ส่วนที่ 1: Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides กระตุ้นการตายของเซลล์มะเร็งตับและเสริมฤทธิ์ต้านเนื้องอก

ติดต่อ: ali.ma@wecistanche.com

Pengfei Yuan, BSc1, Changshuang Fu, MSc1, Yi Yang, PhD1, Aipire Adila, PhD1, Fangfang Zhou, MSc1, Xianxian Wei, MSc1, Weilan Wang, PhD1, Jie Lv, PhD1, Yijie Li, PhD1, Lijie Xia, PhD1, และ Jinyao Li, PhD1

เชิงนามธรรม

Cistanche tubulosก. เป็นยาสมุนไพรจีนชนิดหนึ่งและทำหน้าที่ทางชีวภาพต่างๆ การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่าCistanche tubulosa phenylethanoid ไกลโคไซด์(CTPG) มีฤทธิ์ต้านเนื้องอกในเซลล์เนื้องอกหลายชนิด อย่างไรก็ตาม ผลต้านเนื้องอกของ CTPG ต่อเซลล์ HepG2 และ BEL-7404 มะเร็งตับ (HCC) ยังคงเข้าใจยาก การศึกษาของเราพบว่า CTPG ยับยั้งการเติบโตของเซลล์ HepG2 และ BEL-7404 อย่างมีนัยสำคัญผ่านการเหนี่ยวนำการจับกุมของวัฏจักรเซลล์และการตายของเซลล์ ซึ่งสัมพันธ์กับการกระตุ้นเส้นทาง MAPK ซึ่งมีลักษณะเป็นฟอสโฟรีเลชั่นที่มีการควบคุมเพิ่มขึ้นของ p38, JNK และ ERK1/2 และวิถีที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรียซึ่งมีลักษณะเฉพาะโดยการลดลงของศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย การปลดปล่อยของไซโตโครม c และการตัดแยกของแคสเปส-3, -7, -9 และ PARP ถูกทำให้เพิ่มขึ้นในเวลาต่อมาโดยการบำบัดด้วย CTPG นอกจากนี้ CTPG ยังยับยั้งการย้ายถิ่นของ HepG2 อย่างมีนัยสำคัญโดยการลดระดับของเมทริกซ์ metalloproteinase-2 และปัจจัยการเจริญเติบโตของบุผนังหลอดเลือด สิ่งที่น่าสนใจคือ CTPG ไม่เพียงแต่เพิ่มการเพิ่มจำนวนของเซลล์ม้ามเท่านั้น แต่ยังช่วยลดการตายของเซลล์ม้ามที่เกิดจากซิสพลาตินด้วย ในแบบจำลองเมาส์เนื้องอก H22 CTPG ที่รวมกับซิสพลาตินช่วยยับยั้งการเติบโตของเซลล์ H22 และลดผลข้างเคียงของซิสพลาติน เมื่อนำมารวมกัน CTPG ยับยั้งการเจริญเติบโตของ HCC ผ่านผลต้านเนื้องอกโดยตรงและผลภูมิคุ้มกันทางอ้อม และปรับปรุงประสิทธิภาพการต้านเนื้องอกของซิสพลาติน

คำสำคัญ Cistanche tubulosa phenylethanoid glycosides, apoptosis, MAPK pathway, mitochondria-dependent pathway, cisplatin, immunoenhancement

