ส่วนที่ 1: สารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพจาก Ephedra Fragilis: การเพิ่มประสิทธิภาพการสกัด, ลักษณะทางเคมี, ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและต้านไกลเคชั่น

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม ติดต่อtina.xiang@wecistanche.com

เชิงนามธรรม: Response Surface methodology (RSM) ที่มีการออกแบบ Box-Behnken (BBD) ใช้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการสกัดสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพจาก Ephedra fragilis ผลการวิจัยชี้ว่าการสกัดด้วยเอทานอลร้อยละ 61.93 ที่อุณหภูมิ 44.43 องศาเป็นเวลา 15.84 ชั่วโมงเป็นทางออกที่ดีที่สุดสำหรับการผสมผสานของตัวแปรนี้ สารสกัดเอธานอลแบบหยาบ (CEE) ที่ได้รับภายใต้สภาวะการสกัดที่เหมาะสมที่สุดถูกแยกส่วนตามลำดับด้วยตัวทำละลายที่มีขั้วเพิ่มขึ้น เนื้อหาของ Total phenolic (TP) และ Total flavonoid (TF) รวมทั้ง theสารต้านอนุมูลอิสระและวัดฤทธิ์ต้านไกลเคชั่น โปรไฟล์ลายนิ้วมือพฤกษเคมีของเศษส่วนที่มีกิจกรรมสูงสุดถูกแสดงคุณลักษณะโดยใช้ RP-HPLC เศษส่วนของเอทิลอะซิเตต (EAF) มีเนื้อหา TP และ TF สูงสุด และแสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ต้านไกลเคชันที่มีศักยภาพมากที่สุด ผลการวิเคราะห์สหสัมพันธ์ของเพียร์สันพบว่าเนื้อหา TP และ TF มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญอย่างมากกับฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ต้านไกลเคชั่น โดยสรุป มีการระบุสารประกอบหกชนิดใน EAF ของ E. fragilis รวมถึงกรดฟีนอลิกสี่ชนิดและฟลาโวนอยด์สองชนิด นอกจากนี้ การวิเคราะห์เทียบท่าระดับโมเลกุลยังแสดงให้เห็นความเชื่อมโยงที่เป็นไปได้ระหว่างสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่ระบุกับกลไกการออกฤทธิ์ ผลลัพธ์ของเราแนะนำหลักฐานใหม่เกี่ยวกับฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ต้านไกลเคชั่นของสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพของ E. fragilis ที่อาจนำไปใช้ในการรักษาและป้องกันภาวะแทรกซ้อนที่เกี่ยวข้องกับการแก่ก่อนวัยและไกลเคชั่น

คีย์เวิร์ด: เอฟีดรา fragilis; วิธีการพื้นผิวการตอบสนอง การออกแบบกล่อง-Behnken; สารออกฤทธิ์ทางชีวภาพ RP-HPLC; กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระและ antiglycation

คลิกที่นี่เพื่อเรียนรู้ผลิตภัณฑ์เพิ่มเติม

1. บทนำ

การสัมผัสกับผู้รุกรานจากแหล่งต่าง ๆ อย่างต่อเนื่องอาจทำให้อนุมูลอิสระการผลิตในร่างกายมนุษย์เกินขีดความสามารถในการควบคุมพวกมัน และเมื่อเวลาผ่านไป มีส่วนช่วยในการพัฒนาโรคที่เกี่ยวข้องกับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันหลายอย่าง รวมถึงความชราภาพและโรคเบาหวาน[1] เพราะฉะนั้น,สารต้านอนุมูลอิสระการเสริมสามารถช่วยรักษาระบบชีวภาพที่เหมาะสมโดยการกำจัดอนุมูลอิสระที่มีความเข้มข้นมากเกินไป [2] แสดงให้เห็นว่าอนุมูลอิสระมีส่วนร่วมในกระบวนการไกลเคชั่น Glycation ซึ่งเป็นปฏิกิริยาที่ไม่ขึ้นกับเอนไซม์ที่เกิดขึ้นเองระหว่างกลุ่มอะมิโนที่มีอยู่ของกรดอะมิโนตกค้างในโปรตีนและน้ำตาลรีดิวซ์ เกิดขึ้นในระดับที่สูงขึ้นภายใต้อายุและภาวะน้ำตาลในเลือดสูง ส่งผลให้เกิดการผลิตและการสะสมของผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายไกลเคชั่น (AGEs) ขั้นสูง 3] นอกเหนือจากการรบกวนโปรตีนและเปลี่ยนแปลงการทำงานแล้ว AGEs ยังสามารถ

มีส่วนร่วมกับตัวรับสำหรับ AGEs (RAGE) ซึ่งเป็นตัวรับพื้นผิวหลายลิแกนด์เซลล์ 45 KDa ที่เป็นของอิมมูโนโกลบูลินซูเปอร์แฟมิลี [4] และกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณภายในเซลล์ดาวน์สตรีมหลายทางพร้อมกับการเพิ่มขึ้นของการผลิตอนุมูลอิสระที่นำไปสู่โรคแทรกซ้อนทางพยาธิวิทยาที่เกี่ยวข้อง เบาหวาน [5]

