ส่วนที่ 1 ผลการป้องกันของ Phenylethanol Glycosides จาก Cistanche Tubulosa ต่อภาวะตับอักเสบจากตับที่เกิดจากโปรตีนจากอัลบูมินในหนู

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

เชิงนามธรรม

พื้นหลัง:Cistanche tubulosa เป็นยาสมุนไพรจีนโบราณที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการควบคุมภูมิคุ้มกันฟีนิลเอธานอลไกลโคไซด์จากซิสแทนเช(CPhGs) จากโรงงานนี้เป็นวัสดุที่มีประสิทธิภาพเป็นหลัก จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้คือเพื่อประเมินผลการป้องกันและการรักษาของ CPhG ต่อการเกิดพังผืดในตับที่เกิดจาก BSA ในหนูและกลไกระดับโมเลกุลที่เกี่ยวข้องซึ่งเกี่ยวข้องกับเซลล์ตับ stellate Biejiarangan (BJRG) ซึ่งเป็นยาสมุนไพรจีนโบราณอีกชนิดหนึ่งถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวก วิธีการ: ในการทดลองในร่างกาย หนูแรท 75 ตัวถูกสุ่มแบ่งเป็น 6 กลุ่ม: ปกติ (บำบัดด้วยน้ำกลั่น), แบบจำลอง (ที่ได้รับบีเอสเอ), ยาที่ให้ผลบวก (ที่ได้รับบีเอสเอร่วมกับ BJRG 60{{29} } มก./กก./วัน) และกลุ่มที่บำบัดด้วย BSA บวกกับ CPhG (125, 250 และ 500 มก./กก./วัน) ดัชนีตับและม้าม ระดับซีรั่มของ aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), hexadecenoic acid (HA), laminin (LN), type III procollagen (PCIII), type IV collagen (IV-C), hydroxyproline ( Hyp) และทรานส์ฟอร์เมชั่นแฟคเตอร์ 1 (TGF- 1) ถูกวัดในตับของหนู เกรดทางจุลพยาธิวิทยาสำหรับการเกิดพังผืดในตับได้รับการประเมินสำหรับแต่ละกลุ่มโดยใช้การย้อมสีไตรโครมของ H&E และการย้อมสีของ Masson การแสดงออกของ TGF- 1, คอลลาเจน I (Col-I) และคอลลาเจน III (Col-III) ถูกกำหนดหาโดยวิธีการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมี ผลกระทบเหล่านี้ได้รับการประเมินเพิ่มเติม ในหลอดทดลอง โดยกำหนดระดับการแสดงออกของ NF-κB p65 และ Col-I โดยการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ การแสดงออกของโปรตีน Col-I ยังถูกตรวจสอบโดย western blotting ผลลัพธ์: กลุ่มขนาดยาทั้งหมด (125, 250 และ 500 มก./กก./วัน) ของ CPhGs ลดดัชนีตับและม้ามอย่างมีนัยสำคัญ ลดระดับ ALT, AST, HA, LN, PCIII, IV-C ในเลือด, เนื้อหา TGF- 1 (P < 0.01,="" p="">< 0.01="" และ="" p="">< 0.01)="" และเนื้อหา="" hyp="" cphg="" ยังบรรเทาการบวมของเซลล์ตับได้อย่างชัดเจนและป้องกันเนื้อร้ายในตับและการแทรกซึมของเซลล์ที่มีการอักเสบได้อย่างมีประสิทธิผล="" ผลทางอิมมูโนฮิสโตเคมีพบว่า="" cphg="" ลดการแสดงออกของ="" tgf-="" 1="" อย่างมีนัยสำคัญ="" (p="">< 0.01,="" p="">< 0.01="" และ="" p="">< 0.01),="" col-="" i="" และ="" col-iii="" ผลกระทบในหลอดทดลองของ="" cphgs="" (100,="" 75,="" 50="" และ="" 25="" ug/ml)="" บน="" hsc-t6="" แสดงให้เห็นว่า="" cphgs="" ลดการแสดงออกของ="" mrna="" ของ="" nf-κb="" p65="" และ="" col-i="" อย่างมีนัยสำคัญ="" และ="" cphgs="" ยังลดการแสดงออกของโปรตีน="" col-i="" อีกด้วย="" สรุป:="" cphg="" มีฤทธิ์ต้านการเกิดพังผืดของตับอย่างมีนัยสำคัญ="">

คำสำคัญ: พังผืดในตับ, Cistanche tubulosa, Phenylethanol glycoside, Chemokine BSA, การป้องกันและบำบัด

