ฤทธิ์ป้องกัน reno-protective ของ EphrinB2 (EphB2)

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Zhimin Huang, Simeng Liu, Anna Tang, Laith Al-Rabadi, Mark Henkemeyer, Patrice N. Mimche และ Yufeng Huang

บทนำ

โรคไตเรื้อรัง (CKD) มีลักษณะเฉพาะคือการอักเสบอย่างต่อเนื่องและการเพิ่มขึ้นทีละน้อยของการเกิดพังผืดรวมถึงโรคไตวายเรื้อรัง (glomerulosclerosis) และการเกิดพังผืดในท่อไตโรคไตวายระยะสุดท้าย(ESRD)โดยไม่คำนึงถึงโรคพื้นเดิม|1] สิ่งนี้ชี้ไปที่เส้นทางทั่วไปขั้นสุดท้ายสำหรับ ESRD ความเข้าใจที่ดีขึ้นเกี่ยวกับผู้ไกล่เกลี่ยหลักของวิถีทั่วไปนี้อาจส่งผลให้มีการออกแบบการรักษาที่ตรงเป้าหมายมากขึ้น เพื่อป้องกันหรือย้อนกลับการลุกลามของ CKD

Erythropoietin ที่ผลิตไทโรซีนไคเนสของตัวรับตับ (Eph) และลิแกนด์ที่ทำปฏิกิริยากับตัวรับ Eph (Ephrin) ที่สอดคล้องกันของพวกมันสร้างกลุ่มโปรตีนส่งสัญญาณที่ยึดกับเมมเบรนที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้สูงซึ่งควบคุมปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์และเซลล์ที่หลากหลายตลอดการพัฒนาและในวัยผู้ใหญ่ [2] เมื่อสัมผัสระหว่างเซลล์กับเซลล์ ปฏิกิริยาระหว่าง EphB-EphrinB ส่งผลให้มีไดเมอร์ เตตระเมอร์ และกลุ่มโปรตีนที่มีลำดับสูงกว่า นำไปสู่การกระตุ้นของการส่งสัญญาณแบบสองทิศทางที่กระจายไปยังเซลล์ที่แสดงตัวรับ (การส่งสัญญาณไปข้างหน้า) และลิแกนด์- แสดงเซลล์ (สัญญาณย้อนกลับ)[3-5] เนื่องจากเชื่อว่าการส่งสัญญาณแบบสองทิศทางของ Eph-Ephrin จะมีส่วนร่วมในปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์กับเซลล์ การย้ายถิ่น และเหตุการณ์การยึดติดระหว่างทั้งการพัฒนาของตัวอ่อนและระหว่างการซ่อมแซมเนื้อเยื่อทางสรีรวิทยา 26-10] จึงไม่น่าแปลกใจที่การควบคุมที่ผิดปกติ ของโมเลกุลเหล่านี้มีส่วนเกี่ยวข้องกับการเกิดพังผืดของเนื้อเยื่อ แท้จริงแล้ว บทบาทของการส่งสัญญาณ EphB-EphrinB ในการเกิดพังผืดของเนื้อเยื่อได้ถูกเปิดเผยในโมเดลเมาส์หลายแบบของหลอดเลือด [11], หัวใจ [12], ผิวหนัง [13], ปอด [14] และการเกิดพังผืดในตับ [15] อย่างไรก็ตาม หน้าที่ที่เป็นไปได้สำหรับตัวรับและลิแกนด์เหล่านี้เกี่ยวกับพยาธิสรีรวิทยาของไตนั้นส่วนใหญ่ไม่ทราบ

ในโกลเมอรูไลของไตในผู้ใหญ่ EphrinB1 ถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นที่ไดอะแฟรมผ่าของโพโดไซต์ในโกลเมอรูไล [17], EphrinB2 ส่วนใหญ่แสดงออกในเซลล์บุผนังหลอดเลือดไต (ECs) และกล้ามเนื้อเรียบของหลอดเลือด [18] ในขณะที่ EphrinB3 นั้นแทบจะตรวจพบไม่ได้19] การแสดงออกของไตหรือการกระจายตัวของตัวรับ Eph ยังคงไม่ชัดเจนแม้ว่าการศึกษาบางส่วนระบุว่าเซลล์หายากแสดงออก EphB4 ในโกลเมอรูไลที่โตเต็มที่ [18] ในท่อไต ตรวจพบ EphrinB1 ทั่วทั้ง nephron และอาจส่งผลต่อ cytoarchitecture ของเซลล์เยื่อบุผิวท่อ [19] นอกจากจะแสดงออกมาในเซลล์กล้ามเนื้อเรียบของหลอดเลือดแดงและ EC แล้ว ยังพบ EphrinB2 อย่างมากมายในการเชื่อมต่อท่อต่างๆ กับเยื่อหุ้มสมองและท่อเก็บไขกระดูกของไตที่กำลังพัฒนาและในวัยผู้ใหญ่ [18]เอฟรินบี2 (EphB2) พบว่าตัวรับแสดงออกอย่างมากมายในท่อของไขกระดูกด้านในและด้านนอก ซึ่งรวมถึงท่อตรงส่วนปลายและแขนขาบางของห่วงของ Henle ที่ซึ่งมันกระจุกตัวอยู่ที่ด้านฐานของเซลล์ การแสดงออกของ EphB4 นั้น จำกัด อยู่ที่เส้นเลือดฝอยในไขกระดูก EphB6 แสดงออกอย่างพิเศษใน corpuscles ของไตและ tubules ของทั้ง cortex และ medulla ด้านนอก ซึ่งรวมถึง tubules ส่วน proximal และ distal tubules อย่างไรก็ตาม EphB6 เองไม่มีกิจกรรมการเร่งปฏิกิริยาและไม่น่าจะทำงานเป็นตัวรับอิสระ แต่ส่งสัญญาณว่าเป็นส่วนหนึ่งของคอมเพล็กซ์การส่งสัญญาณเฮเทอโร-โอลิโกเมอริกกับตัวรับ EphB อื่น ๆ ในร่างกาย [20]

