Echinacoside ปรับปรุงฟังก์ชันการสร้างเม็ดเลือดในหนูเมาส์กดประสาทที่เหนี่ยวนำโดย FU 5-
Mar 19, 2022
ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
สายใสวัง, et al
เชิงนามธรรม
จุดมุ่งหมาย:เรามีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบผลกระทบของเอ็กไคนาโคไซด์(ECH) บนเม็ดเลือดทำงานใน 5-หนูที่มีภาวะซึมเศร้าจากไขกระดูกที่เกิดจาก FU
วิธีการหลัก:ในหลอดทดลอง หลังจากการกระตุ้นด้วย ECH ความสามารถในการงอกขยายของเซลล์ไขกระดูก (BM) และเซลล์ stromal ของไขกระดูก (BMSC) ที่ได้มาจากmyelosuppressionหนูได้รับการประเมินโดย CCK8 assay และสัณฐานวิทยาตามลำดับ ในร่างกาย 5-การกดทับของไขกระดูกที่เกิดจาก FU หรือหนูควบคุมได้รับการจัดการในทางเดินอาหารด้วย ECH(อิชินาโคไซด์)ที่ 15 มก./กก. หรือปริมาตรที่เท่ากันของน้ำเกลือปกติทุกวันเป็นเวลา 12 วันก่อนที่เซลล์ BM จะถูกแยกออกสำหรับการสอบวิเคราะห์เซลล์ที่สร้างโคโลนี ในเวลาเดียวกัน BMSC ถูกเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 4 สัปดาห์ก่อนที่เซลล์จะถูกสังเกตพบสำหรับรูปแบบการเติบโต ส่วนลอยเหนือตะกอนของการเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกรวบรวมสำหรับการคัดหลั่ง GM-CSF โดย ELISA และ RNA ของเซลล์ถูกสกัดสำหรับ EPO และ GM-CSF RT-PCR เซลล์ BM หรือ BMSC ที่กระตุ้นด้วย ECH เป็นเวลา 24 ชั่วโมงหรือ 48 ชั่วโมงถูกรวบรวมไว้สำหรับการสกัดโปรตีนและเวสเทิร์นบล็อตติง
การค้นพบที่สำคัญ:ECH(อิชินาโคไซด์)กระตุ้นการเติบโตของเซลล์ BM แต่ไม่ใช่ BMSC ที่ได้มาจาก 5-หนูที่บำบัดด้วย FU การบริหารช่องปากของ ECH(อิชินาโคไซด์)ใน 5-หนูที่ได้รับการรักษาด้วย FU สามารถเพิ่มจำนวนทั้งหมดเม็ดเลือดเซลล์ต้นกำเนิดและเซลล์ต้นกำเนิด GM เพื่อควบคุมระดับหนูที่มีสุขภาพดี แต่ไม่ใช่เซลล์ต้นกำเนิด BFU BMSCs จาก ECH-treatedmyelosuppressionหนูเติบโตอย่างแข็งแรงและแสดง GM-CSF มากขึ้น แต่ไม่ใช่ EPO ECH เปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ PI3K ใน 5-FU ที่ระงับเซลล์ BM
ความสำคัญ:ECH(อิชินาโคไซด์)สามารถปรับปรุงเม็ดเลือดการทำงานของไขกระดูกใน 5-FU-inducedmyelosuppressionหนู ECH(อิชินาโคไซด์)ถือได้ว่าเป็นการรักษาทางเลือกที่มีประสิทธิภาพสำหรับผู้ป่วยระหว่างการทำเคมีบำบัดหรือการปลูกถ่าย HSC
คำสำคัญ:Echinacoside, Hematopoietic, Myelosuppression, GM-CSF, เส้นทางการส่งสัญญาณ PI3K
Echinacoside ในCistanche
บทนำ
Fluorouracil หรือ 5-FU เป็นหนึ่งในสารเคมีบำบัดที่กำหนดมากที่สุดสำหรับการรักษามะเร็งแบบเสริมและแบบประคับประคอง [2,9,28] เป็นแอนะล็อกของ uracil ที่มีอะตอมฟลูออรีนที่ตำแหน่ง C-5 แทนที่ไฮโดรเจน และทำงานผ่านการยับยั้งการทำงานของไทมิดิเลตสังเคราะห์ที่ไม่สามารถย้อนกลับได้ และต่อมายับยั้งการจำลองดีเอ็นเอ [20] เม็ดเลือดขาวและการฝ่อของเม็ดเลือดอวัยวะคือความเป็นพิษหลักสองอย่างที่เกี่ยวข้องกับ 5-การประยุกต์ใช้ FU ในมนุษย์ หนูเมาส์ และสุกร [15,17,22]Myelosuppressionอันเป็นผลมาจากการยับยั้งและผลต่อเซลล์ที่เป็นพิษต่อเม็ดเลือดเซลล์ต้นกำเนิด [10] และความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันบนไขกระดูก [25] จำกัดการประยุกต์ใช้ทางคลินิกของ 5-เคมีบำบัดที่ใช้ FU
การกดไขกระดูกที่เกิดจาก 5-FU ส่งผลให้จำนวนเม็ดเลือดทั้งหมดลดลง อาการทางคลินิกที่ตามมา ได้แก่ มีไข้ โลหิตจาง และมีเลือดออก และการรักษาส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับการถ่ายเลือดและอาหารเสริมปัจจัยการเจริญเติบโต [4] การถ่ายเลือดสามารถมีประสิทธิภาพในการเติมเต็มเซลล์เม็ดเลือดแดงและเกล็ดเลือด แต่การบรรเทาทุกข์นั้นทำได้ในระยะสั้นและจำเป็นต้องได้รับการรักษาซ้ำ ปัจจัยการเจริญเติบโตรวมถึงอีริโทรพอยอิติน ปัจจัยกระตุ้นโคโลนีของแกรนูโลไซต์ (G-CSF) และปัจจัยกระตุ้นโคโลนีของแกรนูโลไซต์-มาโครฟาจ (GM-CSF) ปัจจัยเหล่านี้เป็นสารเคมีจากธรรมชาติและอาจช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของไขกระดูก [7,21] แต่ต้องใช้เงินมากและไม่มีประโยชน์ในการกระตุ้นการเติบโตของเซลล์เม็ดเลือดขาว การรักษาทางเลือกที่มีประสิทธิภาพเป็นที่ต้องการ ยาจีนแผนโบราณเป็นตัวเลือกที่ได้รับความนิยม [5] ในช่วงหลายปีที่ผ่านมา การศึกษาจำนวนมากมุ่งเน้นไปที่ผลของยาสมุนไพรจีนในการป้องกันและรักษาที่เกี่ยวข้องกับเคมีบำบัดmyelosuppression[33,35].
