ส่วนที่ 1: Verbascoside ปกป้องตับอ่อน -Cells Against ER-Stress

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

Alessandra Galli 1, plus , Paola Marciani 1, plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 และ Carla Perego 1*

เชิงนามธรรม:

หลักฐานทางระบาดวิทยาที่สำคัญระบุว่าอาหารที่อุดมด้วยโพลีฟีนอลช่วยป้องกันโรคเบาหวานประเภท 2 ที่กำลังพัฒนา ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์verbascoside/acteosideซึ่งเป็นสารประกอบพืชโพลีฟีนอลที่แพร่หลาย มีคุณสมบัติทางชีวภาพหลายอย่างรวมถึงสารต้านอนุมูลอิสระที่แรง ฤทธิ์ต้านการอักเสบ และการป้องกันระบบประสาท การวิจัยครั้งนี้มีจุดมุ่งหมายเพื่อทดสอบผลกระทบที่เป็นไปได้ของverbascosideในเซลล์ตับอ่อน เป้าหมายที่ไม่เคยมีการทดสอบมาก่อน หนูเมาส์และเซลล์มนุษย์ถูกบ่มด้วยverbascoside(0.8–16 uM) นานถึงห้าวันและการรวมกันของเทคนิคทางชีวเคมีและการถ่ายภาพถูกใช้เพื่อประเมิน -การอยู่รอดของเซลล์และการทำงานภายใต้สภาวะกระตุ้นความเครียดปกติหรือเอนโดพลาสมิกเรติเคิล (ER) เราพบผลการป้องกันที่ขึ้นกับขนาดยาของverbascosideต่อต้านความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในเซลล์โคลนและเซลล์ของมนุษย์ การศึกษาเชิงกลไกพบว่าโพลีฟีนอลปกป้องเซลล์จากความผิดปกติที่เกิดจากความเครียดของ ER ซึ่งปรับการกระตุ้นการทำงานของโปรตีนไคเนส RNA-like เอนโดพลาสมิกเรติคิวลัมไคเนส (PERK) สาขาของการตอบสนองของโปรตีนที่กางออกและส่งเสริมพลวัตของยล เป็นผลให้มีการตรวจพบการมีชีวิตที่เพิ่มขึ้น การทำงานของไมโตคอนเดรีย และปริมาณอินซูลินในเซลล์เหล่านี้ การศึกษาเหล่านี้ให้หลักฐานว่าverbascosideช่วยเพิ่มความสามารถของเซลล์ - ในการรับมือกับความเครียดจาก ER ซึ่งเป็นสาเหตุสำคัญของความผิดปกติของเซลล์และความล้มเหลวในภาวะเบาหวาน และสนับสนุนศักยภาพในการรักษาของ verbascoside ในผู้ป่วยเบาหวาน

คำสำคัญ:

verbascoside; โพลีฟีนอล; เซลล์ที่ผลิตอินซูลิน โรคเบาหวาน; UPR; ความเครียดออกซิเดชัน ER-ความเครียด; เงย; ต่อต้านการอักเสบ; ไมโตคอนเดรีย

1. บทนำ

โรคเบาหวานเป็นโรคเรื้อรังที่ส่งผลกระทบต่อคนหลายร้อยล้านคน [1] สาเหตุที่แตกต่างกันแสดงลักษณะของโรคเบาหวานประเภท 1 (T1D) และเบาหวานประเภท 2 (T2D) ที่มีอินซูลินไม่เพียงพอ [2] อินซูลินควบคุมความเข้มข้นของกลูโคสในพลาสมากระตุ้นการดูดซึมกลูโคสในเซลล์กล้ามเนื้อและไขมัน และปรับการเผาผลาญกลูโคสในตับ ความพร้อมของสารอาหาร ฮอร์โมน และระบบประสาทควบคุมการหลั่งอินซูลินในตับอ่อนและรักษาระดับน้ำตาลในเลือดให้อยู่ในช่วงทางสรีรวิทยา [3–5] ดังนั้น - ความผิดปกติของเซลล์นำไปสู่โรคเบาหวาน โดยภาวะน้ำตาลในเลือดสูงจากการอดอาหาร