Cistanche มีฤทธิ์ต้านเนื้องอก

คลิกไปที่ผลิตภัณฑ์ Cistanche และ Cistanches

บทนำ

มะเร็งตับได้รับการคาดการณ์ว่าจะเป็นมะเร็งที่วินิจฉัยบ่อยที่สุดเป็นอันดับที่ 6 และเป็นสาเหตุอันดับที่สี่ของการเสียชีวิตด้วยโรคมะเร็งทั่วโลกในปี 2561 โดยมีผู้ป่วยรายใหม่ประมาณ 841 000 รายและเสียชีวิต 782,000 รายต่อปีในเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ (มองโกเลีย กัมพูชา และเวียดนาม) .1 ในประเทศจีน มะเร็งตับเป็นสาเหตุอันดับสามของการเสียชีวิตที่เกี่ยวข้องกับมะเร็งในปี 25582 มะเร็งตับปฐมภูมิมากกว่า 90 เปอร์เซ็นต์เป็นมะเร็งตับ (HCC) ทั่วโลก ในปัจจุบัน การตัดตับ การปลูกถ่ายตับ และการตัดผ่านผิวหนังเป็นวิธีการหลักในการรักษา HCC น่าเสียดายที่การรักษาเหล่านี้มีผลกับผู้ป่วย 30 เปอร์เซ็นต์ที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นมะเร็งตับระยะแรก ในขณะที่ผู้ป่วยที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นมะเร็งตับระยะลุกลาม (คิดเป็น 40 เปอร์เซ็นต์ ) ต้องพึ่งพาการรักษาแบบประคับประคองเพื่อยืดเวลาการรอดชีวิต3,4 Sorafenib ร่วมกับยารักษาตับ ยาเคมีบำบัดในหลอดเลือดแดงเป็นวิธีบำบัดแบบประคับประคองที่สำคัญและพบได้บ่อยสำหรับผู้ป่วยส่วนใหญ่ที่มี HCC ขั้นสูงในภูมิภาคเอเชียแปซิฟิก5 Sorafenib ซึ่งได้รับการอนุมัติจากองค์การอาหารและยาในปี 2006 สำหรับการรักษามะเร็งตับระยะลุกลาม เป็นตัวยับยั้งไคเนสหลายชนิดที่ยับยั้งการงอกขยายของเซลล์เนื้องอกและหลอดเลือด การผลิตและส่งเสริมการตายของเซลล์เนื้องอก โซราเฟนิบช่วยยืดเวลาการอยู่รอดของผู้ป่วยได้อย่างมีนัยสำคัญ 3 ถึง 5 เดือน แต่มีผลข้างเคียงที่ร้ายแรงและสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการเกิดภาวะดื้อยา6 ดังนั้นจึงเป็นเรื่องเร่งด่วนที่จะพัฒนายาหรือกลยุทธ์ใหม่ๆ สำหรับ HCC

แพทย์แผนจีน (TCM) เพียงอย่างเดียวหรือใช้ร่วมกับกลยุทธ์อื่น ๆ ถูกนำมาใช้ในการรักษา HCC และได้แสดงให้เห็นประโยชน์ทางคลินิก ซึ่งรวมถึงเวลาการอยู่รอดที่เพิ่มขึ้น คุณภาพชีวิตที่ดีขึ้น อาการไม่พึงประสงค์ลดลง และอื่น ๆ7,8Cistancheเป็น TCM ที่ประกอบด้วย phenylethanoid glycosides (PhGs), iridoids, lignin และ polysaccharides ซึ่งมีหน้าที่ทางชีวภาพต่างๆ เช่น ต่อต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ ต่อต้านริ้วรอย เสริมความจำ และเสริมสร้างภูมิคุ้มกัน 9 PhGs ได้รับการพิจารณาว่าเป็น ส่วนประกอบสำคัญของ Cistanche และมีหน้าที่หลายอย่าง เช่น ต่อต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ ต้านอะพอพโทซิส ปกป้องตับ และป้องกันระบบประสาท10-12 กลุ่มของเรารายงานว่าCistancheทูบูโลซา ฟีนิลทานอยด์ ไกลโคไซด์(CTPG) สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์เมลาโนมา B16-F10, เซลล์มะเร็งหลอดอาหาร Eca-109 และเซลล์ HCC H22 ผ่านทางวิถีการส่งสัญญาณภายนอกหรือภายใน ในหลอดทดลอง หรือในร่างกาย นอกจากนี้ CTPG ยังมีผลกระตุ้นภูมิคุ้มกัน13-15

