ส่วนที่ 1: Echinacoside ป้องกัน MPP plus - การกระตุ้นการตายของเซลล์ประสาทผ่าน ROS/ATF3/CHOP Pathway Regulation

ชิง Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • ยู่ไป่1

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อส่วน2

สายพันธุ์ (ROS) ยังมีส่วนช่วยในการพัฒนา [3] ลักษณะเฉพาะที่คล้ายกับ PD สามารถเหนี่ยวนำได้โดยสารพิษจากสิ่งแวดล้อมหลายชนิด ซึ่งรวมถึง 1-เมทิล-4-ฟีนิล- 1,2,3,6-เตตระไฮโดรไพริดีน (MPTP), ไซยาไนด์, คาร์บอนไดซัลไฟด์, และโทลูอีน MPTP ถูกใช้อย่างกว้างขวางเพื่อกระตุ้นแบบจำลองสัตว์ของ PD และเมตาโบไลต์ที่ออกฤทธิ์ของมัน 1-เมทิล-4- ฟีนิลไพริดิเนียมไอออน (MPP?) ถูกใช้ในแบบจำลองเซลล์ของ PD [4, 5] สพป.? คัดเลือกยับยั้งห่วงโซ่การขนส่งอิเล็กตรอนและส่งผลให้เกิดการผลิต ROS ที่มากเกินไป ซึ่งทำให้เกิดการตายของเซลล์ประสาทและกลุ่มอาการที่คล้ายกับ PD [6] ผลการศึกษาล่าสุดพบว่า MPP? ชักนำวิถีทางที่หลากหลายในแบบจำลอง PD ในหลอดทดลอง ซึ่งรวมถึงการเพิ่มฟอสโฟรีเลชั่น GSK3B (pY206) และการสะสมของเอ-ไซนิวคลีอิน [5], การปรับเพิ่มของ heme oxygenase-1/นิโคตินาไมด์ อะดีนีน ไดนิวคลีโอไทด์ ฟอสเฟต ออกซิเดส/แกน ROS [7, 8] การแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของปัจจัยการถอดรหัสแบบแอคทีฟ 3 (ATF3) และการยับยั้งการเจริญเติบโตผ่านทาง DNA ที่ก่อให้เกิดความเสียหาย 153 (GADD153)/C/EBP-homologous protein (CHOP) [9] ในการรักษาทางคลินิก การปราบปรามผลิตภัณฑ์ ROS เป็นหนึ่งในกลยุทธ์ที่สำคัญที่สุดในการอยู่รอดของเซลล์ประสาทและการรักษา PD [1]

เอ็กไคนาโคไซด์(ECH, รูปที่ 1A), สารธรรมชาติphenylethanoidพบในพืชสมุนไพรหลายชนิด เป็นส่วนประกอบหลักของphenylethanoidไกลโคไซด์ที่แยกได้จากสมุนไพรจีนโบราณCistancheซัลซ่า [10]. ที่น่าสนใจคือ จากการศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้พบว่าECHมีผลในการป้องกันในรูปแบบเมาส์ของ PD ที่เกิดจาก MPTP [10, 11]ECHยังลดทอนการตายของเซลล์นิวโรบลาสโตมาที่เกิดจากปัจจัยการตายของเนื้องอก-a หรือ 6-ไฮดรอกซีโดพามีน ในหลอดทดลอง [12, 13] อย่างไรก็ตาม กลไกโดยที่ECHส่งเสริมการอยู่รอดของเซลล์ประสาทในแบบจำลองเซลล์ PD ที่เกิดจาก MPP?