T2D เป็นภาวะที่ก้าวหน้าซึ่งการดื้อต่ออินซูลินและการทำงานของเซลล์ผิดปกตินั้นเชื่อมโยงกัน และหลักฐานล่าสุดได้เพิ่มความสนใจในบทบาทหลักที่สำคัญของเซลล์ - ต่อสถานะน้ำตาลในเลือดสูง [6,7] ในคนอ้วนที่ไม่เป็นเบาหวาน -เซลล์จะชดเชยการดื้อต่ออินซูลินด้วยการหลั่งฮอร์โมนที่เพิ่มขึ้น อย่างไรก็ตาม ในบางวิชา เนื่องจากภาวะของพวกเขาแย่ลง อินซูลินในเลือดลดลงและระดับน้ำตาลกลูโคสเพิ่มขึ้นเป็นระดับน้ำตาลในเลือดสูง [8,9]

กลูโคสเป็นโมดูเลเตอร์ที่สำคัญที่สุดของฟังก์ชันเซลล์ การกระตุ้นกลูโคสส่งผลต่อการควบคุมยีนและการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับหน้าที่ต่างๆ ของเซลล์ เช่น ไกลโคไลซิส การสังเคราะห์อินซูลิน และการหลั่ง [10] การหลั่งอินซูลินที่เกิดจากกลูโคสอาศัยเมแทบอลิซึมของปฏิกิริยาออกซิเดชันเพื่อผลิตอะดีโนซีน ไตรฟอสเฟต (ATP) และผลิตออกซิเจนชนิดปฏิกิริยา (ROS) ในระดับต่ำ อย่างไรก็ตาม -เซลล์ไม่ได้มีเอ็นไซม์กินของเน่าเป็นอย่างดีและความอ่อนแอนี้ทำให้พวกเขาอ่อนแอต่อความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน [11,12] เมื่อความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันเพิ่มขึ้น - การผลิตอินซูลินในเซลล์ลดลง และ - เซลล์ผลิตไซโตไคน์ที่จุดไฟให้เซลล์ได้รับความเสียหายจากการถูกทำลายและการตายของเซลล์ [13] ที่น่าสนใจ แม้ว่าก่อนหน้านี้มวลเซลล์ที่ลดลงจะเป็นผลมาจากการตายของเซลล์ แต่การศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้ชี้ให้เห็นถึงบทบาทสำคัญของการแยกเซลล์ออกจากเซลล์ [14,15] เป็นที่ชัดเจนว่าหลายขั้นตอนขับเคลื่อนไปสู่ ​​T2D การดูถูกเมตาบอลิซึมและออกซิเดชันทำให้เกิดความเครียดเอนโดพลาสมิกเรติคิวลัม (ER) ซึ่งนำไปสู่การลดลงของการสังเคราะห์และการหลั่งอินซูลิน กระบวนการ inflamation ตามการปลดปล่อยของไซโตไคน์และ - การสูญเสียเซลล์อาจเกิดขึ้นจากการตายของเซลล์และการแยกส่วน ความรู้นี้เป็นพื้นฐานในการพัฒนากลยุทธ์การรักษาที่เหมาะสม เนื่องจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการทำลายล้างสามารถตอบโต้ได้ และความเป็นพลาสติกของเซลล์ตับอ่อนทำให้มีความเป็นไปได้ที่จะเปลี่ยนเซลล์ต้นกำเนิดกลับเป็นเซลล์ตามที่พิสูจน์แล้วในหนูทดลอง [16]