เป็นที่ทราบกันดีว่าสารต้านอนุมูลอิสระและโมเลกุลของกินของเน่าที่เป็นอนุมูลอิสระเป็นตัวป้องกันที่ดีต่อกระบวนการเหล่านี้ [6] การใช้พืชสมุนไพรในการป้องกันและปรับสมดุลโรคที่เกี่ยวข้องกับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันเป็นประเพณีทางการแพทย์ที่เก่าแก่ เมื่อเร็ว ๆ นี้ การศึกษาจำนวนมากได้แสดงให้เห็นว่าสารทุติยภูมิ เช่น แทนนิน กรดฟีนอลิก และฟลาโวนอยด์ที่มีสารต้านอนุมูลอิสระคู่และศักยภาพในการต้านไกลเคชั่นนั้นมีประสิทธิภาพมากกว่าในการรักษาโรคเบาหวาน [7] ดังนั้น การระบุแหล่งที่มาใหม่ของไฟโตเคมิคอลที่กำจัดอนุมูลอิสระอย่างมีประสิทธิภาพและลดการเกิดไกลเคชั่นที่ไม่ใช่เอนไซม์จึงเป็นเรื่องที่น่าสนใจอย่างยิ่ง

Ephedra fragilis เป็นสมาชิกของสกุล Ephedra (ตระกูล Ephedracea) ที่มีมากกว่า 60 สายพันธุ์ที่เติบโตในทะเลทรายและสภาพกึ่งแห้งแล้งในทั้งสองซีกโลกทั่วทั้งหกทวีป [8] เป็นเวลากว่า 5,000 ปีแล้ว หลายชนิดในสกุลเอฟีดราถูกใช้อย่างแพร่หลายในการแพทย์แผนจีน (TCM) เพื่อรักษาโรคต่างๆ มีการศึกษาหลายชิ้นที่รายงานถึงประโยชน์ต่อสุขภาพหลายประการ เช่น ต้านการอักเสบ [9, ต้านการรุกราน, ต้านการสร้างเส้นเลือดใหม่, [10], ต้านจุลชีพ, ต้านการงอกขยาย, โปรอะพอพโทติค[11], ปกป้องระบบประสาท [12], ปกป้องตับ และต้าน -คุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระ [13] สารฟลาโวนอยด์ อัลคาลอยด์ กรดฟีนอลิก และสารประกอบอื่นๆ ในพืชเอฟีดราถือเป็นองค์ประกอบหลักทางพฤกษเคมีสำหรับคุณสมบัติทางเภสัชวิทยาเหล่านี้ [14] ในอุตสาหกรรมเภสัชกรรม โครมาโตกราฟีของเหลวสมรรถนะสูงแบบย้อนกลับเฟส (RP-HPLC) ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นวิธีการวิเคราะห์ในการตรวจหาและระบุสารประกอบทางเคมีตามคุณสมบัติไม่ชอบน้ำที่แตกต่างกัน แม้ว่าจะมีการอธิบายการศึกษาเพียงเล็กน้อยในเอกสารประกอบการวิเคราะห์ทางเคมีของ สายพันธุ์เอฟีดรา

กระบวนการสกัดสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพเหล่านี้จากแหล่งพืชต่างๆ เป็นขั้นตอนสำคัญขั้นตอนแรกที่เกี่ยวข้องกับการวิเคราะห์เชิงคุณภาพและเชิงปริมาณ [15] ปัจจัยต่างๆ ได้แก่ วิธีการสกัด ชนิดและความเข้มข้นของตัวทำละลาย อุณหภูมิ เวลา และอื่นๆ สามารถมีอิทธิพลอย่างมีนัยสำคัญต่อองค์ประกอบและอัตราการสกัดของสารประกอบเหล่านี้ [16] ดังนั้น จำเป็นต้องมีการปรับให้เหมาะสมของกระบวนการสกัดเพื่อให้ได้สารประกอบออกฤทธิ์จากพืชในปริมาณสูง พัฒนาขึ้นในปี 1950 โดย Box and Wilson วิธีการพื้นผิวการตอบสนอง (RSM) เป็นเครื่องมือที่ใช้บ่อยที่สุดในการดำเนินการ ปรับปรุง และเพิ่มประสิทธิภาพกระบวนการดังกล่าว ซึ่งปัจจัยอิสระมีผลกระทบต่อการตอบสนองที่ต้องการ การออกแบบที่นักวิจัยเลือกบ่อยที่สุดใน RSM คือการออกแบบ Box-Behnken (BBD) เนื่องจากต้องมีการทดลองใช้ที่จำกัด ดังนั้นจึงเป็นทางเลือกหนึ่งที่หลีกเลี่ยงการทดลองเป็นเวลานานและลดค่าใช้จ่าย [17-19]

จนถึงปัจจุบัน ยังไม่มีการศึกษาในเอกสารเกี่ยวกับการเพิ่มประสิทธิภาพการสกัดสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพของ E. fragilis ดังนั้น การศึกษานี้จึงมุ่งที่จะเพิ่มประสิทธิภาพการสกัดสารโททัลฟีนอล (TP) และฟลาโวนอยด์ (TF) จากอีฟราจิลิสโดยใช้สารบีบีดี สารสกัดเอธานอลแบบหยาบ (CEE) ที่ได้รับภายใต้สภาวะการสกัดที่เหมาะสมที่สุดถูกแยกส่วนตามลำดับด้วยตัวทำละลายที่มีขั้วที่เพิ่มขึ้น และทำการตรวจสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ต้านไกลเคชันของพวกมันโดยใช้การทดสอบในหลอดทดลองที่แตกต่างกัน สุดท้าย เราทำการวิเคราะห์ด้วยซิลิโกเพื่อทำความเข้าใจกลไกเพิ่มเติมโดยที่สารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพใน EAE ตามที่ระบุโดยโครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงแบบรีเวิร์สเฟส (RP-HPLC) จับกับ BSA และ RAGE เป็นโปรตีนเป้าหมาย