เราแสดงให้เห็นว่าECHผลิตภัณฑ์ ROS ที่เกิดจาก MPP ลดลงอย่างเห็นได้ชัด? ในเซลล์ SH-SY5YECHยังยับยั้งการแสดงออกของ ATF3, CHOP และ a-synuclein ที่เหนี่ยวนำโดย MPP? รวมถึงการยับยั้งการกระตุ้นของแคสเปสโปรตีนโปรอะพอพโทซิส-3และโพลี (ADP-ไรโบส) โพลีเมอเรส (PARP)

Cistancheเอ็กไคนาโคไซด์มีสารป้องกันประสาทเอฟเฟกต์

วัสดุและวิธีการ

รีเอเจนต์

สื่อจำเป็นขั้นต่ำของ Dulbecco (DMEM), เซรั่มโคในทารกในครรภ์, ทริปซิน 0.25 เปอร์เซ็นต์ trypsin, เพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน 1 เปอร์เซ็นต์ และรีเอเจนต์ TRIzol มาจาก Life Technologies (Grand Island, NY) สีย้อมโครมาติน บิสเบนซิไมด์ (Hoechst 33342), โพลี-แอล-ไลซีน, MPP? ไอโอไดด์และ MPTP มาจาก Sigma (St. Louis, MO) ชุดทดสอบ lipid peroxidation malondialdehyde (MDA) และ dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) มาจาก Beyotime Biotech (ไห่เหมิน ประเทศจีน) ECH ของความบริสุทธิ์ C98 เปอร์เซ็นต์มาจาก Push Biotechnology (เฉิงตู ประเทศจีน)

สัตว์และการรักษา

การบำรุงรักษาและการรักษาสัตว์เป็นไปตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [14] เราใช้หนู C57BL/6 เพศผู้ (Shanghai Laboratory Animal Co., Shanghai, China) ซึ่งมีน้ำหนัก 24–26 กรัมเมื่ออายุ 10 สัปดาห์ สัตว์เหล่านี้ได้รับการบำรุงรักษาภายใต้สภาวะมาตรฐาน (12:12 ชั่วโมงแสง: รอบมืด, 21 ± 2C และความชื้นสัมพัทธ์ 40 เปอร์เซ็นต์ ) และอนุญาตให้เข้าถึงอาหารและน้ำได้ตามต้องการ ขั้นตอนทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมสัตว์ของโรงพยาบาล Zhongshan มหาวิทยาลัย Fudan และดำเนินการตาม National Institutes of Health Guide for the Care and Use of

สัตว์ทดลอง.

หนูเมาส์ถูกสุ่มแบ่งออกเป็นสี่กลุ่ม (หนู 10 ตัว/กลุ่ม): กลุ่ม A, กลุ่มควบคุมกระสายยา, ให้ปริมาตรที่เท่ากัน (500 lL) ของน้ำเกลือปกติ (NS); กลุ่ม B, กลุ่มควบคุม ECH, ให้ ECH 20 มก./กก.; กลุ่ม C, กลุ่มโมเดล MPTP, บำบัดล่วงหน้าด้วยปริมาตรที่เท่ากันของ NS; และกลุ่ม D, กลุ่มที่บำบัดด้วย ECH, ก่อนบำบัดด้วย 20 มก./กก.ECH. ECHละลายใน NS และนำส่งโดยการบริหารในกระเพาะอาหารทุก 24 ชั่วโมงเป็นเวลา 15 วันติดต่อกัน แบบจำลอง PD ของหนูเมาส์สำหรับกลุ่ม C และ D ถูกสร้างขึ้นโดยการฉีด MPTP 30 มก./กก. ในช่องท้องติดต่อกัน 5 ครั้ง ทุกๆ 24 ชั่วโมงตั้งแต่วันที่ 11 ถึงวันที่ 15 หนูเมาส์ถูกฆ่าโดยการเคลื่อนตัวของปากมดลูกหรือการแพร่กระจายของเลือดที่ถูกทำให้เสพติดโดยคลอราลไฮเดรต 10 เปอร์เซ็นต์ (3.6 มก./ กก.) ในช่องท้อง 24 ชั่วโมงหลังการรักษาขั้นสุดท้าย