ในการศึกษานี้ เราตรวจสอบผลต้านเนื้องอกและกลไกของ CTPG ในเซลล์ HepG2 และ BEL-7404 ในหลอดทดลอง วิเคราะห์ฟังก์ชันภูมิคุ้มกันของ CTPG ในหลอดทดลอง และในร่างกาย และประเมินผลการรักษาของ CTPG ร่วมกับเคมีบำบัดเพิ่มเติม ยาซิสพลาตินในหนูที่เป็นเนื้องอก HCC H22 ในร่างกาย เราพบว่า CTPG สามารถยับยั้งการเติบโตของเซลล์ HepG2 และ BEL-7404 ผ่านการตายแบบอะพอพโทซิสที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรียและเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK CTPG ยับยั้งการย้ายเซลล์ HepG2 อย่างมีนัยสำคัญโดยการลดระดับของเมทริกซ์เมทัลโลโปรตีน-2 (MMP-2) ​​และปัจจัยการเจริญเติบโตของหลอดเลือดบุผนังหลอดเลือด (VEGF) นอกจากนี้ CTPG ยังส่งเสริมการเพิ่มจำนวนและการกระตุ้นเซลล์ภูมิคุ้มกัน และเพิ่มภูมิคุ้มกันของหนู ที่สำคัญ CTPG ร่วมกับซิสพลาตินสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์ H22 ในร่างกาย และลดผลข้างเคียงของซิสพลาตินได้

Cistanche ช่วยเพิ่มภูมิคุ้มกัน

วัสดุและวิธีการ

สัตว์

ซื้อ BALB/c เพศผู้ อายุประมาณ 6 ถึง 8 สัปดาห์ หนูคุนหมิง และหนู C57BL/6 เพศเมียจากศูนย์ทดลองสัตว์ มหาวิทยาลัยการแพทย์ซินเจียง (อุรุมชี ซินเจียง ประเทศจีน) และอยู่ในสถานที่เลี้ยงสัตว์ของมหาวิทยาลัยซินเจียงที่มีอุณหภูมิห้อง (RT) ที่ 25±3 องศา และช่วงแสง-มืด 12/12 ชั่วโมง

เส้นเซลล์และการเพาะเลี้ยงเซลล์

เซลล์ H22 ของหนูถูกซื้อมาจาก Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (หวู่ฮั่น หูเป่ย ประเทศจีน) และเซลล์ HCC HepG2 และ BEL-7404 ของมนุษย์ได้มาจาก Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering มหาวิทยาลัยซินเจียง (อุรุมชี, ซินเจียง, จีน) และเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI 1640 (Gibco, USA) หรืออาหาร Eagle's medium (DMEM) ดัดแปลงของ Dulbecco (Gibco) ที่มีซีรั่มโคนมในครรภ์ที่ยับยั้งความร้อน 10 เปอร์เซ็นต์ (MRC, จีน), 1 เปอร์เซ็นต์ L- กลูตามีน (100 มิลลิโมลาร์), เพนิซิลลิน 100 ยู/มิลลิลิตร และสเตรปโตมัยซิน 100 กรัม/มิลลิลิตรที่ 37 องศาในบรรยากาศที่มีความชื้นของ CO2 5 เปอร์เซ็นต์

โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC)

สารประกอบหลักของ CTPG (Upbio Tech Co., Ltd., Shanghai, China) ผ่านการรับรองและวัดปริมาณโดย HPLC ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ ใช้คอลัมน์ ZORBAX SB-C18 (250×4.6mm; 5μm) และเฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยสารละลายกรดฟอร์มิก 0.2 เปอร์เซ็นต์และเมทานอลที่มีความลาดชันจาก 23 เปอร์เซ็นต์เป็น 31 เปอร์เซ็นต์ ตัวอย่างทั้งหมด 10μL ถูกฉีดและตรวจพบที่ 330 นาโนเมตร มาตรฐานอิชินาโคไซด์และแอคทีโอไซด์ (หยวนเย่ เซี่ยงไฮ้ จีน) ถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ส่วนประกอบของ CTPG