2. ผลลัพธ์และการอภิปราย

2.1. การติดตั้งรุ่น

RSM with a BBD was applied to investigate the effect of ethanol concentration (%, Xj), temperature(°C, X2), and time (h, X3)on the extraction yield of TP and TF from E. fragilis. The results of 15 trials after the BBD are given in Table 1. Analysis of variance(ANOVA)(Table 2) indicates that the models were significant as evidenced by F and p-values. The coefficient of multiple determinations (R')of the models were 0.9935 and 0.9939 for TP and TF, respectively, suggesting that only 0.65 and 0.61%of the total variations are not explained by the models. A comparable value of adjusted R2 to R2 represents an excellent statistical model. As given in Table 2, the adjusted R2(0.9818 and 0.983 for TP and TF contents, respectively) is close to R2, which means that the insignificant terms were not included in the models. Moreover, predicted R2(0.9012 and 0.9338 for TP and TF contents, respectively) is in reasonable agreement with adjusted R2 and confirms that the models are highly significant. The"fitness" of the models was also confirmed using the lack of fit test The insignificant p-value for lack of fit (p >{{0}}.05) สำหรับการตอบสนองสองครั้งบ่งชี้ถึงความเหมาะสมของแบบจำลองสำหรับการทำนายความผันแปรในผลลัพธ์อย่างแม่นยำ [20] ความแม่นยำที่ดีได้รับการอธิบายว่าเป็นอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนที่มากกว่า 4 ซึ่งถือว่าเป็นที่ต้องการ [21] ค่าความแม่นยำที่เพียงพอคือ 29.4772 และ 28.729 สำหรับเนื้อหา TP และ TF ตามลำดับ ซึ่งแสดงถึงสัญญาณที่เพียงพอ ค่าสัมประสิทธิ์การแปรผันที่น้อยกว่า (ร้อยละ CV ) พร้อมกัน (1.52 และ 0.4246 เปอร์เซ็นต์สำหรับเนื้อหา TP และ TF ตามลำดับ) บ่งชี้ความแม่นยำและความน่าเชื่อถือที่ดีขึ้นของค่าทดลอง สำหรับแต่ละปัจจัยตอบสนอง อิทธิพลของปัจจัยการสกัด XI (ความเข้มข้นของเอทานอล), X2 (อุณหภูมิการสกัด) และ X3 (เวลาในการสกัด) ได้รับการตรวจสอบอย่างรอบคอบ (ตารางที่ 2) ความสำคัญของค่าสัมประสิทธิ์แต่ละค่าได้รับการทดสอบโดยใช้ค่า F และ p โดยพิจารณาว่าค่า F ที่มากกว่าและค่า p ที่น้อยกว่าจะทำให้เกิดความสอดคล้องกันระหว่างตัวแปรอิสระต่างๆ [22] โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าแบบจำลองสามารถทำซ้ำได้และเหมาะสมสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพ

2.2. ผลกระทบของตัวแปรการสกัดต่อเนื้อหา TP

ตามที่ให้ไว้ในตารางที่ 2 ผลลัพธ์ ANOVA แสดงให้เห็นผลกระทบเชิงเส้น (X และ X2) สมการกำลังสอง (Xj, X5 และ X) และการโต้ตอบ (X1X และ X2X3) ที่มีนัยสำคัญต่อเนื้อหา TP ในกลุ่มเหล่านี้ เนื้อหา TP ส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับ X, X3 ที่ p<0.001 followed="" by="" x1="" and="" x1x,="" at=""><0.01. the="" following="" second-order="" polynomial="" equation="" could="" be="" used="" to="" express="" the="" relationship="" between="" tp="" content="" and="">

ค่าของการขาดความพอดีนั้นไม่มีนัยสำคัญ (ค่า F =11.02, p-value=0.0843) ซึ่งบ่งชี้ว่าแบบจำลองนั้นได้รับการคาดการณ์ที่ดี (R{ {9}}.9935; Adj R2=0.9818)(ตารางที่ 2)

ปฏิกิริยาระหว่างความเข้มข้นของเอทานอลและอุณหภูมิการสกัด (XjX2) ทำให้เกิดนัยสำคัญอย่างมาก (p<0.01)effect on="" tp="" content="" (table2).="" as="" ethanol="" concentration="" (x1)="" and="" extraction="" temperature="" (x)increase="" in="" the="" range="" of="" 40-61.80%="" and="" 25-44.30°c="" respectively,="" the="" tp="" content="" increases="" rapidly.="" however,="" beyond="" 61.80%and="" 44.30°c,="" tp="" content="" decreases="" slightly(figure="" 1a).="" however,="" the="" interaction="" of="" the="" extraction="" temperature="" and="" extraction="" time="" (x2x3)showed="" a="" highly=""><0.001) effect="" on="" tp="" content="" (table="" 2).="" as="" shown="" in="" figure="" 1b,="" tp="" content="" slightly="" improved="" with="" increasing="" extraction="" temperature="" (x2)and="" extraction="" time="" (x3)up="" to="" 44.37℃c="" and="" 15.77="" h,="" respectively,="" but="" diminished="" slowly="">