พื้นหลัง

พังผืดในตับเป็นการตอบสนองการรักษาบาดแผลต่อการบาดเจ็บของตับอย่างรุนแรงที่เกิดขึ้นในการเกิดโรคของโรคตับอักเสบเรื้อรังที่เกิดจากปัจจัยต่างๆ ปัจจัยเหล่านี้ได้แก่ การติดเชื้อไวรัส การดื่มแอลกอฮอล์ในทางที่ผิด cholestasis และโรคเมตาบอลิซึมและภูมิต้านทานผิดปกติ [1–3] การสะสมของ extracellular matrix (ECM) แบบก้าวหน้าและการเปลี่ยนแปลงรูปแบบที่ลดลงจะรบกวนโครงสร้างปกติของตับ ส่งผลให้เกิดพังผืดในตับ [4] พังผืดในตับมีความสำคัญอย่างยิ่งในโรคตับเรื้อรังและมักพัฒนาไปสู่โรคตับแข็งที่ไม่สามารถย้อนกลับได้และการเกิดมะเร็ง ปัจจุบันยังไม่มีวิธีการหรือยาที่มีประสิทธิภาพในการรักษาภาวะพังผืดในตับ ดังนั้นจึงเป็นเรื่องเร่งด่วนที่จะต้องหายาต้านโรคพังผืดในตับที่จะลดความก้าวหน้าของการบาดเจ็บที่ตับต่อการเกิดพังผืดและมะเร็งCistanche tubulosaW (ในวงศ์ Orobanchaceae) เป็นพืชกาฝากที่ปลูกกันอย่างแพร่หลายในภาคใต้ของซินเจียงในประเทศจีน [5] ผู้คนมักใช้เพื่อเติมพลังให้ไต บำรุงเลือด ผ่อนคลายลำไส้ และชะลอความชรา มีชื่ออย่างเป็นทางการในตำรับยาจีน [6] C. tubulosa มีส่วนประกอบที่ออกฤทธิ์หลากหลาย ได้แก่ฟีนิลเอธานอลไกลโคไซด์จากซิสแทนเช(CPhG) อิริดอยด์ และพอลิแซ็กคาไรด์ เป็นหนึ่งในองค์ประกอบที่ใช้งานมากมายในค. ทูบูโลซา, CPhGs ได้แสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่น่าเชื่อถือ ต่อต้านความเหนื่อยล้า ปกป้องระบบประสาท และต้านการอักเสบ ในการศึกษาทั้งในร่างกายและในหลอดทดลอง [7] ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา มีรายงานว่า CPhGs(ฟีนิลเอธานอลไกลโคไซด์จากซิสแทนเช) มีผลป้องกันตับ กลไกที่เป็นไปได้ซึ่งอยู่เบื้องหลังผลกระทบเหล่านี้ ได้แก่ การกำจัดอนุมูลอิสระ การป้องกันเยื่อหุ้มตับ การควบคุมภูมิคุ้มกัน การยับยั้งการตายของเซลล์ การยับยั้งการแสดงออกของ HBsAg และ HBeAg และการยับยั้งการจำลองดีเอ็นเอของ HBV และอื่นๆ [8–11] อย่างไรก็ตาม มีงานวิจัยไม่กี่ชิ้นที่กล่าวถึงผลการเกิดพังผืดที่ต้านตับของกราฟิก ดังนั้น การศึกษานี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบผลการต้านการเกิดพังผืดของตับของ GPhCs โดยใช้แบบจำลองของ bovine serum albumin (BSA) ที่เหนี่ยวนำให้เกิดพังผืดที่ตับในหนูแรท กลไกระดับโมเลกุลที่เกี่ยวข้องถูกตรวจสอบในเซลล์ HSC-T6

วิธีการ

เคมีภัณฑ์และรีเอเจนต์

ซื้อชุด Hydroxyproline (Alkaline hydrolysis) (ล็อต: 20140616) จาก Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (ประเทศจีน) หนู TGF- 1 ชุดแซนวิช ELISA (ล็อต: 238240615) ซื้อมาจาก Lianke Biotech Co., Ltd. (ประเทศจีน) แอนติบอดี Anti-Collagen I ของ Rabbit (ล็อต: 140619), แอนติบอดี Anti-Collagen III ของ Rabbit (ล็อต: 980788 W) และแอนติบอดี Rabbit Anti-TGF- 1 (ล็อต: 140619) ให้บริการโดย Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., LTD (จีน). ซื้อมาจาก Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd. (ประเทศจีน) พร้อมเซรั่มแกะธรรมดา (น้ำยาทำงาน) (ล็อต: WP141214), PV-6000 (ล็อต: WK141225) และชุด DAB (ล็อต: K136621D) . การตรวจหาแอนติบอดีปฐมภูมิทำได้โดยใช้ 2. สารละลายแอนติบอดี (Alk-Phos. Conjugated, Anti-rabbit) และ 2. สารละลายแอนติบอดี (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) (ล็อต: 272387) ที่ซื้อจาก Invitrogen Company (สหรัฐอเมริกา) ). Bovine serum albumin (BSA) (ล็อต: SLBG8239V) ซื้อมาจาก Sigma (USA) ก่อนใช้งาน BSA ถูกเตรียมที่ 18 g/L ในน้ำเกลือปกติ แบคทีเรียถูกกำจัดโดยการกรอง และ BSA เก็บไว้ที่ 4 องศา สารเสริมที่ไม่สมบูรณ์ของ Freund ที่มีไขมัน 1 กรัมจากขนแกะ (ล็อต: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (จีน) ผสมกับพาราฟินเหลว 2 กรัม (ล็อต: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (ประเทศจีน) ฆ่าเชื้อในหม้อนึ่งความดันไอน้ำและเก็บไว้ที่ 4 องศา ยา BJRG ที่เป็นบวกได้มาจากยาเม็ด Biejiarangan จาก Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (จีน) สต็อกยา BJRG ถูกเตรียมโดยการละลาย เม็ด BJRG ในน้ำกลั่นที่ความเข้มข้น 600 มก./กก.