เอ็กไคนาโคไซด์

การวิเคราะห์ความมีชีวิตของเซลล์

ผลต้านเนื้องอกของ CTPG ต่อเซลล์ HepG2 และ BEL-7404 ถูกประเมินโดยใช้ MTT (3-(4, 5-ไดเมทิล-2-ไทอะโซลิล)-2, {{7 }}ไดฟีนิล-2-H-เตตตราโซเลียม โบรไมด์) เซลล์ HepG2 และ BEL-7404 ถูกชุบลงในเพลต 96-หลุม (5 × 104 เซลล์/หลุม) และบำบัดด้วย 0, 200, 400 และ 600 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร CTPG เป็นเวลา 24 และ 48 ชั่วโมง ตามลำดับ หลังจากการบ่ม 24 ชั่วโมงที่ 37 องศา ซิสพลาติน (หยวนเย่) ประมาณ 35 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก จากนั้น 100 ไมโครลิตร MTT (0.5 มก./มล., เจือจางโดยอาหารเลี้ยงเชื้อโดยไม่มีอาหารเลี้ยงเชื้อ FBS) ถูกเติมลงในแต่ละหลุมและเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 3 ชั่วโมงที่ 37 องศาและ 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 หลังจากการบ่ม เพลตถูกหมุนเหวี่ยงที่ 1200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 7 นาที ตัวกลางถูกกำจัดออกและ 200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร DMSO ถูกเติมในแต่ละหลุมเพื่อละลายผลึกฟอร์มาซานที่ก่อรูป ค่า OD490 ถูกวัดโดยเครื่องอ่านไมโครเพลท 96-หลุม (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) เพื่อประเมินผลของ CTPG ต่อเซลล์ม้าม เซลล์ถูกแยกออกจากหนูเมาส์ C57BL/6 และเคลือบเข้าไปในเพลต 96-หลุมที่ความหนาแน่น 1 × 105 เซลล์/หลุม ม้ามโตถูกบำบัดด้วย 0, 200, 400 และ 600 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร เป็นเวลา 24, 48 และ 72 ชั่วโมง ตามลำดับ ความมีชีวิตของเซลล์คำนวณตามสูตรต่อไปนี้: ความมีชีวิตของเซลล์ ( เปอร์เซ็นต์ )=(ODtreated/ODuntreated) × 100 เปอร์เซ็นต์

การตรวจจับ Ki-67

การตรวจหา Ki{{0}} ดำเนินการตามการศึกษาก่อนหน้านี้ 16 โดยสรุป เซลล์ BEL-7404 ได้รับการรักษาด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (0, 200, 400 และ 600ug/mL) ของ CTPG หรือซิสพลาติน (35ug/mL) หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมง เซลล์จะถูกเก็บเกี่ยวและล้างด้วย PBS จากนั้นตรึงและซึมผ่านด้วย Foxp3 Staining Buffer Set (eBioscience สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต การย้อมสีภายในเซลล์ถูกดำเนินการโดยใช้แอนติบอดีคอนจูเกต Ki-67 ของ FITC (BD Biosciences, ซานโฮเซ, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) เป็นเวลา 15 นาทีที่ RT ตัวอย่างถูกวิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตเมทรี (BD FACSCalibur, CA, USA)

การวิเคราะห์การตายของเซลล์และวัฏจักรของเซลล์

เซลล์ HepG2 และ BEL-7404 ถูกเพาะที่ความหนาแน่น 2.5×105 เซลล์/จาน และบ่มที่ 37 องศาค้างคืน เซลล์ถูก trypsinized และเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงหลังการบำบัดด้วยความเข้มข้นต่างๆ ของ CTPG หรือปรับสภาพด้วยสารยับยั้งแคสเปส (Z-VAD-FMK) หรือสารยับยั้ง caspase-3 (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, China) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงก่อน การรักษาซีทีพีจี หลังจาก 24 ชั่วโมง ตรวจพบการตายของเซลล์โดยโฟลว์ไซโตเมทรี โดยสังเขป เซลล์ที่เก็บรวบรวมถูกล้างด้วย PBS เย็น (Gibco) และแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์ซึ่งจับแอนเนกซินด้วย 2.5μL Annexin V-FITC และ 5μL PI-PE Staining Solution (Solarbio, Beijing, China) และจากนั้นเซลล์ถูกบ่มที่ RT ในความมืดเป็นเวลา 15 นาที สำหรับการวิเคราะห์การกระจายของวัฏจักรเซลล์ เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวหลังการบำบัดด้วย CTPG และตรึงในเอธานอล 70 เปอร์เซ็นต์ที่เย็นจัดที่ 4 องศาเป็นเวลา 30 นาที เซลล์ถูกย้อมด้วย PI (BD Biosciences) ในความมืดเป็นเวลา 30 นาที ตัวอย่างถูกวิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตมิเตอร์ (BD FACSCalibur) Western blot ตรวจพบระดับการแสดงออกของการตายของเซลล์และโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับวัฏจักร

Western Blot

Western blot ดำเนินการตามการศึกษาก่อนหน้านี้ของเรา 17HCC ได้รับการรักษาด้วย CTPG เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากล้างด้วย PBS ที่เย็นจัดสองครั้ง เซลล์ที่ยึดเกาะและเซลล์ลอยตัวทั้งหมดถูกรวบรวมและสลายใน RIPA Lysis Buffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) เป็นเวลา 20นาทีบนน้ำแข็ง หลังจากการปั่นแยกที่ 12000 รอบต่อนาที 4 องศาเป็นเวลา 10 นาที ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยใช้ชุดทดสอบกรด Bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ความเข้มข้นของโปรตีนที่เท่ากันถูกแยกโดย SDS-PAGE 12 เปอร์เซ็นต์และถ่ายโอนไปยังเยื่อ PVDF หลังจากล้างด้วยบัฟเฟอร์ PBST (PBS ที่มีทวีน 0.05 เปอร์เซ็นต์-20) เยื่อหุ้มถูกบล็อกด้วยนมที่ไม่มีไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์ที่ 37 องศาเป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นจึงบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ (Cell Signaling Technology, MA, USA) ที่เจือจางที่เหมาะสมค้างคืนที่ 4 องศา หลังจากล้างด้วย PBST 3 ครั้ง เมมเบรนถูกบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกต HRP (eBioscience) ที่สอดคล้องกันเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 37 องศา ตรวจพบโปรตีนเป้าหมายโดยใช้ชุดทดสอบ ECL (บีโยไทม์) Image J ได้ข้อมูลการสแกนระดับสีเทา

การวิเคราะห์ศักยภาพของเมมเบรนยล (Δψm)

Δψm ถูกกำหนดหาโดยสีย้อม JC-1 ที่ซึมผ่านเมมเบรนได้ (Beyotime) โดยสรุป เซลล์ HepG2 และ BEL-7404 ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่ต่างกันของ CTPG (0, 200, 400 และ 600 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ทั้งหมดถูกรวบรวมและล้างด้วยบัฟเฟอร์การล้าง JC-1 เซลล์ถูกย้อมด้วยโพรบเรืองแสง JC-1 ตามคำแนะนำของผู้ผลิตเป็นเวลา 20 นาทีที่ RT หลังจากล้างด้วย PBS สองครั้ง ตัวอย่างทั้งหมดถูกวิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตเมทรี (BD FACSCalibur)

Hoechst 33342 การย้อมสี

การย้อมสี Hoechst 33342 ทำได้ตามการศึกษาก่อนหน้านี้ของเรา 16 ตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของนิวเคลียสโดยใช้สีย้อมพันธะดีเอ็นเอที่ซึมผ่านเมมเบรนได้ Hoechst 33342 (Beyotime) โดยย่อ เซลล์ถูกฉีดวัคซีนในจาน 6-หลุมที่ความเข้มข้น 1×105 เซลล์/หลุมในตัวกลางขนาด 2 มล. เมื่อไปถึงการบรรจบกัน 70 ถึง 80 เปอร์เซ็นต์ เซลล์ถูกบำบัดด้วย CTPG หรือซิสพลาติน 200, 400 และ 600 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกล้างด้วย PBS และตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ที่เย็นด้วยน้ำแข็ง 4 เปอร์เซ็นต์ที่ 4 องศาเป็นเวลา 10 นาที หลังจากล้างด้วย PBS เซลล์ถูกย้อมด้วย Hoechst 33342 ที่ 4 องศาเป็นเวลา 10 นาที ตัวอย่างถูกสังเกตโดยกล้องจุลทรรศน์แบบกลับด้านเรืองแสง (Nikon Eclipse Ti-E, Japan)