เมื่อเร็ว ๆ นี้ ความอ่อนแอของเซลล์ - ต่อความเครียดออกซิเดชันได้กระตุ้นให้มีการใช้สารต้านอนุมูลอิสระในอาหารเพื่อป้องกันโรคเบาหวาน [17] ในบรรดาอาหารต้านอนุมูลอิสระที่น่าสนใจที่สุด น้ำมันมะกอกเป็นที่รู้จักในด้านคุณสมบัติที่เป็นประโยชน์ตั้งแต่สมัยกรีกโบราณ น้ำมันมะกอกประกอบด้วยกรดไขมันไม่อิ่มตัวเชิงเดี่ยว (MUFA) ในปริมาณที่ดีและโพลีฟีนอลหลายชนิด เช่น ไทโรซอล ไฮดรอกซีไทโรซอล โอเลโรปีน และเวอร์บาสโคไซด์

Verbascosideยังเป็นที่รู้จักกันในนามแอกทิโอไซด์ เป็นฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ที่สกัดจากโอเลียยุโรป พืชในสายพันธุ์เวอร์บาสคัม และพืชตระกูลอื่นๆ อีก 23 ตระกูล [18–20] นอกจากนี้ยังสามารถหาได้จากผลพลอยได้ของน้ำมันมะกอก (อุดมไปด้วยน้ำเสียจากโรงงานมะกอกที่ได้มาจากกระบวนการแปรรูปผลมะกอก) หรือผลิตโดยวิศวกรรมการเผาผลาญและวิธีทางชีววิทยาสังเคราะห์ [21]

ยังไม่มีการรายงานข้อมูลเกี่ยวกับการดูดซึมของ verbascoside ในมนุษย์ การศึกษาในหนูทดลอง เซลล์ SKBR3 และ Caco-2 แนะนำว่าอาจเป็นไปได้สำหรับ verbascoside ที่ไม่ผ่านกระบวนการเผาผลาญเพื่อข้ามสิ่งกีดขวางในลำไส้ ไหลเวียนในพลาสมาในเลือด และออกฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ [20,22,23] verbascoside ต่างจากโพลีฟีนอลในพืชส่วนใหญ่ verbascoside ส่วนใหญ่ทำหน้าที่ในเซลล์ผ่านการปรับการถอดรหัสยีนของเอ็นไซม์และปัจจัยควบคุมต่างๆ ด้วยสารต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ต้านการแทรกซึม [24–30]

แม้ว่าจะทราบผลที่เป็นประโยชน์มากมายของ verbascoside ต่อสุขภาพของมนุษย์ แต่ไม่มีข้อมูลเกี่ยวกับผลกระทบของมันต่อเซลล์ตับอ่อน เนื่องจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการทำลายล้างเป็นพื้นฐานของการเกิดโรค T2D เราจึงตรวจสอบว่าการรักษาด้วย verbascoside อาจช่วยเพิ่มความมีชีวิตของเซลล์และ

ทำงานในสภาวะกระตุ้นความเครียด ER และเรากำหนดกลไกระดับโมเลกุลของการกระทำของมัน ข้อมูลของเราเปิดเผยว่า verbascoside ป้องกัน -cells ความเครียดออกซิเดชันและ inflammate ที่ปรับการกระตุ้นการตอบสนองของโปรตีนที่กางออกและส่งเสริมการเปลี่ยนแปลงของไมโตคอนเดรีย ซึ่งส่งผลให้เซลล์มีชีวิตและปริมาณอินซูลินเพิ่มขึ้น

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. การเพาะเลี้ยงเซลล์และวัสดุ

