Pingping Zou

Pingping Zoua,†, Yuelin Songb,†, Wei Leia, Jun Lib, เผิงเฟยทัว,b,

หยงเจียง⁎

acetate ห้องปฏิบัติการหลักของยาธรรมชาติและยาชีวเคมี โรงเรียนเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยปักกิ่ง ปักกิ่ง 100191 ศูนย์วิจัยการแพทย์แผนจีนสมัยใหม่ของจีน โรงเรียนแพทย์จีน Materia Medica มหาวิทยาลัยการแพทย์จีนปักกิ่ง ปักกิ่ง 100029 ประเทศจีน

รับ 17 พฤษภาคม 2560; แก้ไขเมื่อ 20 มิถุนายน 2560; ได้รับการยอมรับ 17 กรกฎาคม 2017

เชิงนามธรรม: Cistanche deserticola(ซีดี) เป็นหนึ่งในสองพืชต้นทางที่เชื่อถือได้ของซิสตันเชส เฮอร์บา, พืชสมุนไพรที่มีชื่อเสียง ในที่นี้ สเปกโตรสโคปี 1H NMR ถูกใช้เพื่อกำหนดลักษณะเฉพาะของลักษณะทางเคมีและเพื่อแยกแยะส่วนต่างๆ รวมทั้งเพื่อเสนอขั้นตอนการประมวลผลใหม่สำหรับซีดี การกำหนดสัญญาณทำได้โดยเทคนิคสเปกโตรสโกปี NMR แบบหนึ่งและสองมิติร่วมกับฐานข้อมูลที่มีอยู่และสารประกอบของแท้ ส่วนบนของพืชแตกต่างจากส่วนล่างโดยการรวมชุดข้อมูล 1H NMR spectroscopic กับการวิเคราะห์ทางสถิติหลายตัวแปร วิธีการประมวลผลแบบใหม่ที่การนึ่งด้วยยัติภังค์ด้วยการทำให้แห้งแบบเยือกแข็งได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเหนือกว่าทั้งการนึ่งควบคู่กับการทำแห้งด้วยเตาอบหรือการทำแห้งเยือกแข็งโดยตรงผ่านการแสดงลักษณะเมตาโบโลมิกแบบองค์รวม 1H NMR ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ ส่วนใหญ่เป็นเอไคนาโคไซด์และแอคทีโอไซด์ถูกคัดแยกและยืนยันว่าเป็นเครื่องหมายทางเคมีที่รับผิดชอบในการแสดงความเหนือกว่าของกระบวนการแปรรูปใหม่ ในขณะที่เมตาโบไลต์ปฐมภูมิแบบอนุกรม โดยเฉพาะอย่างยิ่งคาร์โบไฮเดรตและเมแทบอไลต์ของวัฏจักรกรดไตรคาร์บอกซิลิก ถูกพบว่าเป็นโมเลกุลหลักที่ควบคุมการเลือกปฏิบัติระหว่างส่วนบนและส่วนล่างของ พืช โดยรวมแล้ว สเปกโตรสโคปี 1H NMR ได้รับการสาธิตว่าเป็นเครื่องมือวิเคราะห์อเนกประสงค์เพื่อระบุลักษณะเฉพาะของลักษณะทางเคมีและเพื่อเป็นแนวทางในการใช้ประโยชน์ในเชิงลึกของซีดีโดยให้ข้อมูลเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณที่ครอบคลุม

คำสำคัญ:Cistancheทะเลทราย; เมแทบอลิซึมที่ใช้ 1H NMR; การประมวลผลการทำงานflow; ส่วนต่าง ๆฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์; เมแทบอลิซึมของวัฏจักรกรดไตรคาร์บอกซิลิกเอ็กไคนาโคไซด์; แอคทีโอไซด์

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมกรุณาติดต่อ:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola มีเอฟเฟกต์มากมาย คลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

