ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อส่วนที่ 1

สมุนไพร Cistanche มีผลป้องกันระบบประสาทที่ดีมาก

2.6. ผลต้านอะพอพโทติกของไซโตไคนินที่กำหนดโดยการวัดกิจกรรมของแคสเปส-3/7

ตามที่แสดงโดยการสอบวิเคราะห์การย้อมสี PI ที่อธิบายข้างต้น SAL ทำให้เกิดอัตราการตายของเซลล์ SH-SY5Y เพิ่มขึ้น เนื่องจาก SAL เกี่ยวข้องกับทั้งการตายของเซลล์และเนื้อร้าย [51] เราจึงตรวจสอบการเปิดใช้งานของ caspase-3 และ 7 (casp-3/7) เป็นเครื่องหมายเฉพาะของการตายของเซลล์ (ระยะการดำเนินการ) [52] หลังจากให้เซลล์สัมผัสกับ CKs กิจกรรมของแคสเปส-3/7 ที่บันทึกหลังการบำบัดด้วยสารประกอบทดสอบแต่ละชนิดถูกทำให้เป็นมาตรฐานเมื่อเทียบกับสิ่งเหล่านั้นที่บันทึกไว้หลังการบำบัดด้วย 50{{30}} uM SAL (กำหนดเป็น 100 เปอร์เซ็นต์ ). ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 4 ตัวยับยั้งแคสเปสที่รู้จักกันดี Ac-DEVD-CHO (รวมอยู่ในกลุ่มควบคุมเฉพาะที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์) ยับยั้งการออกฤทธิ์ของแคสเปส-3/7 อย่างมากที่ความเข้มข้นย่อยไมโครโมลาร์ (ถึง 36.3 ± 2.66 และ 25.2 ± 2.69 เปอร์เซ็นต์ของระดับในเซลล์ที่บำบัดด้วย SAL เพียงอย่างเดียวที่ 0.05 และ 0.5 uM ตามลำดับ) ระดับการยับยั้งที่คล้ายคลึงกันได้รับการสังเกตก่อนหน้านี้ [53] ในแบบจำลองการเสื่อมสภาพของระบบประสาทในหลอดทดลองที่แตกต่างกัน ในหลอดทดลอง SH-SY5Y NAC การควบคุมเชิงบวกยังลดกิจกรรม caspase-3/7 อย่างมีนัยสำคัญ เป็น 88.7 ± 1.87 เปอร์เซ็นต์และ 78.5 ± 2.56 เปอร์เซ็นต์ของระดับที่เกิดจาก SAL ที่ 100 uM และ 1000 uM ตามลำดับ CKs ที่ทดสอบมีผลกระทบมากมายต่อกิจกรรมของ caspase-3/7 สิ่งที่น่าสนใจจาก CK ribosides มีเพียง cZR เท่านั้นที่มีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อกิจกรรมที่ 0.1 uM (ลดลงเหลือ 83.3 ± 4.33 เปอร์เซ็นต์ของระดับที่เกิดจาก SAL ตามลำดับ) ในขณะที่ iPR ที่ 1 uM ไม่ได้ลดลงอย่างมีนัยสำคัญของ casp-3 ,7. ในที่สุด K3G ลดกิจกรรมของแคสเปส-3/7 โดยมีผลสูงสุดที่ 10 uM (ถึง 81.7 ± 4.31 เปอร์เซ็นต์ของระดับที่เกิดจาก SAL) โดยรวมแล้ว SAL กระตุ้นกิจกรรมของแคสเปสเพิ่มขึ้น 1.6- เท่า-3/7 เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ควบคุมที่มีสุขภาพดี (CTR รูปที่ 4) ตามผลการศึกษาก่อนหน้านี้ ซึ่งมีความคล้ายคลึงกัน ความเข้มข้นของ SAL (400 ไมโครโมลาร์) และสายเซลล์เดียวกันถูกใช้ [54] NAC เป็นที่รู้จักในการกระตุ้นกิจกรรม caspase-3/7 ในรูปแบบต่างๆ ของเซลล์ประสาทความตาย [55–58] อย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์ที่นำเสนอนี้ให้การสาธิตครั้งแรกของแคสเปสของพวกมัน-3/7 ในแบบจำลองที่เหนี่ยวนำโดย SAL แบบเซลล์ SH-SY5Y ของเซลล์ประสาทความตาย. กลุ่มควบคุมเชิงบวกลดแอคติวิตีของแคสเปส-3/7 ที่เหนี่ยวนำโดย 500 uM SAL ในลักษณะที่คล้ายคลึงกับ CK แต่ cZR และ K3G มีประสิทธิผลแม้ที่ความเข้มข้นระดับไมโครไมโครโมลาร์หรือไมโครโมลาร์ การศึกษาอื่นที่มีแบบจำลองความเครียดที่เกี่ยวข้องกับ PD (ตัวยับยั้งโปรตีเอสโซม MG 132- หรือ H2O2- ทำให้เกิดความเป็นพิษในเซลล์ SH-SY5Y [17] และไฟโบรบลาสต์ [15]) และโรคฮันติงตัน (แบบจำลองการอดอาหารในซีรัมใน เซลล์ PC12 [19]) ยังได้แสดงให้เห็นว่า CKs K และ tZR สามารถมีกิจกรรมต่อต้าน apoptotic (caspase-3) [17] และทั้ง K และ tZR สามารถมีกิจกรรมต่อต้านการชราภาพได้ [17,19] . นอกจากนี้ การเชื่อมโยงระหว่างการลดค่า casp-3,7 การเปิดใช้งานและสารป้องกันประสาทมีการรายงานกิจกรรมสำหรับแบบจำลองที่เกี่ยวข้องกับ SAL และ SAL [54,59,60]

