ (MPTP plus Rapamycin group, RA group), autophagy inhibitor A group (MPTP plusอีซีเอช (เอ็กไคนาโคไซด์)บวกกลุ่มคลอโรควิน, กลุ่ม CQ), กลุ่มบียับยั้ง autophagy (MPTP plusอีซีเอช (เอ็กไคนาโคไซด์)บวกกับกลุ่ม Wortmannin, กลุ่ม WO) ขนาดยาของ MPTP คือ 30 มก./กก./วัน ฉีดอย่างต่อเนื่องเป็นเวลา 7 วันอีซีเอช (เอ็กไคนาโคไซด์) ให้ที่ 30 มก./กก./วัน ให้ทางช่องท้อง 9

แบบจำลองสัตว์ทดลองและยารักษาโรค

กลุ่ม N และกลุ่ม EH ได้รับน้ำเกลือปกติและECH(เอ็กไคนาโคไซด์) สามวันก่อนการสร้างแบบจำลอง ตามลำดับ ถึงเจ็ดวันหลังจากการสร้างแบบจำลอง ราพามัยซิน,10 เวิร์ตมันนิน,11,และคลอโรควินถูกบริหารให้เป็นเวลาเจ็ดวันติดต่อกันหลังจากการฉีด MPTP ครั้งสุดท้าย ปริมาณการฉีดราปามัยซินทางหลอดเลือดดำส่วนหางคำนวณเป็น 2 มก./กก./วัน ขนาดยาฉีดคลอโรควินในหนูทดลองคือ 50 มก./กก./วัน ขนาดยาฉีดเข้าหลอดเลือดดำส่วนหางของเวิร์ตมันนินในหนูเมาส์คือ 0.7 มก./กก./วัน (รูปที่ 1)

การสังเกตการณ์ทางระบบประสาท

ตามวรรณกรรม12ที่มีการดัดแปลงเล็กน้อย อุปกรณ์ที่ผลิตเองสำหรับการทดสอบขั้วมีดังนี้: อุปกรณ์มีความยาว 55 ซม. เส้นผ่านศูนย์กลาง 1 ซม. ท่อ PV เส้นผ่านศูนย์กลาง 2 ซม. ฉายภาพทรงกลมที่ด้านบนของ อุปกรณ์เป็นจุดยึดสำหรับหนู อุปกรณ์ถูกปิดด้วยเทปสีดำเพื่อป้องกันไม่ให้หนูตกลงมา เมาส์แต่ละตัวถูกวางบนจุดที่ยื่นออกมาเป็นทรงกลมโดยให้หัวขึ้นด้านบนในระหว่างการทดสอบ บันทึกเวลาจากส่วนบนของแท่งที่วางลงไปที่ศีรษะเพื่อเลี้ยวลง (T-turn) และเวลาทั้งหมดจากด้านบนของแท่งที่วางไว้เพื่อปีนขึ้นไปที่ด้านล่างของท่อสู่พื้นดิน (T-total)

กิจกรรมที่เกิดขึ้นเอง

กิจกรรมที่เกิดขึ้นเองหรือที่เรียกว่ากิจกรรมในสนามเปิดเป็นตัวบ่งชี้ทั่วไปสำหรับการตรวจจับกิจกรรมที่หายากหลังจากได้รับบาดเจ็บจาก MPTP13 ในการศึกษาปัจจุบัน ได้มีการนำระบบวิเคราะห์วิดีโอการทดลองแบบเปิดมาใช้ การดำเนินการเฉพาะมีดังนี้ ก่อนทำการทดลอง หนูสี่ตัวในกลุ่มเดียวกันถูกใส่ลงในกล่องสังเกตการณ์ (มีความยาว 25 ซม. กว้าง 25 ซม. และสูงเท่ากับ

25 ซม.) เพื่อปรับเป็นเวลา 30 นาที จากนั้นจึงบันทึกวิดีโอต่อเนื่องเป็นเวลา 30 นาที ในกรอบเวลาสังเกต 30-นาที จำนวนการเคลื่อนไหวในแนวตั้ง (จำนวนการเลี้ยง) จะถูกนับแยกกันในช่วงสามช่วงไม่ต่อเนื่องกันเป็นเวลาห้านาที ระบบวิเคราะห์วิดีโอวิเคราะห์วิถีการเคลื่อนที่ของกิจกรรมของเมาส์โดยอัตโนมัติ และได้รับระยะทางรวม 30-นาที (ระยะทางทั้งหมด) เป็นตัวบ่งชี้การเคลื่อนที่ในแนวนอน

การวิเคราะห์การเดิน

การวิเคราะห์การเดิน: ตามวรรณกรรม 14 มีการใช้อุปกรณ์วิเคราะห์การเดินที่สร้างขึ้นเอง อุปกรณ์นี้มีดังนี้: ทางเดินไม้ (ยาว 42 ซม. กว้าง