ผลกระทบเหล่านี้อาจเนื่องมาจากข้อเท็จจริงที่ว่าสารประกอบฟีนอลิกเป็นโมเลกุลที่มีขั้วซึ่งเกิดขึ้นตามธรรมชาติกับกลูโคไซด์ ซึ่งทำให้พวกมันละลายน้ำได้มากขึ้น [23] เนื่องจากการสกัดสารประกอบฟีนอลิกขึ้นอยู่กับขั้วของตัวทำละลายอย่างมาก ส่วนผสมระหว่างน้ำกับแอลกอฮอล์จึงมีประสิทธิภาพในการสกัดมากกว่าแอลกอฮอล์เพียงอย่างเดียว [20] ในแง่ของหลักการ "เหมือน-ละลาย-เหมือน" การลดลงของความเข้มข้นของเอทานอลนำไปสู่การเพิ่มขึ้นของขั้วของตัวทำละลาย ซึ่งช่วยให้ละลาย TP[15] อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นของเอทานอลที่สูงสามารถส่งผลต่ออัตราการสกัดโดยป้องกันการละลายของสารประกอบฟีนอลิก ในทำนองเดียวกัน การเพิ่มขึ้นของอุณหภูมิในการสกัดเพิ่มการฟื้นตัวของสารประกอบฟีนอลิกเป้าหมายโดยการทำให้เนื้อเยื่ออ่อนตัวลง ทำให้ความสมบูรณ์ของผนังเซลล์อ่อนแอลง การถ่ายเทมวลที่เพิ่มขึ้นและการแทรกซึมของตัวทำละลายเข้าไปในเมทริกซ์ของพืช และเพิ่มทั้งความสามารถในการละลายและอัตราการแพร่ อย่างไรก็ตาม อุณหภูมิที่สูงเกินไปสำหรับการสกัดเป็นเวลานานอาจเพิ่มโอกาสในการย่อยสลาย [23] นอกจากนี้ พบว่าระยะเวลาการสกัดที่ยาวนานอาจทำให้ออกซิเจนและแสงเพิ่มขึ้นได้ ซึ่งท้ายที่สุดแล้วจะเพิ่มความเสี่ยงของการเกิดอนุมูลอิสระที่สามารถกำจัดโดยสารประกอบฟีนอลิก [23] ดังนั้น การขยายเวลาการสกัดจึงไม่เป็นประโยชน์ในการเพิ่มผลผลิตสูงสุด [24]

2.3.ผลกระทบของตัวแปรการสกัดต่อเนื้อหา TF

ดังที่เห็นได้จากตารางที่ 2 ผลเชิงเส้นของ X และ X3; เอฟเฟกต์กำลังสองของ X และ X; และผลการโต้ตอบของ X1X2 และ XjXg แสดงให้เห็นถึงผลกระทบที่สำคัญต่อเนื้อหา TF ในบรรดาปัจจัยที่สำคัญทั้งหมด TF ส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับ X3,X,X,X และ X1X2 ที่ p<0.001 followed="" by="" x="" andx1x3="" at=""><0.01. the="" fitted="" second-order="" polynomial="" of="" tf="" content="" is="" as="">

ค่าที่ไม่มีนัยสำคัญของการขาดความพอดี(ค่า F=1.13; p-value=0.5024) แนะนำว่าแบบจำลองที่เสนอนั้นเหมาะสมกับอิทธิพลเชิงพื้นที่ของตัวแปรต่อการตอบสนองด้วยดี การทำนาย (R2=0.9939; Adj R2= 0.9830) (ตารางที่ 2)

กราฟพื้นผิวการตอบสนอง 3 มิติต่างๆ ถูกสร้างขึ้นสำหรับเนื้อหา TF และแสดงในรูปที่ 1D-F ผลอันตรกิริยาของความเข้มข้นของเอทานอลและอุณหภูมิการสกัด (X1X2) แสดงให้เห็นอย่างมีนัยสำคัญ(p<0.001) effect="" on="" tf="" content.="" from="" figure="" 1d,="" tf="" content="" increased="" at="" first="" and="" then="" decreased="" quickly="" with="" the="" rise="" of="" the="" two="" parameters,="" and="" a="" maximum="" tf="" content="" was="" achieved="" when="" ethanol="" concentration="" (xj)="" and="" extraction="" temperature="" (xo)were="" 61.89%="" and="" 44.23°c,="" respectively.="" this="" phenomenon="" is="" similar="" to="" tp,="" which="" might="" also="" be="" attributed="" to="" the="" fact="" that="" a="" rise="" in="" the="" extraction="" temperature,="" the="" solubility,="" extraction="" rate,="" and="" diffusion="" rate="" increase,="" which="" ultimately="" helps="" tf="" to="" dissolve="" insolvent="">

ในทำนองเดียวกัน อันตรกิริยาระหว่างความเข้มข้นของเอทานอลและเวลาในการสกัด (XIX3) แสดงความสัมพันธ์ที่คล้ายคลึงกัน (รูปที่ 1F) ผลผลิตการสกัดของ TF ค่อยๆ เพิ่มขึ้นตามการเพิ่มความเข้มข้นของเอทานอล (Xj) และเวลาในการสกัด (X3) เพิ่มขึ้น ใกล้จุดกึ่งกลางของแผนภาพการตอบสนอง (ร้อยละ 61.89 และ 15.81 ชั่วโมงสำหรับ X และ X3 ตามลำดับ) อัตราผลตอบแทน TF สูงถึงระดับสูงสุด แต่ลดลงอย่างช้าๆ หลังจากนั้น ปรากฏการณ์นี้เป็นไปได้มากที่สุดเนื่องจากกฎข้อที่สองของหลักการการแพร่กระจายของ Fick เผยให้เห็นว่าสมดุลสุดท้ายระหว่างความเข้มข้นของสารละลายในเมทริกซ์ที่เป็นของแข็งและตัวทำละลายจะเกิดขึ้นหลังจากช่วงเวลาหนึ่งซึ่งนำไปสู่การลดความเร็วในผลผลิตการสกัดของสารประกอบเป้าหมาย [26] .

