ส่วนที่ 1: ผลของสารสกัดน้ำ Cistanche Tubulosa ต่อจุลินทรีย์ในลำไส้ของหนูที่มีความผิดปกติของลำไส้

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

ความผิดปกติของจุลินทรีย์ในลำไส้มีความเกี่ยวข้องกับโรคต่างๆ *สารสกัดน้ำจากซิสแทนเช่ ทูบูโลซ่า (CT)มีรายงานว่าเป็นสูตรสมุนไพรจีนโบราณที่มีบทบาทในปกป้องลำไส้ของมนุษย์. อย่างไรก็ตาม ไม่ค่อยมีใครทราบเกี่ยวกับผลกระทบต่อจุลินทรีย์ในลำไส้ * การศึกษาในปัจจุบันได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบว่าสารสกัดจากน้ำ CT สามารถปรับ microbiome ในลำไส้ในหนูที่มีความผิดปกติของลำไส้ได้หรือไม่ เราพบว่าผู้เสียหายสัณฐานวิทยาของลำไส้ที่เป็นผลจากการรักษาด้วยเซฟซิซิมสามารถช่วยชีวิตได้โดยใช้สารสกัดจากน้ำ CT * การเปรียบเทียบความหลากหลายของจุลินทรีย์ระหว่างหนูทดลองที่ได้รับสารสกัดจาก CT และหนูควบคุมยังระบุด้วยว่าความผิดปกติในชุมชนไมโครไบโอมของกลุ่มแบบจำลองสามารถฟื้นฟูได้ด้วยการบำบัดด้วยสารสกัดที่เป็นน้ำที่มีความเข้มข้นสูงและปานกลาง การรักษาด้วยเซฟิซิมทำให้แบคทีเรียกรดแลคติกลดลงอย่างมีนัยสำคัญ อย่างไรก็ตามการเสริมสารสกัดจากน้ำ CT ช่วยฟื้นฟูการเจริญเติบโตของแบคทีเรียกรดแลคติกเหล่านี้ นอกจากนี้ สารสกัดจากน้ำ CT ยังสามารถลดการเปลี่ยนแปลงอย่างมากในวิถีการเผาผลาญของไมโครไบโอมในลำไส้ที่เกิดจากเซฟซิซิม *ผลการวิจัยเหล่านี้ให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับผลประโยชน์ของสารสกัดจากน้ำ CT ที่มีต่อจุลินทรีย์ในลำไส้ และยังเป็นข้อมูลอ้างอิงที่สำคัญสำหรับการพัฒนายาที่เกี่ยวข้องในอนาคต

Cistanche เพื่อการผ่อนคลายลำไส้ โปรดคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