4.5 ซม. และสูง 12 ซม.) ปลายด้านหนึ่งเปิด ปลายอีกด้านนำไปสู่กรงกระรอก กรงกระรอกถูกคลุมด้วยผ้าสีดำ หมึกสีน้ำเงินจุ่มลงที่ด้านล่างของเท้าของเมาส์ จากนั้นวางเมาส์ไว้ที่ปลายเปิดของทางเดิน หนูเคลื่อนตัวไปตามธรรมชาติของกรงกระรอกที่คลุมด้วยผ้าสีดำ วัดระยะก้าวขาหน้าและขาหลังที่ยาวที่สุดสามก้าวตามลำดับ และหาค่าเฉลี่ย

การทดสอบโรทารอด

เมาส์ถูกวางบนโรทารอดที่ปรับความเร็วได้ โดยความเร็วของโรทารอดถูกปรับเพื่อเพิ่มจากสี่รอบ/นาทีเป็น 40 รอบ/นาทีภายในห้านาที เวลาตั้งแต่เริ่มต้นการหมุน rotarod จนถึงการดรอปของเมาส์จาก rotarod ในแต่ละครั้ง จะถูกบันทึกเป็นเวลาแฝงที่จะลดลง การหาปริมาณสารสื่อประสาทโมโนเอมีนใน striatum โดยการตรวจจับด้วยเคมีไฟฟ้าเคมีเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC-ECD)

การสุ่มตัวอย่างและการรักษา

หนูถูกทำการุณยฆาต และ striatum ถูกแยกออกจากกันอย่างรวดเร็วบนน้ำแข็งและชั่งน้ำหนัก ตามอัตราส่วน 1 มล. ของกรดเปอร์คลอริก 5 เปอร์เซ็นต์ ต่อ 0.1 กรัมของสมอง (น้ำหนักเปียก) ตัวอย่างของแต่ละกลุ่มจะถูกใส่ลงในแก้วที่มีปริมาตรที่สอดคล้องกันของกรดเปอร์คลอริกและทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในหลอดสารละลาย . โฮโมจิเนตถูกหมุนเหวี่ยงที่อุณหภูมิต่ำด้วย 13,{5}} รอบ/นาที เป็นเวลา 20 นาที นำ supernatant ไป และหมุนเหวี่ยงซ้ำ ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกวางไว้ในตู้เย็นอุณหภูมิต่ำเพื่อการตรวจจับเพิ่มเติม สภาวะสำหรับ HPLC-ECD มีดังต่อไปนี้ โครมาโตกราฟีไฟฟ้าเคมี 5300 ถูกนำมาใช้ วิธีการตรวจหาคือเซลล์ 5020 และ 504 ปอนด์ โดยมีคอลัมน์โครมาโตกราฟีของ MD-150 (3.0*150 มม.; 3 ไมโครเมตร) เฟสเคลื่อนที่ของ MDTM-2 และความไวของ 2uA อัตราการไหลตั้งไว้ที่ 0.6 มล./ นาที ศักย์ไฟฟ้าของอิเล็กโทรดถูกตั้งไว้ที่ 220mV และตั้งอุณหภูมิคอลัมน์ไว้ที่ 30 องศา ปริมาตรการฉีดคือ 20 ul (เจือจางครั้งแรกสิบครั้ง)

สารสื่อประสาทต่อไปนี้ตรวจพบโดปามีน (DA), กรดไดไฮดรอกซีฟีนิลอะซิติก (DOPAC), กรดวานิลลิกสูง (HVA), นอเรพิเนฟริน (NE), {{0}}ไฮดรอกซีทริปตามีน (5-HT), 5-กรดไฮดรอกซีอินโดเลอะซิติก (5-HIAA) การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ของ TH, -Synuclein, LC3 และ p62 หนูเมาส์ (n=6 ต่อกลุ่ม) ถูกการุณยฆาตภายใต้การดมยาสลบ (5 เปอร์เซ็นต์ของคลอเรตไฮเดรต) และผสมด้วยโซเดียมคลอไรด์ 0.9 เปอร์เซ็นต์ ตามด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% ผ่านช่องหัวใจด้านซ้าย สมองถูกนำออกอย่างรวดเร็วและแก้ไขภายหลังเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นจึงย้ายไปยังน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) ที่มีซูโครส 30 เปอร์เซ็นต์ที่ 4 องศาเซลเซียส จนกว่าจะจม เนื้อเยื่อถูกฝังในพาราฟิน และส่วนโคโรนา (30 µm) ถูกตัดผ่าน substantia nigra pars compacta (SNc; −2.8 ถึง −3.8 มม. หางถึง bregma) โดยใช้ไมโครโทมเลื่อน ส่วนที่ถูกตัดออกและให้ความชุ่มชื้น และเปอร์ออกซิเดสภายในร่างกายถูกระงับด้วย H2O2 0.3 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 30 นาที หลังจากการดึงแอนติเจนที่เกิดจากความร้อน สไลด์ถูกฟักด้วย Triton-X100 0.5 เปอร์เซ็นต์ จากนั้นอัลบูมินในซีรัมของวัว 5 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 30 นาที จากนั้นส่วนต่างๆ ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีต้าน- -ซินิวคลีอีน, แอนติบอดีต้าน TH, แอนติบอดีต้าน LC3, แอนติบอดีต้าน p62 และแอนติบอดีทุติยภูมิที่เรืองแสงที่สอดคล้องกันในชั่วข้ามคืนที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากล้างห้านาทีสามครั้งใน PBS , ส่วนต่างๆ ถูกบ่มในแอนติบอดีทุติยภูมิ biotinylated เป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง ตามด้วย avidin-biotin complex เป็นเวลา 30 นาที การออกฤทธิ์ของเปอร์ออกซิเดสถูกแสดงภาพด้วย 3.3-ไดอะมิโนเบนซิดีน