รูปที่ 4 กิจกรรมของแคสเปส-3/7 ในแบบจำลองที่เหนี่ยวนำโดย SAL ของ PD เพิ่มขึ้นสามเท่าในอย่างน้อยสี่วันอิสระ * P เทียบกับรถที่มี 500 uM SAL, # P เทียบกับรถที่ไม่มี 500 uM SAL

2.7. การระบุกิจกรรมป้องกันระบบประสาทของไซโตไคนินในแบบจำลอง CellDeath ที่เกิดจากกลูตาเมต

เนื่องจากเซลล์ SH-SY5Y ไม่แสดงหน่วยย่อยของตัวรับ NMDA ทั้งหมด [61] กลไกที่เป็นไปได้มากที่สุดของความเป็นพิษของกลูตาเมต (Glu) คือการอุดตันของซีสทีน/กลูตาเมต Xc-antiporter ที่มีการเหนี่ยวนำให้เกิดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันอย่างมาก [62] ผู้เขียนคนก่อน ๆ ได้แสดงให้เห็นแล้วว่ามีความเกี่ยวข้องกันระหว่างการตายของเซลล์ที่เกิดจากกลูตาเมตกับเนื้อร้ายในเซลล์ SH-SY5Y [63] และความสำคัญของการกระตุ้นแคสเปส-3ในความเป็นพิษที่เกิดจากกลูตาเมตที่มีต่อเซลล์เหล่านี้ [62,64] การศึกษาหลายชิ้นยังแสดงให้เห็นการเกิดขึ้นของการตายของเซลล์ที่ขับด้วยธาตุเหล็ก (ferroptosis) หลังการเป็นพิษของกลูตาเมต [62,65,66] และระบุการเกิดการตายของเซลล์สามประเภท (เนื้อร้าย, การตายของเซลล์, และเฟอร์รอปโตซิส) หลังจากการปิดกั้นของ Xc - ระบบกันสะเทือน เพื่อที่จะเสร็จสิ้นการประเมินที่ครอบคลุมของสารป้องกันประสาทศักยภาพของการทดสอบไซโตไคนิน, ระบบทดสอบการตายของเซลล์ที่เหนี่ยวนำโดยกลูตาเมตถูกรวมไว้ในแผงการวิเคราะห์ด้วยค่าที่รู้จักสารป้องกันประสาทiron chelator deferoxamine (DFO) และตัวยับยั้งของ necroptosis necrostatin-1 (NEC-1) [67] เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก ในที่นี้ เซลล์ SH-SY5Y ถูกสร้างความแตกต่างเป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นบำบัดด้วย Glu 160 มิลลิโมลาร์หรือในการบำบัดร่วมกันของพวกมันด้วยสารต่างๆไซโตไคนินความเข้มข้น ({{0}}.1–10 uM) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและย้อมด้วย PI ในแบบจำลองนี้ ผลของ Glu ต่อการตายของเซลล์คือสัญญาณ PI 100 เปอร์เซ็นต์ ดังนั้นการประเมินการลดลงของการตายของเซลล์โดยสารประกอบทดสอบ Glu กระตุ้นให้เซลล์ตายเพิ่มขึ้นเกือบ 4-เท่าเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม SH-SY5Y ที่มีสุขภาพดี (26.1 ± 0.42 เปอร์เซ็นต์) การคัดกรองกลุ่มควบคุมเชิงบวกและไซโตไคนินเปิดเผยว่าทั้งกลุ่มควบคุมเชิงบวก NEC-1 (50 uM,76.6 ± 2.51 เปอร์เซ็นต์ ) และ DFO (10 uM, 84.2 ± 4.54 เปอร์เซ็นต์ ) ลดการตายของเซลล์ที่เกิดจากกลูตาเมต ดังแสดงในรูปที่ 5A จากแผงของไซโตไคนิน, เพียงสามไซโตไคนินสามารถป้องกันได้เซลล์ประสาทคล้ายเซลล์ SH-SY5Y ในลักษณะเดียวกับการควบคุมเชิงบวก แอคทีฟที่สุดไซโตไคนินคือทรานส์ซีติน (tZ) (0.1 uM, 79.5 ± 2.91 เปอร์เซ็นต์ ; 1 uM, 81.3 ± 2.77 เปอร์เซ็นต์ ) และ cis-zeatin (CZ) (0.1 uM, 82.1 ± 3.29 เปอร์เซ็นต์ ; 1 uM, {{20}}.2 ± 2.89 เปอร์เซ็นต์ ) และ kinetin (K) (1 uM, 88.0 ± 3.76 เปอร์เซ็นต์ ; 10 uM, 79.9 ± 3.44 เปอร์เซ็นต์ ). เพื่อยืนยันกิจกรรมที่มีแนวโน้มดี การทดสอบแบบมุมฉากถูกนำมาใช้เพื่ออธิบายรายละเอียดเพิ่มเติมเกี่ยวกับผลกระทบทางชีวภาพของ CKs ในแบบจำลองนี้: การทดสอบการปลดปล่อยแลคเตทดีไฮโดรจีเนส (LDH) [68] ซึ่งแสดงให้เห็นอย่างมาก (4-เท่า) เพิ่มความเป็นพิษหลังการรักษาด้วย Glu ที่น่าสนใจ การกำหนดการปล่อย LDH ทำให้เราสามารถแยกความแตกต่างระหว่างกิจกรรมของ CK และการควบคุมเชิงบวก (NEC-1 และ DFO) CKs มีฤทธิ์ป้องกันในระดับปานกลางแต่มีนัยสำคัญ (tZ ลดอัตราการเสียชีวิตลงเหลือ 91.9 ± 1.40 เปอร์เซ็นต์ที่ 0.1 uM; cZ ลดลงเหลือ 92.3 ± 1.15 เปอร์เซ็นต์ที่ 0.1 uM และ 91.7 เปอร์เซ็นต์ ± 1.56 เปอร์เซ็นต์ที่ 1 uM; K ลดเหลือ 92.2 ± 1.06 เปอร์เซ็นต์ที่ 1 uM) กลุ่มควบคุมเชิงบวก NEC-1 และ DFO มีผลการป้องกันที่แข็งแกร่งกว่าแต่มีประสิทธิผลที่ความเข้มข้นที่สูงขึ้นมาก (ลดอัตราเป็น 76.9 ± 2.94 เปอร์เซ็นต์และ 81.6 ± 3.74 เปอร์เซ็นต์ที่ 50 และ 10 uM ตามลำดับ) (รูปที่ 5B) การสอบวิเคราะห์ LDH ตรวจสอบการบ่งชี้ที่ได้รับจากการย้อมสี PI และผลที่สังเกตได้ของการควบคุมเชิงบวกนั้นสอดคล้องกับข้อมูลที่เผยแพร่ [69,70] ผลการวิจัยเกี่ยวกับผลกระทบของ K ในแบบจำลองการตายของเซลล์ที่เกิดจาก Glu ในเซลล์ HT22 [18] และการสังเกตผลของ CK ที่เป็นตัวแทน เช่น tZ, cZ และ K แสดงให้เห็นว่า CKs เป็นตัวเลือกที่มีแนวโน้มว่าจะรักษาโรคทางระบบประสาทที่เกี่ยวข้องกับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน [ 71]. สุดท้าย tZ และ cZ เป็นที่ต้องการเนื่องจากพวกมันมีประสิทธิผลที่ความเข้มข้นต่ำกว่า และเลือกร่วมกับ K สำหรับการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับผลกระทบของพวกมันต่อระดับของความเครียดออกซิเดชันและแคสเปส-3,7 การกระตุ้น