1. บทนำ

ซิสตันเชส เฮอร์บา(CH ชื่อจีน: Roucongrong) เดิมเก็บถาวรในแพทย์จีน Materia ของ Shen Nongได้รับการยกย่องอย่างกว้างขวางว่าเป็นหนึ่งในพืชสมุนไพรที่รับประทานได้และเป็นที่รู้จักมากที่สุด และได้รับการยกย่องว่าเป็น "โสมแห่งทะเลทราย"^1,2. ในฐานะหนึ่งในสองโรงงานต้นทางอย่างเป็นทางการของ CHCistanche deserticola(CD, Orobanchaceae) เป็นพืชโฮโลปาราซิติก กระจายพันธุ์ส่วนใหญ่ในภาคเหนือและตะวันตกเฉียงเหนือของจีน^2,3. มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการรักษาภาวะไตพร่อง โดยมีลักษณะอาการอ่อนแรง ปวดเอวและเข่า ภาวะเป็นหมันของสตรี และท้องผูกในศาสตร์การแพทย์แผนจีนมานานหลายศตวรรษ^3–5. อย่างไรก็ตาม แหล่งซีดีธรรมชาติกำลังใกล้จะสูญพันธุ์ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาเนื่องจากการเก็บเกี่ยวที่มากเกินไป และได้รับการระบุว่าเป็นหนึ่งในพืชประเภท II ที่ต้องการการคุ้มครองในประเทศจีน¹. นอกจากนี้ ซีดีมีส่วนสำคัญในการควบคุมทะเลทราย ดังนั้นจึงเป็นสิ่งสำคัญแต่ท้าทายที่จะใช้สมุนไพรนี้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น

การศึกษาทางวิทยาศาสตร์เกี่ยวกับCistancheพืชที่ริเริ่มในทศวรรษ 1980⁶. การตรวจสอบไฟโตเคมิคอลเผยให้เห็นถึงการมีอยู่ของสารเคมีประเภทต่างๆe.g., ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ (PhGs), อิริดอยด์, ลิกแนน, กรดไขมัน, อัลดิทอล และคาร์โบไฮเดรต ภายในซีดี⁷. ในหมู่พวกเขา PhGs ถูกกล่าวถึงบ่อยที่สุดเนื่องจากมีกิจกรรมทางชีวภาพที่หลากหลาย รวมถึงการต่อต้านอนุมูลอิสระ การต่อต้านริ้วรอย การต่อต้านความเหนื่อยล้า การต่อต้านการอักเสบ การเสริมสร้างภูมิคุ้มกันของร่างกาย การปรับปรุงการเรียนรู้และความจำของหนูที่เป็นโรคอัลไซเมอร์ เป็นต้น¹. เมื่อเร็ว ๆ นี้ PhGs กำลังดึงดูดความสนใจเพิ่มขึ้นในฐานะผู้สมัครยาใหม่ที่มีศักยภาพในการรักษาความผิดปกติของระบบประสาท โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การควบรวมของ PhGs ทั้งหมดที่พบใน CH ได้รับการพัฒนาให้เป็นยาตัวใหม่ ซึ่งขึ้นทะเบียนเป็น TotalCistancheไกลโคไซด์แคปซูล (Memoregain^®) สำหรับการรักษาภาวะสมองเสื่อม⁸. Echinacoside ซึ่งเป็นองค์ประกอบที่อุดมสมบูรณ์และมีประสิทธิภาพที่สุดของ PhGs ทั้งหมด แสดงผลการต่อต้าน apoptotic ต่อเซลล์ประสาท SHSY5Y หลังจากการตายของเซลล์ที่เกิดจาก TNF และย้อนกลับข้อบกพร่องในหนูที่เป็นโรคพาร์กินสัน⁹. นอกจากนี้ สารประกอบออกฤทธิ์หลักอีกชนิดหนึ่ง แอคทีโอไซด์ (หรือที่เรียกว่า verbascoside) สามารถต่อต้านการตายของเซลล์ในเซลล์ประสาทได้¹⁰เพื่อป้องกันความเป็นพิษต่อระบบประสาทในเซลล์ PC12 ที่เกิดจาก 1-methyl-4-phenylpyridium หรือ glutamate¹¹และเพื่อปรับปรุงความบกพร่องของหน่วยความจำที่เกิดจากสโคโพลามีน².

