ส่วนที่ 1: Cistanoside ของ Cistanche Herba Ameliorates ความเสียหายต่อการสืบพันธุ์ของเพศชายที่เกิดจาก Hypoxia ผ่านการปราบปรามความเครียดออกซิเดชัน

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, HeWang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1

เชิงนามธรรม:หลักฐานที่เพิ่มขึ้นแสดงให้เห็นว่าการขาดออกซิเจนเป็นสาเหตุของภาวะมีบุตรยากในผู้ชาย และการขาดออกซิเจนอาจเกี่ยวข้องกับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน (OS) Cistanoside (Cis) เป็นสารประกอบ phenylethanoid glycoside ที่สามารถสกัดได้จาก CistanchesHerba และมีหน้าที่ทางชีวภาพต่างๆ การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบผลการป้องกันของ Cis ต่อความเสียหายต่อการเจริญพันธุ์ที่เกิดจากการขาดออกซิเจนและสำรวจกลไกพื้นฐานที่เฉพาะเจาะจง แบบจำลองการทดลองเซลล์และสัตว์ขาดออกซิเจนถูกสร้างขึ้น และผลการป้องกันของชนิดย่อยต่างๆ ของ Cis ต่อระบบสืบพันธุ์เพศชายได้รับการประเมินทั้งในหลอดทดลองและในร่างกาย ผลการวิจัยพบว่าภาวะขาดออกซิเจนช่วยลดความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์ GC-1 ได้อย่างมีนัยสำคัญผ่านการหยุดการทำงานของวัฏจักรเซลล์และการกระตุ้นการตายของเซลล์ ซึ่งสัมพันธ์กับ OS ที่เพิ่มขึ้น นอกจากนี้ Cis ยังมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่งทั้งในหลอดทดลองและในร่างกาย ซึ่งช่วยฟื้นฟูการทำงานของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระได้อย่างมีนัยสำคัญ และปรับลดระดับของออกซิเจนปฏิกิริยา (ROS) ในขณะที่เพิ่มความมีชีวิตของเซลล์และลดการตายของเซลล์ ที่สำคัญ ชนิดย่อยของ Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C และ Cis-H) ที่ศึกษาในที่นี้ทั้งหมดแสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระบางอย่าง ซึ่งผลของ Cis-B มีความสำคัญมากที่สุด การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่า Cis ลดทอนผลที่เป็นอันตรายของ OS ที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนอย่างเห็นได้ชัดโดยส่งผลต่อการทำงานของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระในอัณฑะและเซลล์ GC-1

คำสำคัญ: ซิสตาโนไซด์, ภาวะขาดออกซิเจนในเลือดต่ำ, ภาวะมีบุตรยากในผู้ชาย, ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน, การป้องกันการเจริญพันธุ์

ผักชีฝรั่งสด

บทนำ

ปัจจุบัน คู่รักในวัยเจริญพันธุ์ทั่วโลกประมาณ 48.5 ล้านคน (15 เปอร์เซ็นต์) ได้รับผลกระทบจากภาวะมีบุตรยาก [1] โดยในจำนวนนี้ 40-50 เปอร์เซ็นต์ระบุว่าเป็นภาวะมีบุตรยากของผู้ชาย [2] ซึ่งเป็นภาวะที่มีความเกี่ยวข้องอย่างยิ่งกับสิ่งแวดล้อมและวิถีชีวิต ปัจจัย. หลักฐานบ่งชี้ว่าความอ่อนแอของลูกอัณฑะต่อความดันออกซิเจนต่ำเป็นปัจจัยเชิงสาเหตุของภาวะมีบุตรยากในผู้ชายบางรูปแบบ [3] ดังที่แสดงให้เห็นในการศึกษาก่อนหน้านี้ การสร้างสเปิร์มบกพร่องและลดลงเมื่อได้รับภาวะขาดออกซิเจนในเลือดต่ำ [4-7]