การตรวจจับของโปรตีนโดย Western Blot

สกัดโปรตีน SNc (หนูเมาส์ {{0}} ตัวต่อกลุ่ม) แยกโดยใช้ SDS–PAGE 12–15 เปอร์เซ็นต์ และถ่ายโอนไปยังเยื่อ PVDF เยื่อหุ้มเซลล์ถูกบล็อกด้วยนมที่ไม่มีไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 1.5 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง และบ่มด้วยแอนติบอดีต้าน TH, synuclein, p62, Beclin 1, LC3, p-AKT, AKT, p-mTOR, mTOR และ GAPDH ที่ 4 องศาเซลเซียสค้างคืน . วันรุ่งขึ้น ล้างเมมเบรนด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ไตรสที่มี Tween 20 0.1 เปอร์เซ็นต์ และถูกไฮบริไดซ์กับแอนติบอดีทุติยภูมิที่สอดคล้องกันเป็นเวลา 1.5 ชั่วโมง โปรตีนถูกแสดงภาพโดยใช้เคมีลูมิเนสเซนส์ที่ได้รับการปรับปรุง และแถบอิมมูโนรีแอคทีฟถูกวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์วิเคราะห์ภาพ (Gel Doc 1000-UV; Bio-Rad, Richmond, CA) เพื่อคำนวณความหนาแน่นทางแสงของแถบ -synuclein และแถบ TH ที่ปรับให้เป็นมาตรฐานเป็น GADPH

ข้อมูลของแอนติบอดี: กระต่าย polyclonal LC3 แอนติบอดี: 1:1000 แอนติบอดีโพลีโคลนัล P62 ของกระต่าย: 1:1000 เบคลิน 1 โพลีโคลนอลแอนติบอดี: 1:1000 Mice anti TH โมโนโคลนัลแอนติบอดี: 1:1000 แอนติบอดีโพลีโคลนอล -ไซนิวคลีอีนของกระต่าย: 1:1000

การสังเกตโครงสร้างพื้นฐานของ Substantia Nigra โดยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด

หนูเมาส์ (n=6 ต่อกลุ่ม) ถูกทำการุณยฆาตด้วยคลอรัลไฮเดรต 5 เปอร์เซ็นต์และถูกทำให้ซึมผ่านช่องด้านซ้ายด้วย PBS ที่เย็นจัด ตามด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์และกลูตาราลดีไฮด์ 1 เปอร์เซ็นต์ใน PBS สมองถูกนำออกและปรับแต่งด้วยกลูตาราลดีไฮด์ 2.5 เปอร์เซ็นต์ ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลาหกชั่วโมง SNc ถูกตัดเป็นก้อนขนาดประมาณ 1 มม. 3 และตรึงใน PBS ที่มีกลูตาราลดีไฮด์ 2.5 เปอร์เซ็นต์ และเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสสำหรับการประมวลผลต่อไป ชิ้นส่วนถูกแก้ไขภายหลังใน 1 เปอร์เซ็นต์ osmium tetroxide ในบัฟเฟอร์เดียวกัน ถูกทำให้แห้งด้วยแอลกอฮอล์ที่จัดระดับแล้ว และฝังอยู่ใน Epon 812 (Shell Chemical Co., Houston, TX) ส่วน Ultrathin (50 นาโนเมตร) ถูกตัดโดยใช้ ultramicrotome ย้อมด้วย uranyl acetate และ lead citrate และวิเคราะห์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (Leica TCS SP2CLSM, School of Medicine Electron Microscopy Center, Fudan University)

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลการวัดทั้งหมดในการศึกษานี้แสดงในรูปแบบของค่าเฉลี่ย ± ข้อผิดพลาดมาตรฐาน และการวิเคราะห์ทางสถิติถูกประมวลผลโดยซอฟต์แวร์ GraphPad Prism 50 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA) พี<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" one-way="" analysis="" of="" variance="" (one-way="" anova)="" was="" used="" to="" test="" the="" statistical="" differences,="" and="" the="" comparison="" between="" multiple="" groups="" was="" analyzed="" by="" tukey's="" multiple="" group="">

คลิกที่นี่เพื่อเป็นส่วนหนึ่ง Ⅱ