เอ็กไคนาโคไซด์(ECH) (รูปที่ 1) เป็นสารประกอบฟีนิลทานอยด์ที่สกัดจากยาจีนโบราณ Herba Cistanches ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นตัวแทนส่งเสริมการไหลเวียนโลหิต ยารักษาโรคไตและโรคเกี่ยวกับระบบประสาท [24] ECH(อิชินาโคไซด์)มีกิจกรรมทางเภสัชวิทยาหลายอย่างของการสร้างกระดูกใหม่ [18] ต่อต้านอนุมูลอิสระ [8,14,27] การควบคุมภูมิคุ้มกัน การป้องกันระบบประสาท และการปรับปรุงพฤติกรรม [11,16] นอกจากนี้ยังพบว่าเป็นสารป้องกันพิษต่อตับ [32] และอาการบาดเจ็บที่ปอดเฉียบพลัน [34] ตัวรับ Trk และทางเดินปลายน้ำ Trk-ERK อาจเกี่ยวข้องกับกิจกรรมการป้องกันเซลล์ประสาทจากการบาดเจ็บของ rotenone [36] บทบาทและกลไกใหม่ของ ECH ในการส่งเสริมmyelosuppressionการเจริญเติบโตของเซลล์ไขกระดูกยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้ ในการศึกษานี้ เราประเมินผลกระทบของ ECH(อิชินาโคไซด์)บนเม็ดเลือดทำงานใน 5-หนูที่เป็นโรคซึมเศร้าจากไขกระดูกที่เกิดจาก FU ในหลอดทดลอง และในร่างกาย และกลไกที่เกี่ยวข้อง
วัสดุและวิธีการ
เคมีภัณฑ์และชีวเคมี
เอ็กไคนาโคไซด์ถูกซื้อจาก Ronghe Medical Technology and Development Corporation (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) (ความบริสุทธิ์มากกว่าหรือเท่ากับ 98 เปอร์เซ็นต์ กำหนดโดย HPLC) และละลายใน DMSO 5-FU ได้รับมาจาก HaoRan Biotechnology Corporation (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) สื่อเมทิลเซลลูโลสที่มีรีคอมบิแนนท์ไซโตไคน์ (อาหารเลี้ยงเชื้อ MethoCult) สำหรับเซลล์หนูเมาส์ถูกซื้อจาก Stem Cell Technologies (แวนคูเวอร์, แคนาดา)
เพาะกาย cistanche
การออกแบบสัตว์และการทดลอง
หนู Balb/c เพศเมียที่ปราศจากเชื้อโรคเฉพาะ 5- ถึง 6-สัปดาห์ มีน้ำหนักระหว่าง 15-18 กรัม ซื้อจาก Shanghai Laboratory Animal Company (SLAC, Shanghai, China) หนูถูกเลี้ยงไว้ในสถานที่เลี้ยงสัตว์ที่มหาวิทยาลัยเจ้อเจียง ประเทศจีน การทดลองกับสัตว์ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของมหาวิทยาลัยเจ้อเจียง และกำลังปฏิบัติตามคำแนะนำในการดูแลและการใช้สัตว์ทดลอง [1,31]
หนูถูกฉีดเข้าช่องท้องด้วยปริมาณหนึ่ง 200 มก./กก. 5-FU เพื่อสร้างภาวะซึมเศร้าของไขกระดูกตามที่อธิบายโดย Choi EH และคณะ [6]. สำหรับการศึกษาในหลอดทดลอง เซลล์ไขกระดูก (BM) และเซลล์สโตรมอลไขกระดูก (BMSC) ถูกแยกออก 2 วันหลังจากการฉีด 5-FU ในร่างกาย หนูถูกสุ่มแบ่งเป็น 4 กลุ่ม โดยหนู 5–6 ตัวในแต่ละกลุ่ม (n=5–6): 5-กลุ่ม FU/ECH, 5-FU/กลุ่มควบคุม, ECH(อิชินาโคไซด์)กลุ่มและกลุ่มควบคุม ในกลุ่ม 5-FU/ECH หลังจาก 5-การฉีด FU หนูเมาส์ถูกป้อนเข้าทางเดินอาหารทุกวันด้วย ECH ที่ 15 มก./กก. ต่อวันเป็นเวลา 12 วัน ใน 5-FU/กลุ่มควบคุม แทนที่จะเป็น ECH(อิชินาโคไซด์), ให้น้ำเกลือปกติปริมาตรเท่ากันแก่หนูเมาส์ที่ฉีด FU 5-ตัว สำหรับกลุ่ม ECH และกลุ่มควบคุม ECH หรือน้ำเกลือปกติถูกบริหารให้ด้วยวิธีเดียวกันกับ 5-FU หนูเมาส์ที่ไม่บำบัด ในวันที่ 12 หนูถูกทำการุณยฆาตและสกัดเซลล์ไขกระดูกเพื่อการศึกษาต่อไป ในรายละเอียด เซลล์ BM ถูกเตรียมสำหรับการสอบวิเคราะห์เซลล์ที่ก่อรูปโคโลนี (CFC) BMSC ใช้สำหรับการสอบวิเคราะห์การงอกขยาย และส่วนลอยเหนือตะกอนของการเพาะเลี้ยงเซลล์ของ BMSC ถูกรวบรวมสำหรับ GM-CSF ELISA และ RNA ของ BMSC ถูกสกัดสำหรับ EPO และ GM-CSF RT -พีซีอาร์ การทดลองซ้ำ 3 ครั้ง
การเตรียมเซลล์ BM และ BMSC
เซลล์ BM ถูกเตรียมจากสารแขวนลอยเซลล์เดียวที่สกัดจากไขกระดูกของหนูเมาส์ โดยสังเขป หนูถูกทำการุณยฆาตและแช่ในเอทานอลเป็นเวลา 5 นาที เซลล์ถูกขับออกจากช่องไขกระดูกของกระดูกหน้าแข้งและกระดูกต้นขาโดยการล้างซ้ำด้วย23-เข็มวัดและกรองผ่านตัวกรองเซลล์ 100 ไมโครเมตรเพื่อให้ได้สารแขวนลอยเซลล์เดียว เซลล์ไขกระดูกอีริทรอยด์ถูกสลายโดยการฟักตัวในระยะสั้น (30 วินาที) ด้วยบัฟเฟอร์แอมโมเนียมคลอไรด์ที่ตามด้วยขั้นตอนการล้างซ้ำๆ ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อ ความมีชีวิตและจำนวนเซลล์ถูกกำหนดโดยวิธีการแยกทริปแพนสีน้ำเงินโดยใช้ฮีโมไซโตมิเตอร์
สำหรับการสร้าง BMSCs เซลล์ BM ได้รับอนุญาตให้เติบโตในหลุมของเพลต TC เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากการขจัดเซลล์ที่ไม่เกาะติดกันและการล้างซ้ำด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อ เซลล์ที่ยึดติดถูกนำมาเป็น BMSC