คล้ายกับถั่งเช่าและโสม, ซีดีได้รับการบริโภคอย่างกว้างขวางและมีมูลค่าเป็นอาหารเพื่อสุขภาพ ประโยชน์ที่แท้จริงและที่รับรู้ของซีดีมีแนวโน้มที่จะมีบทบาทเป็นตัวกำหนดราคาของยาดิบ เนื่องจากตัวยาดิบๆ ของแผ่นซีดีมีขนาดใหญ่ จึงทำให้ชิ้นนี้เป็นที่นิยมในตลาดมากขึ้น โดยทั่วไป การหยุดการทำงานของเอนไซม์และการกีดกันน้ำเป็นสองขั้นตอนสำคัญในระหว่างการประมวลผลชิ้นยา วิธีการทำให้แห้งแบบทั่วไปของ CD รวมถึงฉนวน การทำให้แห้งในเตาอบ การทำเกลือ และการเก็บรักษาในห้องใต้ดิน อย่างไรก็ตาม ผลิตภัณฑ์จากกระบวนการเหล่านี้มักจะมีลักษณะที่ดูไม่ดีและมี PhG ในปริมาณต่ำ จึงเป็นอุปสรรคต่อการใช้งานและการบริโภคซีดีในวงกว้าง ในปี 2550 กลุ่มของเราได้เสนอเทคนิคการประมวลผลใหม่สำหรับซีดีซึ่งเก็บรักษาเนื้อหาของ echincoside และ . ไว้ได้อย่างมากแอคทีโอไซด์เป็นชิ้นๆ¹⁴. อย่างไรก็ตาม เนื่องจากผลิตภัณฑ์จากกระบวนการนี้ยังคงมีลักษณะที่ไม่พึงประสงค์ เราจึงได้อธิบายวิธีการประมวลผลเพื่อปรับปรุงรูปลักษณ์และเพื่อรักษาเนื้อหาของ PhGs ในวัสดุที่ผ่านกรรมวิธีไว้

เครื่องมือวิเคราะห์แบบอนุกรมได้ถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ทางเคมีของซีดี ซึ่งรวมถึงโครมาโตกราฟีแบบชั้นบาง โครมาโตกราฟีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูง (HPLC) ควบคู่ไปกับเครื่องตรวจจับต่างๆ เช่น เครื่องตรวจจับอาร์เรย์ไดโอด (DAD) เครื่องตรวจจับการกระเจิงของแสงระเหย (ELSD) เครื่องตรวจจับการดักจับอิเล็กตรอน (ECD) และแมสสเปกโตรมิเตอร์แบบตีคู่ (MS/MS) PhGs โดยเฉพาะอย่างยิ่ง echinacoside และ acteoside ถูกนำมาใช้เป็นเครื่องหมายแสดงคุณภาพบ่อยที่สุด¹. ลายนิ้วมือของยาสมุนไพรนี้ยังได้รับการพัฒนาโดยใช้ HPLC–DAD และ HPLC–DAD–MS/MS^15,16. อย่างไรก็ตาม การประเมินคุณภาพของซีดียังคงเป็นเรื่องท้าทาย เนื่องจากคุณสมบัติทางเคมีที่ซับซ้อนมากของซีดี โดยทั่วไป แนวทางที่กำหนดเป้าหมายไปยังผู้วิเคราะห์หลายรายนั้นไม่สามารถนำเสนอมุมมองทางเคมีแบบองค์รวมสำหรับสารสกัดหยาบ แม้ว่าจะสามารถรับข้อมูลเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณได้จาก LC−MS/MS นอกจากนี้ กลยุทธ์การวิเคราะห์ที่เกี่ยวข้องกับ HPLC อาจถูกจำกัดด้วยตัวทำละลายจำนวนมาก การเตรียมตัวอย่างที่น่าเบื่อ และ/หรือขั้นตอนที่ใช้เวลานาน ดังนั้น จึงจำเป็นต้องใช้เครื่องมือวิเคราะห์ที่เหมาะสมกับวัตถุประสงค์ใหม่ซึ่งสามารถให้ข้อมูลที่ครอบคลุมของแหล่งรวมสารประกอบจึงจำเป็นสำหรับการวิเคราะห์ทางเคมีที่เหมาะสมที่สุด โชคดี,¹สเปกโตรสโกปี H NMR ได้รับการพิสูจน์อย่างชัดเจนว่าเป็นเครื่องมือ "ครบวงจร" ที่น่าสนใจ ซึ่งไม่เพียงแต่นำเสนอชุดข้อมูลเชิงคุณภาพเท่านั้น แต่ยังรวมถึงข้อมูลเชิงปริมาณสำหรับสารเมตาโบไลต์ระดับปฐมภูมิและทุติยภูมิที่หลากหลายด้วยการเตรียมตัวอย่างอย่างง่ายและการได้มาซึ่งข้อมูลอย่างรวดเร็ว^17–20. จนถึงปัจจุบันแอพพลิเคชั่นมากมายของ¹ได้มีการเปิดตัวสเปกโตรสโกปี H NMR สำหรับการวัดค่าพร้อมกัน การทำโปรไฟล์ทางเคมี และเมตาโบโลมิกส์ของเมทริกซ์เชิงซ้อน