วัสดุปลูก

ค. ทูบูโลซา(วงศ์ Orobanchaceae) ซื้อมาจากเขต Minfeng ของ Xinjiang ของจีน วัสดุดังกล่าวได้รับการรับรองโดยนักวิจัย Jun Zhao, Key Laboratory for Uighur Medicine, Institute of Materia Medica of Xinjiang ตัวอย่างบัตรกำนัลถูกฝากไว้ที่สถาบัน Materia Medica แห่งซินเจียง

การเตรียม CPhGs(ฟีนิลเอธานอลไกลโคไซด์จากซิสแทนเช)

เหง้าตากแห้งหั่นฝอยค. ทูบูโลซา(6.0 กก.) ถูกสกัดอย่างต่อเนื่องภายใต้การไหลย้อนสามครั้งด้วยเอทานอล 70 เปอร์เซ็นต์ และตัวทำละลายถูกกำจัดออกเพื่อให้ผลผลิตสกัดเอทานอล สารสกัดเอทานอลถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้เรซิน AB-8 เพื่อให้ได้ฟีนิลเอทานอลไกลโคไซด์ (CPhGs) สารละลายสต็อคของ CPhG ที่ใช้สำหรับกลุ่มขนาดยาที่แตกต่างกันในการศึกษาในสัตว์ทดลอง (500 มก./กก., 250 มก./กก. และ 125 มก./กก. ตามลำดับ) ถูกละลายในคาร์บอกซีเมทิล เซลลูโลส 0.5 เปอร์เซ็นต์ (5 กรัม/ลิตร) (เกลือโซเดียม)

การหาปริมาณของ CPhGs(ฟีนิลเอธานอลไกลโคไซด์จากซิสแทนเช)

เนื้อหาของสองส่วนประกอบ (echinacoside และ acteoside) ใน CPhG ถูกกำหนดโดย HPLC โดยใช้วิธีที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ (Zhang et al. 2004) [12] HPLC ถูกดำเนินการโดยใช้ Shimadzu LC-10A HPLC ที่ติดตั้งเครื่องตรวจจับ UV คอลัมน์ HPLC คือคอลัมน์ Phenomenex Gemini ODS (250 × 4.6 มม., 5 ไมโครเมตร) เฟสเคลื่อนที่แบบไอโซเครติกประกอบด้วยเมทานอล-อะซีโตไนไตรล์-1 เปอร์เซ็นต์กรดอะซิติก (15:10:75, v/v/v) การชะเป็นเวลา 40 นาทีและอัตราการไหลถูกคงไว้ที่ 0.6 มล./นาที อุณหภูมิคอลัมน์ถูกรักษาให้คงที่ที่ 30 องศา การตรวจจับรังสียูวีอยู่ที่ 334 นาโนเมตร

สัตว์และสายเซลล์ HSC-T6

[เกรด SPF] หนู Sprague–Dawley (SD) เพศผู้โตเต็มวัยที่มีสุขภาพดี (180–220 กรัม) ถูกซื้อจากศูนย์สัตว์มหาวิทยาลัยการแพทย์ซินเจียง เลขที่ใบอนุญาต: SCXK (ใหม่) 2011–0004 หนูถูกเลี้ยงโดยปราศจากเชื้อก่อโรค (SPF) ขั้นตอนทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับการทดลองกับสัตว์ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมสัตว์ของโรงพยาบาลในเครือแห่งแรกของมหาวิทยาลัยการแพทย์ซินเจียง หนูถูกเลี้ยงในกรงภายใต้สภาวะแวดล้อมที่มีการควบคุม (วัฏจักรแสง/มืดที่ 25 องศาและ 12 ชั่วโมง) และสามารถเข้าถึงอาหารเม็ดหนูและน้ำประปาได้ฟรี หนูเคยชินกับสภาพก่อนการรักษา สายเซลล์สเตลเลตตับหนูที่เป็นอมตะ HSC-T6 ได้รับจาก Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD. (อู่ฮั่น ประเทศจีน). เซลล์ HSC-T6 ได้รับการเพาะเลี้ยงในอาหารปานกลางของ Dulbecco (กลูโคสสูง) (DMEM, ปักกิ่ง, จีน) เสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (Gibco, South America), 100 IU/ml penicillin และ 100 ug/ml streptomycin (ปักกิ่ง) , ประเทศจีน) ในตู้ฟักที่มีความชื้น 37 องศาพร้อมคาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์