เพาะเลี้ยงเซลล์ที่ 37 องศาโดยมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์ในตู้ฟักที่มีความชื้นในตัวกลาง Modified Eagle (DMEM) ของ Dulbecco เสริมด้วยซีรัมของตัวอ่อนในครรภ์ที่เลิกใช้ความร้อน 10 เปอร์เซ็นต์ (FBS), เพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน (100 U/มล.) และแอล-กลูตามีน (2 นาโนโมลาร์) รีเอเจนต์การเพาะเลี้ยงเซลล์ทั้งหมดซื้อมาจาก Invitrogen (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน)
การเพิ่มจำนวนเซลล์ BM ในหลอดทดลองโดย CCK8 assay
เซลล์ BM จาก 5-หนูเมาส์ที่ได้รับการบำบัดด้วย FU ถูกชุบที่ความหนาแน่น 1 × 103 เซลล์/หลุมในจาน 96-หลุม (Costar) และเพาะเลี้ยงในตัวกลางที่เสริมด้วย ECH ที่มีความเข้มข้นต่างกัน(อิชินาโคไซด์)({{0}} μM, 0.1 μM, 1 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM ตามลำดับ) ในวันที่ 3 หรือวันที่ 6 เซลล์ถูก "พัลส์" ด้วยรีเอเจนต์ของสารละลาย CCK-8 20 ไมโครลิตร (เบโยไทม์ เจียงซู) และเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 4 ชั่วโมงเพิ่มเติม การเพิ่มจำนวนเซลล์ถูกตรวจโดยการวัดค่า CCK8 ของสีบนเครื่องอ่านไมโครเพลทพิเศษ (อุปกรณ์โมเลกุล) ที่ 450 นาโนเมตร
Echinacoside ในCistanche
การเพิ่มจำนวนและสัณฐานวิทยา BMSC ในหลอดทดลอง
BMSC ถูกเตรียมในหลุมของเพลต 6-หลุมที่มีความหนาแน่นเริ่มต้นของเซลล์ BM (รวมถึงจาก 5-หนูเมาส์ที่บำบัดด้วย FU ด้วย) เป็น 3.5 × 106 เซลล์/หลุม หลังจาก 24 ชั่วโมง อาหารเลี้ยงเชื้อถูกแทนที่ด้วยอาหารที่มี ECH (50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ทุกสัปดาห์ ครึ่งหนึ่งของส่วนลอยเหนือตะกอนจะถูกลบออกและแทนที่ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่สดใหม่ (มีหรือไม่มี ECH(อิชินาโคไซด์)ตามที่ระบุ) หลังจากการเพาะเลี้ยง 4 สัปดาห์ สัณฐานวิทยาของ BMSC ถูกสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัว
การทดสอบเซลล์สร้างอาณานิคม (CFC)
การทดสอบ CFC ในสื่อ MethoCult ดำเนินการตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยสรุป เซลล์ BM จากหนูกลุ่มต่างๆ ถูกเตรียมที่ 2 × 105 ต่อมิลลิลิตร หลังจากนั้น เซลล์ 0.4 มล. ถูกเติมลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ MethoCult 4 มล. เพื่อสร้างส่วนผสมของเซลล์ หลังจากผสมอย่างทั่วถึงด้วย 16-เข็มปลายทู่เกจ ผสมเซลล์ 1.1 มล. ถูกจ่ายลงในจานเพาะเชื้อ 35 มม. (เทคโนโลยีเซลล์ต้นกำเนิด) สามเท่า และฟักที่อุณหภูมิ 37 องศาในบรรยากาศที่มีความชื้นของ CO2 5 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 7 วัน หลังจากเพาะเลี้ยง 7 วัน อาณานิคมที่ประกอบด้วยเซลล์อย่างน้อย 30 เซลล์จะถูกระบุและนับ
ปฏิกิริยาลูกโซ่ทรานสคริปเทส-โพลีเมอเรสย้อนกลับ (RT-PCR) และ GM-CSF ELISA
BMSC ที่ได้มาจากกลุ่มของหนูเมาส์ที่ต่างกันถูกเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 4 สัปดาห์ตามที่บรรยายไว้ข้างต้น หลังจากการเพาะเลี้ยง 4-สัปดาห์ BMSC ถูกรวบรวมสำหรับการสกัด RNA ทั้งหมดด้วยชุด RNAsimple Total RNA (TianGen, Beijing) cDNA สายแรกถูกสังเคราะห์โดยใช้ RNA ทั้งหมด 1 ไมโครกรัม (DNase-treated) โดยใช้ชุดการสังเคราะห์ iScript cDNA (Bio-Rad, Richmond, CA) การแสดงออกของแกรนูโลไซต์-มาโครฟาจโคโลนี-ตัวกระตุ้นแฟกเตอร์ (GM-CSF) และอีรีโทรพอยเอติน (EPO) ถูกระบุโดย RT-PCR กึ่งเชิงปริมาณ ลำดับไพรเมอร์ PCR มีดังนี้: GM-CSF: 5′-GGCCTTGGAA GCATGTAGAGG-3′ (ไปข้างหน้า) และ 5′-GGAGAACTCGTTAGAGACGA CTT-3′ (ย้อนกลับ); EPO: 5′-CCTCATCTGCGACAGTCG AG-3′ (ไปข้างหน้า) และ 5′-ACAACCCAT CGTGACATTTTCT-3′ (ย้อนกลับ); ยีนดูแลทำความสะอาด Beta-actin: 5′-GTATCCTGACCCT GAAGTACC-3′ (ไปข้างหน้า) และ 5′-TGAA GGTCTCAAACATGATCT-3′ (ย้อนกลับ) การขยาย PCR ดำเนินการบน Thermal Cycler 2720 (Applied Biosystems) และผลิตภัณฑ์ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ agarose gel electrophoresis ระดับการแสดงออกของ mRNA ของเป้าหมายถูกทำให้เป็นมาตรฐานเป็นระดับเบตา-แอคติน ส่วนลอยเหนือตะกอนของ BMSC ถูกรวบรวมสำหรับการทดสอบ GM-CSF ELISA โดยใช้ชุดเครื่องมือ ELISA ของ GM-CSF (จินซุย เซี่ยงไฮ้) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