มีรายงานก่อนหน้านี้ว่าการส่งสัญญาณย้อนกลับของ EphrinB2 ป้องกันการหายากของเส้นเลือดฝอยและการเกิดพังผืดหลังจากได้รับบาดเจ็บที่ไตซึ่งเกิดจากการอุดตันของท่อไตข้างเดียว (UUO) หรืออาการบาดเจ็บที่ภาวะขาดเลือดกลับ (IR) เนื่องจากหนูที่ไม่มี EphrinB2-การส่งสัญญาณที่ขึ้นกับ PDZ มีอาการรุนแรงกว่า การบาดเจ็บของหลอดเลือดและการเกิดพังผืดที่เพิ่มขึ้นหลังการบาดเจ็บที่ไต [21] อย่างไรก็ตาม ยังเป็นไปได้ที่โปรตีน PDZ-dead EphrinB2 ทำหน้าที่เป็นแกนด์ที่แข็งแรงกว่าเพื่อกระตุ้นการส่งสัญญาณไปข้างหน้าของ EphB และนี่อาจเป็นสาเหตุของการเกิดพังผืดในไตมากเกินไปที่สังเกตได้จากการศึกษาข้างต้น นอกจากนี้ การศึกษาข้างต้นไม่ได้ระบุว่าตัวรับ EphB ตัวใดมีส่วนร่วมในพยาธิสภาพของไตหลังได้รับบาดเจ็บ กำหนดบทบาทสำคัญของ EphB2 (EphB2)การส่งสัญญาณที่สังเกตได้เมื่อเร็ว ๆ นี้ในการเกิดพังผืดในตับ[15,16] และการแสดงออกที่อุดมสมบูรณ์ที่สุดของ EphB2 (EphB2)ในเซลล์ท่อไต[19] เราตั้งสมมติฐานว่า EphB2 (EphB2)มีแนวโน้มที่จะเกี่ยวข้องกับไตพังผืด. ในการศึกษานี้ เราตรวจสอบว่า EphB2 . สูงขึ้นหรือไม่ (EphB2)ยังพบในโรคไตต่างๆ และไม่ว่าการแสดงออกและการส่งสัญญาณของ EphB2 (EphB2)มีส่วนร่วมในการพัฒนาไตบัส EphB2 (EphB2)น็อคเอาท์(KO) และหนูควบคุมครอกเพื่อรับข้างเดียวไตการบาดเจ็บจากอินฟราเรด. เราพบว่า EphB2 (EphB2)ความสามารถในการแสดงออกและความสามารถในการส่งสัญญาณถูกควบคุมอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการบาดเจ็บของ IR ในแบบจำลองหนูเมาส์และในไตจากแบบจำลองหนูเมาส์ CKD ที่เป็นความดันโลหิตสูงและเบาหวานในการทดลองและผู้ป่วยที่ทุกข์ทรมานจาก CKD นอกจากนี้ การสูญเสียพันธุกรรมของ EphB2 (EphB2)ในหนู KO ปกป้องไตอย่างมากจากการบาดเจ็บที่เกิดจากอินฟราเรดไตความเสียหายความผิดปกติ และการเกิดพังผืด จึงเป็นการระบุถึงบทบาทที่สำคัญสำหรับตัวรับนี้ในการไกล่เกลี่ยเหตุการณ์ที่ไม่พึงประสงค์ของเซลล์ที่ส่งผลต่อไตในระหว่างที่โรคลุกลาม

cistanche ประโยชน์ชายสำหรับไต

ผลลัพธ์

EphB2 (EphB2)ถูกควบคุมและกระตุ้นในไตหลังได้รับบาดเจ็บ

การถอดเสียงสำหรับโมเลกุล EphB และ Ephrin-B ทั้งหมดในไตของหนูเมาส์ผู้ใหญ่ปกติได้รับการประเมินโดย RT-PCR (รูปที่ S1A เสริม) เผยให้เห็นผลิตภัณฑ์การขยายเสียงที่โดดเด่นที่สุดคือ EphB2 (EphB2), EphB4, EphrinB1 และ EphrinB2 แสดงให้เห็นว่า EphB4 ส่วนใหญ่แสดงออกใน EC ของหลอดเลือดและจำเป็นสำหรับความสมบูรณ์ของโครงสร้างของหลอดเลือด และไม่พบในเซลล์ไตที่สำคัญที่เกี่ยวข้องกับการเกิดพังผืด [21,26] นอกจากนี้ ข้อมูลของเราเปิดเผยว่าเซลล์เยื่อบุผิวในท่อไตและไฟโบรบลาสต์แบบท่อแสดง EphB2 (EphB2)รีเซพเตอร์และสายเลือด EphrinB1 และ EphrinB2ligands (ดูรูปเพิ่มเติม S1B) จากนั้นเราตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงที่อาจเกิดขึ้นในการแสดงออกหลังจากการบาดเจ็บของ IR และพบว่า EphB2 (EphB2)ระดับ mRNA และโปรตีนถูกควบคุมอย่างมีนัยสำคัญในไตที่ได้รับบาดเจ็บจาก WT IR เมื่อเทียบกับไตควบคุมที่ไม่ได้รับบาดเจ็บ (CTL) (รูปที่ 1A-C) สอดคล้องกับสิ่งนี้ อิมมูโนบล็อกที่ใช้แอนติบอดีจำเพาะฟอสโฟสำหรับ EphB1/EphB2 (EphB2)ที่ให้การอ่านค่าไทโรซีนไคเนสตัวเร่งปฏิกิริยาตัวรับ (p-EphB1/2) ตรวจพบการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในไตของหนูเมาส์ WT ที่ได้รับบาดเจ็บด้วยอินฟราเรด (รูปที่ 1B, D) การวิเคราะห์ส่วนเนื้อเยื่อโดยใช้สารต่อต้าน EphB2 (EphB2)แอนติบอดียืนยันการเพิ่มขึ้นในการแสดงออกของโปรตีนรีเซพเตอร์ในไตที่ได้รับบาดเจ็บของ WT IR โดยเฉพาะอย่างยิ่งในเซลล์เยื่อบุผิวแบบท่อและเซลล์ระหว่างเนื้อเยื่อทูบูโลอินเทอร์สติเชียล (รูปที่ 1E) ที่สำคัญไม่มี EphB2 (EphB2)ตรวจพบสัญญาณใน immunoblots หรือ IF ในไตจาก EphB2 (EphB2)KO หนูเมาส์(EphB2-/)แสดงให้เห็นถึงความจำเพาะของรีเอเจนต์แอนติบอดี ในที่สุด การแสดงออกของโปรตีน EphrinB2 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในไตที่ได้รับบาดเจ็บด้วย IR จากหนูเมาส์ WT ถึงแม้ว่าการเพิ่มขึ้นนี้จะไม่พบในไตที่ได้รับบาดเจ็บจาก EphB2 ที่น่าสนใจ (EphB2)KO หนู (รูปที่ 1B, F)