กระบวนการกระจายและเนื้อเยื่อเป็นไปตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [14] หลังจากการให้เลือดไปเลี้ยงหัวใจแล้ว ตัวอย่างสมองถูกรวบรวมและตรึงในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ร้อยละ 4 เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ฝังอยู่ในพาราฟิน และส่วนโคโรนัลที่ล้อมรอบ SNc ทั้งหมด (พิกัดสเตริโอแทกซี anteroposterior -3.64 ถึง -2.92 มม. เทียบกับ bregma) ถูกตัดที่ 5 ลูเมน

สัตว์อีก 5 ตัวจากแต่ละกลุ่มถูกฆ่าโดยปากมดลูกเคลื่อน และสมองส่วนกลางหน้าท้องถูกสลายอย่างรวดเร็วในบัฟเฟอร์การแยกสลาย SDS 1 เปอร์เซ็นต์บนน้ำแข็ง ระดับโปรตีน CHOP และ ATF3 ในไลเสตถูกวิเคราะห์โดยเวสเทิร์นบล็อตติง

kidney injury and disease

Cistancheเอ็กไคนาโคไซด์มีผลทำให้กระปรี้กระเปร่าไต

วัฒนธรรมของ Rat Ventral Midbrain (VM)

เซลล์ประสาทโดปามีน

หนู Wistar ตั้งท้องถูกซื้อมาจาก Shanghai Laboratory Animal Co., (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) เซลล์ประสาท DA ใน VM ถูกแยกออกในวันที่ 14 ของตัวอ่อน VM ถูกผ่าและประมวลผลเพื่อสร้างวัฒนธรรมเซลล์ประสาท VM DA หลักตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [15, 16] โดยสรุป ชิ้นส่วนเนื้อเยื่อถูกรวบรวมในสารละลายเกลือที่สมดุลของแฮงค์ที่เย็นจัด (HBSS) และหมุนเหวี่ยงที่ 1000 รอบต่อนาทีที่ 4ซ เป็นเวลา 5 นาที เม็ดเนื้อเยื่อถูกบ่มใน 750 lL ของ trypsin–HBSS 0.1 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 15 นาทีที่ 37C โดยมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์ เซรั่มน่องของทารกในครรภ์ (FCS; 750 lL) ถูกใช้เพื่อหยุดการทำงานของทริปซินและเนื้อเยื่อถูกแยกออกจากกันโดยการบดให้ละเอียด

โดยใช้ปิเปตปาสเตอร์ที่ผ่านการฆ่าเชื้อ สารแขวนลอยของเซลล์ถูกปั่นเหวี่ยงที่ 1,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 4 นาทีที่ 4ซ และแขวนตะกอนอีกครั้งในตัวกลางสร้างความแตกต่าง (ตัวกลาง/F12 ของ Eagle ดัดแปลงของ Dulbecco, 33 mmol/L D-glucose, 1 เปอร์เซ็นต์ L-glutamine และ 1 เปอร์เซ็นต์ FCS, เสริมด้วย 2 เปอร์เซ็นต์ ข27). เซลล์ถูกเพาะบนแผ่นเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 24-หลุมที่เคลือบด้วยพอลิ-ดี-ไลซีน (ซิกมา) ที่ 5 9 104 เซลล์/หลุมในตัวกลางสร้างความแตกต่าง 500 ลิตรที่ 37ซ ด้วยคาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 10 วันเพื่อพัฒนาไปเป็น

เซลล์ประสาท DA ที่โตเต็มที่ เซลล์ประสาท VM DA มีลักษณะเฉพาะด้วยอิมมูโนﬂออเรสเซนซ์ที่มีแอนติบอดีต้านบีทูบูลินไอโซไทป์ III และแอนติบอดีไทโรซีนไฮดรอกซีเลส (TH) (รูปที่ S1) เซลล์ได้รับการรักษาด้วย MPP 1 มิลลิโมล/ลิตร, 40 LG/ มิลลิลิตร ECH, การรวมกันของ MPP? และ ECH หรือ PBS เพียงอย่างเดียวในฐานะตัวควบคุม ความอยู่รอดของเซลล์ถูกวิเคราะห์ด้วยรีเอเจนต์ CCK-8 หลังการบำบัด 96 ชั่วโมง

และแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD (n {{0}}; **P \001 vs control, #P \ 0.05, ##P \0.01 vs MPP ? การรักษา). C ภาพขนาดเล็กของการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาที่เกิดจาก MPP? หรือ สพป.? และอีซีเอช a, การควบคุม PBS; b, 40 lg/mL ECH; c, MPP 1 มิลลิโมล/ลิตร?; d, MPP 1 มิลลิโมล/ลิตร? และ 10 lg/mL ECH; e, MPP 1 มิลลิโมล/ลิตร? และ 20 lg/mL ECH; f, 1 มิลลิโมล/ลิตร MPP? และ 40 lg/mL ECH (แท่งมาตราส่วน, 200 lm)

11-

Cistanche echinacoside มีฤทธิ์ยับยั้งการตายของเซลล์

การเพาะเลี้ยงเซลล์ SH-SY5Y

เซลล์ SH-SY5Y มาจาก Cell Bank of Shanghai Institute of Cell Biology (Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) และเพาะเลี้ยงใน DMEM ที่เสริมด้วยซีรัมวัวในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์, เพนิซิลลิน 100 U/mL และ 100 U/mL streptomycins เซลล์ถูกคงรักษาไว้ในตู้อบ 37C ที่ให้ความชื้น โดยจัดให้มี CO2 5 เปอร์เซ็นต์ สพป.? ละลายในน้ำปราศจากเชื้อและนำไปใช้ทันที ECH ถูกละลายใน PBS เพื่อสำรวจการแสดงออกของยีนและระดับโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ ROS เซลล์ถูกเพาะลงในจาน 6-หลุมและเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นเซลล์ถูกเลี้ยงด้วยอาหารสดที่มี MPP?, ECH, ส่วนผสมของ MPP? และ ECH หรือ PBS เพียงอย่างเดียวในฐานะตัวควบคุม หลังการรักษา 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกสลายด้วยบัฟเฟอร์การสลาย SDS 1 เปอร์เซ็นต์ (SDS 1 เปอร์เซ็นต์, EDTA 25 มิลลิโมล/ลิตร, ทริส–HCl 45 มิลลิโมล/ลิตร, pH 6.5) สำหรับการวิเคราะห์ western blot และแยก RNA ทั้งหมดโดยตรงด้วย น้ำยาไตรซอล

ในการวิเคราะห์การกระจาย ATF3 และ CHOP หลังการรักษา ใช้ชุดรีเอเจนต์การสกัดด้วยนิวเคลียร์และไซโตพลาสซึม (Thermo Fisher, Waltham, MA) เพื่อแยกไซโตพลาสซึมและเศษส่วนนิวเคลียร์ออกจากเซลล์ที่บำบัดด้วยยาและควบคุม

การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์

เซลล์ SH-SY5Y ถูกเพาะในจาน 96-หลุมและบ่มข้ามคืน เซลล์ถูกเลี้ยงทุก 24 ชั่วโมงด้วยอาหารสดที่สมบูรณ์ซึ่งมียาที่แตกต่างกันและคงสภาพไว้เป็นเวลา 3 วัน จากนั้นจึงประเมินความมีชีวิตโดยใช้ชุดตรวจนับเซลล์ CCK8 (โดจินโด ประเทศญี่ปุ่น) ข้อมูลถูกทำให้เป็นมาตรฐานเพื่อผลลัพธ์จากการควบคุม PBS และแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD เพื่อวิเคราะห์ความมีชีวิตในเซลล์ ATF3-การล้มลง SH-SY5Y (ATF3 shRNA) และเซลล์กลุ่มควบคุม (GFP shRNA) เซลล์ถูกเติมลงในเพลต 96-หลุมและเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 14–16 ชั่วโมง พลาสมิด ATF3 shRNA หรือ GFP shRNA พลาสมิดถูกทรานส์เฟกไปในเซลล์ SH-SY5Y โดยใช้ Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) เซลล์ถูกบำบัดด้วย MPP 1 มิลลิโมล/ลิตร? หรือปริมาตรที่เท่ากันของ PBS หลังจาก 24 ชั่วโมงของการทรานส์เฟกชัน จากนั้นจึงฟักตัวเป็นเวลา 3 วัน นับเลขเซลล์ทุกวัน ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD

shRNA Constructs และ Oligo Primers

pGV298-ATF3 shRNA (ATF3shRNA) และโครงสร้าง shRNA ควบคุม GFP มาจาก GeneChem Co. (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) ลำดับเป้าหมาย ATF3 คือ 50-GCAAAAGT G!CCGAAACAAGA-30 จากวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [17, 18] เพื่อตรวจหาการแสดงออกของยีนที่เหนี่ยวนำโดย MPP? ยีนที่เกี่ยวข้องกับความเครียด ROS และยีนที่เกี่ยวข้องกับ PD ถูกเลือกสำหรับ qRT-PCR และใช้ GAPDH เป็นกลุ่มควบคุม ไพรเมอร์ทั้งหมดถูกสังเคราะห์โดย Sangon Biotech Co. (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) และลำดับไพรเมอร์แสดงอยู่ในตารางที่ 1

PCR แบบเรียลไทม์

RNA ทั้งหมดถูกสกัดด้วยรีเอเจนต์ TRIzol ตามคำแนะนำของผู้ผลิต Reverse-transcription และ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (qRT-PCR) ถูกดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ปฏิกิริยาการถอดรหัสแบบย้อนกลับดำเนินการโดยใช้ชุดอุปกรณ์สังเคราะห์ cDNA ของ RevertAid First Strand (Thermo Scientific, Waltham, MA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ชุด SYB Premix Ex Taq II (TaKaRa, Dalian, China) ใช้สำหรับ qRT-PCR: ระบบปฏิกิริยา 20-lL ใช้กับ ABI (Life Technologies, Carlsbad, CA) พารามิเตอร์ PCR ประกอบด้วยขั้นตอนต่อไปนี้: 95C เป็นเวลา 3 นาที 1 รอบ; 95C เป็นเวลา 5 วินาที และ 60C เป็นเวลา 40 วินาที 40 รอบ ข้อมูลสุดท้ายไม่เป็น

ศีลธรรมเพื่อ GAPDH และนำเสนอเป็นอัตราส่วนต่อการควบคุม ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับการขยายเสียงแสดงไว้ในตารางที่ 1

ซับตะวันตก

การวิเคราะห์ Western blot ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [19] แอนติบอดีหลักคือ caspase ที่ต้านการแยกตัว 3 และ p53 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-GAPDH (Proteintech Group, Chicago, IL), anti- GADD153/CHOP (Wanlei Bio, Shenyang, China) และ anti- ATF3, anti-PARP, anti-PUMA และ anti-histone 3 (เทคโนโลยีชีวภาพของซานตาครูซ, ซานตาครูซ, แคลิฟอร์เนีย) แอนติบอดีทุติยภูมิที่ติดฉลากฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดสมาจากห้องปฏิบัติการวิจัยภูมิคุ้มกันของแจ็คสัน (Western Grove, PA) เมมเบรน PVDF มาจากเมอร์ค EMD (Billerica, MA) และซับสเตรต ECL มาจาก CWBio (ซูโจว ประเทศจีน) ระดับโปรตีนสัมพัทธ์ตามระดับสีเทาจากภาพได้รับการวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์ Tanon GIS (Tanon Biotech, Shanghai, China) และข้อมูลจะถูกนำเสนอเป็นอัตราส่วนของโปรตีนเป้าหมายต่อ GAPDH