ซับตะวันตก
เซลล์ BM และ BMSC จาก 5-FU ที่เหนี่ยวนำmyelosuppressionหนูเมาส์หรือหนูควบคุมถูกชุบที่ความหนาแน่นเริ่มต้น 5 × 106 ต่อหลุมในจาน 6-หลุม หลังจาก 24 ชั่วโมง ECH ถูกเติมลงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 50ug/ml และเซลล์ได้รับอนุญาตให้เติบโตเป็นเวลา 24 ชั่วโมงหรือ 48 ชั่วโมงเพิ่มเติมก่อนที่เซลล์จะถูกสลายในบัฟเฟอร์ RIPA 1 เท่า (CST, Danvers, MA) ที่มีฟีนิลเมทิลซัลโฟนิล fluoride 1 มิลลิโมลาร์ (PMSF). ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยการสอบวิเคราะห์โปรตีน BCA 30 ไมโครกรัมของโปรตีนทั้งหมดถูกอิเล็กโตรโฟเรสบนเจลโซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์ 10 เปอร์เซ็นต์ และถ่ายโอนไปยังเยื่อ PVDF (Millipore, MA, USA) เมมเบรนถูกปิดกั้นด้วยบัฟเฟอร์การปิดกั้น ((Beyotime, Haimen, China) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศา จากนั้นฟักตัวในชั่วข้ามคืนที่ 4 องศาด้วยแอนติบอดีต้าน -actin (#4967, CST), phospho-PI3 kinase p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) (#4228, CST), phospho-Akt (Ser473) (#4060, CST), Akt (แพน) (C67E7) (#4691, CST), phosphor-Stat1(Tyr701)(#9167, CST), Phospho-Stat3 (Tyr705) (#9415, CST), Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)(#9215, CST), Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (#4377, CST ), p38 MAPK(#9212, CST), p44/42 MAPK (Erk1/2)(#4695, CST), Phospho- SAPK/JNK (Thr183/Tyr185)(#4668, CST) และ SAPK/JNK(# 9258, CST) ตามลำดับ หลังจากล้าง เยื่อหุ้มถูกตรวจสอบด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิต่อต้านกระต่ายที่ต้านกระต่ายกับฮอร์สแรดิชเพอร์ออกซิเดส (Lianke, หางโจว, จีน) ตามด้วยการตรวจจับสัญญาณด้วยระบบ FluorChem E (Protein Simple, Santa Clara, แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา)
การวิเคราะห์ทางสถิติ
ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM ความสำคัญของความแตกต่างระหว่างแต่ละกลุ่มถูกกำหนดโดยการทดสอบ t ของนักเรียน ค่า p b 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ
เพาะกาย cistanche
ผลลัพธ์
ในหลอดทดลองที่ให้มา ECH(อิชินาโคไซด์)กระตุ้น 5-FU ยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์ BM
เซลล์ BM จาก 5-FU ที่เหนี่ยวนำmyelosuppressionหนูได้รับการรักษาด้วย ECH(อิชินาโคไซด์)ที่ความเข้มข้นต่างๆ ตั้งแต่ 0.01 ถึง 50 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 3 วันหรือ 6 วัน และการเพิ่มจำนวนเซลล์ถูกประเมินโดยการสอบวิเคราะห์ CCK8 ดังแสดงในรูปที่ 2 ระดับการเพิ่มจำนวนของเซลล์ BM ที่บำบัดด้วย ECH นั้นสูงกว่าเซลล์ที่ไม่ผ่านการบำบัดด้วย ECH ทั้งหลังจากการเพาะเลี้ยง 3 หรือ 6 วัน ผลกระตุ้นแสดงให้เห็นลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา
ในหลอดทดลองที่ให้มา ECH(อิชินาโคไซด์)ไม่มีผลกับ 5-FU ที่ถูกระงับ BMSC proliferation
BMSC จาก 5-FU ที่เหนี่ยวนำmyelosuppressionหนูได้รับการรักษาด้วย ECH(อิชินาโคไซด์)ที่ความเข้มข้น 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร เป็นเวลา 4 สัปดาห์ และการเพิ่มจำนวนเซลล์ถูกประเมินโดยการสังเกตสัณฐานวิทยาของเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับด้านด้วยแสง ดังแสดงในรูปที่ 3 รูปแบบการเติบโตและสัณฐานวิทยาของเซลล์มีความคล้ายคลึงกันโดยมีหรือไม่มีการบำบัดด้วย ECH
ECH . ทางช่องท้อง(อิชินาโคไซด์)กระตุ้นการทำงานของเม็ดเลือดของ 5-FU ที่เหนี่ยวนำให้เกิด myelosuppressive granulocyte-macrophage (CFU-GM) แต่ไม่ใช่เซลล์ต้นกำเนิดของเม็ดเลือดแดง (BFU-E)