เซลล์ tc3 ของหนูเมาส์ (ที่กรุณาจัดเตรียมไว้ให้โดย Prof. Hanahan— Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco, CA [31]) ถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลาง RPMI 1640 (Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, อิตาลี) เสริมด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ (v/v) เซรั่มน่องของทารกในครรภ์ที่หยุดการทำงานของความร้อน (EuroClone SpA, ECS0180L, Pero MI, อิตาลี), 1 เปอร์เซ็นต์ (v/v) เพนิซิลลิน-สเตรปโตมัยซิน (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI ประเทศอิตาลี) และ 1 เปอร์เซ็นต์ (v/v) L-glutamine (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Italy) เกาะ Langerhans ของมนุษย์ถูกแยกออกจากมิลาน (Niguarda Ca' Granda) จากผู้บริจาคซากศพหลายอวัยวะตามขั้นตอนที่อธิบายไว้โดย Ricordi et al (32); พวกมันถูกเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI ที่มีกลูโคส 5.5 มิลลิโมล/ลิตร, เซรั่มโควีนในครรภ์ที่หยุดการทำงานของความร้อน 10 เปอร์เซ็นต์, กลูตามีน 0.7 มิลลิโมลาร์, เพนิซิลลิน 50 หน่วย/มล. และสเตรปโตมัยซิน 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (EuroClone, SpA, Pero MI, อิตาลี) ใช้การเตรียมเกาะเล็กเกาะน้อยที่แตกต่างกันสี่เกาะ ความบริสุทธิ์ของเกาะเล็กเกาะน้อยคือ 80 ± 10 เปอร์เซ็นต์ การแยกเกาะและการศึกษาเกาะเล็กเกาะน้อยได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมของโรงพยาบาล Niguarda Ca' Granda ในมิลาน (11.12.2009) เซลล์ tc3 ได้รับการรักษาด้วย verbascoside 0.8, 1.6 และ 16 uM (Carbosynth, OV08034, Compton, UK), กรด cafeic และ hydroxytyrosol (ของขวัญจาก Prof. Dell'Agli, Department of Pharmacological and Biomolecular Sciences, Universita degli Studi di Milano, มิลาน ประเทศอิตาลี) ในสื่อ RPMI ที่สมบูรณ์เป็นเวลา 5 วัน ในขณะที่เกาะเล็กเกาะน้อยของมนุษย์ที่มี verbascoside 16 uM เซลล์ที่บำบัดด้วยเมทานอล/เอทานอลถูกใช้เป็นตัวควบคุม เพื่อกระตุ้นความเครียดออกซิเดชัน เซลล์ได้รับการรักษาด้วย H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, USA) 500 uM ในตัวกลาง RPMI ที่สมบูรณ์เป็นเวลา 20 นาทีก่อนการวิเคราะห์ ในขณะที่บำบัดด้วย tunicamycin 2 ug/mL (T7765, Sigma Aldrich ) เป็นเวลา 7 ชั่วโมงถูกดำเนินการเพื่อกระตุ้นความเครียด ER

2.2. การตรวจจับความมีชีวิตของเซลล์โดยการทดสอบ MTT

เซลล์ถูกชุบในเพลตหลายหลุม 96 เพลต และห้าวันหลังจากการบำบัดด้วยเวอร์บาสโคไซด์ พวกมันถูกบ่มด้วย 0.5 มก./มล. MTT (3-(4,5-ไดเมทิลไทอะซอล{{7} }yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, USA) เป็นเวลา 4 ชั่วโมงในบรรยากาศที่มีความชื้นซึ่งมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์ที่ 37 องศาเซลเซียส หลังจากการฟักไข่ เซลล์ถูกแขวนลอยใหม่อย่างนุ่มนวลใน 100 uL DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Italy) และตรวจพบการดูดกลืนแสงที่ 540 nm ด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลท (เกณฑ์มาตรฐาน, เครื่องอ่านไมโครเพลท, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, สหรัฐอเมริกา) [33]. การทดลองดำเนินการเป็นสามเท่าและข้อมูลถูกแสดงเป็นการเพิ่มขึ้นเท่าของตัวอย่างกลุ่มควบคุม

2.3. การตรวจจับการตายของเซลล์โดย Flow Cytometry

ห้าวันหลังจากฟักไข่ด้วยเวอร์บาสโคไซด์ 16 uM, -เซลล์ถูกแยกออกโดยการฟักไข่ 7 นาทีด้วยทริปซิน/EDTA, รวบรวมและหมุนเหวี่ยง เม็ดถูกแขวนไว้อย่างนุ่มนวลในเกลือโซเดียมบัฟเฟอร์ฟอสเฟตต่ำ เซลล์ถูกย้อมด้วยการนับ MuseTM และรีเอเจนต์การมีชีวิต (Millipore, MCH100102, Burlington MA, USA) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิตและวิเคราะห์ผ่าน flow cytometry การทดลองดำเนินการเป็นสามเท่าและข้อมูลถูกแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ที่ตายแล้วจากผลรวมทั้งหมด