บทนำ

ได้แสดงให้เห็นว่าซีDeserticola พอลิแซ็กคาไรด์กระตุ้นการสร้างเม็ดสีในเมลาโนไซต์, ลดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน[15], บรรเทาความผิดปกติของความรู้ความเข้าใจโดยควบคุมสารต้านอนุมูลอิสระและกระบวนการต้านการอักเสบในหนูแรท [16], ปกป้องเซลล์ PC12 จากการบาดเจ็บที่เกิดจาก OGD/RP [17], เพิ่มการดูดซึมอิไคนาโคไซด์ในร่างกาย และส่งผลต่อไมโครไบโอตาในลำไส้ [ 18]. โปรไบโอติกเป็นจุลินทรีย์ที่ไม่ก่อให้เกิดโรคที่มีชีวิตซึ่งมีประโยชน์ต่อสุขภาพและให้ความสมดุลของจุลินทรีย์ในทางเดินอาหารเมื่อให้ในปริมาณที่เพียงพอ [19] *ey สามารถเพิ่มการตอบสนองของภูมิคุ้มกันของเซลล์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงซึ่งมีลักษณะโดยการกระตุ้นของมาโครฟาจ เซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติ (NK) และ T ลิมโฟไซต์ที่เป็นพิษต่อเซลล์ที่จำเพาะต่อแอนติเจน และการปล่อยไซโตไคน์ต่างๆ ในลักษณะจำเพาะต่อสายพันธุ์และขึ้นกับขนาดยา [20] สายพันธุ์โปรไบโอติกปรับปรุงคุณสมบัติของเยื่อบุผิวในลำไส้ผ่านการมอดูเลต TJ และได้แสดงให้เห็นสายพันธุ์โปรไบโอติกเฉพาะเพื่อควบคุมการแสดงออกของเมือก ซึ่งส่งผลต่อคุณสมบัติของชั้นเมือกและควบคุมโดยอ้อมต่อระบบภูมิคุ้มกันของลำไส้ [21] สายพันธุ์ของแบคทีเรียกรดแลคติก (LAB) และ Bifidobacterium เป็นโปรไบโอติกหลักที่ใช้กันในหลายสาขา [22-26] *ประโยชน์ต่อสุขภาพของพวกมันมีมากมาย โดยความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระเป็นปัจจัยสำคัญในการทำงานที่เกี่ยวข้องกับสุขภาพ[27] โปรไบโอติกสามารถคีเลตไอออนของโลหะเพื่อป้องกันไม่ให้เกิดปฏิกิริยาออกซิเดชัน [28, 29]; พวกเขายังสามารถเพิ่มการแสดงออกของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ [30, 31] ผลิตสารต่างๆที่มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ [32, 33] เป็นสื่อกลางในการส่งสัญญาณของสารต้านอนุมูลอิสระ [34–36] และควบคุมเอนไซม์ที่ผลิตออกซิเจนปฏิกิริยา (ROS) และการตอบสนองของลำไส้ จุลินทรีย์ต่อความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน[37] การศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้แสดงให้เห็นว่าพอลิแซ็กคาไรด์ของซีดีสามารถกระตุ้นการเจริญเติบโตของแบคทีเรียกรดแลคติกบางชนิด ซึ่งอาจเป็นประโยชน์ต่อสุขภาพของมนุษย์ [38] อย่างไรก็ตาม เนื้อหาของพอลิแซ็กคาไรด์ในซีดีแตกต่างจากใน CT [7, 39] และความแตกต่างนี้อาจนำไปสู่ความแตกต่างในจุลินทรีย์ในลำไส้ นอกจากนี้ แม้ว่า CD พอลิแซ็กคาไรด์สามารถลดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันได้โดยการกระตุ้นวิถี NRF2/HO-1 [15] แต่ผลของโพลีแซ็กคาไรด์เดี่ยวอาจแตกต่างจากผลโดยรวมขององค์ประกอบหลายตัวใน CT *เรา จำเป็นต้องกำหนดผลกระทบของสารสกัด CT ในน้ำอย่างแม่นยำต่อจุลินทรีย์ในลำไส้ นอกจากนี้ พัดลมยังสามารถต้านทานความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน [40] และระงับการตอบสนองต่อการอักเสบที่เกิดจากไลโพลีแซคชาโดยการเปิดใช้งานเส้นทาง Keap1/Nrf2/HO-1 [41] *ก่อนหน้านั้น การพิจารณาผลของสารสกัด CT ในน้ำนั้นมีค่ามาก นอกจากนี้ ผลขององค์ประกอบบางอย่างของสารสกัดซีดีในน้ำต่อความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและพืชในลำไส้ ชี้ให้เห็นว่าความต้านทานต่อความเครียดออกซิเดชันอาจสัมพันธ์กับการเปลี่ยนแปลงของฟลอราในลำไส้ เพื่อเติมเต็มช่องว่างในความรู้ในหัวข้อที่กล่าวถึงข้างต้น เราได้ตรวจสอบผลของสารสกัด CTaqueous ต่อจุลินทรีย์ในลำไส้ของหนูเมาส์ที่มีความผิดปกติของลำไส้เล็ก *ผลลัพธ์เหล่านี้จะให้ข้อมูลที่มีค่าเกี่ยวกับกลไกที่เป็นไปได้ ซึ่งจะเปลี่ยนพืชในลำไส้และให้ความต้านทานของลำไส้ต่อความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน

2. วัสดุและวิธีการ

ให้ทุกวันที่ 12:00 ชั่วโมง และสารอื่นๆ ถูกบริหารให้ทุกวันที่ 15:00 ชั่วโมง ในระหว่างการทดลอง กลุ่ม C, D, E และ F ถูกเก็บไว้ในสถานะแบบจำลองของความผิดปกติของลำไส้ *อุจจาระ e ถูกเก็บรวบรวมทุก ๆ เจ็ดวันบนโต๊ะที่ผ่าตัดได้ปลอดเชื้อและเก็บไว้ที่ -20 องศา .2.4 การสังเกตทางจุลพยาธิวิทยาของหนูโคลอน ในตอนท้ายของการทดลอง หนูถูกฆ่าโดยปากมดลูกเคลื่อน และเนื้อหาในลำไส้ของพวกมันถูกรวบรวมบนโต๊ะที่ผ่าตัดได้ปลอดเชื้อและเก็บไว้ที่ −80 องศา ; ในเวลาเดียวกัน ตัวอย่างเนื้อเยื่อลำไส้ถูกตรึงในฟอร์มาลินที่เป็นกลาง 10 เปอร์เซ็นต์*en ตัวอย่างถูกทำให้แห้งโดยใช้ความเข้มข้นของเกรเดียนท์ของเอธานอล ถูกไฮยาลินโดยใช้ไซลีน ฝังในพาราฟิน แบ่งส่วน และย้อมด้วยฮีมาทอกซิลิน-อีโอซิน สังเกตการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาในเยื่อบุลำไส้และเปรียบเทียบโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง วัดความยาว Villus และความลึกของ crypt ในโคลอน และคำนวณอัตราส่วนของความยาว villus ต่อความลึกของ crypt (ค่า V/C) (51).2.5 การสกัดดีเอ็นเอและการสร้างห้องสมุด DNA ถูกสกัดจากอุจจาระโดยใช้ EZNA ®Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ตรวจสอบคุณภาพดีเอ็นเอโดยใช้ฟลูออโรมิเตอร์ (QuantiFluor™–ST, Promega Corporation, USA) ไพรเมอร์ที่จับคู่ในบริเวณ V3-V4 ของ 16s rDNA ได้รับการออกแบบมาเพื่อขยายขอบเขตและผลิตชิ้นส่วนดีเอ็นเอ 466 bp *ไพรเมอร์ไปข้างหน้าคือ 341F (-5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3-) และไพรเมอร์แบบย้อนกลับคือ 806R (-5-GGACTACHVGGGGTATCTAAT-3-) ปริมาตร PCR แต่ละรายการคือ 25 ไมโครลิตร ประกอบด้วย 2.5 ไมโครลิตรของ 10 × PCR buffffer, 2 ไมโครลิตรของ dNTPs, 1 ไมโครลิตรของไพรเมอร์แต่ละตัว และ 20–30 ng ของแม่แบบดีเอ็นเอ *en อะแด็ปเตอร์ที่ทำดัชนีถูกต่อเข้ากับส่วนท้ายของแอมพลิคอนเพื่อสร้างไลบรารีลำดับ *ห้องสมุดได้รับการตรวจสอบโดยใช้ฟลูออโรมิเตอร์ QuantiFluor™ และหาปริมาณเป็น 10 nmol.2.6 ลำดับยีน rRNA 16 วินาทีและการวิเคราะห์ชุมชนจุลินทรีย์ *e แพลตฟอร์ม Illumina (Illumina MiSeq) ถูกใช้เพื่อรับข้อมูลปลายทางที่จับคู่ 2 × 250 bp หน่วยอนุกรมวิธานในการปฏิบัติงาน (OTU) ได้มาโดยใช้ซอฟต์แวร์ Uparse ผ่านการทำคลัสเตอร์มาตรฐานที่มีความคล้ายคลึงกัน 97 เปอร์เซ็นต์ *อัลกอริธึมการกำหนดแบบเบย์ที่ไร้เดียงสาของตัวแยกประเภท RDP ถูกใช้เพื่อจัดตำแหน่ง OTU กับฐานข้อมูล Greengene รีลีส 13.5 และดำเนินการคำอธิบายประกอบของสปีชีส์ *ความหลากหลายของอัลฟาของจุลินทรีย์ในลำไส้คำนวณโดยใช้ดัชนีแชนนอนและซิมป์สัน และความแตกต่างระหว่างกลุ่มถูกวิเคราะห์โดยการวิเคราะห์การเลือกปฏิบัติเชิงเส้นขนาดผล (LEfSe) *ความหลากหลาย e เบต้าถูกวิเคราะห์โดยการวิเคราะห์พิกัดหลัก (PCoA) ของความแตกต่างของ Brady–Curtis PICRUSt2 ใช้เพื่อประเมินความสามารถในการเผาผลาญของจุลินทรีย์ในลำไส้เล็ก [42].2.7 การวิเคราะห์ข้อมูลทางสถิติ SPSS 20 ใช้สำหรับ ANOVA ทางเดียว และข้อมูลการทดลองแสดงเป็น X ± S; X หมายถึงค่าเฉลี่ย และ S หมายถึงส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน

Cistanche สำหรับการปรับปรุงภูมิคุ้มกัน

3. ผลลัพธ์

3.1. 8 ผลของสารสกัดน้ำ CT ต่อสัณฐานวิทยาของลำไส้ใหญ่*e สารประกอบที่เป็นตัวแทน (อิชินาโคไซด์และอะซีโตไนด์) และความเข้มข้นของสารสกัด CT ของพวกมันถูกตรวจสอบโดย HPLC (รูปที่ S1) เพื่อตรวจสอบผลของสารสกัดที่เป็นน้ำในลำไส้ เราได้ตรวจสอบความยาวของวิลลี่ลำไส้ใหญ่และความลึกของช่องหลังการบำบัดด้วยสารสกัดที่เป็นน้ำ * e colon villi ในกลุ่มปกติและกลุ่มที่ได้รับยาในขนาดสูง (A, B และ D) จะยาวกว่าและเหมือนนิ้ว ขณะที่ villi ลำไส้ใหญ่ในกลุ่มตัวอย่างและกลุ่มที่ได้รับยาในขนาดต่ำ (C และ F) จะสั้น และส่วนปลายของ โคลอนวิลลี่แตก (รูปที่ 1) ดังนั้น สารสกัดจากน้ำ CT ในขนาดสูงจึงเพิ่มความยาวของลำไส้ใหญ่ได้อย่างมีนัยสำคัญ และลดความลึกของช่องในหนูที่มีความผิดปกติของลำไส้เมื่อเปรียบเทียบกับหนูในกลุ่มแบบจำลอง (P < 0.01)="" ในทางตรงกันข้าม="" ความลึกของช่องไม่แตกต่างกันระหว่างกลุ่มที่ได้รับยาขนาดสูงกับกลุ่มปกติ="" (p=""> 0.05) (ตารางที่ S1) *ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าปริมาณที่สูงของสารสกัด CT ในน้ำสามารถปรับปรุงลักษณะทางสัณฐานวิทยาภายในลำไส้ใหญ่ของหนูที่มีความผิดปกติของลำไส้ได้3.2 8e ผลของสารสกัดน้ำ CT ต่อความหลากหลายของจุลินทรีย์ในลำไส้ เราทำการจัดลำดับยีน rRNA 16s เพื่อตรวจสอบสาเหตุที่เป็นไปได้ของการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาภายในลำไส้ใหญ่ และตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของจุลินทรีย์ในลำไส้หลังการรักษาด้วยสารสกัดจากน้ำ CT แท็กที่มีประสิทธิภาพเฉลี่ย 100,553 แท็ก ตั้งแต่ 77,734 ถึง 125,144 ได้รับจากข้อมูลดิบ (ตาราง S2) *stags ถูกจัดกลุ่มเป็น 4932 OTU (ตาราง S3) จากนั้นเราวิเคราะห์ความหลากหลายของจุลินทรีย์ในลำไส้โดยอ้างอิงจากเธเซอุส *ดัชนีแชนนอนและซิมป์สันไม่พบความแตกต่างระหว่างกลุ่ม A (ปกติที่มีสารสกัดน้ำ CT) และกลุ่ม B (ปกติที่ไม่มีสารสกัดน้ำ CT) (รูปที่ 2(a)) *มีการบ่งชี้ว่าในหนูที่ไม่ได้รับการรักษาด้วยเซฟิซิม สารสกัดน้ำ CT อาจไม่มีผลดีหรืออันตรายเพิ่มเติมต่อ -ความหลากหลายของจุลินทรีย์ในลำไส้ อย่างไรก็ตาม -diversity ในกลุ่มตัวอย่าง (C) มีแนวโน้มลดลงเมื่อเทียบกับในกลุ่มปกติ *หนูทดลองที่ได้รับการบำบัดด้วยสารสกัดที่เป็นน้ำ CT ในขนาดสูงและปานกลางแสดงสัญญาณของการฟื้นตัวของความหลากหลาย ในขณะที่ปรากฏการณ์ดังกล่าวไม่ได้ถูกสังเกตพบในหนูที่ได้รับการบำบัดด้วยสารสกัดจากน้ำ CT ในขนาดต่ำ (รูปที่ 2 (a)) ในขณะเดียวกัน PCoA เปิดเผยว่ากลุ่มปกติ (A และ B) และกลุ่มความผิดปกติของลำไส้ที่ได้รับ CTaqueous ในปริมาณสูง (D) และระดับกลาง (E) มีแนวโน้มที่จะมีระยะห่างระหว่างตัวอย่างสั้นกว่าในกลุ่มแบบจำลองและในระดับต่ำ -dose กลุ่มอาหารเสริมสารสกัด CTaqueous (F) (รูปที่ 2 (b)) *ผลลัพธ์ระบุว่าสารสกัดจากน้ำ CT สามารถช่วยปรับปรุงความหลากหลายของจุลินทรีย์ในลำไส้ในหนูที่มีความผิดปกติของลำไส้

3.3. การเปลี่ยนแปลงองค์ประกอบของ Gut Microbiota ที่บำบัดด้วยสารสกัดจาก CT Aqueous *โปรไฟล์องค์ประกอบจุลินทรีย์ e ถูกเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มต่างๆ ในระดับไฟลัม ความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ของ Proteobacteria ในกลุ่มแบบจำลองนั้นสูงกว่าในกลุ่มอื่นๆ

รูปที่ 1: *e ผลของสารสกัด Cistanche tubulosa (CT) ที่เป็นน้ำต่อลักษณะทางสัณฐานวิทยาของลำไส้ใหญ่: A, กลุ่มปกติที่มีสารสกัด Cistanche tubulosa (CT) ในน้ำขนาดปานกลาง; B, กลุ่มปกติ; C, กลุ่มรุ่น; D, กลุ่มแบบจำลองที่มีสารสกัดน้ำ CT ปริมาณสูงเพิ่ม; E, กลุ่มแบบจำลองที่มีสารสกัดน้ำ CT ปริมาณปานกลางเพิ่ม; F ซึ่งเป็นกลุ่มแบบจำลองที่มีสารสกัดน้ำ CT ขนาดต่ำเพิ่ม (ก) กรุ๊ปเอ (b) กลุ่ม B. (c) กลุ่ม C. (d) กลุ่ม D. (e) กลุ่ม E. (f ) กลุ่ม F.