รูปที่ 1.EphB2 (EphB2)การแสดงออกเพิ่มขึ้นในไตของหนูหลังจากได้รับบาดเจ็บจากอินฟราเรดเป็นเวลา 2 สัปดาห์

(A) ตัวรับ EphB2, EphrinB1, ระดับ EphrinB2 mRNA ถูกวิเคราะห์ในไตของหนูเมาส์โดยใช้ RT-PCR แบบเรียลไทม์ ผลลัพธ์จะแสดงเป็นการเปลี่ยนแปลงพับเมื่อเทียบกับไตที่ตรงกันข้าม (CTL) แถบค่าคลาดเคลื่อนแสดงถึงค่าเฉลี่ย ± SD, n=5 สัตว์

(B) Western blots ของ EphB2, phosphor-EphB2 (pEphB21594), EphrinB2 และ GAPDH จากไตของ EphB2 plus / plus (WT และ EphB2-/(KO) หนู น้ำหนักโมเลกุลถูกติดฉลากไว้ทางด้านขวา

กราฟสรุปผลการวัดความหนาแน่นของแถบสำหรับ EphB2(C), p-EphB2(D) และ EphrinB2 (F)*P<0.05 vs.ephb2+/+="">

(E) ส่วนของไตที่แช่แข็งจาก EphB2 plus / plus และ EphB2-/- หนูเมาส์หลังการบาดเจ็บของ IR ถูกย้อมด้วย EphB2 (สีแดง) และ DAPI/DNA (สีน้ำเงิน) กำลังขยาย × 200 ไม่พบ EphB2 ในอิมมูโนบลอตหรือ IF การย้อมในไตจากหนู EphB2 KO

ซิสแทนเช เฮอร์บารักษาได้ไตโรคทำให้ดีขึ้นการทำงานของไต

เพื่อตรวจสอบว่านิพจน์ EphB2 . ควบคุมขึ้นหรือไม่ (EphB2)และยีน EphrinB ยังสามารถสังเกตพบได้ในสัตว์รุ่นอื่นๆ ของโรคไต เราให้ไตจากหนูเบาหวานชนิดที่ 2 db/db [27] และ deoxycorticosterone acetate (DOCA) เกลือและ angiotensin (Ang) II-infused หนูที่มีความดันโลหิตสูง [22] ถึง การวิเคราะห์ RT-PCR ข้อมูลระบุว่า EphB2 (EphB2), EphrinB1 และ EphrinB2 transcripts ทั้งหมดเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในไตในทั้งสองรุ่น (รูปที่ S2) เสริม จากนั้นเราก็ทำการย้อม IF สำหรับ EphB2 (EphB2)ในการตรวจชิ้นเนื้อไตในผู้ป่วย CKD ที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นโรคไต lgA (IgAN) ที่มีภาวะ glomerulosclerosis การฝ่อของท่อ และพังผืดคั่นระหว่างหน้าตามที่กำหนดโดยการย้อมสี PAS (รูปที่ 2A) เมื่อเทียบกับตัวแบบปกติ รูปแบบที่โดดเด่นของ EphB2 . ที่เพิ่มขึ้น (EphB2)โปรตีนและการส่งสัญญาณไปข้างหน้า (การย้อมสีด้วยแอนติบอดี p-EphB1/2) ไม่เพียงตรวจพบในโกลเมอรูไลที่เป็นโรคเท่านั้น แต่ยังพบในบริเวณท่อที่เกี่ยวข้องกับโรคในไตจากผู้ป่วย IgAN เหล่านี้ด้วย (รูปที่ 2B, C) การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีโดยใช้แอนติบอดีต้าน p-EphB2 เดียวกันกับที่ใช้สำหรับการย้อมสี IF เปิดเผยเพิ่มเติมว่าการย้อมสี p-EphB2 ที่เข้มข้นนั้นพบเห็นได้ส่วนใหญ่ในเซลล์ท่อและบางส่วนในเซลล์ระหว่างเนื้อเยื่อท่อในผู้ป่วย IgAN เหล่านี้ (รูปที่ 2D) ในทางตรงกันข้าม มีเซลล์รูปท่อเพียงไม่กี่เซลล์เท่านั้นที่ย้อมสี p-EphB2 ในไตปกติอย่างอ่อน (รูปที่ 2D) ระดับความหนาแน่นรวมกึ่งเชิงปริมาณสำหรับ EphB2 (EphB2)หรือการย้อมสี p-EphB2 ในบริเวณรอยต่อของท่อไตที่กำหนดโดย ImageJ ถูกแสดงไว้ทางด้านขวาตามลำดับ ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าการแสดงออกของ EphB2 ที่ได้รับการควบคุมและการเปิดใช้งานที่เป็นไปได้ของการส่งสัญญาณการส่งต่อเป็นคุณสมบัติที่โดดเด่นของไตพังผืด.