2.4. ROS Generation

ROS ภายในเซลล์ได้รับการประเมินด้วย DCFDA (2/,7/-dichlorofuorescein diacetate) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, USA) ซึ่งเป็นโพรบที่ซึมผ่านได้ของเมมเบรนที่จะกลายเป็นฟลูออเรสเซนต์เมื่อผูกกับ ROS [34] เซลล์ tc3 ถูกโหลดล่วงหน้าด้วย 15 uM DCFDA ใน Krebs–Ringer bufer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7.4 และ 2 mM CaCl2)

เสริมด้วยน้ำตาลกลูโคส 11 mM เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 oC ตรวจพบเนื้อหา ROS เป็นเวลา 30 นาทีทั้งในสภาวะพื้นฐานและสภาวะความเครียดด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลท (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Switzerland) ค่าเฉลี่ยและส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานมาจากการทดลองอิสระสามการทดลอง

2.5. ซับตะวันตก

เซลล์ tc3 ถูกรวบรวมและละลายในบัฟเฟอร์ RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 7.6, 1 mM EDTA, 1 เปอร์เซ็นต์ TERGITOLw NP40, 0.5 เปอร์เซ็นต์ deoxycholate) ที่เติมด้วย aprotinin (Sigma Aldrich, A4529, St. Louis, MO, USA), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, USA) และสารยับยั้ง Roche (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, USA) เป็นเวลา 40 นาทีที่อุณหภูมิ 4 oC ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยการทดสอบ Bradford [35] โดยใช้ Bradford Reagent (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, USA) โปรตีน 30 ไมโครกรัมได้รับการแก้ไขโดย SDS-PAGE 10 เปอร์เซ็นต์ และถ่ายโอนไปยังเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลส (Millipore, Burlington แมสซาชูเซตส์สหรัฐอเมริกา) แอนติบอดีปฐมภูมิถูกนำไปใช้เป็นเวลา 2 ชั่วโมงในบัฟเฟอร์การปิดกั้นด้วยนมที่ไม่มีไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์หรือสารละลาย BSA 5 เปอร์เซ็นต์; แอนติบอดีหลักต่อไปนี้ถูกใช้: สารต่อต้านเมาส์- -แอคติน (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, USA), สารต้านอะโครลีนของเมาส์ (Abcam, ab48501,Cambridge, UK), สารต้าน BIP ของเมาส์ (ของขวัญจาก Prof. Borgese Nica, Institute of Neuroscience, CNR, Milan, Italy), rabbit anti-HNE ( -diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, USA), mouse anti-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, USA), rabbit anti-phospho-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), mouse anti-IKB (Cell Signaling Technology Inc. เซลล์ ., 4814, Danvers, MA, USA), rabbit anti-phospho-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), rabbit anti-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, USA), ยาต้านไวรัส SOD1 ของแกะ (Merck, KGaA, ดาร์มสตัดท์, เจอร์เมเนีย), แอนตี้ไวรัส PERK ของกระต่าย (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, USA), แอนตี้ไวรัส eIF2 ของกระต่าย (Cell Signaling Technology Inc., 5324, Danvers, MA, USA) และ Rabbit anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, USA) แอนติบอดีรอง HRP-คอนจูเกต (Dako Agilent, Santa Clara, CA, USA) ถูกใช้ที่การเจือจาง 1:5000 ตรวจพบโปรตีนโดยใช้ระบบตรวจจับ ECL (Euro-Clone SpA, Pero MI, Italy) โดยใช้ระบบอิมเมจ Fc ของ Odyssey (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg เยอรมนี) และวัดความหนาแน่นของแถบความถี่ด้วยซอฟต์แวร์ Image Studiow Lite (LI -COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) [36]. การทดลองดำเนินการเป็นสามเท่าและข้อมูลถูกแสดงเป็นการเพิ่มขึ้นเท่าของตัวอย่างกลุ่มควบคุม