รูปแบบการเพิ่มจำนวนและการสร้างความแตกต่างของเซลล์ BM จาก 5-FU/ ECH, 5-FU/control, ECH(อิชินาโคไซด์)และกลุ่มควบคุมถูกประเมินโดยการทดสอบ CFC หลังจากการเพาะเลี้ยงเซลล์ BM ในอาหารเลี้ยงเชื้อ MethoCult 7 วัน CFCs จะถูกจำแนกและแจกแจงในแหล่งกำเนิดภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง ดังแสดงในรูปที่ 4 การวิเคราะห์ระดับต้นกำเนิดเปิดเผยว่ามีนัยสำคัญ (pb 0.0001) เพิ่มจำนวนของ CFU-GM ในกลุ่ม 5-FU/ECH เมื่อเทียบกับ 5-FU/กลุ่มควบคุม (169.3 ± 11.1 เทียบกับ 54.5 ± 3.1) เช่นเดียวกับกลุ่มควบคุม (169.3 ± 11.1 เทียบกับ 129.3 ± 5.6) (pb 0.05 ตามลำดับ) จำนวน BFU-E ในแต่ละกลุ่มไม่มีความแตกต่าง (73.0 ± 11.1 เทียบกับ 74.7 ± 8.6 เทียบกับ 91.2 ± 5.5) จำนวน CFU-GM และ BFU-E ในกลุ่ม ECH ใกล้เคียงกับในกลุ่มควบคุม (ไม่แสดงข้อมูล)
มะเดื่อ 4. การบริหาร ECH . ทางกระเพาะ(อิชินาโคไซด์)กระตุ้นเม็ดเลือดฟังก์ชันของ 5-FU ที่เหนี่ยวนำให้เกิดmyelosuppressionแกรนูโลไซต์-มาโครฟาจ (CFU-GM) แต่ไม่ใช่เซลล์ต้นกำเนิดอีรีทรอยด์ (BFU-E) (A) ภาพตัวแทนของหน่วยที่สร้างอาณานิคม CFU-GM: หน่วยสร้างอาณานิคม - มาโครฟาจแกรนูโลไซต์ BFU-E: แตกออกเป็นหน่วยอีริทรอยด์ (B) ภาพตัวแทนของหน่วยสร้างอาณานิคมของแต่ละกลุ่ม (C) จำนวนหน่วยที่สร้างอาณานิคมของแต่ละกลุ่ม เซลล์ BM ถูกแยกออกจากแต่ละกลุ่มและเพาะเมล็ดสำหรับการสอบวิเคราะห์การก่อรูปโคโลนีของเซลล์ต้นกำเนิด CFU-GM และ BFU-E ตามที่บรรยายไว้ในวัสดุและวิธีการ ผลลัพธ์ได้มาจากการทดลองอิสระ 3 ครั้งและแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM, n=5–6 * pb 0.05 เทียบกับกลุ่มควบคุม ## pb 0.0001 เทียบกับกลุ่ม FU 5-
ECH . ทางช่องท้อง(อิชินาโคไซด์)กระตุ้นการงอกขยาย BMSC ที่เหนี่ยวนำโดย FU 5-
หลังจากการเพาะเลี้ยง 4 สัปดาห์ การงอกขยายของ BMSC ถูกประเมินโดยการสังเกตสัณฐานวิทยาของเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับด้านด้วยแสง ดังแสดงในรูปที่ 5 BMSC ใน 5-FU/ECH(อิชินาโคไซด์)กลุ่มเติบโตอย่างแข็งแกร่งกว่ากลุ่มควบคุม
ECH . ทางช่องท้อง(อิชินาโคไซด์)กระตุ้นการผลิต GM-CSF ของ 5-FU ที่เหนี่ยวนำให้เกิด myelosuppressive BMSCs
หลังจากการเพาะเลี้ยง BMSC เป็นเวลา 4 สัปดาห์ การแสดงออกของ mRNA ของ GM-CSF และ EPO ของเซลล์ถูกกำหนดหาโดย RT-PCR ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 6A การแสดงออกของ GM-CSF ใน BMSC จากหนูเมาส์กดไขกระดูกที่บำบัดด้วย ECH นั้นเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับ 5-FU/กลุ่มควบคุม การผลิต GM-CSF ในส่วนลอยเหนือตะกอนของการเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกกำหนดหาโดย ELISA ดังแสดงในรูปที่ 6B เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม 5-FU/ กลุ่มควบคุม 5-FU/ECH(อิชินาโคไซด์)กลุ่มแสดงการแสดงออกที่สูงกว่าของ GM-CSF (pb 0.05) และเกือบจะมากเท่ากับกลุ่มควบคุม
ECH(อิชินาโคไซด์)เปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ PI3K ใน 5-FU ที่ถูกระงับ BM cells
เซลล์ BM และ BMSC จาก 5-FU ที่เหนี่ยวนำmyelosuppressionหรือหนูควบคุมถูกกระตุ้นด้วย ECH(อิชินาโคไซด์)ที่ความเข้มข้น 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร เป็นเวลา 24 ชั่วโมงหรือ 48 ชั่วโมง ก่อนที่เซลล์จะถูกรวบรวมเพื่อสกัดโปรตีนและเวสเทิร์นบล็อตติง เนื่องจากกลไกของ ECH(อิชินาโคไซด์)ไม่ได้รับการศึกษามากนัก เราได้คัดเลือกแผงเส้นทางสัญญาณที่เกี่ยวข้อง รวมถึง JAK/STAT1, JAK/STAT3, SAPK/JNK, p-38 MAPK, p44/42 MAPK และเส้นทางการส่งสัญญาณ PI3K/Akt ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 7 ECH สามารถกระตุ้นการแสดงออกสูงของ p-PI3K p85/p55 ในเซลล์ BM ที่ได้มาจาก 5-หนู FU ซึ่งการเหนี่ยวนำไม่ชัดเจนใน BMSC หรือในกลุ่มควบคุม สำหรับเส้นทางอื่นๆ ทั้งหมด เราไม่เห็นความแตกต่างใหญ่หลวง (ไม่แสดงข้อมูล)
การอภิปราย
ดูเหมือนว่า ECH(อิชินาโคไซด์)ไม่มีผลกับหนูที่มีการสร้างเม็ดเลือดปกติ เนื่องจากสำหรับหนูที่ไม่มี 5-การรักษาด้วย FU จำนวนเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดใน ECH(อิชินาโคไซด์)กลุ่มเกือบจะเหมือนกันกับกลุ่มควบคุม การเพิ่มจำนวนและการกระตุ้นของ BMSC ก็เช่นกันตามที่บ่งชี้โดยลักษณะทางสัณฐานวิทยา การคัดหลั่ง GM-CSF และ EPO ดังนั้นในช่วงผลลัพธ์ ข้อมูลจาก ECH(อิชินาโคไซด์)กลุ่มถูกรวมเข้ากับกลุ่มควบคุมและอธิบายไว้ว่าเป็นกลุ่มควบคุม
5-FU เป็นยาเคมีบำบัดในการรักษามะเร็งมีผลกระทบต่อการทำงานของไขกระดูก การใช้ 5-FU ในขนาดสูงอาจทำให้เกิดการกดไขกระดูกอย่างรุนแรง [19] ในการศึกษาของเรา แบบจำลองการปราบปรามของไขกระดูกถูกสร้างขึ้นอย่างประสบความสำเร็จในหนูเมาส์โดยการบำบัดด้วย 5-FU ซึ่งได้รับการสนับสนุนโดยหน่วยที่สร้างอาณานิคมที่ลดลงและสัณฐานวิทยาของ BMSC