(รูปที่ 3(ก)). * e ที่เพิ่มขึ้นของ Proteobacteria ชี้ให้เห็นว่า microbiome ของหนูทดลองมีการเปลี่ยนแปลงโดย cefixime และสารสกัด CT ในน้ำอาจเป็นประโยชน์ต่อ microbiota ในลำไส้เนื่องจากความชุกของ Proteobacteria ที่เพิ่มขึ้นเป็นจุดศูนย์กลางของลำไส้แปรปรวน [43–45] นอกจากนี้ ในระดับสกุล ความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ของแลคโตบาซิลลัสในกลุ่มแบบจำลองลดลงเมื่อเทียบกับในกลุ่มปกติและปริมาณสูง อย่างไรก็ตาม เพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับในกลุ่มที่ได้รับยาขนาดกลางและขนาดต่ำ (รูปที่ 3(b)) *ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าสารสกัด CTaqueous ปริมาณสูงอาจส่งเสริมการเจริญเติบโตของแบคทีเรียบางชนิดจากสกุลแลคโตบาซิลลัส จุลินทรีย์ที่แตกต่างกันระหว่างกลุ่มที่ศึกษาถูกกำหนดหาเพิ่มเติมตามการวิเคราะห์ LEfSe *การวิเคราะห์พบว่า หลังการรักษาด้วยเซฟิซิซิม ปริมาณสัมพัทธ์ของทูริซิแบคเตอร์ อัลฟาโปรตีโอแบคทีเรีย แอซิโดแบคทีเรีย เบต้าโปรตีโอแบคทีเรีย และคลอโรเฟล็กซิเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ขณะที่กลุ่มแลคโตบาซิลลัส ยูแบคทีเรียม_โนดาตัม_จำนวนสัมพัทธ์เพิ่มขึ้น ซูโดโน หัวใจและกลุ่ม Christensenellaceae_R-7_ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มปกติ (รูปที่ 4(a)) ที่น่าสนใจคือ เมื่อเสริมกลุ่มแบบจำลองด้วยสารสกัด CT ในปริมาณสูง ความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ของ Muribaculaceae แลคโตบาซิลลัส Kin eosporiaceae กลุ่ม Eubacterium no datum และ Pedobacter เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มแบบจำลอง ในขณะเดียวกัน ความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ของ Rhodobacter, Ruminococcaceae UCG_013, Roseburia, Ruminiclostri dium_9 และ Candidatus Stoquefifichus ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มแบบจำลอง (รูปที่ 4(b))

รูปที่ 2: การวิเคราะห์ความหลากหลายของจุลินทรีย์ในลำไส้ของอุจจาระของหนู (ก) -ความหลากหลายของชุมชนแบคทีเรียที่วัดโดยดัชนีแชนนอน (A) และดัชนีซิมป์สัน (B) (b) แผนภาพการวิเคราะห์พิกัดหลัก (PCoA) ที่แสดงภาพข้อมูลโดยอิงจากความแตกต่างของ Bray–Curtis.A เพิ่มกลุ่มปกติที่มีสารสกัด Cistanche tubulosa (CT) ในน้ำขนาดปานกลาง B, กลุ่มปกติ; C, กลุ่มรุ่น; D, กลุ่มแบบจำลองที่มีสารสกัดน้ำ CT ปริมาณสูงเพิ่ม; E, กลุ่มแบบจำลองที่มีสารสกัดน้ำ CT ปริมาณปานกลางเพิ่ม; F, กลุ่มแบบจำลองที่มีสารสกัดน้ำ CT ปริมาณต่ำเพิ่ม