ในการสำรวจกลไกเบื้องหลัง การศึกษาได้แสดงให้เห็นว่าการได้รับ hypobaric hypoxia ช่วยเพิ่มการผลิต reactive oxygen species (ROS) [8, 9] ROS มีบทบาทสำคัญในระบบสืบพันธุ์ของพวกมัน ในระดับต่ำ จำเป็นสำหรับความจุของตัวอสุจิ ปฏิกิริยาอะโครโซม และการรวมตัวของอสุจิกับไข่[10] อย่างไรก็ตาม ROS ที่มากเกินไปสามารถทำให้เกิดความเสียหายของ DNA ของอสุจินิวเคลียร์/ไมโทคอนเดรียและความเสียหายของเยื่อหุ้มเซลล์ในพลาสมา ซึ่งเป็นปัจจัยสำคัญที่ทำให้เกิดความเสี่ยงที่จะเป็นหมันในผู้ชายเพิ่มขึ้น [11, 12] ดังนั้นการสะสมของ ROS ที่เกิดจากการขาดออกซิเจนอาจเป็นสาเหตุหนึ่งของภาวะมีบุตรยากในผู้ชาย

Cistanches Herba เป็นพืชสมุนไพรที่เป็นปรสิตยืนต้น มีการกระจายอย่างกว้างขวางในพื้นที่แห้งแล้ง [13] และใช้กันอย่างแพร่หลายเนื่องจากฤทธิ์ทางเภสัชวิทยา [14-17] ในบรรดาเนื้อหาที่มีประสิทธิภาพทั้งหมดของ Cistanches Herba PhGs ได้รับการพิจารณาว่าเป็นส่วนประกอบหลักที่ใช้งานอยู่ จนถึงปัจจุบัน มีการแยก PhGs 34 ออกจากพืช Cistanches [13] Cistanoside (Cis), anactive PhG ที่แยกได้จาก Cistanches Herba ได้รับความสนใจจากผลของสารต้านอนุมูลอิสระ

เมื่อพิจารณาถึงผลกระทบของสารต้านอนุมูลอิสระของ Cis และบทบาทของ ROS ในภาวะมีบุตรยากในผู้ชายที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจน Cis ถือเป็นตัวยาที่มีศักยภาพในการรักษาภาวะมีบุตรยากในเพศชายที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจน อย่างไรก็ตาม มีรายงานเพียงไม่กี่ฉบับที่กล่าวถึงผลกระทบของสารต้านอนุมูลอิสระของ Cis ที่สกัดจาก Cistanches Herba ในการรักษาภาวะมีบุตรยากของผู้ชายที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนหรือเส้นทางการส่งสัญญาณที่เกี่ยวข้อง ในการศึกษานี้ ได้สร้างแบบจำลองการทดลองในหลอดทดลองและขาดออกซิเจนในร่างกายและประเมินองค์ประกอบผลกระทบของ Ciswere ที่แตกต่างกัน

Cistanche มีผลการสืบพันธุ์

วัสดุและวิธีการ

การเพาะเลี้ยงเซลล์และรีเอเจนต์

สายเซลล์สเปิร์มโกเนียของหนูเมาส์ GC-1spg(GC-1) ถูกซื้อจาก American TypeCulture Collection (ATCC) และเพาะเลี้ยงใน DMEM(Invitrogen, USA) ที่เสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์, L- 1 เปอร์เซ็นต์ กลูตามีน (100 มิลลิโมลาร์), เพนิซิลลิน (100 U/mL) และสเตรปโตมัยซิน (100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ที่ 37 องศาในตู้อบที่มีความชื้นที่มีคาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ Cis (Cis-A, B, C, H) ซื้อมาจากChengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (ประเทศจีน)

การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์

ความอยู่รอดของเซลล์ถูกทดสอบโดยชุดตรวจนับเซลล์{{0}}การทดสอบ (CCK-8) โดยสรุป เซลล์ GC-1 ถูกเพาะในจาน 96-หลุมที่ 1.5×103 หลุมต่อหลุมและเพาะเลี้ยงที่ 37 องศาเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นเซลล์ได้รับการบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (20 เปอร์เซ็นต์ ,15 เปอร์เซ็นต์ , 10 เปอร์เซ็นต์ , 5 เปอร์เซ็นต์ ) ของออกซิเจนหรือความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (2 ไมโครโมลาร์ 0.2 ไมโครโมลาร์ 0.02 ไมโครโมลาร์) ของ Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C , Cis-H) ตามเวลาที่กำหนด จากนั้น supernatant ถูกละทิ้ง และตรวจพบความมีชีวิตของเซลล์โดยใช้ชุด CCK-8 (DojindoJapan) วัดค่าการดูดกลืนแสงของแต่ละหลุมที่ 450 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (BioRad USA) ในที่สุด ความมีชีวิตของเซลล์ถูกคำนวณตามสูตรต่อไปนี้:

ความมีชีวิตของเซลล์=(กลุ่ม ODexperimental - กลุ่ม ODblank)/(กลุ่มควบคุม OD - กลุ่ม ODblank) × 100 เปอร์เซ็นต์

การวิเคราะห์ Western blot

เซลล์หรือเนื้อเยื่อที่เก็บเกี่ยวถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์ RIPA เพื่อแยกโปรตีน (RIPA Beyotimeจีน; ค็อกเทลโรชสวิตเซอร์แลนด์) สารลอยลอยเหนือตะกอนถูกรวบรวม และความเข้มข้นของโปรตีนถูกทดสอบโดยวิธี BCA (บีโยไทม์) โปรตีนที่สกัดได้ประมาณ 40 ไมโครกรัมจากแต่ละตัวอย่างถูกแยกโดย SDS-PAGE และถ่ายด้วยไฟฟ้าบนเมมเบรนกรองไนโตรเซลลูโลส (NC) (BeyotimeChina) เยื่อกรอง NC ถูกปิดกั้นด้วยนมที่ไม่มีไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 1.5 ชั่วโมง และบ่มด้วยแอนติบอดีจำเพาะ (แอนติ-PARP 1:1000, แอนติ-แคสเปส-3 1:1000, แอนติ-Bcl-2 1:1000, แอนติ-Bax1: 1000, anti-GAPDH 1:1000; แอนติบอดีทั้งหมดซื้อจาก Cell Signaling Technology, USA) ในชั่วข้ามคืนที่ 4 องศา จากนั้น เยื่อหุ้ม NC ทั้งหมดถูกบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิคอนจูเกตที่เชื่อมด้วยฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดสที่สอดคล้องกันเป็นเวลา 1.5 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องและถ่ายภาพด้วยระบบการถ่ายภาพ (แทนนอน ประเทศจีน)

cistanche สารสกัดจากผงอาหารเสริม

การตรวจจับวัฏจักรเซลล์

การสอบวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมตริก (FCM) ถูกดำเนินการเพื่อวิเคราะห์วัฏจักรของเซลล์ เซลล์ถูกบำบัดภายใต้สภาวะที่ต่างกันเป็นเวลา 72 ชั่วโมงและเก็บเกี่ยว จากนั้นล้างเซลล์ด้วย PBS ตรึงด้วยเอธานอล 75 เปอร์เซ็นต์ และย้อมด้วยโพรพิดิยูมิโอไดด์ (PI) สำหรับแต่ละตัวอย่าง เซลล์ 1×104 ถูกรวบรวมและวิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตเมทรี (FACSCalibur, BD Biosciences) จากนั้น คำนวณสัดส่วนของเซลล์เฟส G1/S/G2 และดัชนีการงอกขยาย [เฟส(S บวก G2)/เฟส(G1 บวก S บวก G2) × 100 เปอร์เซ็นต์ ]

Ki-67 การย้อมสี

เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในจานคอนโฟคอลและบำบัดด้วยการขาดออกซิเจนหรือชนิดย่อยที่แตกต่างกันของ Cis เป็นเวลา 72 ชั่วโมง หลังจากตรึงเซลล์ทั้งหมดด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ พวกมันถูกบ่มด้วยแอนติ-Ki-67 แอนติ-บอดี้ (1:200, เทคโนโลยีการส่งสัญญาณของเซลล์) จากนั้น เซลล์ทั้งหมดถูกบ่มด้วย IgG แอนติบอดีต้านกระต่าย CY-3-คอนจูเกต (1:200, Boster, จีน) และสารละลาย DAPI (1.0ug/mL, Beyotime) สังเกตการเรืองแสงด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล Fluoview FV1000 (โอลิมปัส ประเทศญี่ปุ่น)