ไขกระดูกเป็นหลักเม็ดเลือดอวัยวะประกอบด้วยเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด (HSCs) และเซลล์สโตรมอลจากไขกระดูก (BMSCs) [13] เซลล์เดิมสามารถผลิตเซลล์เม็ดเลือดรวมทั้งเซลล์เม็ดเลือดแดง เกล็ดเลือด โมโนไซต์ แกรนูโลไซต์ และลิมโฟไซต์ และเซลล์หลังสามารถผลิตไขมัน กระดูกอ่อน และกระดูก ซึ่งกำหนดเป็นเซลล์มีเซนไคม์หรือสโตรมอล [26] เป็นที่ยอมรับกันดีว่า BMSCs เป็นองค์ประกอบหลักของช่อง HSC ซึ่งประชากรสเต็มเซลล์ทั้งสองนี้จัดเรียงอย่างใกล้ชิดตามมาเม็ดเลือดและสภาวะสมดุลของโครงกระดูก [29]. BMSC สามารถกระตุ้นและส่งเสริมการเพิ่มจำนวนของ HSC โดยการคัดหลั่งโมเลกุลควบคุมและไซโตไคน์ เช่น FL [23], GM-CSF [12] และ SCF [12,3]
ข้อมูลในหลอดทดลองแสดงให้เห็นว่า ECH(อิชินาโคไซด์)สามารถกระตุ้นการเพิ่มจำนวนของเซลล์ BM จากmyelosuppressionหนูในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา แม้ว่าโดยทั่วไปแล้ว เซลล์จะเติบโตอย่างแข็งแรงในวันที่ 3 มากกว่าวันที่ 6 ซึ่งอาจเป็นผลมาจากสภาพแวดล้อมการเพาะเลี้ยงในหลอดทดลอง ในทางตรงกันข้าม ECH(อิชินาโคไซด์)ไม่มีผลต่อการเพิ่มจำนวนของ BMSC จากหนูเมาส์ที่บำบัดด้วย 5-FU ในการยกเว้นความเป็นไปได้ที่ผลกระทบด้านลบไม่ได้เกิดจากสภาวะการเจริญเติบโตของเซลล์ ในการตั้งค่าทดลอง เรายังรวม Rg1 ซึ่งเป็นส่วนประกอบสมุนไพรที่ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าสามารถกระตุ้น BMSC จากmyelosuppressionการเจริญเติบโตของหนูเป็นตัวควบคุมเชิงบวก [33]
ข้อมูลในร่างกายพิสูจน์แล้วว่า ECH(อิชินาโคไซด์)สามารถสร้างเม็ดเลือดขึ้นใหม่ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ซึ่งน่าจะเป็น granulocytopoiesis และ megakaryocytopoiesis แต่ไม่ใช่ erythropoiesis ในmyelosuppressionหนู การบริหารช่องปากของ ECH(อิชินาโคไซด์)ไป 5-หนูที่บำบัดด้วย FU เป็นเวลา 12 วัน ส่งผลให้จำนวนทั้งหมดเพิ่มขึ้นเม็ดเลือดเซลล์ต้นกำเนิดและเซลล์ต้นกำเนิดแกรนูโลไซต์-มาโครฟาจ แต่ไม่ใช่เซลล์ต้นกำเนิดอีรีทรอยด์ตามที่กำหนดโดยจำนวนของ CFU-GM และ BFU-E จากการตรวจ CFC น่าสนใจ เราสังเกตเห็นว่าจำนวน CFU-GM ใน 5-FU/ECH(อิชินาโคไซด์)สูงกว่าในกลุ่มควบคุมด้วยซ้ำ เราคาดการณ์การขยายตัวอย่างรวดเร็วของ CFU-GM ที่เกิดขึ้นเพื่อเป็นการชดเชยสำหรับmyelosuppressionสภาพนำโดย 5-FU. ข้อมูลของเรายังเปิดเผยว่า ECH สามารถกระตุ้นการเพิ่มจำนวน BMSC และ GM-CSF แต่ไม่สามารถกระตุ้นการผลิต EPO ในmyelosuppressionหนูซึ่งสอดคล้องกับผล CFC
ผลลัพธ์ที่ได้ชี้ให้เห็นวิธีการใหม่ ECH(อิชินาโคไซด์)ที่อาจนำไปใช้ปรับปรุงได้เม็ดเลือดฟังก์ชั่นในmyelosuppressionหนู (ดังแสดงในรูปที่ 8): ในสภาพแวดล้อมเฉพาะของ HSC ไม่ว่าจะโดยการเพาะเลี้ยง BMs แบบผสม ในหลอดทดลอง หรือในไขกระดูกในแหล่งกำเนิด ECH จะกระตุ้นการเพิ่มจำนวนและการผลิต BMSC ของ GM-CSF ซึ่งจะช่วยกระตุ้นและส่งเสริมการเพิ่มจำนวนและการสร้างความแตกต่าง ของ HSC หากไม่มีการมีอยู่ของ HSC ECH ก็ไม่สามารถกระตุ้นการเพิ่มจำนวน BMSC ได้
ตัวรับ GM-CSF ประกอบด้วยหน่วยย่อย (การจับลิแกนด์) และ (การส่งสัญญาณ) GM-CSF จับกับยูนิตย่อยก่อน จากนั้นจึงเหนี่ยวนำให้สัญญาณดาวน์สตรีมลดหลั่นผ่านอันตรกิริยาของโปรตีนเอฟเฟกเตอร์กับยูนิตย่อย [30] ยูนิตย่อย transactivated JAK2 ซึ่งเริ่มต้นการส่งสัญญาณดาวน์สตรีม โมดูลการส่งสัญญาณที่เปิดใช้งาน ได้แก่ ทรานสดิวเซอร์ Janus kinase/สัญญาณ และตัวกระตุ้นเส้นทางการถอดรหัส (JAK/STAT) วิถีทางโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นด้วยไมโตเจน (MAPK) และวิถีทางฟอสฟาติดิลลิโนซิทอล 3-ไคเนส (PI3K) [30] ที่น่าสนใจ ผลลัพธ์จากการตรวจคัดกรองของเราแสดงให้เห็นว่าวิถีของ PI3K ถูกกระตุ้นในเซลล์ BM ที่ได้มาจาก 5-หนูเมาส์ที่ได้รับการบำบัดด้วย FU แต่ไม่ชัดเจนใน 5-FU ที่ยับยั้ง BMSCS และเซลล์ BM หรือ BMSC ปกติ มีแนวโน้มว่า ECH . จากการเปิดใช้งานเส้นทาง GM-CSF/PI3K(อิชินาโคไซด์)คัดเลือกกระตุ้นการเจริญเติบโตของเซลล์ BM
บทสรุป