2.6. ศักยภาพของเมมเบรนยล

เซลล์ tc3 และเกาะเล็กเกาะน้อยของมนุษย์ของ Langerhans ถูกบ่มด้วย 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milan, Italy) หรือ 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805, Campoverde Srl, Milan, Italy) เป็นเวลา 30 นาทีที่ 37 oC; ตรวจพบความเข้มของการเรืองแสงด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลท TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em สำหรับ MitoSpyw Orange CMTMRos; 490/516 nm Ex/Em สำหรับ MitoSpyw Green) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Switzerland) เซลล์ถูกบ่มด้วย 500 ไมโครโมลาร์ H2O2 เป็นเวลา 20 นาทีและตรวจพบความเข้มแสงออเรสเซนซ์ตามที่บรรยายไว้ก่อนหน้านี้ ค่าเฉลี่ยและส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานมาจากการทดลองที่แตกต่างกันสามการทดลอง

2.7. สัณฐานวิทยาและพลวัตของยล

เซลล์ tc3 ถูกโหลดล่วงหน้าด้วย MitoSpyw Orange CMTMRos 100 นาโนโมลาร์ (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, มิลาน, อิตาลี) ใน 11 มิลลิโมลาร์ของกลูโคส Krebs–Ringer บัฟเฟอร์ที่ 37 oC เป็นเวลา 30 นาที ตัวอย่างถูกจัดวางตำแหน่งในห้องภาพและสุ่มภาพโดยใช้ตัวกรองโรแดนของกล้องจุลทรรศน์ Axio Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen Germany) ในการประเมินสัณฐานวิทยาของยล พารามิเตอร์ต่อไปนี้ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์อนุภาค ImageJ: พื้นที่ (um2) ความเป็นวงกลม (4mArea2/ปริมณฑล2) และเส้นผ่านศูนย์กลางสูงสุดของ Feret (um) [37]

สำหรับการทดลองเหลื่อมเวลา การถ่ายภาพด้วยเซลล์เดียวดำเนินการที่ 1 เฟรมต่อวินาทีเป็นเวลา 30 วินาทีภายใต้สภาวะควบคุมหรือสภาวะความเครียดออกซิเดชัน ในการวัดระยะทางสะสมไมโตคอนเดรีย (um2) รูปภาพจะได้รับการแก้ไขเป็นครั้งแรกสำหรับการฟอกสีภาพถ่าย จากนั้นจึงวิเคราะห์วิดีโอโดยใช้ปลั๊กอิน Image-Pro Plus (การติดตามวัตถุ) ที่มีอยู่ (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA) มากถึงสิบสอง

เซลล์ถูกถ่ายภาพในการทดลองอิสระสามครั้ง และข้อมูลถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ยและส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน

2.8. การหลั่งอินซูลิน

เกาะ Langerhans ที่แยกได้ของมนุษย์ถูกเพาะในจานหลุม 96- หลุมที่ความหนาแน่น 20 เกาะเล็กๆ ต่อหลุม และหลังจาก 5 วันของการรักษา ปริมาณอินซูลินและการคัดหลั่งถูกวัดในเบส (3.3 mM กลูโคส) และกระตุ้น (กลูโคส 16.7 mM) ) สภาวะโดยวิธี ELISA immunoassay (Mercodia, 10-1113-01, Uppsala, Sweden)

2.9. การวิเคราะห์ทางสถิติ

การวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดดำเนินการด้วย GraphPad Prism 80 ในการทำซ้ำทางชีวภาพที่เป็นอิสระ ค่าเฉลี่ยระหว่างสองกลุ่มได้รับการประเมินโดยใช้ t-test ของนักเรียนแบบ two-tailed และ p-value < 0.05="" ถือเป็นหลักฐานของนัยสำคัญทางสถิติ="" ค่าเฉลี่ยระหว่างสามกลุ่มขึ้นไปถูกเปรียบเทียบโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวน="" (anova)="" ตามด้วยการทดสอบเปรียบเทียบแบบโพสต์-เฉพาะกิจ="" (tukey's)="" หลายครั้ง="" การทดสอบทางสถิติที่ใช้="" ค่า="" p="" ที่แน่นอน="" และจำนวนแบบจำลอง="" (n)="" จะถูกระบุไว้ในคำอธิบายภาพแต่ละภาพ="" แถบข้อผิดพลาดในรูปแสดงค่าเฉลี่ย="" ±="" sd="" หรือค่าเฉลี่ย="" ±="" se="">