การตรวจจับ ROS

FCM ถูกนำมาใช้เพื่อวัดระดับ ROS ภายในเซลล์โดยใช้ DCFH-DA เซลล์ที่ถูกระงับถูกเพาะในแผ่นหลุม6-หลุมและอยู่ภายใต้การบำบัดที่แตกต่างกัน หลังการรักษา 72 ชั่วโมง เซลล์ถูกแขวนลอยใน DMEM ที่ปราศจากซีรัมที่มี DCFH-DA 10 ไมโครโมลาร์ (บีโยไทม์) จากนั้นจึงกำหนดปริมาณ ROS โดยการคัดแยกเซลล์ที่กระตุ้นด้วยแสงเรืองแสงบนระบบ Beckman Coulter Flow Cytometry ที่มีความยาวคลื่นกระตุ้นที่ 488 นาโนเมตรและความยาวคลื่นการปล่อย 525 นาโนเมตร [18]

ความมุ่งมั่นของลิปิดเปอร์ออกซิเดชัน (LPO)

การทดสอบสารทำปฏิกิริยากรดไธโอบาร์บิทูริก (TBARS) ดำเนินการเพื่อตรวจหา LPO ขั้นตอนการดำเนินการทั้งหมดดำเนินการตามคำแนะนำ (Sigma USA) ความเข้มข้นคำนวณโดยใช้ค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ของฟันกรามที่ 1.56×105/(M·cm) ซึ่งได้มาจากการใช้มาลอนไดอัลดีไฮด์เป็นมาตรฐาน ผลลัพธ์จะแสดงเป็น nmol ของ MDA ที่เทียบเท่า/มิลลิกรัมของโปรตีน

การกำหนดกิจกรรมของเอนไซม์

กิจกรรมของเอนไซม์ได้รับการทดสอบโดยใช้ชุดทดสอบซึ่งรวมถึงกลูตาไธโอนรีดักเตส (GR), กลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส (GPx) และซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส (SOD) ขั้นตอนการดำเนินงานทั้งหมดดำเนินการตามคำแนะนำที่ให้มา (Nan Jing Jian Cheng BioengineeringInstitute China)

สัตว์และโปรโตคอลการทดลอง

หนู Wistar เพศผู้ที่โตเต็มที่ (180-220 ก. อายุ 8 วัตต์) ได้รับจากศูนย์เลี้ยงสัตว์ของมหาวิทยาลัยการแพทย์ทหารที่สี่ เมืองซีอาน ประเทศจีน ขออนุญาตใช้สัตว์ดังกล่าวจากคณะกรรมการจริยธรรมของมหาวิทยาลัย (หมายเลขอ้างอิง) : 20190506). การทดลองกับสัตว์ได้ดำเนินการตามแนวทางของมหาวิทยาลัยในการดูแลและการใช้สัตว์ทดลอง