2.4. การตรวจสอบเงื่อนไขที่เหมาะสมที่สุด

จุดมุ่งหมายของการเพิ่มประสิทธิภาพคือการกำหนดเงื่อนไขการสกัดที่จะให้เนื้อหา TP และ TF สูงสุดพร้อมกัน ซอฟต์แวร์ผู้เชี่ยวชาญด้านการออกแบบใช้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพ BBD เสนอความเข้มข้นของเอทานอลที่เหมาะสม อุณหภูมิในการสกัด และเวลาเป็นร้อยละ 61.93 , 44.43 องศา และ 15.84 ชั่วโมง ตามลำดับ สำหรับการสกัดสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพของ E. fragilis ที่จุดที่เหมาะสมที่สุดนี้ ปริมาณ TP และ TF ที่คาดการณ์ไว้คือ 15.335 มก. GAE/g dw และ 2.972 มก. OE/g dw ตามลำดับ (ตารางที่ 3) การตรวจสอบความสามารถในการคาดการณ์ของแบบจำลองได้ดำเนินการทดลองภายใต้สภาวะที่เหมาะสมที่สุดที่ได้รับจาก RSM การทดลองดำเนินการเป็นสามเท่าภายใต้เงื่อนไขที่ได้รับ และค่าเฉลี่ยของเนื้อหา TP และ TF เท่ากับ 14.98±0.29GAE/g DW และ 2.92±0.09 QE/g dw ตามลำดับ ค่าการทดลองของการตอบสนองที่ตรวจสอบมีการเปรียบเทียบและสอดคล้องกับค่าที่คาดการณ์ไว้ ซึ่งยืนยันว่าแบบจำลองนั้นเพียงพอที่จะสะท้อนถึงการเพิ่มประสิทธิภาพที่คาดหวัง

2.5. ผลผลิตการสกัดและการวิเคราะห์ไฟโตเคมิคอล

ตารางที่ 4 แสดงผลผลิตการสกัดของ E.fragilis CEE และเศษส่วน ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าผลผลิตที่ได้จากการแยกส่วนแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญจาก 0.78 ถึง 10.6 เปอร์เซ็นต์ (w/wo) ดังแสดงในตารางที่ 4 CEE(1{{14}) }.6 เปอร์เซ็นต์ )มีเปอร์เซ็นต์ผลตอบแทนสูงสุด รองลงมาคือ WF (2.73 เปอร์เซ็นต์ ), WBF (2.{16}}4 เปอร์เซ็นต์ ), DMF(0.64 เปอร์เซ็นต์ ) และ EAF (0.93 เปอร์เซ็นต์ ) ในขณะที่ HF (0.78 เปอร์เซ็นต์) )มีอัตราผลตอบแทนต่ำสุด

ปริมาณ TP ของ E. fragilis CEE และเศษส่วนถูกกำหนดโดยสมการถดถอยของเส้นโค้งการสอบเทียบ (y {0}}}.009x-0{{ 25}}154; R2=0.9973) และแสดงออกเป็นมิลลิกรัมเทียบเท่ากรดแกลลิก (GAE) ต่อกรัมของน้ำหนักแห้ง (ตารางที่ 4) โดยทั่วไป EAF มีเนื้อหา TP สูงสุด (32.78±0.49 มก. GAE/g DW) ตามมาด้วย WBF, DMF และ CEE (25.02±1.01,19.21±0.22 และ14.98±0.29 มก. GAE/g ตามลำดับ DW) ในขณะที่ WF และ HF แสดงเนื้อหาต่ำสุด (10.47±0.71 และ 8.14±0.17 มก. GAE/g DW ตามลำดับ) ปริมาณ TF ของ E. fragilis CEE และเศษส่วนได้รับการประเมินโดยการทดสอบสีอะลูมิเนียมคลอไรด์โดยใช้เควอซิทินas a standard (y=0.0295x+0.0361; R2=0.9986)(Table 4). Similar to the TP content, the same results were observed in the TF content with the highest and lowest content being detected in the EAF(10.50 ± 0.11 mg OE/g of DW)and HF(1.65± 0.13 mg OE/g of DW), respectively. The TF content is arranged as the following sequence: EAF>WBF>DMF> CEE>WF>เอช.เอฟ. สิ่งที่น่าสนใจคือ ปริมาณ TP และ TF ใน EAF คือ 2.18 และ 3 59-เท่าของค่า CEE ซึ่งบ่งชี้ว่าเอทิลอะซิเตตอาจเป็นตัวทำละลายที่เหมาะสมในการรวมสารประกอบฟีนอลและฟลาโวนอยด์ที่มีอยู่มากขึ้นในระหว่างการแยกส่วน CEE ข้อมูลของเราเกี่ยวกับเนื้อหา TP และ TF นั้นสอดคล้องกับเนื้อหาของ Yao et al [27] ผู้รายงานว่า EAF ที่ได้จากพืชสมุนไพร Pyrola asarifolia มีระดับฟีนอลและฟลาโวนอยด์สูงสุดเมื่อเทียบกับเศษส่วนอื่นๆ (ปิโตรเลียมอีเทอร์ เอ็น-บิวทานอล และน้ำ) ในการศึกษาของพวกเขา Bhardwaj et al. [28]ยังรายงานผลลัพธ์ที่คล้ายกันเมื่อใช้ตัวทำละลายหลายชนิดที่มีขั้วเพิ่มขึ้น (เอ็น-เฮกเซน, คลอโรฟอร์ม, เอทิลอะซิเตท และเอ็น-บิวทานอล) ในการแตกตัวของพืชสมุนไพร Codonopsis clematidea ตามที่ผู้เขียนเหล่านี้ระบุว่า EAF มีเนื้อหา TP และ TF สูงสุด รองลงมาคือเอ็น-บิวทานอล คลอโรฟอร์ม และเฮกเซน ความผันแปรที่มีนัยสำคัญในผลผลิต องค์ประกอบ และความบริสุทธิ์ของสารประกอบฟีนอลิกระหว่างเศษส่วนนี้อาจเนื่องมาจากความแตกต่างในขั้วขององค์ประกอบที่พบในวัสดุพืช โครงสร้างทางเคมี ระดับการเกิดพอลิเมอไรเซชัน และปฏิกิริยาระหว่างกัน [29 ].