การบาดเจ็บและการรักษาตับที่เกิดจาก BSA

หนู SD เจ็ดสิบห้าตัวถูกสุ่มแบ่งออกเป็นหกกลุ่ม: ปกติ (บำบัดด้วยน้ำกลั่น), แบบจำลอง (BSAtreated), ยาที่ให้ผลบวก (ที่ได้รับ BSA บวก BJRG 600 มก./กก./วัน) และที่ได้รับ BSA ร่วมกับ CPhG(ฟีนิลเอธานอลไกลโคไซด์จากซิสแทนเช)(125, 250, 5{{20}}0 มก./กก./ วัน) กลุ่ม กลุ่มที่ได้รับ BSA บวกกับ CPhGs (125, 250, 500 มก./ กก./วัน) มีหนู 13 ตัวในแต่ละกลุ่ม และอีกกลุ่มมีหนู 12 ตัวในแต่ละกลุ่ม แบบจำลองการบาดเจ็บที่ตับที่เกิดจาก BSA แบ่งออกเป็นการทำให้ไวต่อการกระตุ้นหลักตามด้วยการโจมตีทางภูมิคุ้มกัน) [13] ยกเว้นกลุ่มปกติ กลุ่มอื่น ๆ ถูกบริหารให้ฉีดเข้าใต้ผิวหนังหลายครั้งด้วยสารเสริมที่ไม่สมบูรณ์ของ BSA Freund 0.5 มล. (9 มก./มล.) ในวันที่ 1, วันที่ 15, วันที่ 22, วันที่ 29 และวันที่ 36 สำหรับการทำให้ไวต่อการกระตุ้นปฐมภูมิ เจ็ดวันหลังจากการฉีดครั้งที่ 5 เลือดได้รับผ่านทางช่องท้องของจอประสาทตาของหนูและทดสอบหาแอนติบอดีต่ออัลบูมินในซีรัม ตรวจพบแอนติบอดี BSA ในซีรัมของหนูด้วยวิธีการแพร่แบบ double agar diffusion การฉีดเข้าเส้นเลือดดำทำการโจมตีโดยการฉีด BSA 0.4 มิลลิลิตรในน้ำเกลือปกติผ่านทางเส้นเลือดหางในหนูที่มีแอนติบอดีต่อ BSA สองครั้งต่อสัปดาห์เป็นเวลาสิบครั้ง ความเข้มข้นและเวลาของการฉีดเท่ากับ 5.{28}}, 5.50, 6.00, 6.50, 7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 และ 10.00 g/L ที่วันที่ 46 วันที่ 50 วันที่ 53 วันที่ 57 วันที่ 60 วันที่ 64 วันที่ 67 วันที่ 71 วันที่ 74 และวันที่ 78 ตามลำดับ ในกลุ่มปกติ ใช้น้ำเกลือปกติในการฉีดปฐมภูมิ (การทำให้แพ้) และการฉีดทุติยภูมิ (โจมตี) แทน BSA และสภาวะอื่นๆ ก็เหมือนกับในกลุ่มแบบจำลอง กลุ่มปกติให้รับประทานน้ำกลั่นขนาด 10 มล./กก./วัน กลุ่มแบบจำลองถูกบริหารให้ทางปาก 10 มล./กก./วัน 0.5 เปอร์เซ็นต์ของสารละลาย CMC-Na กลุ่มยาที่เป็นบวกได้รับ BJRG 600 มก./กก./วัน ทางปาก CPhG ที่บำบัดด้วย BSA บวก (125,

กลุ่ม 250 และ 500 มก./กก./วัน) ถูกบริหารให้ทางปากด้วย CPhG ขนาด 125, 250 และ 500 มก./กก./วัน(ฟีนิลเอธานอลไกลโคไซด์จากซิสแทนเช)ตามลำดับ หนูที่ได้รับยาทุกวันยังคงดำเนินต่อไปเป็นเวลาสองสัปดาห์หลังจากการฉีดครั้งสุดท้าย หลังจากช่วงทดลอง หนูถูกอดอาหารเป็นเวลา 12 ชั่วโมงก่อนคลอรีนไฮเดรต 10 เปอร์เซ็นต์ จากนั้นจึงทำการุณยฆาตทันที เก็บตัวอย่างซีรัมจากหนูแต่ละตัวและนำไปใช้ทันที ตับถูกเก็บเกี่ยวเพื่อวัตถุประสงค์สองประการ: (1) การเก็บรักษาในไนโตรเจนเหลวสำหรับชุด Hyp และ (2) การตรึงในฟอร์มัลดีไฮด์ 10 เปอร์เซ็นต์สำหรับการตรวจเนื้อเยื่อวิทยาและอิมมูโนฮิสโตเคมี ระยะเวลาทั้งหมดของการศึกษาในสัตว์คือ 93 วัน

ดัชนีตับและม้าม

ตับและม้ามผ่าโดย laparotomy และล้างด้วยน้ำเกลือ 4 องศา หลังจากดูดซับน้ำส่วนเกินด้วยกระดาษกรองแล้ว ตับและม้ามถูกชั่งน้ำหนักเพื่อคำนวณดัชนีที่เกี่ยวข้อง: น้ำหนักอวัยวะสัมพัทธ์=มวลอวัยวะ (g) / มวลกายบุคคล (g) × 100 เปอร์เซ็นต์ [14]

การทดลองเซลล์

เซลล์ HSC-T6 ถูกชุบในจาน 96-หลุม เริ่มแรก เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงด้วย DMEM ที่มี FBS 10 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นสื่อถูกแทนที่ด้วย DMEM โดยไม่มี FBS เพื่อทำให้เซลล์อดอาหารเป็นเวลา 12 ชั่วโมง จากนั้นเซลล์ถูกเพาะเลี้ยงด้วย DMEM ที่มี 5.0 ng/mL TGF- 1 (ไม่มี FBS) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ในที่สุด ความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CPhGs(ฟีนิลเอธานอลไกลโคไซด์จากซิสแทนเช)(100ug/ml, 50ug/ml และ 25ug/ml), แอกทิโอไซด์ (6 มก./มล., 3 มก./มล. และ 1.5 มก./มล.) และอิชินาโคไซด์ (500 มก./มล. 250 มก./มล. และ 125 มก./มล.) ถูกดำเนินการในจานในบ่อสี่ส่วนและฟักเป็นเวลา 48 ชั่วโมง

การวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์

ระดับการแสดงออกของ mRNA ของ NF-κB, p65 และคอลลาเจน I ถูกกำหนดโดย PCR แบบเรียลไทม์ เพื่อตรวจสอบการแสดงออกของ mRNA ในเซลล์ HSC-T6 เซลล์ (4 × 105 เซลล์) ถูกเพาะในเพลตหกหลุมที่มี DMEM 3 มล. ที่มี FBS 10 เปอร์เซ็นต์ และบ่มในชั่วข้ามคืนที่ 37 องศาและ CO2 5 เปอร์เซ็นต์ หลังจากนั้นสื่อเพาะเลี้ยงเซลล์ เปลี่ยนเป็น DMEM ที่ปราศจากเซรั่ม ต่อไป CPhGs(ฟีนิลเอธานอลไกลโคไซด์จากซิสแทนเช)(100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร, 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และ 25 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร), แอกทิโอไซด์ (6 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร, 3 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และ 1.5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และอิชินาโคไซด์ (500 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) , 250 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และ 125 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ถูกเติมลงในหลุม หลังจากการบ่ม 48 ชั่วโมงด้วย CPhG หรือองค์ประกอบโมโนเมอร์ RNA ทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้รีเอเจนต์ TRIzol (Invitrogen, USA) และกวนอย่างแรงด้วยคลอโรฟอร์มเป็นเวลา 15 วินาที หลังจากนั่งที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 3 นาที ไลเสตถูกหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 × ก. เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 องศา RNA ในระยะที่เป็นน้ำถูกตกตะกอนด้วยไอโซโพรพานอล และเฟสของน้ำด้านบนถูกถ่ายโอนไปยังหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ใหม่ RNA ตกตะกอนโดยการเติมเอทานอล 0.75 เปอร์เซ็นต์ หลังจากนั้นหลอด microcentrifuge และหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 × g ที่ 4 องศาเป็นเวลาไม่เกิน 5 นาที ส่วนลอยเหนือตะกอนจะถูกลบออกและ RNA ถูกทำให้แห้งที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5-10 นาที ชุดไพรเมอร์เฉพาะ (Sangon, Shanghai, China) ที่ใช้สำหรับการขยายพันธุ์ rat -actin [GenBank: NM_031144.3], Collagen I [GenBank: NM_ 053304.1] และ NF -κB p65 [GenBank: NM_199267.2] ยีนได้รับการออกแบบโดยใช้ Batch Primer 3 ไพรเมอร์ไปข้างหน้า (fw) และย้อนกลับ (rv) มีดังนี้: Collagen I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG , rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), -actin (fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G, rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A) ผลลัพธ์ถูกทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับ mRNA ของยีนดูแลทำความสะอาด -แอกติน เป็นการควบคุมภายในและแสดงเป็นระดับ mRNA สัมพัทธ์ ปฏิกิริยาถูกดำเนินการด้วย 8 ไมโครลิตร iQ SYBR Green Supermix, 1 ไมโครลิตร 10 pM ไพรเมอร์คู่, 8.5 ไมโครลิตร น้ำกลั่น และ 2.5 ไมโครลิตร cDNA ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแต่ละครั้งดำเนินการภายใต้สภาวะต่อไปนี้: 95 องศาเป็นเวลา 3 นาที จากนั้น 40 รอบ 10 วินาทีที่ 95 องศา 30 วินาทีที่ 55 องศา และ 10 วินาทีที่ 55 องศา – 95 องศาสำหรับการยืดออก ตามด้วยการวัดการเรืองแสงครั้งเดียว . ผลลัพธ์สุดท้ายถูกอธิบายด้วยค่าสัมพัทธ์ (2-ΔΔCt) การคำนวณและวิเคราะห์ดำเนินการโดยระบบตรวจจับ PCR แบบเรียลไทม์ของ iQ5

การวิเคราะห์ Western blot

Collagen I (Abcam, Cambridge, UK, Art No: ab34710) ระดับการแสดงออกของโปรตีนถูกกำหนดโดย Western blotting [with -actin (Lot: 60008-1-lg; Proteintech, China) เป็นตัวควบคุมการดูแลทำความสะอาด สารสกัดทั้งเซลล์ถูกเตรียมโดยใช้ Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) (Thermo Scientific, USA) กับค็อกเทลสารยับยั้งโปรตีเอส 1 เปอร์เซ็นต์ (Thermo Scientific, USA) และค็อกเทลสารยับยั้ง Halt phosphatase 1 เปอร์เซ็นต์ (Thermo Scientific, USA) ความเข้มข้นของโปรตีนวัดและหาปริมาณโดยวิธีแบรดฟอร์ด [18] แยกโปรตีน (10–50 ไมโครกรัม) บนเจล SDS-PAGE 10 เปอร์เซ็นต์ และถ่ายโอนไปยังเยื่อ PVDF (เมอร์ค สหรัฐอเมริกา) เมมเบรนถูกปิดกั้นเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องด้วย BSA 5 เปอร์เซ็นต์ และแอนติบอดีปฐมภูมิ (แอนติบอดีต้านคอลลา gen I, การเจือจาง 1:200 หรือ mAb ของ -แอคตินของหนูเมาส์, การเจือจาง 1:5000) ถูกบ่มที่ 4 องศาข้ามคืน Alk-Phos ที่สอดคล้องกัน แอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตถูกบ่มที่อุณหภูมิห้อง สุดท้าย เยื่อเมมเบรนถูกล้างสามครั้งด้วยน้ำเกลือ 1 × Tris–HCl ที่มี Tween 20 0.1 เปอร์เซ็นต์ และสัญญาณถูกสแกนและแสดงภาพโดย GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad) วิเคราะห์เดนซิโตเมตริกบนโปรตีนที่สนใจและถูกทำให้เป็นมาตรฐานเป็น -แอกติน โดยซอฟต์แวร์ GEL DOC Image Studio (Bio-Rad) - ใช้แอกตินเป็นตัวควบคุมภายใน