รูปที่ 2. EphB2 (EphB2)การแสดงออกที่เพิ่มขึ้นในเนื้อเยื่อตรวจชิ้นเนื้อไตของมนุษย์ด้วย CKD เมื่อเทียบกับวิชาปกติ การตัดชิ้นเนื้อไตจากส่วนปกติของไต (NC, n=3) และผู้ป่วย lgAN (ชนิดทางพยาธิวิทยาของ Oxford T=1 [38]) (n=7) จาก Nanjing Medical University ถูกย้อมด้วย PAS (A), EphB2 (สีแดง)(B) และฟอสเฟอร์-EphB2 (p-EphB2) (สีแดง) (C) กำลังขยาย ×200.DAPI-stained DNA(สีน้ำเงิน) ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมการย้อมสีนิวเคลียสสำหรับการย้อมแบบ IF (IF การย้อมสีได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้สำหรับเนื้อเยื่อของหนูเมาส์) การใช้วัสดุของมนุษย์ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการตรวจสอบจริยธรรมในท้องถิ่น กำลังขยาย ×200ลูกศรบ่งชี้การเกิดพังผืดในบริเวณโกลเมอรูลัสและทูบูโลอินเทอร์สติเชียล (D) การย้อมสีอิมมูโนเคมีสำหรับ p-EphB2 (ย้อมด้วยสีน้ำตาล) (ใช้แอนติบอดีต้าน pEphB2 เดียวกันกับแอนติบอดีหลักที่ใช้สำหรับการย้อมสี IF และเปอร์ออกซิเดส-คอนจูเกต anti-rabbit lgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) เป็นรอง แอนติบอดีและการย้อมสีที่เป็นบวกได้รับการพัฒนาโดยใช้ 3,3'-ไดอะมิโนเบนซิดีน) เพิ่มเติมในส่วน 3-μm ของพาราฟินที่ฝังเนื้อเยื่อชิ้นเนื้อไต lgAN เหล่านี้ไว้ 3-ไมโครเมตร และทำการย้อมทับด้วยฮีมาทอกซิลิน ในฐานะกลุ่มควบคุมเชิงลบ แอนติบอดีปฐมภูมิถูกแทนที่ด้วย lgG ก่อนภูมิคุ้มกันและไม่มีการย้อมสีจำเพาะถูกบันทึกไว้ กำลังขยาย ×400 ความหนาแน่นของพิกเซลแบบบูรณาการสัมพัทธ์ของการย้อมสีของ EphB2 หรือ p-EphB2 โดยเฉพาะอย่างยิ่งในบริเวณรอยต่อของท่อไต ตามที่วัดโดย ImageJ นั้นแสดงไว้ทางด้านขวาของภาพถ่ายการย้อมสีแต่ละภาพ*P<0.05 vs.="" normal="" kidney="">

รูปที่ 3.EphB2 (EphB2)- หนู KO แสดงการทำงานของไตที่ดีขึ้นและการฝ่อ และลดการบาดเจ็บของท่อและการเกิดพังผืดของ tubulointerstitial หลังจากได้รับบาดเจ็บจากอินฟราเรด (AC) เซรั่ม BUN (A), ระดับ Cr (B) และน้ำหนักไต (C) (n=5/กลุ่ม).*P<0.05 vs.ephb2+/+="" mice.="" (d,="" e)representative="" microscopic="" images="" showing="" pas="" staining="" (d)="" and="" masson's="" trichrome="" staining="" (e)="" of="" the="" kidney="" sections="" were="" used="" to="" detect="" tubular="" injury,="" inflammation,="" and="" collagen="" deposition="" (stained="" blue).="" magnification,×200.(f,="" g).="" the="" graphs="" summarized="" the="" results="" of="" tubular="" injury="" (f="" and="" collagen="" deposition="" (g)="" quantified="" by="" imagej.(h,="" d)="" mrna="" expression="" of="" tubular="" injury="" markers,="" ngal(h)="" and="" kim-1="" ()="" in="" the="" kidney="" following="" ir=""><0.05 vs.ephb2+/="" contralateral="" kidney=""><0.05 vs.ephb2+/+="" ir-injured="">