2.6. กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระในหลอดทดลอง

2.6.1.DPPH"กิจกรรมการกวาดล้าง

DPPH" เป็นหนึ่งในอนุมูลอิสระที่เสถียรไม่กี่ชนิดที่ใช้กันอย่างแพร่หลายเพื่อตรวจสอบศักยภาพในการต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดจากพืช [30] ศักยภาพในการเก็บขยะของสารสกัดมักเกี่ยวข้องกับความสามารถในการกำจัดอนุมูลอิสระที่เสถียรซึ่งเกิดจากความสามารถในการให้ไฮโดรเจน .

ได้ทำการศึกษาความสามารถในการขจัดของ CEE/เศษส่วนและ VC ที่ปริมาณที่แตกต่างกันของอนุมูลอิสระ DPPH* รูปที่ 2A แสดงให้เห็นว่าเศษส่วนทั้งหมดแสดงการออกฤทธิ์ของ DPPH·scavenging ที่ชัดเจนในรูปแบบที่ขึ้นกับขนาดยาในช่วงของ0.1 ถึง 1 มก./มล. ที่ขนาดยา 1 มก./มล.,64.32,44.1{{22} },67.24,86.63,80.95,51.37,และ99.62 เปอร์เซ็นต์ของ DPPH"รุนแรงถูกระงับโดย CEE, HE, DMF, EAF, WBF, WF และ VC ตามลำดับ IC5 ที่ต่ำที่สุด0สำหรับ DPPH ที่ดักจับ"จากเศษส่วนทั้งหมดถูกแสดงโดย EAF(0.116±{{30}}}015 มก./มล. )ดำเนินการโดย WBF (0.175 ± 0.03 มก./มล.),CEE (0.23 ± 0.065 มก./มล.)และ DMF (0.297 ±0.044 มก./มล.)WFและ HF แสดงค่า IC50 ที่ค่อนข้างสูงกว่า (0.964±0.178 และ 1.245±0.105 มก./มล.) ตามลำดับ

Observed differentials in the scavenging activities of the fractions against the DPPH*radical may be assigned to the structural characteristics and the number of phenolic compounds present in each fraction. Similar results were observed in the medicinal plant Liquidambar formosana Hance leaf since the EAF was more effective than the other fractions (dichloromethane, n-butanol, and water fractions)[31]. As a standard molecule, ascorbic acid (VC) displayed the lowest IC50 value (0.039 ±0.009 mg/mL) in comparison to all fractions. The scavenging potential is in decreasing order of VC>EAF> WBF>DMF >CEE>WF>เอช.เอฟ.

ค่า IC50 สำหรับการขจัดอนุมูล DPPH มีความสัมพันธ์เชิงบวกอย่างมีนัยสำคัญกับทั้งเนื้อหา TP (r=0.963;p<0.01) and="" tf="" content(r=""><0.01)as presented="" in="" table="" 5.="" therefore,="" the="" discovered="" antioxidant="" activity="" suggested="" that="" eaf="" can="" be="" a="" source="" of="" numerous="" natural="" compounds="" with="" antioxidant="" properties="" that="" can="" act="" as="" hydrogen="" donors="" to="" terminate="" the="" process="" of="" oxidation="" by="" converting="" the="" free="" radicals="" to="" their="" stable="">

2.6.2.ABTS· บวกกับกิจกรรมการกวาดล้าง

การทดสอบการขจัดของ ABTS ถูกใช้อย่างกว้างขวางเป็นดัชนีเพื่อแจ้งและตรวจสอบความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระของสารประกอบบริสุทธิ์ตลอดจนสารสกัดจากธรรมชาติ [32,33] การซีดจางของสีน้ำเงิน/เขียวของโครโมฟอร์ ABTS* ที่ 734 เมื่อมีสารสกัดจากพืชอาจบ่งบอกถึงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ

ดังที่แสดงในรูปที่ 2B เส้นโค้งการกวาดล้างของ CEE/เศษส่วนบน ABTS* บวกกับ exhib-it มีแนวโน้มสูงขึ้นเมื่อความเข้มข้นเพิ่มขึ้น ที่ 1 มก./มล. อัตราการกำจัดของ CEE, HF,DMF,WBF,EAF, WF และ VC คือ 80.31,40.54,88.76, 9{{2{ {22}}}}.11,82.97, 67.36 และ 94.90 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ ในบรรดาเศษส่วนทั้งหมด ค่า IC ต่ำสุด0 แสดงโดย EAF(0.11{{30}}±0.{36}}14 มก./ มล.)ดำเนินการโดย DMF(0.196±0.023 มก./มล.),WBF (0.277±0.031 มก./มล.), CEE(0.429 ± 0.039 มก./มล.) และ WF(0.654± 0.043 มก./มล.) ในขณะที่ HF แสดงค่า ICs0 สูงสุด (1.314 ± 0.104 มก./มล.) โดยรวมแล้วการค้นพบนี้เห็นด้วยกับแก้วสีจันทร์และศิริอมรพันธุ์ [29] เมื่อเปรียบเทียบกับความสามารถในการยับยั้งของ VC (0.025±0.005 มก./มล.) พบว่ากิจกรรมการกำจัดของ CEE และเศษส่วนของมันอ่อนแอเล็กน้อย

ดังที่แสดงในตารางที่ 5 ความสัมพันธ์ที่มีนัยสำคัญอย่างมากของการกำจัดอนุมูล ABTS กับเนื้อหา TP (r=0.921;p<0.01), and="" a="" significant="" correlation="" with="" tf="" content="" (r=""><0.05), were="" shown.="" this="" finding="" confirms="" the="" results="" obtained="" for="" the="" dpph*scavenging="" assay,="" proving="" the="" capacity="" of="" eaf="" to="" scavenge="" free="">