แม้ว่าจะมีการสอบสวนหลายครั้งสำหรับยาสมุนไพรอันล้ำค่านี้ แต่รายละเอียดทางเคมีทั่วโลกของยานี้ยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด เนื่องจากซีดีเป็นพืชกาฝาก ส่วนล่างควรมีหน้าที่ในการส่งสารอาหาร ซึ่งส่วนใหญ่เป็นเมแทบอไลต์หลัก จากโฮสต์ไปยังส่วนบน ในขณะที่การเผาผลาญพลังงานที่รุนแรง เช่น ดอก มักเกิดขึ้นในส่วนบน ดังนั้นจึงมีเหตุผลที่จะสมมติว่าความแตกต่างเกิดขึ้นกับเมตาบอลิซึมของส่วนต่างๆ ดังนั้น ในการศึกษาปัจจุบัน เราจึงตั้งเป้า 1) เพื่ออธิบายลักษณะทางเคมีของซีดีโดยใช้¹สเปกโตรสโคปี H NMR ควบคู่ไปกับการวัด NMR สองมิติ (2D) ที่หลากหลาย 2) เพื่อชี้แจงความแตกต่างระหว่างส่วนบนและส่วนล่าง และ 3) เพื่อเสนอการประมวลผลใหม่ผ่าน¹H NMR-based metabolomic study. ผลการวิจัยที่ได้รับคาดว่าจะเป็นแนวทางที่มั่นคงสำหรับการใช้ประโยชน์จากสมุนไพรนี้ในทางที่ดีขึ้นโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการใช้ชิ้นส่วนต่างๆและเทคนิคการแปรรูป

2. ทดลอง

2.1. วัสดุปลูก

วัสดุสดสิบสองชุด (CD1–CD12, ตาราง S1, ข้อมูลเพิ่มเติม) ถูกรวบรวมจากเขตปกครองตนเองในจีน มองโกเลียใน ซินเจียง และหนิงเซี่ย ต้นกำเนิดทางพฤกษศาสตร์ของวัตถุดิบทั้งหมดได้รับการรับรองเป็น

1H NMR-based metabolomics ของCistanche deserticola 649ค. ทะเลทรายิโคลาโดยหนึ่งในผู้เขียน Prof. Pengfei Tu ตัวอย่างบัตรกำนัลทั้งหมดจะถูกเก็บไว้ที่สมุนไพรของศูนย์วิจัยการแพทย์แผนจีนสมัยใหม่ มหาวิทยาลัยปักกิ่ง (ปักกิ่ง ประเทศจีน)