cistancheความคิดเห็นเกี่ยวกับผลกระทบของการป้องกันระบบประสาท

2.8. ผลของ Cytokinins ต่อความเครียดที่เกิดจากออกซิเดชันที่เกิดจาก Glu ในเซลล์ SH-SY5Y

Glu สามารถเหนี่ยวนำให้เกิดความเครียดออกซิเดชันในเซลล์ SH-SY5Y ต่างจากรุ่นก่อนๆ ได้โดยใช้วิถีทางที่แตกต่างกัน หนึ่งอยู่บนพื้นฐานของการอุดตันของสารต้านซีสทีน/กลูตาเมต (Xc-) ซึ่งนำไปสู่การพร่องของกลูตาไธโอน (GSH) และผลกระทบด้านลบต่อกิจกรรมของซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส (SOD) [62] การตายของเซลล์ที่มี Glu-mediated ยังเกี่ยวข้องกับการก่อรูป ROS ที่ขับเคลื่อนด้วย Rac-NADPH-oxidase (โดยเฉพาะอย่างยิ่ง superoxide radical) ในเซลล์ SH-SY5Y [72] การค้นพบนี้บ่งชี้ว่าสาเหตุหลักของการตายของเซลล์ในแบบจำลองที่เกิดจาก Glu คือ OS ภายในโมเดลเซลล์ประสาทเซลล์ที่คล้ายคลึงกันถูกบำบัดร่วมกับ Glu และสารประกอบที่ทดสอบแล้ว ย้อมด้วย DHE และสังเกตพบโดยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง ดังสามารถเห็นได้ในรูปที่ 6A การเรืองแสง DHE สีแดงเพิ่มขึ้นอย่างมากถูกสังเกตพบในเซลล์ที่บำบัดด้วย Glu ซึ่งได้รับการแก้ไขโดยสารควบคุมเชิงบวกและ CKs ที่ทดสอบ จากการสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์ การหาปริมาณของระดับซูเปอร์ออกไซด์ได้ดำเนินการในเซลล์ที่เหนี่ยวนำโดย Glu ในลักษณะที่คล้ายคลึงกัน โดยการทดสอบ DHE กับเซลล์ที่อยู่ในเซลล์ที่เกิดจาก SAL ผลลัพธ์ถูกทำให้เป็นมาตรฐานตามระดับที่เกิดจาก Glu เพียงอย่างเดียว (กำหนดเป็น 100 เปอร์เซ็นต์) ซึ่งทำให้ระดับซูเปอร์ออกไซด์เพิ่มขึ้นอย่างมากเกือบ 3- เท่าภายในเวลาเพียง 4 ชั่วโมงในเซลล์ประสาทเซลล์ SH-SY5Y ที่คล้ายคลึงกันกับระดับในเซลล์ควบคุมที่มีสุขภาพดี (CTR: 33.79 ± 1.45 เปอร์เซ็นต์) ดังแสดงในรูปที่ 6B CK เช่น tZ, cZ และ K ลดระดับซูเปอร์ออกไซด์ในเซลล์ที่ทำให้มึนเมา Glu อย่างมีนัยสำคัญ: 0.1 uM tZ, 0.1 uM cZ, 1 uM และ 10 uM K ลดลงเหลือ 81.0 ± 4.03, 80.6 ± 3.89, 81.8 ± 3.39 และ 83.8 ± 2.32 เปอร์เซ็นต์ของระดับในเซลล์ที่บำบัดด้วย Glu เพียงอย่างเดียว ระดับเหล่านี้เทียบได้กับระดับที่ได้รับจาก NEC-1 ตัวยับยั้งการตายของเนื้อร้าย (80.5 ± 3.19 เปอร์เซ็นต์ที่ 5 uM และ 80.4 ± 2.70 เปอร์เซ็นต์ที่ 50 uM) และ DFO ของธาตุเหล็ก (80.2 ± 3.80 เปอร์เซ็นต์ที่ 10 uM) ผลลัพธ์ที่ได้จากแบบจำลองการตายของเซลล์ที่เกิดจาก Glu โดยเฉพาะอย่างยิ่งผลของกลุ่มควบคุมเชิงบวก สอดคล้องกับรายงานก่อนหน้า [70,73] หลักฐานก่อนหน้านี้ว่า CK มีผลในการลด OS ในแบบจำลองที่เกิดจาก Glu หรือแบบจำลองที่คล้ายคลึงกันนั้นจำกัดเพียงการสาธิตว่า K เป็นสารลด OS ที่มีศักยภาพ (ที่ประมาณ 23 uM) ในแบบจำลองการตายของเซลล์ Glu ที่เกิดจากเซลล์ HT22 [18 ]. เราพบว่า K มีผลลด OS ที่ความเข้มข้นต่ำกว่า (1–10 uM) ในเซลล์ SH- SY5Y ของเรา นอกจากนี้ ยังมีการสังเกตผลกระทบระยะยาวที่เป็นประโยชน์ของ tZ ต่อไฟโบรบลาสต์ของมนุษย์ รวมถึงกิจกรรมการสลายตัวของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ [15] ซึ่งบ่งชี้ว่า tZ และ cZ อาจมีผลทางอ้อมในการลด OS ในแบบจำลองการตายของเซลล์ที่เกิดจาก Glu นอกจากนี้ รายงานอื่น ๆ ชี้ให้เห็นถึงความเชื่อมโยงระหว่างผลการลดระบบปฏิบัติการที่ใช้ CKs กับกิจกรรมการป้องกัน [22,74–76] เมื่อนำมารวมกัน tZ, cZ และ K แสดงผลการลด OS ที่แข็งแกร่งอย่างน่าประหลาดใจ เทียบได้กับการควบคุมเชิงบวก แม้ว่าจะมีจุดแข็งในภาพรวมต่างกันสารป้องกันประสาทผล.