EphB2 (EphB2)KO ปกป้องไตจากการบาดเจ็บและพังผืดที่เกิดจากอินฟราเรด

ในรูปแบบ IR ของการบาดเจ็บที่ไตและการเกิดพังผืด 35-โปรโตคอลขาดเลือดขั้นต่ำในหนูเมาส์ WT ทำให้เกิดความเสียหายของไตข้างเดียวเรื้อรังอย่างรุนแรงโดยทั่วไปหลังจาก 2 สัปดาห์ ซึ่งรวมถึงการทำงานของไตบกพร่องตามหลักฐานโดยระดับ BUN และ Cr ในซีรัมที่เพิ่มขึ้น (รูปที่ 3A, B) (แม้ว่าระดับซีรั่มของ BUN หรือ Cr ที่วัดที่นี่เพียงบางส่วนจะสะท้อนถึงการทำงานที่บกพร่องของไตที่ได้รับบาดเจ็บจาก IR ทั้งระดับ BUN และ Cr ในซีรัมในหนู WT ที่มีข้างเดียวการบาดเจ็บของ IR ไตเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับหนูปกติ WT ที่ไม่มีอาการบาดเจ็บใดๆ (BUNvs. Normal:26.81±4.25 vs.17.3±0.37 mg/dl; Cr:0.3{{1{{12} }}}1±0.029 vs.0.158±0.064 mg/dl)) และไตลีบตามที่เห็นได้ชัดเจนจากดัชนีน้ำหนักไตที่ลดลง (อัตราส่วนของน้ำหนักไตที่ได้รับบาดเจ็บจากรังสีอินฟราเรดเหนือการควบคุม น้ำหนักไตที่ไม่ได้รับบาดเจ็บ) (ภาพที่ 3C ). ในทางเนื้อเยื่อวิทยา ไตที่ได้รับบาดเจ็บจากรังสีอินฟราเรดในหนูเมาส์ WT แสดงให้เห็นการแทรกซึมของเซลล์โมโนนิวเคลียร์แบบทูบูโลอินเทอร์สติเชียลโดยทั่วไปและการสะสมของคอลลาเจนที่สะสมตามที่กำหนดโดยการย้อมด้วย PAS และการย้อมสีไตรโครมของแมสสัน (รูปที่ 3D-G) EphB2-/-mice ที่ได้รับบาดเจ็บจากอินฟราเรดแสดงระดับ BUN และ Cr ที่ลดลงอย่างมากเมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่ได้รับบาดเจ็บจาก WT และการฝ่อของไต การบาดเจ็บของท่อ และพังผืดในท่อไตลดลงอย่างเห็นได้ชัด การถอดเสียงของไตสำหรับ lipocalin ที่เกี่ยวข้องกับนิวโทรฟิลเจลาติเนส (NGAL) และโมเลกุลการบาดเจ็บของไต-1(KIM-1) mRNA ได้รับการประเมินเช่นกันเนื่องจากทั้งสองได้รับการตรวจสอบว่าเป็นตัวบ่งชี้การทำนายเบื้องต้นของการบาดเจ็บที่ท่อไต ข้อมูลระบุว่าในขณะที่ NGAL และ KIM-1 แสดงออกอย่างมากในไตที่ได้รับบาดเจ็บจาก IR จากหนูเมาส์ WT การแสดงออกของไตลดลงอย่างเห็นได้ชัด 77.2 และ 88.5 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ ในไตที่ได้รับบาดเจ็บจาก EphB{{33} }/ หนูกลายพันธุ์ (รูปที่ 3H-I) สิ่งนี้บ่งชี้ว่าความเสียหายของท่อหลังจากการบาดเจ็บของ IR ลดลงอย่างมากในหนูที่ไม่มีการแสดงออกของEphB2 (EphB2)ตัวรับ

รูปที่ 4.EphB2 (EphB2)- หนู KO ลดการย้อมสีของท่อ -SMA และระดับโปรตีนในไตของตัวบ่งชี้ไฟโบรติกหลังจากได้รับบาดเจ็บจากอินฟราเรด

(A) ส่วนของไตที่ถูกแช่แข็งจาก EphB2 plus / plus t และ EphB2-/- หนูเมาส์หลังการบาดเจ็บของ IR ถูกย้อมด้วย -SMA (สีแดง) และ DAPI/DNA (สีน้ำเงิน) และวิเคราะห์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล กำลังขยาย×200.

(B) กราฟสรุปผลลัพธ์ของการสะสม -SMA ที่หาปริมาณโดย ImageJ.*P<0.05 vs.ephb2+/t="" contralateral="" kidney="">

(C) Western blots ของ FN, -SMA, N-cadherin และ GAPDH จาก CTL และไตที่ได้รับบาดเจ็บจาก IR ของ EphB2 plus / plus และ EphB2-/7- หนู น้ำหนักโมเลกุลถูกติดฉลากไว้ทางด้านขวา n =5 สัตว์/กลุ่ม

(DF) กราฟสรุปผลลัพธ์ของการตรวจวัดความหนาแน่นของแถบสำหรับ FN (D), -SMA (E) และ N-cadherin (F)*P<0.05 vs.="" ephb2+/+=""><0.05 vs.="" ephb2+/+="" ir-injured="">

ประโยชน์ของ cistanche ทะเลทรายบนไต

-SMA มักจะเพิ่มขึ้นในระหว่างการสร้างความแตกต่างของเซลล์ในท่อเป็นไฟโบรบลาสต์หรือการกระตุ้นไฟโบรบลาสต์กับไมโอไฟโบรบลาสต์หรือการเปลี่ยนแปลงของหลอดเลือด เมื่อใช้การวิเคราะห์ IF ของส่วนของไต เราตรวจพบการย้อมสี -SMA ที่เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดในเซลล์ท่อในไตที่ได้รับบาดเจ็บจาก IR จากหนูเมาส์ WT ซึ่งเป็นการตอบสนองที่ยกเลิกไปอย่างมากใน EphB2 (EphB2)-/- หนูเมาส์ (รูปที่ 4A, B) การสังเกตนี้ได้รับการสนับสนุนเพิ่มเติมโดยการวิเคราะห์อิมมูโนบลอตซึ่งแสดงการลดลงอย่างน่าทึ่งในระดับโปรตีนที่สูงขึ้นของ -SMA เช่นเดียวกับฟีโนไทป์ของเยื่อหุ้มสมอง/ไฟโบรติกที่แสดงคุณลักษณะโดยการแสดงออกของ N-cadherin และ FN ในไตที่ได้รับบาดเจ็บจาก IR จาก EphB2 (EphB2)-/- เมาส์เปรียบเทียบกับตัวควบคุม WT (รูปที่ 4C-F) การวิเคราะห์เพิ่มเติมแสดงให้เห็นว่าระดับ mRNA ที่เพิ่มขึ้นของตัวบ่งชี้ไฟโบรติกรวมถึงคอลลาเจนชนิด Iol (Col-Io1), Col-II 1, Col-IVcl และ FN ในไตที่ได้รับบาดเจ็บจากอินฟราเรดก็ลดลงเช่นกันใน EphB2 (EphB2)-/- กลายพันธุ์ (รูปที่ 5) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า EphB2 (EphB2)KO ปกป้องไตจาก EMT และพังผืดที่เกิดจาก IR