สารสกัดจากซิสแทนเช่

การทดสอบการย้ายถิ่น

ตรวจพบการย้ายเซลล์ HCC ผ่านการทดสอบการรักษาบาดแผล โดยสรุป เซลล์ HepG2 (2×104/หลุม) ถูกเพาะในจาน24-หลุม หลังจากการบรรจบกันถึง 80 เปอร์เซ็นต์ จุดศูนย์กลางของแต่ละหลุมก็ถูกขีดข่วนหนึ่งครั้งด้วยปลายปิเปต 20μL หลังจากการล้างด้วย PBS เซลล์ถูกบำบัดด้วยซิสพลาติน (35 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หรือความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (0, 200, 400 และ 600 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ของ CTPG ที่ 37 องศา หลังจาก 24 ชั่วโมง ภาพของแต่ละตัวอย่างจะถูกถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์ (Nikon Eclipse Ti-E) วิเคราะห์ระยะทางเฉลี่ยของการย้ายเซลล์ด้วย Image J เปอร์เซ็นต์ของการหายของบาดแผลคำนวณโดยสมการ: การหายของบาดแผล ( เปอร์เซ็นต์ )=(1−พื้นที่รอยขีดข่วน ณ จุดเวลาที่ระบุ/พื้นที่การเกาที่ 0 ชั่วโมง)×100 เปอร์เซ็นต์ ระดับการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการย้ายเซลล์ MMP-2 และ VEGF ถูกตรวจพบโดย Western blot

การเพิ่มจำนวนและการตายของเซลล์ม้าม

สำหรับการวิเคราะห์การเพิ่มจำนวน ม้ามโตถูกแยกออกจากหนูเมาส์ C57BL/6 3 ตัวและย้อมด้วย CFSE (eBioscience) เซลล์ที่ติดฉลาก CFSE ถูกฉีดวัคซีนลงในจาน 24-หลุมที่ความหนาแน่น 2 × 106 เซลล์ในตัวกลาง 1 มล. ต่อหลุม และบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG (200, 400 และ 600 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หรือรวมกับ 35 ไมโครกรัม /mL ซิสพลาตินเป็นเวลา 72 ชั่วโมง การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีถูกดำเนินการหลังจากการย้อมสีด้วย CD3-APC และ CD19-PE (BD Biosciences) สำหรับการวิเคราะห์อะพอพโทซิส เซลล์ม้ามถูกเพาะเลี้ยงในเพลต 24-หลุมที่ความหนาแน่น 2 × 106 เซลล์ในตัวกลางขนาด 1 มล. ต่อหลุม และบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG (200, 400 และ 600 ไมโครกรัม/มล.) หรือรวมกับ ซิสพลาตินเป็นเวลา 24 ชั่วโมง การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีถูกดำเนินการหลังจากการย้อมสีด้วย 2.5 ไมโครลิตร Annexin V-FITC และ 5 ไมโครลิตร PI-PE Solution