รูปที่ 5 (A) อัตราการเสียชีวิตของเซลล์ประสาทคล้ายเซลล์ SH-SY5Y ในแบบจำลองการตายของเซลล์ที่เหนี่ยวนำโดยกลูตาเมต (Glu) (B) ความเป็นพิษที่เกิดจาก Glu (การปลดปล่อย LDH) ของเซลล์ประสาทคล้ายเซลล์ SH-SY5Y เพิ่มสามเท่าในอย่างน้อยสามวันอิสระ* P เทียบกับรถที่มี 160 uM Glu, # P เทียบกับรถที่ไม่มี 160 uM Glu

รูปที่ 6 (A) ความเครียดออกซิเดชันที่เหนี่ยวนำโดย Glu (OS) และกิจกรรมการลด OS ของสารประกอบที่ระบุในมนุษย์เซลล์ประสาทเซลล์ SH-SY5Y ที่คล้ายคลึงกันถูกมองเห็นโดยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงตามการติดฉลากไดไฮโดรเอธิเดียม (DHE) บาร์=50 อืม แสดงรูปภาพเซลล์ประสาทคล้ายเซลล์ SH-SY5Y ที่บำบัดโดย DMSO (กลุ่มควบคุม), 160 mM กลูตาเมต (Glu) เพียงอย่างเดียว และร่วมกับ: 10 uM deferoxamine ( บวก DFO), 50 uM necrostatin{{6} } ( บวก NEC-1), 0.1 uM tZ ( บวก tZ) และ 0.1uM cZ ( บวก cZ) เป็นเวลา 4 ชั่วโมง แล้วย้อมด้วย DHE (B) การก่อรูปเรดิคัลซูเปอร์ออกไซด์ที่เหนี่ยวนำโดย Glu ในเซลล์ประสาท-เหมือนเซลล์ SH-SY5Y หลังจาก 4 ชั่วโมง กราฟแสดงการหาปริมาณของเซลล์ที่ย้อมสี DHE โดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท Infinite M200 Pro (เทคาน ประเทศออสเตรีย) เพิ่มขึ้นสามเท่าในห้าวันอิสระ

* P เทียบกับรถที่มี 160 uM Glu, # P เทียบกับรถที่ไม่มี 160 uM Glu

2.9. ผลของไซโตไคนินต่อกิจกรรมของแคสเปส-3/7 ในแบบจำลองการตายของเซลล์ที่เกิดจากกลู

Glu มีพิษคล้ายคลึงกันในเซลล์ SH-SY5Y กับผลกระทบที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ในเซลล์ HT22 ที่เกี่ยวข้องกับการอุดตันของ Xc-antiporter ดังนั้น กลไกการตายของเซลล์ที่ไม่เป็นอะพอพโทซิส (ferroptosis, necroptosis ฯลฯ) มีส่วนเกี่ยวข้องในทั้งสองกรณี [62] แม้ว่าการแสดงออกของแคสเปส-3 และในระดับหนึ่ง ยูนิตย่อย NMDA ของ NR1 อาจเกิดขึ้นรุนแรงกว่าใน SH เซลล์ -SY5Y [61] ดังนั้น ระยะสุดท้ายของการตายของเซลล์ในสองสายเซลล์อาจแตกต่างกัน บทบาทที่สนับสนุนของกิจกรรม caspase-3 ได้รับการสังเกตในการศึกษาจำนวนมากในแบบจำลองการตายของเซลล์ SH-SY5Y ที่เกิดจากกลูโคส [62,77–79] ในการทดสอบนี้เซลล์ประสาทเซลล์ที่คล้าย SH-SY5Y ถูกบำบัดที่นี่ด้วย 160 มิลลิโมลาร์ Glu ซึ่งนำไปสู่การเพิ่มขึ้นของกิจกรรมของแคสเปส-3/7 ในความพยายามที่จะอธิบายบทบาทของอะพอพโทซิสในการตายของเซลล์ SH-SY5Y ที่เกิดจาก Glu ได้ใช้ตัวยับยั้ง caspase-3/7 เฉพาะ Ac-DEVD-CHO และพบว่ามีผลในการยับยั้งที่รุนแรง: ที่ 50 นาโนเมตร มันลด caspase-3,7 กิจกรรมเป็น 23.70 ± 1.01 เปอร์เซ็นต์ของระดับในเซลล์ที่รับการรักษา