2.2. เคมีและรีเอเจนต์

เมทานอล-d4 (CD3OD, ความอุดมสมบูรณ์ของดิวเทอเรียม, D 99.8 เปอร์เซ็นต์อะตอม D), น้ำดิวเทอเรต (D2O, ความชุกของดิวเทอเรียม, 99.8 เปอร์เซ็นต์ของอะตอม D) และโซเดียม 3-ไตรเมทิลไซลิล [2,2,3,3-d4 ] propionate (TSP-d4) ได้จาก Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA, USA) ซื้อเมทานอลเกรดวิเคราะห์จาก Beijing Chemical Works (ปักกิ่ง ประเทศจีน)

สารประกอบแท้ ซึ่งรวมถึงอิไคนาโคไซด์ แอกทีโอไซด์ และแมนนิทอล ถูกทำให้บริสุทธิ์จากซีดีในห้องปฏิบัติการของเราก่อนหน้านี้ 14 และซูโครส -กาแลคโตส ร่วมกับ -กลูโคส จัดหาโดยซิกมา–อัลดริช (เซนต์หลุยส์ รัฐมิสซูรี สหรัฐอเมริกา) ความบริสุทธิ์ของข้อมูลอ้างอิงทั้งหมดถูกกำหนดให้มากกว่า 98 เปอร์เซ็นต์โดยการวิเคราะห์ HPLC–UV และ 1H NMR

2.3. การเตรียมตัวอย่าง

วัตถุดิบดิบทั้งหมด (CD1–CD11) ยกเว้น CD12 ถูกตัดเป็นท่อนบน (GU) และส่วนล่าง (GD) ที่ตรงกลางของลำต้นทั้งหมด และทุกส่วนถูกตัดเป็นชิ้นบาง (ประมาณ 6-มม. -หนาอย่างละตัว) ต่อจากนั้น แผ่น CD1–CD12 ทั้งหมดถูกนึ่งอย่างต่อเนื่องเป็นเวลา 10 นาที และอบให้แห้งที่อุณหภูมิ 6{{40}} องศา เป็นเวลา 48 ชั่วโมงเพื่อให้ได้ตัวอย่างแบบ a วิธีการประมวลผลอื่น ๆ อีกสองวิธี ซึ่งรวมถึงการทำแห้งเยือกแข็งโดยตรงและการนึ่งด้วยไอน้ำ 10-นาที ตามด้วยการทำแห้งเยือกแข็งตามลำดับ ถูกดำเนินการสำหรับตัวอย่างที่เลือกบางตัวอย่าง ซึ่งรวมถึง CD1-GU, CD4-GU, CD4-GD, CD11-GD และ CD12 เพื่อซื้อตัวอย่างที่ประมวลผลเพิ่มเติมสองชุด (ตัวอย่างประเภท b และ c) คำอธิบายโดยละเอียดของตัวอย่างทั้งหมดแสดงไว้ในตารางที่ S1 ก่อนทำการสกัด ชิ้นส่วนที่ผ่านกระบวนการทั้งหมดจะถูกบดให้เป็นผงด้วยโรงสีตัวอย่าง (รุ่น YF102, Ruian Yongli Pharmacy Machinery, ประเทศจีน) และร่อนผ่านตะแกรง 80 mesh จากนั้นจึงชั่งน้ำหนักวัสดุพืชที่บดเป็นผงอย่างแม่นยำ (แต่ละชิ้นประมาณ 200 มก.) และสกัดด้วยเมทานอลที่เป็นน้ำ 50 เปอร์เซ็นต์ (w/v) 50-เท่า (w/v) ในอ่างน้ำอัลตราโซนิก (25 องศา) เป็นเวลา 40 นาที หลังจากนั้น เติมเมทานอลในน้ำ 50 เปอร์เซ็นต์เพื่อชดเชยน้ำหนักที่สูญเสียไปในระหว่างการสกัด สารสกัดแต่ละชนิดถูกหมุนเหวี่ยงที่ 10,{32}}×g ที่ 10 องศา เป็นเวลา 10 นาที และกรองผ่านเมมเบรนขนาด 0.22 ไมโครเมตร อะลิควอต (2 มล.) ของส่วนลอยเหนือตะกอนถูกระเหยในเวลาต่อมาและถูกขับออกเพิ่มเติมโดยใช้การทำแห้งแบบสุญญากาศที่ 30 องศา เป็นเวลา 30 นาที เรซิดิวแบบแห้งของแต่ละตัวอย่างถูกสร้างใหม่โดยใช้ของผสม 0.5 มล. (1:1, ปริมาตร/ปริมาตร) ของ CD3OD และบัฟเฟอร์ฟอสเฟตใน D2O ที่มี TSP-d4 0.05 เปอร์เซ็นต์ (pH 7.4) และจากนั้นสารละลายถูกถ่ายโอนไปใน 5 มม. (id) หลอด NMR (Norell ST500-7) สำหรับการสอบวิเคราะห์ NMR แต่ละตัวอย่างถูกวิเคราะห์เป็นสามเท่า