การประเมินความปลอดภัยและกิจกรรมกระตุ้นภูมิคุ้มกันของ CTPG ใน Vivo

สำหรับการประเมินกิจกรรมกระตุ้นภูมิคุ้มกันในร่างกายของ CTPG หนูคุนหมิงเพศผู้อายุ 6 ถึง 8 สัปดาห์ถูกสุ่มแบ่งออกเป็น 7 กลุ่ม (หนู 5 ตัว/กลุ่ม) ฉีดเข้าใต้ผิวหนัง (sc, 200, 400 มก./กก.), ฉีดเข้าช่องท้อง (ip, 200, 400 มก./กก.) และฉีดเข้าช่องท้อง (ig, 200, 400 มก./กก.) ทุก 2 วัน รวมเป็น 7 ครั้ง ในขณะที่กลุ่มควบคุมไม่ได้รับการรักษาใดๆ หนูชั่งน้ำหนักวันเว้นวันและสังเกตสถานะของหนูทุกวัน หลังจากการรักษาด้วย CTPG อวัยวะของหนูจะถูกแยกและชั่งน้ำหนัก ดัชนีอวัยวะคำนวณตามสูตร: ดัชนีอวัยวะ=น้ำหนักอวัยวะ (มก.)/น้ำหนักตัว (ก.) ม้ามโตถูกรวบรวม, นับและย้อมด้วยแอนติ-CD3-APC, แอนติ-CD19-PE, FITC ต้าน CD49b หรือแอนติ-CD4-APC, แอนติ-CD{{ 22}}PE, แอนติ-ซีดี8-FITC (BD Biosciences) ตัวอย่างถูกตรวจพบโดยโฟลว์ไซโตเมทรี (BD FACSCalibur)

ประสิทธิภาพในการต้านเนื้องอกของ CTPG ที่รวมกับ Cisplatin ในหนูเมาส์ที่มีเนื้องอก H22 หนู BALB/c เพศผู้อายุประมาณ 6 ถึง 8 สัปดาห์ถูกฉีดเข้าใต้ผิวหนังด้วยเซลล์ H22 (1.0 × 106 ต่อหนูเมาส์ใน 100 ไมโครลิตร PBS) เมื่อปริมาตรเนื้องอกถึงประมาณ 60 มม.3 หนูเมาส์ที่มีเนื้องอกถูกสุ่มแบ่งออกเป็น 4 กลุ่ม (6 หนู/กลุ่ม) และบำบัดด้วยซิสพลาติน (4 มก./กก.), CTPG (400 มก./กก.), ซิสพลาติน (4 มก./กก.) บวกกับ CTPG ( 400 มก./กก.) หรือไม่มีการบำบัด (กลุ่มควบคุม) ตามลำดับ หนูเมาส์เนื้องอกถูกฉีดเข้าช่องท้องด้วย CTPG ในวันที่ 5, 7, 9, 11 และ 13 ตามลำดับ Cisplatin ถูกฉีดเข้าเส้นเลือดดำในวันที่ 7 และ 11 วัดปริมาตรเนื้องอกและน้ำหนักตัววันเว้นวัน ปริมาตรของเนื้องอกคำนวณได้ดังนี้: ปริมาตรของเนื้องอก (V)=a × b2/2 โดยที่ a และ b แทนเส้นผ่านศูนย์กลางที่ยาวที่สุดและสั้นที่สุดของเนื้องอกที่วัดโดยเวอร์เนียร์คาลิเปอร์ตามลำดับ ในวันที่ 20 แยกอวัยวะและเนื้องอกออกและชั่งน้ำหนัก ม้ามโตถูกรวบรวม, นับและย้อมด้วยแอนติ-CD3-APC และแอนติ-CD19-PE หรือแอนติ-CD4-FITC และแอนติ-CD8-APC หรือ แอนติ-CD11b-PE และแอนติ-Gr-1-APC หรือแอนติ-CD4-FITC, แอนติ-CD25-APC และแอนติ-Foxp3-PE (BD Biosciences) . ต่อจากนั้น ความถี่และจำนวนของเซลล์ถูกวิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตเมทรี (BD FACSCalibur)

Cistanche ช่วยเพิ่มผลต่อต้านเนื้องอกและช่วยเพิ่มภูมิคุ้มกัน

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมกรุณาคลิกที่ภาพ

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าความคลาดเคลื่อนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย (SEM) การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบหนึ่ง/สองทาง (ANOVA) โดยใช้ซอฟต์แวร์ Prism5.0 พี<.05 was="" considered="" statistically="">

คลิกที่นี่เพื่อส่วนที่ 2