ด้วย Glu เพียงอย่างเดียวและที่ 0.5 uM มันเกือบจะปิดกั้นกิจกรรมทั้งหมด (ลดให้อยู่ในระดับปกติเพียง 7.22 ± 1.05 เปอร์เซ็นต์ เทียบได้กับระดับที่สังเกตได้ในเซลล์ที่มีสุขภาพดี:

7.8 ± 0.39 เปอร์เซ็นต์ ) ดังแสดงในรูปที่ 7 การใช้กลุ่มควบคุมเชิงบวกส่งผลให้กิจกรรม caspase-3,7 ลดลงตามขนาดยา ที่น่าสนใจคือ NEC-1 มีผลเพียงเล็กน้อยโดยมีผลสูงสุดที่ 50 uM และ DFO มีกิจกรรมการยับยั้งที่แข็งแกร่งกว่าที่ 10 uM (ลดกิจกรรมเป็น 80.5 ± 1.85 และ 75.8 ± 3 .00 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ) ในทางกลับกัน เพียงเล็กน้อย แต่มีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อ casp-3,7 ทำได้โดย tZ ที่ 1 uM (89.5 ± 2.50 เปอร์เซ็นต์ ), cZ ที่ 0.1 uM (87.4 ± 1.62 เปอร์เซ็นต์ ) และ K ที่ 1 uM ( 91.0 ± 2.06 เปอร์เซ็นต์ ). เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์แสดงว่ากลุ่มควบคุมเชิงบวกทั้งสองมีกิจกรรมที่ลดลงของ caspase-3/7 ที่สูงกว่ากลุ่มควบคุม CK ที่ทดสอบ แต่ CKs มีผลที่ความเข้มข้นต่ำกว่ามาก โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์ระบุว่าการปรับกิจกรรมของ caspase-3/7 มีบทบาทสำคัญในการเพิ่มประสิทธิภาพสารป้องกันประสาทกิจกรรมของสารเช่น DFO [58] ในแบบจำลองการตายของเซลล์ที่เกิดจาก Glu [79,80] อย่างไรก็ตาม ตามที่แสดงในส่วนนี้ NEC-1 ก็มีสารป้องกันประสาทซึ่งบ่งชี้ว่าการตายของเซลล์ประเภทอื่นอาจเกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ SH-SY5Y ที่มีลักษณะคล้ายเซลล์ประสาทด้วย Glu [63,67,81] การบ่งชี้ว่ากลไกที่ไม่ขึ้นกับแคสเปสมีส่วนเกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ที่เกิดจาก Glu ในการวิเคราะห์ผลของ NEC-1 [70], DFO [69] และ K [18] ในเซลล์ HT22

รูปที่ 7 กิจกรรมของแคสเปส-3/7 ในแบบจำลอง Glu ของความเสียหายจากออกซิเดชันของเซลล์ประสาทคล้ายเซลล์ SH-SY5Y เพิ่มขึ้นสามเท่าในอย่างน้อยสี่วันอิสระ * P เทียบกับรถที่มี 160 uM Glu, # P เทียบกับรถที่ไม่มี 160 uM Glu

3. บทสรุป

โดยสรุป การศึกษาของเราพบว่า CKs และสารเมตาโบไลต์ของพวกมันมีสารป้องกันประสาทกิจกรรมในรูปแบบที่เหนี่ยวนำโดย SAL ของโรคพาร์กินสันและความเสียหายที่เกิดจากออกซิเดชันที่เกิดจาก Glu ใน SH-SY5Y . ที่มีความแตกต่างของมนุษย์เซลล์ประสาทเซลล์. พบว่า K3G, cZR และ iPR มีความสำคัญทางชีวภาพสารป้องกันประสาทกิจกรรม. นอกจากนี้ CKs ที่ออกฤทธิ์มีประสิทธิภาพที่ความเข้มข้นต่ำกว่าไมโครโมลาร์และไมโครโมลาร์ต่ำกว่าสารควบคุมเชิงบวก NAC K3G, cZR และ iPR ยังมีผลในเชิงบวกต่อการดำรงชีวิต ความเป็นพิษต่อเซลล์ ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน และการทำงานของแคสเปส-3,7 (ยกเว้น iPR) การสาธิตแบบมุมฉากบ่งชี้อย่างชัดเจนว่าฤทธิ์ต้านความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันมีบทบาทสำคัญในการป้องกัน CKs ในแบบจำลองการตายของเซลล์ที่เกิดจาก SAL มีเพียงสามเมตาโบไลต์ในแผงทดสอบของ CKs (tZ, cZ และ K) ที่ได้รับการป้องกันเซลล์ประสาทเซลล์ SH-SY5Y ที่คล้ายคลึงกันในแบบจำลองที่เกิดจาก Glu ของความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในลักษณะเดียวกันกับตัวคีเลเตอร์เหล็ก NEC1 และ DFO ที่ยับยั้งการตายของเนื้อร้าย เพื่อยืนยันกิจกรรมที่มีแนวโน้มดี เราได้ทดสอบผลกระทบของพวกมันในการทดสอบการปลดปล่อยแลคเตทดีไฮโดรจีเนสแบบมุมฉาก (LDH) CKs มีฤทธิ์ป้องกันในระดับปานกลางแต่มีนัยสำคัญ ซึ่งอ่อนแอกว่ากิจกรรมที่สอดคล้องกันของสารควบคุม แต่ถึงแม้จะมีความแตกต่างในการมอดูเลตของเซลล์ประสาทสุขภาพ CKs ที่ทดสอบทั้งสามตัวได้กระตุ้นการลดลงที่มีศักยภาพในการเกิดอนุมูลของซูเปอร์ออกไซด์ คล้ายกับสารควบคุมเชิงบวก CKs ยังมีผลที่เปรียบเทียบได้กับความเครียดออกซิเดชันที่เกิดจาก Glu ในเซลล์ SH-SY5Y กับของ NEC1 และ DFO แต่สารประกอบเหล่านี้มีผลในการยับยั้งที่แรงกว่าต่อกิจกรรมของแคสเปส-3/7 มากกว่า CK เนื่องจากการตายของเซลล์ที่เกิดจาก Glu ไม่ได้อาศัยวิถีที่ขึ้นกับ caspase ดังที่แสดงในการศึกษาผลกระทบของ DFO และ NEC-1 ต่อเซลล์ HT-22 [70] CKs สามารถปรับเปลี่ยนทั้ง caspase- การตายของเซลล์ขึ้นอยู่กับและเป็นอิสระโดยการลดความเครียดออกซิเดชัน [18,82] ในการศึกษาต่อเนื่อง กลไกโดยละเอียดของการกระทำของ CKs และ/หรือผลกระทบของไมโตคอนเดรียต่อเซลล์ประสาทหรือเซลล์แอสโทรไซต์จะถูกตรวจสอบ