รูปที่ 5. RT-PCR เชิงปริมาณสำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนของเครื่องหมาย profibrotic และ inflammatory

RNA ทั้งหมดถูกเตรียมจาก contralateral (CTL) หรือไตที่บาดเจ็บด้วย IR ของEphB2บวก บวก และEphB2---/- หนูเมาส์ข้อมูลคือค่าเฉลี่ย± SD สัตว์ n=5 ตัวต่อกลุ่ม*P<0.05>EphB2บวก / บวก CTL, #P<0.05>EphB2บวก / บวกกับไตที่ได้รับบาดเจ็บจาก IR

EphB2 (EphB2)KO บรรเทาการอักเสบของไตอย่างรุนแรง ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน และการตอบสนองที่เพิ่มขึ้นหลังการบาดเจ็บจากอินฟราเรด

ในฐานะที่เป็นโมดูเลเตอร์ที่สำคัญของการเกิดพังผืดของเนื้อเยื่อ TGF 1, plasminogen-activator inhibitor type 1(PAI-1), ตัวรับปัจจัยการเจริญเติบโตจากเกล็ดเลือด (PDGFR ) และตัวยับยั้งเนื้อเยื่อของ metalloproteinase (TIMP1) มีบทบาทสำคัญในไตพังผืด. ตามที่คาดไว้ ระดับ mRNA ของไตของ TGF 1, PAI-1, PDGFR- และ TIMP1 เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดในไตที่ได้รับบาดเจ็บจาก IR ของหนูเมาส์ WT เมื่อเทียบกับไตที่ไม่ได้รับบาดเจ็บของ CTL ภายใน (รูปที่ 5) อย่างไรก็ตาม การแสดงออกของ mRNA ของโมดูเลเตอร์โปรไฟโบรติกเหล่านี้มีความคมชัดอย่างมากในไตที่บาดเจ็บด้วย IR ของหนู EphB2-7- ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับการลดลงของไตพังผืดเราสังเกตใน EphB2-7หนูหลังจากได้รับบาดเจ็บจาก IR

เพื่อตรวจสอบผลกระทบของ EphB2 . เพิ่มเติม (EphB2)KO บนเส้นทางการส่งสัญญาณดาวน์สตรีมของเซลล์ที่เกี่ยวข้อง เราสังเกตว่าการถอดเสียง RNA ของไตสำหรับ NF-kB-p65, โปรตีน monocyte chemoattractant-1(MCP-1), interleukin (IL)-1B และ Nox2 ทั้งหมดเพิ่มขึ้นในไตที่ได้รับบาดเจ็บจาก IR ของหนูเมาส์ WT (รูปที่ 5) นอกจากนี้ การผลิตโปรตีนในไตของ NF-KB-p65, Nox2 และโคแฟกเตอร์ของ p47Phox นั้นมากกว่าในไตที่บาดเจ็บด้วย IR ของหนูเมาส์ WT เมื่อเทียบกับ CTLkidneys ซึ่งบ่งชี้ถึงการกระตุ้นวิถีการอักเสบที่อาศัย NF-kB และ Nox2 ใน IR- ไตได้รับบาดเจ็บ อย่างไรก็ตาม ระดับของตัวกลางไกล่เกลี่ยเหล่านี้ได้รับการแก้ไขหรือย้อนกลับใกล้เคียงกับระดับปกติในหนู KO ที่ไม่มี EphB2 (EphB2)การแสดงออก (รูปที่ 6A-D) ฟอสโฟรีเลชันและการส่งสัญญาณของซีรีน/ทรีโอนีนไคเนส (Akt) และเส้นทาง MAPK/ERK เพิ่มขึ้นในไตที่บาดเจ็บด้วยอินฟราเรดของหนูเมาส์ WT ซึ่งลดลงอย่างมากเมื่อเข้าใกล้ระดับปกติใน EphB2-/-หนู (รูปที่ 6A, E, F). แอนติบอดี F4/80 ที่รู้จักในการติดฉลากมาโครฟาจ แสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมากในจำนวนที่แน่นอนของ F4/80 plus เซลล์ในบริเวณ tubulointerstitial ในไตที่ได้รับบาดเจ็บจาก IR ของหนูเมาส์ WT ในขณะที่เซลล์ F4/80 plus นั้นเบาบางในหลอดเลือดของไตใน ไต CTL ซึ่งบ่งชี้ถึงการสะสมของแมคโครฟาจและการอักเสบในไตที่เสียหาย อย่างไรก็ตาม จำนวนเซลล์บวก F4/80 ลดลงอย่างมากในหนู EphB2-7- โดยเข้าใกล้ระดับปกติที่พบในไตที่ไม่ได้รับบาดเจ็บ (รูปที่ 7A, B) ยิ่งกว่านั้น เราได้ทดสอบ Ki-67 ซึ่งเป็นโปรตีนนิวเคลียร์ที่ทำหน้าที่เป็นเครื่องหมายของเซลล์ของการเพิ่มจำนวน สอดคล้องกับการกระตุ้นของ Akt และ ERK1/2 ในไตที่ได้รับบาดเจ็บด้วย IR ของหนูเมาส์ WT การย้อมสี IF ตรวจพบการเพิ่มขึ้นอย่างมากใน Ki-67-จำนวนเซลล์ที่เป็นบวกในพื้นที่ tubulointerstitial ในทางตรงกันข้าม EphB2-7-หนูแสดงจำนวนที่ต่ำกว่ามากและมีความเข้มของ Ki-67 ในไตที่ได้รับบาดเจ็บน้อยกว่ามาก (รูปที่ 7C, D) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าการลบ EphB2 (EphB2)ยับยั้งการอักเสบที่เกิดจาก NF-kB การสร้างและการกระตุ้นของ NADPH oxidase-mediated oxidase และการเพิ่มจำนวนเซลล์ที่เป็นสื่อกลางของ Akt และ ERK1/2- ในไตที่ได้รับบาดเจ็บจาก IR ในหนูทดลอง ดังนั้น EphB2 (EphB2)อาจจำเป็นสำหรับรูปธรรมไตอักเสบและการตอบสนองที่เพิ่มขึ้นซึ่งนำไปสู่การเป็นพังผืด