3. ผลลัพธ์

3.1. Verbascoside ปรับปรุง -Cells Viability

เนื่องจากไม่มีข้อมูลเกี่ยวกับผลของ verbascoside บนเซลล์ เราจึงทำการทดสอบ MTT เพื่อประเมินความมีชีวิตของเซลล์ และดังแสดงในรูปที่ 1A เราจึงสังเกตเห็นแนวโน้มที่ขึ้นกับปริมาณรังสีที่เป็นบวก ดังนั้น สำหรับการศึกษาเพิ่มเติม เราจึงเลือกความเข้มข้น 16 uM ซึ่งได้รับการพิสูจน์ทางสถิติแล้วว่ามีประสิทธิภาพในการเพิ่มความมีชีวิตของเซลล์ โดย flow cytometry เราศึกษาผลกระทบของการฟักตัวของ verbascoside เป็นเวลาห้าวันต่อการอยู่รอดของเซลล์ในสภาวะที่เป็นเบสและหลัง 2{{21} } นาทีของการบำบัดล่วงหน้าด้วย 500 uM H2O2 ในสภาวะที่เป็นเบส verbascoside ไม่ส่งผลต่อการอยู่รอดของเซลล์ ซึ่งบ่งชี้ว่าความมีชีวิตของเซลล์ที่เพิ่มขึ้นที่สังเกตได้จากการทดสอบ MTT อาจเนื่องมาจากการทำงานของไมโตคอนเดรียที่ดีขึ้น ในขณะที่หลังจากการสัมผัสกับ H2O2 การบำบัดล่วงหน้าด้วย verbascoside 16 uM ลดลงอย่างมากจากความเครียดที่เกิดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน -การตายของเซลล์ (รูปที่ 1B,C)Verbascoside เป็นโมเลกุลที่ซับซ้อนที่สามารถแก้ไขได้โดยเอนไซม์ไฮโดรไลซ์ [18] เพื่อทดสอบว่าสารเมแทบอไลต์ของ verbascoside สามารถรับผิดชอบต่อผลการป้องกันที่สังเกตได้หรือไม่ เซลล์ tc3 ได้รับการรักษาด้วยกรดไฮดรอกซีไทโรซอลและกรดคาเฟอิก (0.8 และ 16 uM) เป็นเวลา 5 วัน เมแทบอไลต์ทั้งสองไม่ได้เพิ่มความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์ ในทางตรงกันข้าม ผลของพิษต่อเซลล์ ซึ่งมีความเกี่ยวข้องมากขึ้นหลังจากการสัมผัส H2O2 ถูกตรวจพบสำหรับความเข้มข้น 16 ไมโครโมลาร์ (รูปที่ S1) การค้นพบนี้พิสูจน์ว่า verbascoside และไม่ใช่สารเมตาโบไลต์ของมันมีผลในการป้องกันการรักษา H2O2

3.2. Verbascoside ปรับ Homeostasis รีดอกซ์และออกแรงต่อต้าน Inflammatory Efect ใน -Cells

ขั้นแรก เรายืนยันในเซลล์ tc3 ว่ามีฤทธิ์ต้านการอักเสบและต่อต้านอนุมูลอิสระของ verbascoside ที่พบในเซลล์ประเภทอื่นๆ [24,29,34] กิจกรรมการขับ ROS ของ verbascoside ถูกประเมินด้วยเซลล์ tc3 ที่ติดฉลากด้วยโพรบที่ซึมผ่านได้ของเซลล์ DCFDA (2/,7/-dichlorofuorescein diacetate) เฉพาะของ ROS ดังที่แสดงในรูปที่ 2A การลดลงอย่างมีนัยสำคัญของปริมาณ ROS ถูกตรวจพบหลังจากการบำบัดด้วย verbascoside ล่วงหน้า ทั้งภายใต้สภาวะความเครียดพื้นฐานและสภาวะความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน

การวิเคราะห์ Western blot เผยให้เห็นการลดลงอย่างมีนัยสำคัญของตัวทำเครื่องหมายความเครียดออกซิเดชัน acrolein และการแสดงออกของ 4-hydroxynonenal (HNE) ในเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วย verbascoside นอกจากนี้ เราพบว่าการแสดงออกของซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส (SOD1) เพิ่มขึ้น ซึ่งบ่งชี้ว่า verbascoside มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระซึ่งอาจมีกลไกที่แตกต่างกันสองอย่าง เป็นตัวเก็บขยะ ROS โดยตรงและโดยอ้อมโดยการกระตุ้นการแสดงออกของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ (รูปที่ 2B, C)

ผลการต้านการแทรกซึมของ verbascoside บนเซลล์ได้รับการประเมินโดยการประเมินการกระตุ้นของวิถี NFKB ซึ่งเป็นวิถีทางโปร-inflammatory ที่สำคัญที่สุดในเซลล์เหล่านี้ [38] โดยการวิเคราะห์ western blot เราพบการแสดงออกที่ลดลงของตัวยับยั้งปัจจัยนิวเคลียร์ kappa B (IKB ) และปัจจัยนิวเคลียร์ kappa-light-chain-enhancer (NFKB) และการลดลงอย่างมีนัยสำคัญของ NFKB ฟอสโฟรีเลชันในเซลล์ที่ได้รับการบำบัดล่วงหน้า ซึ่งสนับสนุนสมมติฐานของ ประสิทธิภาพของ verbascoside เพื่อลดการทำลายเซลล์ (ภาพที่ 2D,E)

3.3. Verbascoside ปรับการตอบสนองของโปรตีนที่กางออกของ -Cells

จากนั้นเราวิเคราะห์เชิงลึกเกี่ยวกับกลไกระดับโมเลกุลโดยที่ verbascoside ทำหน้าที่ต้านอนุมูลอิสระและต่อต้านการแทรกซึม โดยเน้นที่เอนโดพลาสมิกเรติคิวลัมซึ่งปรากฏเป็นเซ็นเซอร์สำคัญของสัญญาณการเผาผลาญและสัญญาณความเครียดในเซลล์ ภายใต้สภาวะความเครียด ออร์แกเนลล์จะสร้างการตอบสนองแบบ homeostatic หรือที่เรียกว่าการตอบสนองของโปรตีนที่กางออก (UPR) โดยมุ่งเป้าไปที่การฟื้นฟูการทำงานของ ER อย่างไรก็ตาม การกระตุ้นเส้นทางนี้มากเกินไปส่งผลให้เกิดการตายของเซลล์ [39,40]

เครื่องหมายของความเครียด ER ที่เพิ่มขึ้นคือการควบคุมโปรตีนของพี่เลี้ยงและการกระตุ้นการตอบสนอง UPR การวิเคราะห์แบบ Western blotting ของเซลล์ที่บำบัดด้วย verbascoside เผยให้เห็นระดับที่ลดลงของโปรตีนช็อตความร้อนของ chaperonins 70 (HSP70) สองตัวและโปรตีนอิมมูโนโกลบูลินที่จับได้ (BIP) ที่ลดลง (รูปที่ 3A,B) นอกจากนี้ การลดลงอย่างมีนัยสำคัญของการแสดงออกของโปรตีนไคเนส RNA-like ER kinase (PERK) และลดฟอสโฟรีเลชันของเอฟเฟกเตอร์ปลายทางของมัน ปัจจัยการเริ่มต้นการแปลยูคาริโอต 2 (eIF2 ) ถูกตรวจพบ

คลิกที่นี่เพื่อส่วนที่ 2