cistancheประสบการณ์สำหรับPDและหน่วยความจำ

4. วัสดุและวิธีการ

4.1. เคมีภัณฑ์และรีเอเจนต์

ไซโตไคนินได้มาตรฐานจาก OlChemIm (Olomouc, สาธารณรัฐเช็ก) Calcein AM (สารละลาย 1 มก./มล.) และชุดปล่อย LDH และชุดผลพลอยได้ของนิวไรท์ที่ซื้อมาจาก ThermoFisher โพรพิเดียม ไอโอไดด์, ไดไฮโดรเอทิเดียม, ส่วนประกอบของแคสเปส- 3/7 สารบัฟเฟอร์สำหรับการทดสอบ, DMEM/F12 1:1 สื่อ, เซรั่มวัวในครรภ์, ทริปซิน, ATRA, ซัลลิโนล ไฮโดรโบรไมด์, เกลือโมโนโซเดียมกลูตาเมต, ดีเฟอรอกซามีน, N-อะเซทิลซิสเทอีน ซื้อ Ac-DEVD-CHO และ DMSO สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์จาก Sigma Aldrich (เมอร์ค) วัสดุพิมพ์ Ac-DEVD-AMC จัดทำโดย Enzo Life Science

4.2. ORAC Radical Scavenging Activity Assays

ความสามารถของสารประกอบในการขับอนุมูลอิสระในหลอดทดลองถูกกำหนดโดยการสอบวิเคราะห์ Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) Briefly, fluorescein (100 uL, 500 mM) และ 25 uL ของสารละลายสารประกอบที่ทดสอบถูกเติมไปยัง 96-หลุมไมโครเพลทล่วงหน้าที่ 37oC ถัดไป 25 uL 250 mM 2,2<-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride (aaph)="" was="" quickly="" added,="" the="" microplate="" was="" shaken="" for="" 5="" s="" and="" red="" fluorescence="" (with="" 485="" and="" 510="" nm="" excitation="" and="" emission="" wavelengths,="" respectively)="" was="" measured="" every="" 3="" min="" over="" 90="" min="" using="" an="" infinite="" 200="" microplate="" reader="" (tecan,="" männedorf,="" switzerland).="" nauc="" (net="" area="" under="" curve)="" values="" were="" used="" to="" express="" antioxidant="" activities="" relative="" to="" that="" of="" trolox="" (a="" synthetic="" hydrophilic="" analog="" of="" α-tocopherol,="" vitamin="" e).="" substances="" with="" orac="" values="" greater="" than="" zero="" are="" deemed="" to="" actively="" trap="" free="">

4.3. การเพาะเลี้ยงเซลล์ SH-SY5Y

สายเซลล์นิวโรบลาสโตมาของมนุษย์ SH-SY5Y ที่ซื้อจาก ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) ถูกปลูกในสารผสมสารอาหาร F12 ของ Eagle ดัดแปลงของ Dulbecco และ Ham (DMEM: F-12, 1:1 ) เสริมด้วยซีรัมของตัวอ่อนในครรภ์ (FBS) 10 เปอร์เซ็นต์ และเพนิซิลลินและสเตรปโตมัยซิน 1 เปอร์เซ็นต์ ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในบรรยากาศ CO2 ที่มีความชื้น 5 เปอร์เซ็นต์ เซลล์ถูกส่งผ่านมากถึง 20 ครั้งและสื่อถูกเปลี่ยนสองครั้งหรือสามครั้งต่อสัปดาห์ ความหนาแน่นของเซลล์ถูกกำหนดตามความเหมาะสมสำหรับการสอบวิเคราะห์ที่วางแผนไว้ (5000, 7000, 10,000 หรือ 20,000 เซลล์ต่อหลุม) ใน 96-เพลตหลายหลุมในปริมาตรรวม 100 uL ของตัวกลางสำหรับแต่ละตัว การทดลอง. วันหลังการเพาะ ATRA ในอาหาร 1 เปอร์เซ็นต์ FBS DMEM/F12 ถูกเติมลงในเซลล์จนถึงความเข้มข้นสุดท้ายที่ 10 uM และการฟักตัวต่อไปอีก 48 ชั่วโมงเพื่อกระตุ้นการสร้างความแตกต่าง ทำให้เกิดนิวริต์ที่ยาวขึ้น และลดลง การขยายพันธุ์