2.6.3. กิจกรรมกวาดล้าง H2O2

ในฐานะที่เป็นปัจจัยหลักที่ทำให้เกิดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน H2O2 จึงแพร่กระจายอย่างรวดเร็วผ่านเซลล์ต่างๆ ทั่วเยื่อหุ้มเซลล์เป็นโมเลกุลของสาร เมื่อนำมารวมกัน H2O2 เองนั้นไม่เป็นอันตราย [35] แต่มันสามารถทำปฏิกิริยากับ Fe2 ผ่านปฏิกิริยาเฟนตัน และทำให้เกิดไฮดรอกซิลเรดิคัล (OH*) ที่มีปฏิกิริยาสูง[36] ดังนั้นจึงเป็นอันตรายต่อ ROS มากที่สุดต่อสารชีวโมเลกุล ดังนั้นจึงจำเป็นต้องประเมินความสามารถของ CCE และเศษส่วนต่างๆ เพื่อกำจัด H2O2

Scavenging activities of CEE/fractions, as well as standard antioxidants, were presented in Figure 2C. Notably, all extracts showed a strong scavenging activity on HO, which increased with the increase of sample doses ranging from 0.1 to 1 mg/mL. Moreover, the H2O2 scavenging potential decreased in the order of EAF> WBF>DMF>CEE>WF>HF และความสามารถในการกำจัดที่สอดคล้องกันที่ 1.0 มก./มล. คือ 84.56,75.24, 67.17,56.18, 50.19 และ 34.95 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ ซึ่งต่ำกว่า VC มาก (98.03 เปอร์เซ็นต์)

ในบรรดาเศษส่วนทั้งหมด EAF แสดงค่า IC50 ต่ำสุด (IC0= 0.098±0.013 มก./มล.) และมีค่าสูงกว่าค่าของ IC อย่างมีนัยสำคัญ VC (0.024±0.006 มก./มล.) ซึ่งอาจเกิดจากการมีสารประกอบฟีนอลและฟลาโวนอยด์สูงใน EAF ซึ่งเป็นที่รู้จักกันอย่างแพร่หลายว่ามีบทบาทสำคัญในการเป็นสารต้านอนุมูลอิสระในระบบชีวภาพ ในการศึกษาล่าสุดของเรา เราแสดงให้เห็นถึงความสามารถของ EAF จาก E.fragilis ในการปกป้อง Tetrahymena pyriformis จาก H2O2- ความเสียหายที่เกิดจากออกซิเดชัน [37]

การวิเคราะห์ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่า สำหรับผลลัพธ์ DPPH" และ ABTS* บวก ความสัมพันธ์เชิงบวกที่แข็งแกร่งของค่า IC0 สำหรับการขจัด H2O2 ถูกบันทึกไว้ด้วยเนื้อหา TP ทั้งสอง (r=0.926; p<0.01) and="" tf="" content="" (r=""><0.01)(table 5).="" in="" their="" study,="" sroka="" and="" cisowski="" [38]="" reported="" also="" a="" positive="" correlation="" between="" phenolic="" compounds="" with="" ho2-scavenging="" ability.="" according="" to="" these="" authors,="" the="" ho2-scavenging="" depended="" strongly="" on="" the="" number,="" positions,="" and="" the="" model="" of="" substitution="" of="" oh="" bonded="" to="" the="" aromatic="" ring="" of="" phenolic="">

2.6.4. ลดแรง

พลังการลดของสารสกัดทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ถึงศักยภาพในการต้านอนุมูลอิสระ [39, A40] ศักยภาพในการต้านอนุมูลอิสระประเมินโดยความสามารถของสารต้านอนุมูลอิสระในการลดธาตุเหล็ก (Fe3) ในเฟอริกคลอไรด์เป็นเหล็ก (Fe2 บวก) โดยทั่วไป คุณสมบัติในการรีดิวซ์นั้นมาจากการมีอยู่ของสารสกัดจากพืชรีดักโทน ซึ่งเป็นที่ยอมรับกันว่าใช้แรงกระทำโดยการทำลายสายโซ่อนุมูลอิสระโดยการบริจาคอะตอมไฮโดรเจน [41]

รูปที่ 2D แสดงเส้นกราฟการตอบสนองขนาดยาสำหรับกำลังรีดิวซ์ของสารสกัด E. fragilis เป็นที่ทราบกันดีอยู่แล้วว่ายิ่งการดูดกลืนแสงที่ 700 นาโนเมตรสูงเท่าใด ความสามารถในการลดลงก็จะยิ่งมากขึ้นเท่านั้น ในการศึกษาปัจจุบัน CEE และเศษส่วนห้าส่วนแสดงกำลังการลดลงอย่างมากในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้น

EAF แสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระสูงสุด (EC{{0}}.136± 0.{{10}}13 มก./มล.) เมื่อเปรียบเทียบกับ VC(EC{{4 }}.083± 0.005 มก./มล.)ตามมาด้วย WBF (EC50=0.180 ± 0.028 มก./มล.), DMF (EC50=0.319 ± 0.031 มก./มล.), CEE (EC50=0.334±0.029 มก./มล.)และ WF(EC50=0.398±0.064 มก./มล.) .HF ตามหลังซึ่งแสดงกิจกรรมกำลังรีดิวซ์ขั้นต่ำ (EC5s0 =0.626±0.068 มก./มล.) เมื่อเทียบกับเศษส่วนอื่นๆ การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่า EAF อาจมีสารประกอบแต่ละตัวที่มีกิจกรรมการลดพลังงานที่มีประสิทธิภาพและมีศักยภาพ นักวิทยาศาสตร์พบว่าสารสกัดจากเอทิลอะซิเตทอาจทำหน้าที่เป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่ง [42]