รูปที่ 6. ระดับโปรตีนในไตของการอักเสบ ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน และเครื่องหมายการงอกขยาย

(A) Western blots ของ NF-kBp65, Nox2,p47phox, p-Akt, pERK1/2,t-ERK1/2 และ GAPDH จาก contralateral (CTL) และไตที่ได้รับบาดเจ็บจาก IR ของEphB2 (EphB2)/ และEphB2-/-หนู. มีการติดฉลากน้ำหนักโมเลกุลไว้ทางด้านขวา n=5 สัตว์/กลุ่ม

(BF) กราฟสรุปผลการวัดความหนาแน่นของแถบสำหรับ NF-kB-p65 (B), Nox2 (C), p47Phox(D), p-Akt (E), pERK1/2/t-ERK1/2 (F ) ตามลำดับ *ป<0.05 vs.="">EphB2บวก / บวก CTL.#P<0.05 vs.="">EphB2*/ บวกกับไตที่ได้รับบาดเจ็บจาก IR

ลดการตายของเซลล์ในไตของ EphB2 (EphB2)-/- หนูตามอาการบาดเจ็บของ IR

ไตที่ได้รับการบาดเจ็บจากรังสีอินฟราเรดยังมีลักษณะเฉพาะด้วยการตายของเซลล์เยื่อบุผิวในท่อไตที่กว้างขวาง การย้อมสี TUNEL แสดงให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของการตายของเซลล์ในไตที่บาดเจ็บด้วย IR ของหนูเมาส์ WT เมื่อเทียบกับไต CTL (รูปที่ 8A, B) ซึ่งลดลงอย่างมากในหนู EphB2-7 ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนบทบาทของ EphB2 (EphB2)KO ในการยับยั้งการตายของเซลล์และกลไกการซ่อมแซมเมื่อได้รับบาดเจ็บที่ไต ผลกระทบเพิ่มเติมดังกล่าวของ EphB2 (EphB2)ยังอาจอธิบายการเกิดพังผืดจำกัดที่เกิดขึ้นใน EphB2-7-หนูหลังการบาดเจ็บเรื้อรังที่เกิดจาก IR