4.4. กล้องจุลทรรศน์

ไมโครกราฟของเซลล์ประสาท- ได้เซลล์ SH-SY5Y ที่คล้ายคลึงกันโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง DM IL LED (Leica Microsystems, Mannheim, Germany) ที่มีตัวกรองการกระตุ้นที่เหมาะสมสำหรับการทดสอบ หรือการตั้งค่าความสว่างด้วยกล้องดิจิตอล DP73 ประสิทธิภาพสูง (Olympus, Tokyo, Japan ). เนื่องจากอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนสำหรับการย้อมสีอยู่ในระดับปานกลาง คอนทราสต์จึงถูกปรับเล็กน้อยในซอฟต์แวร์ ImageJ (ฟิจิ) โดยไม่ส่งผลต่อการสังเกตที่ได้ ภาพต้นฉบับจะรวมอยู่ในวัสดุเสริม

4.5. การย้อมสีเมมเบรนของเซลล์ (Neurite Outgrowth kit, Invitrogen™)

เซลล์ประสาทเซลล์ SH-SY5Y ที่คล้ายคลึงกัน (5,000 เซลล์ต่อหลุม) ที่ได้จากกระบวนการสร้างความแตกต่างใน 48 ชั่วโมงถูกย้อมด้วยชุดผลพลอยได้ของนิวไรท์ (Invitrogen™) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตโดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย เซลล์ถูกล้างด้วย PBS ที่ติดฉลากด้วยสารละลายของสีย้อมเมมเบรนที่ให้มากับชุดอุปกรณ์ (ตามโปรโตคอลสำหรับเพลต 96 หลุม) ใน PBS เป็นเวลา 20 นาทีที่ 37 oC ล้างอีกครั้งด้วย PBS และมองดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง ( ด้วยความยาวคลื่นกระตุ้นและปล่อย 533 และ 585 นาโนเมตร ตามลำดับ)

4.6. การรักษาเซลล์

หลังจากขั้นตอนการดิฟเฟอเรนติเอชัน ตัวกลางสร้างความแตกต่างถูกเปลี่ยนเป็นตัวกลาง DMEM/F12 1 เปอร์เซ็นต์ที่เสริมด้วยสารประกอบทดสอบที่ความเข้มข้น 0.1, 1, และ 10 uM (ด้วย 7000 เซลล์ต่อหลุมสำหรับการทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์) หรือร่วมกับสารพิษ SAL ที่ 500 uM (ด้วย 7000–10,000 เซลล์ต่อหลุม) หรือ 160 mM Glu (มี 20,000 เซลล์ต่อหลุม) สำหรับระยะเวลาที่เหมาะสมสำหรับประเภทการทดสอบ (ความมีชีวิต การตายของเซลล์ เป็นต้น) เซลล์ควบคุมถูกบำบัดด้วยตัวกลางที่มี .0.1 เปอร์เซ็นต์ของ DMSO

4.7. ความมีชีวิตของเซลล์และการตายของเซลล์

ความมีชีวิตของเซลล์ประสาท-เหมือนเซลล์ SH-SY5Y ที่กำลังเติบโตใน96-ไมโครเพลทแบบหลุม (ด้วย ca. 7000 เซลล์ต่อหลุม) หลังการรักษา 24 ชั่วโมงถูกประเมินโดยการทดสอบ Calcein AM ด้วยการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย [31] สารละลาย Calcein AM ใน PBS ที่ใช้มีความเข้มข้น 0.75 uM และตั้งเวลาฟักตัวเป็น 50 นาที จำนวนเซลล์ที่มีชีวิตในแต่ละหลุมถูกกำหนดโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท Infinite M200 Pro (เทคาน ประเทศออสเตรีย) ที่มีความยาวคลื่นกระตุ้นและปล่อยรังสี 495 และ 517 นาโนเมตร ตามลำดับ

การตายของเซลล์ของเซลล์ประสาทเซลล์ที่คล้ายคลึงกัน (แบบจำลอง SAL: 10,000 เซลล์ต่อหลุม แบบจำลอง Glu: 20,000 เซลล์ต่อหลุม) ถูกกำหนดหาโดยการสอบวิเคราะห์ PI ตามที่รายงานโดยสโตน และคณะ พ.ศ. 2546 โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย [83] Briefly ตัวกลางของแบบจำลองที่เหนี่ยวนำด้วย SAL ถูกสำลักและเปลี่ยนเป็นสารละลาย 1 ug/mL ของ PI ใน PBS แต่เซลล์ที่อยู่ภายใต้การเหนี่ยวนำ Glu มีการยึดเกาะที่อ่อนแอกว่า ดังนั้นสารละลาย 1 มก./มล. ของ PI ใน PBS ถูกเติมลงใน ให้ความเข้มข้นสุดท้าย 1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ในทั้งสองกรณี เซลล์ถูกบ่มต่อไปอีก 15-25 นาทีที่อุณหภูมิห้อง จากนั้น PI fluorescence จะถูกวัดโดยเครื่องอ่าน Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, ออสเตรีย) ด้วยความยาวคลื่นกระตุ้นและปล่อยรังสี 535 และ 617 ตามลำดับ การเรืองแสงของ PI ที่เป็นผลลัพธ์ที่ได้มาจากสารพิษเพียงอย่างเดียวถูกตั้งค่าเป็นการตายของเซลล์ 100 เปอร์เซ็นต์

4.8. การวัดความเครียดออกซิเดชันโดยการทดสอบไดไฮโดรเอธิเดียม (DHE)