พบความสัมพันธ์เชิงบวกระหว่างกำลังรีดิวซ์และทั้งเนื้อหา TP และ TF (r=0.975; p<0.01 and="" r="0.987;"><0.01; respectively).these="" correlations="" confirmed="" the="" contribution="" of="" phenolic="" compounds="" in="" the="" reducing="" power="">

2.6.5. การทดสอบฟอสโฟโมลิบดีนัม

TAC ของ CEE และเศษส่วนของมัน รวมทั้ง VC ถูกประเมินโดยใช้การสอบวิเคราะห์ฟอสโฟ-โมลิบดีนัมและแสดงเป็น EC0 ซึ่งเป็นความเข้มข้นที่ให้ 0.5 ของการดูดกลืนแสง วิธีการนี้ขึ้นอยู่กับการลดลงของ Mo(VI) เป็น Mo(V) โดยสารสกัดเพื่อสร้างสารเชิงซ้อนสีเขียวฟอสเฟต/โม (V) ที่ pH ที่เป็นกรดพร้อมการดูดซึมสูงสุดที่ 695 นาโนเมตร [43]

As shown in Figure 2E, the total antioxidant capacity of CCE/fractions and VC correlated well with increasing concentrations in the range of 0.1 to 1 mg/mL.Of the CEE fractions, the ECs0 values ranged from 0.159±0.019 to 0.604±0.073 mg/mL, with a descending order of EAF>WBF> DMF> CEE >WF>HF(p<0.05), which="" indicates="" that="" eaf="" and="" hf="" had="" the="" highest="" and="" lowest="" antioxidant="" activity,="" respectively.="" this="" activity="" could="" be="" due="" to="" the="" presence="" in="" eaf="" of="" various="" phenolic="" compounds="" that="" might="" possess="" antioxidant="" activity.="" vc,="" which="" is="" the="" positive="" control,="" displayed="" the="" lowest="" ec5o="" value="" (0.095±="" 0.008="" mg/ml)="" in="" comparison="" to="" all="">

มีการสังเกตความสัมพันธ์ที่มีนัยสำคัญอย่างมากระหว่างฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระทั้งหมดกับทั้งเนื้อหา TP และเนื้อหา TF (r=0.978 สำหรับทั้งสอง; p<0.01) and="" is="" shown="" as="" presented="" in="">

2.6.6. -ระบบโมเดลแคโรทีน-ไลโนเลต

ในแบบจำลองกรดแคโรทีน-ไลโนเลอิก โมเลกุลแคโรทีนที่ไม่อิ่มตัวสูงจะเกิดการเปลี่ยนสีอย่างรวดเร็วเนื่องจากอนุมูลอิสระไลโนเลตที่เกิดจากการออกซิเดชันของกรดไลโนเลอิก [44] การเสริมด้วยสารต้านอนุมูลอิสระสามารถลด -carotene oxidation โดย neutralizing linoleate free radicals และยับยั้ง -carotene bleaching [45]

Antioxidant activity of CCE/fractions and BHT, as measured by the β-carotene-linoleate model, are shown in Figure 2F. All tested extracts showed concentration-dependent scavenging activity. The EAF, which contained the highest amount of phenolics and flavonoids contents, showed a significant effect in inhibiting β-carotene bleaching, reaching 74.75%at a concentration of 1mg/mL. WBF, CCE, DMF, HF, and WF inhibited the oxidation of β-carotene by 51.61,58.12,50.09,41.39, and 31.66% respectively, at the same concentration. Overall, decreasing antioxidant activity was depicted as EAF> WBF> CEE>DMF>HF>WF.

EAF แสดงค่า IC50 ขั้นต่ำ (IC50=0.127 ± 0.{{10}}42 มก./มล.) เมื่อเปรียบเทียบกับ BHT (ICs { {5}}.049 ± 0.001 มก./มล.) WBF. ป.ป.ช. ดีเอ็มอี เรา. และไอซีที่แสดงโดย HF ที่ค่อนข้างสูงกว่า0ค่าของ 0.5±0.111 มก./มล., 0.998 ± 0.101 มก./มล., 1.073 ± 0.084 มก./มล.,1.402 ± 0.058 มก./มล. และ 2.209±0.081 มก./มล. ตามลำดับ

สังเกตความสัมพันธ์ที่มีนัยสำคัญในทางบวกระหว่างการขับ -carotene oxidation scavenging และทั้งเนื้อหา TP (r= 0.850;p<0.05) and="" tf="" content="" (r=""><0.05)(table 5).="" this="" result="" suggests="" that="" eaf="" may="" contain="" some="" antioxidants="" that="" can="" inhibit="" the="" formation="" of="" hydroperoxide="" and="" stop="" the="" radical-chain="" reaction="">

The involvement of reactive oxygen species (ROS) in several pathological situations has been growing recently. Bioactive compounds are gaining interest thanks to their potent antioxidant activity, but their complexity imposes the development of many methods to evaluate the antioxidant activity and the effectiveness of these chemical compounds. Thus, in this study, CEE and its fractions have been investigated for their antioxidant potential using six assays: DPPH, ABTS, H>O, RP, TAC และ -carotene ดังนั้นเราจึงแสดงให้เห็นว่ากิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระที่มีศักยภาพของ CEE และเศษส่วนของมันแสดงกิจกรรมการขจัดที่สูงขึ้น และอาจเนื่องมาจากองค์ประกอบของกรดฟีนอลิกและฟลาโวนอยด์ เช่น กรดแกลลิก รูติน และเควอซิติน