หนูทุกตัวได้รับอนุญาตให้ปรับตัวได้ประมาณหนึ่งสัปดาห์ก่อนเริ่มการทดลอง หลังจากปรับตัวให้ชินกับสภาพแวดล้อมแล้ว สุ่มแบ่งหนูออกเป็น 6 กลุ่ม โดยแต่ละกลุ่มมีสัตว์ 5 ตัว หนูในกลุ่มควบคุมถูกเลี้ยงภายใต้ความดันปกติ (PO2: 20 เปอร์เซ็นต์ ; ความกดอากาศ:101.3 kPa) ในขณะที่หนูในแบบจำลองและกลุ่มซีสทรีตถูกเลี้ยงในห้องออกซิเจนแรงดันต่ำ (ความดันภายใน 61.6 kPa เทียบเท่ากับ ความสูงจากระดับน้ำทะเล 4000 เมตร PO2: 14.55 เปอร์เซ็นต์ ) เพื่อจำลองสภาพแวดล้อมที่เป็นพิษในระดับสูง หนูทุกตัวสามารถเข้าถึงอาหารและน้ำได้ฟรีในกรงพลาสติกที่ 22± 2 องศาและสภาวะความชื้นด้วยวงจรแสง/ความมืดอัตโนมัติ 12-ชม. หนูในแบบจำลองและกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย Cis ยังคงอยู่ในภาวะ hypobaric แต่ถูกย้ายสภาพ tonormobaric ทุกๆ 96 ชั่วโมง ในขณะนั้นให้อาหารและน้ำแก่พวกมัน และทำความสะอาดกรง ระยะเวลาของการเปลี่ยนจาก hypobaric เป็น hypobaric อยู่ที่ประมาณ 2 ชั่วโมง กลุ่มบำบัดทั้งหมดได้รับการบำบัดด้วย Cis ที่สอดคล้องกัน (8 มก./กก./วัน) ผ่านทางสายทางปากเป็นเวลา 8 สัปดาห์ ในขณะที่หนูกลุ่มควบคุมและหนูทดลองได้รับการบำบัดด้วยน้ำปริมาณเท่ากัน

หลังจาก 8 สัปดาห์ หนูถูกสังเวยภายใต้การดมยาสลบ อัณฑะ หลอดน้ำอสุจิ และถุงน้ำเชื้อถูกแยกและชั่งน้ำหนัก และคำนวณดัชนีอวัยวะตามสูตรต่อไปนี้ (น้ำหนักของอวัยวะ/น้ำหนักของสัตว์) × 100 เปอร์เซ็นต์ ต่อมาได้มีการรวบรวมอสุจิในหลอดน้ำอสุจิและทำการทดสอบการเคลื่อนไหวและการทำงานของเอนไซม์อะโครโซม ในทำนองเดียวกัน เนื้อเยื่ออัณฑะถูกรวบรวมสำหรับการศึกษาทางจุลพยาธิวิทยาและ ROS, LPO และการตรวจจับการทำงานของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ

การประเมินอัตราอสุจิที่มีชีวิต

ท่อน้ำอสุจิถูกตัดด้วยกรรไกรผ่าตัด และเตรียมตัวอสุจิในน้ำเกลือปกติ ในการประเมินอัตราอสุจิที่มีชีวิต 5 ไมโครลิตรของสารแขวนลอยตัวอสุจิถูกผสมอย่างระมัดระวังกับอีโอซิน-อีสเทนในปริมาณที่เท่ากัน จากนั้นนับสเปิร์มภายใต้กล้องจุลทรรศน์ที่จุดไฟ อัตราสเปิร์มที่มีชีวิตประเมินโดยการคำนวณทั้งอสุจิที่ตายแล้ว (ตัวอสุจิตาย) และตัวอสุจิที่ไม่ย้อมสี (ตัวอสุจิที่มีชีวิต)

ผงซิสทานเช่ทูบูโลซ่าเพิ่มอัตราสเปิร์มสด.

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม กรุณาคลิกที่นี่

การหาค่าเอนไซม์อะโครโซมของอสุจิ

การทดสอบการทำงานของเอนไซม์อะโครโซมของอสุจิถูกใช้เพื่อประเมินอะโครโซมเอนไซม์ของสเปิร์ม [19] ผลลัพธ์ในแต่ละกลุ่มคำนวณโดยใช้สูตรต่อไปนี้: การทำงานของเอนไซม์อะโครโซม (μIU)=(ODExperimentgroup - กลุ่ม ODBlank)/(247.5×10) × 106

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลเชิงปริมาณทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD และวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS 220 ใช้การทดสอบ t ของนักเรียนอิสระเพื่อเปรียบเทียบข้อมูลระหว่างสองกลุ่ม *ป< 0.05="" and="" **p="" <="" 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">

คลิกที่นี่เพื่อส่วนที่ 2