โดยสรุป เราได้แสดงให้เห็นว่า ECH(อิชินาโคไซด์)มีผลส่งเสริมที่มีแนวโน้มในเม็ดเลือดทำงานใน 5-หนูเมาส์กดไขกระดูกที่เกิดจาก FU โดยเฉพาะอย่างยิ่งในเซลล์ granulocytic และ macrophagocytic ซึ่งแนะนำว่า ECH(อิชินาโคไซด์)อาจมีศักยภาพสำหรับการใช้งานทางคลินิกในการยับยั้งไขกระดูกระหว่างการรักษาด้วยเคมีบำบัดหรือการปลูกถ่าย HSC หลังการรักษาด้วยสารเคมี
แถลงการณ์ความขัดแย้งทางผลประโยชน์
ไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์
อ้างอิง
[1] ESD Alleva, คู่มือการดูแลและการใช้สัตว์ทดลอง, Ethology 103 (1997) 1072–1073
[2] J. Bergh, T. Wiklund, B. Eriksen, E. Lidbrink, H. Lindman, P. Malmstrom, et al., Tailored fluorouracil, epirubicin และ cyclophosphamide เมื่อเทียบกับการรักษาด้วยเคมีบำบัดขนาดสูงในไขกระดูกเป็นการรักษาเสริม สำหรับมะเร็งเต้านมที่มีความเสี่ยงสูง: การทดลองแบบสุ่ม การศึกษากลุ่มเต้านมสแกนดิเนเวีย 9401, Lancet 356 (2000) 1384–1391
[3] A. Bernstein, L. Forrester, AD Reith, P. Dubreuil, R. Rottapel, The murine W/c-kit และ steel loci and the control of hematopoiesis, Semin. ฮีมาทอล 28 (1991) 138–142.
[4] พีเจ แครี่, ยากระตุ้นmyelosuppression: การวินิจฉัยและการจัดการ, ยาเซฟ. 26 (2003) 691–706.
[5] F. Cheung, TCM: ผลิตในประเทศจีน Nature 480 (2011) S82–S83
[6] EH Choi, HE Ok, Y. Yoon, BA Magnuson, MK Kim, HS Chun, ฤทธิ์ป้องกันของสารสกัดที่อุดมด้วยแอนโธไซยานินจากบิลเบอร์รี่ (Vaccinium myrtillus L.) ต่อความเป็นพิษของกล้ามเนื้อที่เกิดจาก 5-fluorouracil, BioFactors ( อ็อกซ์เอฟ อังกฤษ) 29 (2007) 55–65
[7] J. Crawford, H. Ozer, R. Stoller, D. Johnson, G. Lyman, I. Tabbara, et al., การลดปัจจัยกระตุ้นไข้และนิวโทรพีเนียของ granulocyte ที่เกิดจากเคมีบำบัดในผู้ป่วยที่มีขนาดเล็ก เซลล์มะเร็งปอด, N. Engl. เจ เมด 325 (1991) 164–170.
[8] L. Dalby-Brown, H. Barrett, AK Landbo, AS Meyer, P. Molgaard, Synergistic antioxidative effects of alkamides, อนุพันธ์ของกรด caffeic และเศษส่วน polysaccharide จาก Echinacea purpurea ในการออกซิเดชันในหลอดทดลองของ lipoproteins ความหนาแน่นต่ำของมนุษย์, เจ. อากริก. เคมีอาหาร. 53 (2005) 9413–9423.
[9] WH de Vos tot Nederveen Cappel, HJ Meulenbeld, JH Kleibeuker, FM Nagengast,
FH Menko, G. Griffioen, et al., Survival after adjuvant 5-FU treatment for stage III colon cancer in hereditary nonpolyposis colorectal cancer, Int. เจ. มะเร็ง 109 (2004) 468–471.
[10] LE Friberg, MO Karlsson, โมเดลกลไกสำหรับmyelosuppression, สืบสวน. ยาใหม่ 21 (2003) 183–194
[11] X. Geng, X. Tian, P. Tu, X. Pu, ผลกระทบต่อระบบประสาทของเอ็กไคนาโคไซด์ในรูปแบบ MPTP ของเมาส์ของโรคพาร์กินสัน Eur. เจ. ฟาร์มาคอล. 564 (2007) 66–74.
[12] JY Han, RY Goh, SY Seo, TH Hwang, HC Kwon, SH Kim, et al., การปลูกถ่ายร่วมของเลือดจากสายสะดือเม็ดเลือดเซลล์ต้นกำเนิดและการขยายวัฒนธรรม และ GM-CSF−/SCF- ถ่ายเซลล์ต้นกำเนิดจากเยื่อหุ้มเซลล์ในหนู SCID, J. Korean Med วิทย์. 22 (2007) 242–247.
[13] EL Herzog, L. Chai, DS Krause, ความเป็นพลาสติกของเซลล์ต้นกำเนิดจากไขกระดูก, เลือด 102 (2003) 3483–3493
[14] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, et al., เมแทบอลิซึมของเอ็กไคนาโคไซด์สารต้านอนุมูลอิสระที่ดีในหนู: การแยกและการระบุสารเมตาโบไลต์ของท่อน้ำดี, Metab ของยา จำหน่าย 37 (2009) 431–438.
[15] S. Kojima, K. Takaba, N. Kimoto, T. Takeda, M. Kakuni, M. Mizutani, et al., ผลการป้องกันของกลูตาไธโอนต่อ 5-fluorouracil-inducedmyelosuppressionในหนูอาร์ค ท็อกซิคอล 77 (2003) 285–290.
[16] R. Kuang, Y. Sun, W. Yuan, L. Lei, X. Zheng, ผลการป้องกันของเอ็กไคนาโคไซด์ซึ่งเป็นหนึ่งในฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์บนความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจาก H(2)O(2) ในเซลล์ PC12, Planta Med 75 (2009) 1499–1504.
[17] เจซี ลอเรนซ์, เอ็ม. Hadjisavas, GW Chovanec, FW Bazer,Myelosuppressionในสุกร (Sus scrofa): uteroferrin ช่วยลดผลกระทบต่อ myelosuppressive ของ 5-fluorouracil ในสุกรอายุน้อย, Comp. ไบโอเคมี. ฟิสิออล เอ ฟิสิโอล 116 (1997) 369–377.