costanche บนไต

EphB2 (EphB2)เส้นทาง profibrotic ที่เกี่ยวข้องกับสัญญาณ

ในบรรดา 760 ยีนที่ทดสอบโดยการแสดงออกของยีน NanoString (แสดงในรูปที่ 9A ซึ่งเป็นแผนที่ความร้อนของการแสดงออกของยีน) มีหลักฐานของการแสดงออกของยีนที่แตกต่างกัน (ปรับ P<0.05)in the="" ir-injured="" kidney="" of="" wt="" mice="" relative="" to="" the="" wt="" ctl="" kidney="" (wt-ir="" vs.="" wt-ctl)="" for="" 506="" genes(356genes="" were="" up-regulated="" and="" 150="" genes="" were="" down-regulated)with="" an="" estimated="" false="" discovery="" rate="" of="" 5%.="" the="" up-regulated="" 356="" genes="" include="" all="" molecules="" that="" we="" have="" observed="" in="" their="" rna="" expression="" or="" protein="" production="" using="" real-time="" rt-pcr="" or="" western="" blot="" assay="" described="" above="" and="" these="" genes="" encode="" for="" fibrotic="" markers="" such="" as="" col-iol,="" col-iiol,="" col-ivαl,="" and="" fn;="" emt="" markers="" such="" as="" α-sma="" and="" vimentin;="" inflammatory="" factors="" and="" oxidative="" enzymes="" such="" as="" nf-kb,="" mcp-1,="" il-1β,="" and="" nox2;="" growth="" factors="" and="" proliferation="" markers="" such="" as="" tgfβ1,="" pai-1,="" pgdfrβ1,="" timp-1,="" mek="" kinase,="" akt-1="" and="" ki-67,="" and="" caspase-3,="" -4,="" and-12="" that="" regulate="" inflammation="" and="" apoptosis.="" however,="" all="" those="" increased="" markers="" that="" were="" significantly="" attenuated="" in="" the="" ir-injured="" kidney="" of=""> (EphB2)หนู KO เปรียบเทียบกับหนูเมาส์ WT (KO-IR กับ WT-IR) ที่กำหนดโดย RT-PCR แบบเรียลไทม์หรือการทดสอบ Western blot ที่อธิบายข้างต้นนั้นได้รับการยืนยันโดยการทดสอบการแสดงออกของยีน NanoString ยีนที่มีการควบคุมลดลง ได้แก่ superoxide dismutase 1(SOD1) [28], heme oxygenase 1(Hmox1) [29] และ thioredoxin 1,2(Txn1,2) [30] ที่ดูเหมือนว่าจะอยู่ในตระกูลสารต้านอนุมูลอิสระ การลดลงของยีนเหล่านี้สัมพันธ์กับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่เพิ่มขึ้นซึ่งสังเกตพบในไต WT ที่ได้รับบาดเจ็บจาก IR อย่างไรก็ตาม การลดลงดังกล่าวใน SOD1 และ Txn1, 2 ไม่ได้เกิดขึ้นใน EphB2 ที่ได้รับบาดเจ็บจาก IR (EphB2)KO ไต. เห็นได้ชัดว่าการทดสอบการแสดงออกของยีน NanoString ได้เปิดเผยยีนของผู้สมัครหลายตัวที่เกี่ยวข้องกับการกระตุ้นด้วยอินฟราเรดไตบาดเจ็บและพังผืด โดยเฉพาะอย่างยิ่ง 230 จาก 356 ยีนที่ได้รับการควบคุมลดลง (รวม 64.6% โดยมี P . ที่ปรับแล้ว<0.05)and 129="" of="" 150="" down-regulated="" genes="" were="" reversed="" to="" varying="" degrees（total="" 86%个,="" with="" adjusted=""><0.05）in the="" ir-injured="" kidney="" of="" ephb2-/-mice="" compared="" with="" wt="" mice(ko-ir="" vs.="" wt-ir).="" all="" those="" ameliorated="" molecules="" are="" involved="" in="" 50="" ameliorated="" annotated="" pathways="" (shown="" in="" figure="" 9b,="" a="" heatmap="" of="" pathway="" scores).="" among="" those,="" the="" common="" profibrotic="" pathways,="" shown="" in="" figure="" 9c,="" that="" will="" contribute="" to="" the="" development="" of="">ไตพังผืดเช่น EMT และวิถีการอักเสบและการแพร่กระจาย ถูกกระตุ้นหรือควบคุมในไตที่บาดเจ็บด้วย IR อย่างเห็นได้ชัด แต่จะดีขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน EphB2 ที่ได้รับบาดเจ็บจากอินฟราเรด (EphB2)KO ไต. น่าแปลกที่การวิเคราะห์นี้ยังเปิดเผยว่าเมแทบอลิซึมของพลังงานในเซลล์ท่อไต เช่น de novo lipogenesis, gluconeogenesis, เมแทบอลิซึมของคอเลสเตอรอล, การส่งสัญญาณ Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) และโดยเฉพาะอย่างยิ่งการเผาผลาญของกรดไขมันนอกเหนือจากการแสดงออกของ mRNA ที่ลดลงของสารต้านอนุมูลอิสระ (เช่น ระบุเป็นเส้นทางความเครียดออกซิเดชันในแผนที่ความร้อน รูปที่ 9B) ซึ่งส่วนใหญ่ถูกทำลายในไตที่ได้รับบาดเจ็บจาก IR ได้รับการอดทนอย่างมากใน EphB2 ที่ได้รับบาดเจ็บจาก IR (EphB2)KO ไต (ดังแสดงในรูปที่ 9D) ผลลัพธ์เหล่านี้แนะนำเพิ่มเติมว่าโมเลกุลส่วนใหญ่ที่เกี่ยวข้องกับไตบาดเจ็บและพังผืดถูกควบคุมโดยหรือเกี่ยวข้องกับ EphB2 (EphB2)การส่งสัญญาณ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง EphB2 (EphB2)การส่งสัญญาณอาจเกี่ยวข้องหรือเป็นสื่อกลางในการเผาผลาญพลังงานของไมโตคอนเดรียของเซลล์ท่อไต เช่น การเกิดออกซิเดชันของกรดไขมันไมโตคอนเดรียและการเกิดพิษต่อไขมันในโรคไต

รูปที่ 7.EphB2 (EphB2)KO ลดการแทรกซึมของมาโครฟาจและการเพิ่มจำนวนเซลล์ท่อในไตหลังจากได้รับบาดเจ็บจากอินฟราเรด ส่วนของไตจาก EphB2 plus / plus และ EphB2-7หนู (n=5/ตัว) หลังการบาดเจ็บของ IR ถูกย้อมด้วย F4/80 (สีแดง)(A), Ki-67 (สีแดง) (C) และ DAPI/DNA (สีน้ำเงิน) และวิเคราะห์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล กำลังขยาย×200 กราฟสรุปผลลัพธ์ของ F4/80 บวก (B) และ Ki-67 บวกเซลล์ (D) ที่หาปริมาณโดย ImageJ.*P<0.05 vs.ephb2+/+="" contralateral="" kidney=""><0.05 vs.ephb2+/+="" ir-injured="">

รูปที่ 8.EphB2 (EphB2)KO ช่วยลดการตายของเซลล์ tubular ในไตหลังจากได้รับบาดเจ็บจาก ischemia-reperfusion (IR) (A) ส่วนของไตจาก EphB2 plus / plus และ EphB2-7- หนูเมาส์ ((n=5/ตัว) หลังการบาดเจ็บของ IR ถูกย้อมด้วย TUNEL(สีเขียว) และ DAPI/DNA(สีน้ำเงิน) และวิเคราะห์โดยใช้ กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล กำลังขยาย×200 (B) กราฟสรุปผลลัพธ์ของ TUNEL บวกเซลล์ที่หาปริมาณโดย ImageJ.*P<0.05 vs.ephb2++="" contralateral="" kidney=""><0.05 vs.="" ephb2+="" ir-injured="">

คลิกที่นี่เพื่อเป็นส่วนหนึ่ง Ⅰ Ⅱ