การวิเคราะห์ทางสถิติ

การทดสอบความปกติของชาปิโร-วิลค์และการทดสอบความแปรปรวนของความแปรปรวนของเลวีนถูกนำไปใช้เพื่อตรวจสอบความปกติและคุณและคณะ DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 หน้า 4 จาก 13 ความสม่ำเสมอของความแปรปรวน การวิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA) ตามด้วยการทดสอบ post hoc ของ Tukey ใช้เพื่อระบุความแตกต่างทางสถิติที่ไม่เป็นเนื้อเดียวกัน ข้อมูลที่กระจายตามปกติ การทดสอบแบบไม่อิงพารามิเตอร์ของ Kruskal-Wallis ใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูลที่ไม่ได้กระจายตามปกติหรือเป็นเนื้อเดียวกัน ผลลัพธ์แสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD ความสำคัญถูกกำหนดไว้ที่ P < 0.05="" ข้อมูลทั้งหมดได้รับการวิเคราะห์โดยซอฟต์แวร์="" spss="" 16.0="">

ผลลัพธ์

การกำหนดปริมาณของ CPhGs

CPhG ใน C. tubulosa มีฟีนิลเอทิลแอลกอฮอล์ไกลโคไซด์สองชนิด, อิชินาโคไซด์และแอกทิโอไซด์ และเนื้อหาของพวกมันใน CPhG ถูกกำหนดหาโดยการวิเคราะห์ HPLC (รูปที่ 1) ให้เป็น 42.71 ± 0.42 เปอร์เซ็นต์และ 14.27 ± {{7 }}.18 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ

ดัชนีตับและม้าม

ตามที่แสดงตารางที่ 1 ดัชนีตับและม้ามของกลุ่มแบบจำลองถูกยกระดับอย่างมีนัยสำคัญ [P < 0.01,="" p="">< 0.05]="" ดัชนีตับและม้ามของยาบวก="" bjrg="" และ="" cphg="" ที่กลุ่มขนาดยาต่างกันลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มแบบจำลอง="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0" 004,="" พลิเวอร์="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070," ตามลำดับ]="">

ผลของ CPhG ต่อกิจกรรม ALT, AST และตัวบ่งชี้การเกิดพังผืดของตับ

ในการศึกษานี้ ระดับซีรัมของเอนไซม์ตับ AST และ ALT เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มแบบจำลอง ซึ่งสะท้อนถึงความเสียหายของเซลล์ตับในหนูที่เกิดพังผืดในตับที่เกิดจาก BSA อย่างไรก็ตามการทดลอง

แสดงให้เห็นว่าการบำบัดด้วย BJRG (600 มก./กก.) และ CPhG (125, 250 และ 5{{10}}0 มก./กก.) ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ AST [PAST < 0.0{{60}}1,="" past="">< 0.001,="" past="">< 0.001,="" past="">< 0.001="" ตามลำดับ]="" และ="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189," palt="0.255" ตามลำดับ]="" ในหนูที่มีพังผืดในตับ="" .="" (ตารางที่="" 2).="" ระดับของ="" ha,="" ln,="" pc="" และ="" iv-c="" ในหนูทดลองเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ="" [pha="">< 0.001,="" pln="">< 0.001,="" ppciii="0.002," piv-c="">< 0.001="" ตามลำดับ]="" เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มแบบจำลอง="" ระดับของ="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023" ตามลำดับ],="" ln="" [pln="0.011," p="" ln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069" ตามลำดับ],="" pc="" iii="" [p="" pciii="" {="" {47}}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296" ตามลำดับ]="" และ="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001="" ตามลำดับ]="" ในหนูแรทลดลงอย่างเห็นได้ชัดโดย="" bjrg="" (600="" มก./กก.)="" และ="" cphg="" ที่กลุ่มขนาดยาที่ต่างกัน="" (125,="" 250="" และ="" 500="" มก./กก.)="" (ตารางที่="" 3)="" ปริมาณ="" hyp="" และ="" tgf-="" 1="" ยังตรวจพบโดยการวัดระดับ="" hyp="" ในเนื้อเยื่อตับ="" ดังแสดงในตารางที่="" 4="" ค่าเฉลี่ย="">ระดับในกลุ่มแบบจำลองสูงกว่ากลุ่มปกติอย่างมีนัยสำคัญ แต่ลดลงอย่างเห็นได้ชัดในกลุ่ม BJRG และกลุ่มขนาดยา CPhGs ที่แตกต่างกัน ความเข้มข้นของตับของ TGF{{0}} ของกลุ่มแบบจำลองในหนูทดลองเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ [P < 0.001]="" เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มแบบจำลอง="" ระดับ="" tgf-="" 1="" ของยาที่เป็นบวกและกลุ่มขนาดยา="" cphg="" ที่ต่างกันลดลงอย่างเห็นได้ชัด="" [p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" ptgf-="" 1="">< 0.001="" ตามลำดับ]="" ผลลัพธ์สรุปไว้ในตารางที่="">

การตรวจทางจุลพยาธิวิทยา

การสังเกตส่วนเนื้อเยื่อตับปกติที่ย้อมด้วย H&E และไตรโครมของ Masson แสดงก้อนเนื้อตับและไซนูซอยด์ในตับที่แตกต่างกัน โครงสร้างเนื้อเยื่อตับในหนูทดลองมีความผิดปกติ และเนื้อเยื่อตับและไซนัสในตับถูกแทนที่ด้วยเนื้อเยื่อเกี่ยวพันจำนวนมาก อย่างไรก็ตาม ตรวจพบ cytoarchitecture ที่ปกติมากกว่าและเนื้อเยื่อเกี่ยวพันในกลุ่มทรีตเมนต์น้อยกว่าในกลุ่มแบบจำลอง