เซลล์ถูกสร้างความแตกต่างและบำบัดตามที่อธิบายไว้ในส่วนก่อนหน้าสำหรับการเหนี่ยวนำ SAL (10,000 เซลล์ต่อหลุม 24 ชั่วโมงหรือการเหนี่ยวนำ Glu (20,{6}} เซลล์ต่อหลุม 4 ชั่วโมง) หลังจาก ทรีทเมนต์ เซลล์ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 500 xg เป็นเวลา 330 วินาที จากนั้นอาหารเลี้ยงเชื้อถูกแทนที่ (ตามความทะเยอทะยาน) ด้วยสารละลาย 10 uM DHE ใน PBS 96-เพลตหลายหลุมที่มีเซลล์ถูกบ่มในที่มืดเป็นเวลา 30 นาทีที่ห้อง อุณหภูมิ จากนั้นการเรืองแสงของ DHE ถูกวัดโดยเครื่องอ่านไมโครเพลท Infinite M200 Pro ( Tecan, Grödig, ออสเตรีย) ที่มีความยาวคลื่นกระตุ้นและปล่อยรังสี 500 และ 580 นาโนเมตร ตามลำดับ ผลการเรืองแสงของ DHE ที่ได้จาก SAL หรือ Glu เพียงอย่างเดียวถูกตั้งค่าเป็นซูเปอร์ออกไซด์ 100 เปอร์เซ็นต์ การก่อตัว ได้รับไมโครโฟโตกราฟี fluorescence ที่เป็นภาพประกอบของเซลล์ที่ย้อมด้วย DHE หลังจากการวัด DHE ด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลท

พืช Cistanche มีผลป้องกันระบบประสาทที่ดีมาก

4.9. การวัดแคสเปส-3/7 กิจกรรม

การทดสอบแคสเปสแบบขั้นตอนเดียว-3/7 ถูกดำเนินการตามขั้นตอนที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้ [84] สำหรับการเพาะเลี้ยงภายใต้การเหนี่ยวนำ SAL และการเหนี่ยวนำ Glu ของผสมของปฏิกิริยา (แคสเปส-3,7 บัฟเฟอร์และส่วนประกอบที่มีเซลล์ในเพลตหลายหลุม 96-เพลต) ถูกบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงและ 3 ชั่วโมงที่ 37 oC ตามลำดับ กิจกรรมของแคสเปส-3/7 ถูกวัดโดยเครื่องอ่านไมโครเพลท Infinite M200 Pro (เทคาน ประเทศออสเตรีย) ด้วยความยาวคลื่นของการกระตุ้นและการปล่อยคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้า 346 และ 438 นาโนเมตร ตามลำดับ

4.10. การวิเคราะห์ทางสถิติ

การทดลองดำเนินการเป็นสามเท่าและทำซ้ำในสามถึงห้า (n {0}}–5 วันอิสระ ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SEM ค่าสำหรับตัวแปรที่วัดได้ทั้งหมดจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM ซึ่งคำนวณโดยใช้ Prism 8.4.3 (ซอฟต์แวร์ GraphPad, La Jolla, CA, USA) ซึ่งใช้ในการสร้างตัวเลขเช่นกัน การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยแพ็คเกจซอฟต์แวร์ PAST (เวอร์ชั่น 1.97) [85] สำหรับการทดสอบความแตกต่าง จะใช้การทดสอบ Student t การทดลองที่เหลือได้รับการประเมินโดยการทดสอบ Kruskal–Wallis แบบไม่อิงพารามิเตอร์ด้วยการทดสอบ Mann–Whitney post hoc พร้อมการแก้ไข Bonferroni ตามลำดับ ค่า p < 0.05="">

วัสดุเสริม: รูปภาพต้นฉบับสามารถดูได้ทางออนไลน์

ผลงานของผู้เขียน: ผลงานของผู้เขียนมีดังนี้: การสืบสวน, วิธีการ, การตรวจสอบ, การวิเคราะห์ข้อมูล, GG, CWD และ JG; การเขียน—การเตรียมร่างต้นฉบับ GG, CWD และ MS; การจัดการข้อมูล การจัดหาเงินทุน การกำกับดูแล การเขียน—การทบทวนและการแก้ไข CWD, MS และ PK ผู้เขียนทุกคนได้อ่านและตกลงที่จะตีพิมพ์ต้นฉบับในเวอร์ชันที่ตีพิมพ์

เงินทุน: งานนี้ได้รับการสนับสนุนทางการเงินบางส่วนโดยทุนจาก Internal Grant Agency of Palacky University ใน Olomouc สาธารณรัฐเช็ก (IGA{{0}}PrF_2020_021), หน่วยงานให้เงินช่วยเหลือของสาธารณรัฐเช็ก ({{ 2}}S) และ European Regional Development Fund—Project ENOCH (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/ 16_019/ 0000868) และทุนนักศึกษาจากกองทุนบริจาคของมหาวิทยาลัยปาลัคกี้

คำชี้แจงของคณะกรรมการพิจารณาสถาบัน: ไม่เกี่ยวข้อง

คำชี้แจงความยินยอมที่ได้รับแจ้ง: ไม่เกี่ยวข้อง

คำชี้แจงความพร้อมใช้งานของข้อมูล: ข้อมูลมีอยู่ภายในบทความหรือเอกสารประกอบ

กิตติกรรมประกาศ: ผู้เขียนขอขอบคุณ Dita Jordovd, Jana Hrubešovd และ Lucie Koplikovd สำหรับความช่วยเหลือด้านเทคนิคที่ยอดเยี่ยม นอกจากนี้ ผู้เขียนขอขอบคุณ Sees-editing Ltd. สหราชอาณาจักรสำหรับการแก้ไขต้นฉบับภาษาอังกฤษ

ความขัดแย้งทางผลประโยชน์: ผู้เขียนประกาศว่าไม่มีผลประโยชน์ทับซ้อน

ความพร้อมของตัวอย่าง: ตัวอย่างของสารประกอบไม่สามารถหาได้จากผู้เขียน