[18]
F. Li, Y. Yang, P. Zhu, W. Chen, D. Qi, X. Shi, et al.,เอ็กไคนาโคไซด์ส่งเสริมการสร้างกระดูกใหม่โดยการเพิ่มอัตราส่วน OPG/RANKL ในเซลล์ MC3T3-E1, Fitoterapia 83 (2012) 1443–1450
[19] A. Lindner, D. Santilli, J. Hodgett, C. Nerlinger, ผลกระทบของ 5-fluorouracil ต่อเม็ดเลือดระบบของเมาส์ Cancer Res. 20 (1960) 497–502.
[20] DB Longley, DP Harkin, PG Johnston, 5-fluorouracil: กลไกการออกฤทธิ์และกลยุทธ์ทางคลินิก, Nat. รายได้มะเร็ง 3 (2003) 330–338
[21] BR Luce, JW Singer, JM Weschler, CD Buckner, SH Sheingold, K. Shannon-Dorcy, et al., Recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor หลังการปลูกถ่ายไขกระดูก autologous สำหรับมะเร็งต่อมน้ำเหลือง: การวิเคราะห์ทางเศรษฐศาสตร์ของ PharmacoEconomics 6 (1994) 42–48 แบบสุ่ม ปกปิดสองครั้ง ควบคุมด้วยยาหลอก
[22] M. Malet-Martino, R. Martino, การศึกษาทางคลินิกของสาม prodrugs ในช่องปากของ 5-fluorouracil (capecitabine, UFT, S-1): a review, Oncologist 7 (2002) 288–323 .
[23] S. Mishima, A. Nagai, S. Abdullah, C. Matsuda, T. Taketani, S. Kumakura, et al., การขยายตัวของ ex vivo อย่างมีประสิทธิภาพเม็ดเลือดสเต็มเซลล์ที่ใช้เซลล์ต้นกำเนิดมีเซนไคม์ที่มีความแตกต่างของออสทีโอบลาสต์ขึ้นอยู่กับ CXCL12, Eur. เจ. ฮีมาตอล. 84 (2010) 538–546.
[24] M. Mostafa, N. Nahar, M. Mosihuzzaman, T. Makhmoor, MI Choudhary, AU Rahman, phenylethanoid glycosides กำจัดอนุมูลอิสระจาก Leucas indica Linn, Nat. แยง. ความละเอียด 21 (2007) 354–361.
[25] S. Numazawa, K. Sugihara, S. Miyake, H. Tomiyama, A. Hida, M. Hatsuno, et al., การมีส่วนร่วมที่เป็นไปได้ของความเครียดออกซิเดชันใน 5-fluorouracil-mediatedmyelosuppressionในหนู Basic Clin ฟา. ท็อกซิคอล 108 (2011) 40–45.
[26] DJ Prockop, Marrow stromal cells เป็นเซลล์ต้นกำเนิดเพื่อการต่ออายุอย่างต่อเนื่องของไม่ใช่เม็ดเลือดเนื้อเยื่อและเป็นพาหะที่เป็นไปได้สำหรับยีนบำบัด, เจ. เซลล์. ไบโอเคมี. (1998) 284–285.
[27] BD Sloley, LJ Urichuk, C. Tywin, RT Coutts, PK Pang, JJ Shan, การเปรียบเทียบส่วนประกอบทางเคมีและความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระของ Echinacea สปีชีส์ต่างๆ, J. Pharm ฟา. 53 (2001) 849–857.
[28] C. Twelves, A. Wong, MP Nowacki, M. Abt, H. Burris III, A. Carrato, et al., Capecitabine เป็นการรักษาแบบเสริมสำหรับมะเร็งลำไส้ใหญ่ระยะที่ 3, N. Engl เจ เมด 352 (2005) 2696–2704.
[29] M. Valtteri, A. Sorrentino, การมีส่วนร่วมของเซลล์ stromal mesenchymal ต่อสภาวะสมดุล, J. Cell ฟิสิออล 217 (2008) 296–300.
[30] L. van de Laar, PJ Coffer, AM Woltman, ระเบียบการพัฒนาเซลล์เดนไดรต์โดย GM-CSF: การควบคุมระดับโมเลกุลและนัยสำหรับสภาวะสมดุลภูมิคุ้มกันและการบำบัด, เลือด 119 (2012) 3383–3393
[31] JMBK Worley, M. Bloomsmith, K. Coleman, TL Koban, คู่มือการดูแลและการใช้สัตว์ทดลองฉบับที่แปด (2011); ความหมายสำหรับการจัดการพฤติกรรม, อ. เจ. พรีมาทอล. 73 (2011) 98.
[32] Y. Wu, L. Li, T. Wen, YQ Li, ผลการป้องกันของเอ็กไคนาโคไซด์เกี่ยวกับความเป็นพิษต่อตับที่เกิดจากคาร์บอนเตตระคลอไรด์ในหนู พิษวิทยา 232 (2007) 50–56
[33] SF Xu, LM Yu, ZH Fan, Q. Wu, Y. Yuan, Y. Wei, et al., การปรับปรุง ginsenoside Rg1 บนเม็ดเลือดทำหน้าที่ในการกระตุ้นด้วยไซโคลฟอสฟาไมด์myelosuppressionหนู, ยูโร. เจ. ฟาร์มาคอล. 695 (2012) 7–12.
[34] Y. Zhang, J. Xing, T. Ai, T. Wen, L. Guan, J. Zhao, การคุ้มครองเอ็กไคนาโคไซด์ป้องกันการบาดเจ็บที่ปอดเฉียบพลันที่เกิดจากกรดโอเลอิกในหนูแรท Free Radic ความละเอียด 41 (2007) 798–805.
[35] AB Zhao, B. Yu, XL Wu, KJ Cao, EQ Li, QM Li, et al., ผลการป้องกันบนmyelosuppressionหนูที่ได้รับการบำบัดโดย Pharmacogn สูตรยาจีนโบราณสามสูตร แม็ก 7 (2011) 133–140.
[36] M. Zhu, C. Lu, W. Li, การสัมผัสกับ .ชั่วคราวเอ็กไคนาโคไซด์เพียงพอที่จะกระตุ้นการส่งสัญญาณ Trk และปกป้องเซลล์ประสาทจาก rotenone, J. Neurochem 124 (2013) 571–580.