การย้อมสี H&E

ในกลุ่มปกติ พบความสมบูรณ์ของโครงสร้างของตับกลมที่ไม่มีพื้นที่พอร์ทัลผิดปกติและไซนัสในตับ สายตับถูกจัดเรียงอย่างเป็นระเบียบ โดยแกนกลางจะกลมและใส นิวเคลียสตั้งอยู่ตรงกลางเซลล์ มีไซโตพลาสซึมอยู่มาก เฉพาะพื้นที่พอร์ทัลเท่านั้นที่มีเนื้อเยื่อเส้นใยจำนวนเล็กน้อย (รูปที่ 2a) ในกลุ่มแบบจำลอง โครงสร้าง lobular ได้รับความเสียหายอย่างรุนแรง เซลล์ตับมีการเสื่อมของน้ำเล็กน้อย ส่วนใหญ่เป็นบอลลูนเสื่อมสภาพและ/หรือไขมันเสื่อม นอกจากนี้ยังสังเกตเห็นการก่อตัวของการแทรกซึมของเซลล์อักเสบ, hyperplasia เนื้อเยื่อเส้นใยที่กว้างขวาง, การก่อตัวของเยื่อบุโพรงมดลูกจำนวนมาก, lobules แยกและการเพิ่มจำนวนเซลล์ตับอย่างมีนัยสำคัญ การสังเกตเหล่านี้ยืนยันความสำเร็จของการจัดตั้งแบบจำลองสัตว์ที่มีอาการบาดเจ็บภูมิคุ้มกันของหนูที่เป็นพังผืดในตับ (รูปที่ 2b) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มแบบจำลอง มีการลดลงในการแทรกซึมของเซลล์ที่มีการอักเสบใน CPhG ที่ต่างกัน ยังสังเกตพบเนื้อร้ายน้อยลงและความเสื่อมของไขมันของเซลล์ตับรวมทั้งบรรเทาการเกิดพังผืด CPhG บรรเทาพยาธิสภาพของการเกิดพังผืดในตับที่เกิดจาก BSA ในหนูได้อย่างมีนัยสำคัญ บรรเทาการบวมของเซลล์ตับ และป้องกันเนื้อร้ายในตับและการแทรกซึมของเซลล์ที่มีการอักเสบได้อย่างมีประสิทธิภาพ ซึ่งบ่งชี้ว่า CPhGs ให้ผลในการป้องกันพังผืดที่ตับของหนูที่เกิดจาก BSA (รูปที่ 2c–f ). การย้อมสีไตรโครมของ Masson ในกลุ่มปกติ เนื้อเยื่อตับเป็นปกติ บริเวณพอร์ทัลตับแสดงเส้นใยคอลลาเจนสีน้ำเงินจำนวนเล็กน้อย และเนื้อเยื่อตับมีโครงสร้างตามปกติ (รูปที่ 3a) เมื่อเทียบกับเนื้อเยื่อตับของกลุ่มปกติ เนื้อเยื่อเส้นใยจะขยายตัวโดยแผ่นพับส่วนกลางและขยายไปสู่เนื้อเยื่อตับ เส้นใยคอลลาเจนขยายและเชื่อมโยงและ

ห่อหุ้มทั้ง lobule และล้อมรอบเส้นเลือดส่วนกลาง ผลกระทบเหล่านี้ พร้อมกับการเกิดพังผืดในตับ ความเสียหายของโครงสร้าง lobular การเกิดพังผืดในช่องท้อง และการก่อรูป pseudolobule (รูปที่ 3b) ให้หลักฐานว่าแบบจำลองถูกสร้างขึ้น เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มแบบจำลอง เส้นใยคอลลาเจนในกลุ่มควบคุมยาที่เป็นบวกถูกขยายออกด้านนอกอย่างอ่อนโยนจากบริเวณพอร์ทัลส่วนปลาย (รูปที่ 3c) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มแบบจำลอง เส้นใยคอลลาเจนในกลุ่มขนาดยา CPhG ต่างๆ ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ยับยั้งการงอกของเส้นใย และการเพิ่มจำนวนเนื้อเยื่อเส้นใยภายในเนื้อเยื่อตับลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า CPhG ป้องกันหนูจากการพังผืดของตับที่เกิดจาก BSA (รูปที่ 3d–f )

การย้อมสีอิมมูโนฮิสโทเคมี

ที่สำคัญ การแสดงออกของคอลลาเจนชนิดที่ 1 และคอลลาเจนชนิดที่ 3 มีบทบาทสำคัญในการพัฒนาการเกิดพังผืดในตับ และการสร้างและการสะสมของคอลลาเจนในเนื้อเยื่อตับอาจเป็นตัวกำหนดประสิทธิภาพของการต่อต้านพังผืดในตับ ผลลัพธ์สรุปไว้ในตารางที่ 5

คอลลาเจนชนิด I

กลุ่มปกติแสดงคอลลาเจนประเภทที่ 1 ส่วนใหญ่ในหลอดเลือดและบริเวณพอร์ทัล กลุ่มแบบจำลองแสดงออกอย่างสูงของคอลลาเจนชนิดที่ 1 vascular fibrosis ในบริเวณพอร์ทัล ในพื้นที่ของ Disse พบว่าการย้อมสีคอลลาเจนประเภทที่ 1 มีริ้วหรือกระจายเป็นหย่อมๆ คอลลาเจนหุ้มผนังกั้นเส้นใยเพื่อสร้าง pseudolobule ในการทดลองเหล่านี้ ผนังกั้นที่มีเส้นใยน้อยลงถูกสร้างขึ้นสำหรับ BJRJ (600 มก./กก.) และกลุ่มขนาดยาที่แตกต่างกันของ CPhGs (125, 250 และ 500 มก./กก.) [PCol I=0.002, PCol I {{ 6}}.001, PCol I=0.023 และ P Col I=0.044 ตามลำดับ] ผลการศึกษาเชิงกึ่งปริมาณพบว่าการแสดงออกของคอลลาเจนประเภท I ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มแบบจำลอง (รูปที่ 4)

คอลลาเจนชนิด III

คอลลาเจนชนิด III ถูกแสดงออกอย่างอ่อนในกลุ่มปกติ และพื้นที่รอบนอกรอบพอร์ทัลและเส้นเลือดในตับแสดงสีเหลืองละเอียดจำนวนเล็กน้อยแทนที่จะเป็นเส้นใยต่อเนื่อง (รูปที่ 5a) ในกลุ่มแบบจำลอง เส้นใยคอลลาเจนมีสายที่กว้างและหนา ซึ่งบ่งบอกถึงการแสดงออกที่แข็งแกร่ง ซึ่งส่วนใหญ่อยู่ในพอร์ทัลและบริเวณเนื้อเยื่อที่เป็นเส้นใย (รูปที่ 5b) เส้นใยคอลลาเจนของ BJRJ (600 มก./กก.) และกลุ่มขนาดยาที่แตกต่างกันของ CPhG (125, 250 และ 500 มก./กก.) มีลักษณะเป็นเส้นใยและกระจายไปรอบๆ เส้นเลือดส่วนกลางและบริเวณพอร์ทัล เมื่อเทียบกับกลุ่มโมเดล เส้นใยคอลลาเจนลดลงอย่างมีนัยสำคัญ การย้อมสีซีดและบาง และการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีเป็นไปในเชิงบวกเล็กน้อย (รูปที่ 5c–f) ผลลัพธ์กึ่งเชิงปริมาณเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าเซลล์ที่แสดงออกในเชิงบวกในกลุ่มขนาดยาที่เป็นบวกและแตกต่างกัน [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PCol III=0.010 และ P Col III=0.037, ตามลำดับ] แตกต่างจากในกลุ่มโมเดล

ทีจีเอฟ- 1

มีการแสดงออกเพียงเล็กน้อยของ TGIF{{0}} ในเซลล์ตับของหนูปกติ การแสดงออกถูกจำกัดไว้ที่เซลล์คั่นระหว่างหน้าจำนวนน้อย (รูปที่ 6a) ในกลุ่มแบบจำลอง การแสดงออกของ TGF- 1 ถูกกระจายอย่างกว้างขวางในพื้นที่พอร์ทัล, ช่องว่างที่มีเส้นใย, เซลล์ตับ stellate, เซลล์อักเสบ, ผนังไซน์และไซโทพลาสซึม พื้นที่พอร์ทัลเฉพาะแสดงการแสดงออกในเชิงบวกอย่างมากด้วยการย้อมสีน้ำตาลอมเหลือง (รูปที่ 6b) มีการแสดงออกในปริมาณเล็กน้อยในบริเวณพอร์ทัลและผนังกั้นที่มีเส้นใยของ BJRJ (600 มก./กก.) และกลุ่มขนาดยาที่แตกต่างกันของ CPhG (125, 250 และ 500 มก./กก.) ขอบเขตของการย้อมสีในเชิงบวกในกลุ่มเหล่านี้ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มแบบจำลอง การย้อมสีในเซลล์คั่นระหว่างหน้าในผนังกั้นเส้นใยและไซโตพลาสซึมของเซลล์อักเสบลดลง (รูปที่ 6c–f ) ผลกึ่งเชิงปริมาณเปิดเผยว่า BJRJ และกลุ่มขนาดยาที่แตกต่างกันของ CPhG [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0.001,="" p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0" .004="" ตามลำดับ]="" มีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มแบบจำลอง="" ดังที่ได้กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ในบทความ="" tgf-="" 1="">

พังผืดกระตุ้นการผลิตเมทริกซ์นอกเซลล์ [19]. เราแสดงให้เห็นว่าระดับของ TGF- 1 เพิ่มขึ้นในกลุ่มแบบจำลองในลักษณะที่สอดคล้องกับความรุนแรงของการเกิดพังผืดในตับ ระดับการแสดงออกของ TGF- 1 ในตับสอดคล้องกับระดับ TGF- 1 ในซีรัม สิ่งนี้บ่งชี้ว่า CPhG สามารถลดการเกิดพังผืดในตับได้อย่างมีนัยสำคัญเนื่องจากการแสดงออกของ TGF- 1 โดยการมีส่วนร่วมในการสังเคราะห์และการเสื่อมสภาพของ ECM การแสดงออกของคอลลาเจนชนิดที่ 1 คอลลาเจนชนิดที่ III และ TGF- 1 สามารถตรวจพบกระบวนการทางพยาธิวิทยาของการเกิดพังผืดในตับได้ ระดับการแสดงออกในกลุ่มบำบัดลดลงอย่างมีนัยสำคัญและแสดงให้เห็นว่า CPhG สามารถปรับปรุงการทำงานของคอลลาเจนเนส รักษาสมดุลแบบไดนามิกของการสังเคราะห์และการสลายตัวของ ECM ของตับ จึงชะลอและป้องกันการก่อตัวของพังผืดในตับ