2.4. การวัด NMR

สเปกตรัม 1H NMR, 13C NMR และ 2D NMR ทั้งหมดถูกบันทึกบนสเปกตรัม Varian Unity Plus 500 MHz (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA) ที่ความถี่โปรตอน 499.91 MHz พร้อมกับ TCI cryoprobe และระบบ Z-gradient พารามิเตอร์ที่เหมือนกันถูกนำมาใช้สำหรับทั้งสารสกัดและสารประกอบอ้างอิงเพื่อให้ได้สเปกตรัมที่เปรียบเทียบกันได้ สำหรับการวัด 1H NMR สแกน 256 ครั้งโดยใช้พารามิเตอร์ต่อไปนี้: ความกว้างสเปกตรัม, 8012.6 Hz (16 ppm); ความกว้างพัลส์ 11.05 μs (flip มุม 90 องศา ); เวลาในการรับ 2.04 วินาที; ความล่าช้าในการผ่อนคลาย (d1), 2 วินาที; และอุณหภูมิ 298 K. CD3OD ถูกใช้เพื่อล็อคความถี่ของสนาม และการเปลี่ยนแปลงทางเคมีของสเปกตรัมทั้งหมดถูกจัดตำแหน่งโดยใช้สัญญาณจาก TSP-d4 ที่ δ 000 ใช้ขั้นตอนเปียกเพื่อลดความเข้มของสัญญาณ H2O ที่อาศัยอยู่ประมาณ δ 3.3021 มีการใช้ฟังก์ชันเลขชี้กำลังที่มีปัจจัยการขยายเส้น (LB) ที่ 0.3 Hz และข้อมูลถูกเติมศูนย์เพื่อให้จุดข้อมูลอย่างน้อยห้าจุดเหนือครึ่งความกว้างสำหรับแต่ละเรโซแนนซ์เพื่อรับประกันการผสานรวมที่แม่นยำและเชื่อถือได้ สัญญาณการสลายตัวด้วยการเหนี่ยวนำอิสระ (FID) ถูกแปลงฟูริเยร์ (FT) และสเปกตรัมทั้งหมดถูกแบ่งเฟสและแก้ไขด้วยตนเองโดยใช้โปรแกรมพื้นฐานพหุนามอัตโนมัติ

เพื่อช่วยในการกำหนดลักษณะทางเคมีและการกำหนดสัญญาณ

13C NMR และการวิเคราะห์ 2D NMR ต่างๆ เช่น 1H–1H

correlation spectroscopy (1H–1H COSY), heteronuclear single quantum coherence spectroscopy (HSQC) และ heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy (HMBC) ยังได้รับมาสำหรับตัวอย่างที่เป็นตัวแทน (CD1-GUI) โดยใช้โปรแกรมที่ผิดนัดเหล่านั้น ความกว้างสเปกตรัมสำหรับ COZY คือ δ 0.5–10.0 ในทั้งสองมิติและเพิ่มขึ้นทีละ 128t1 สำหรับแต่ละ t1 สิบหกชั่วครู่โดยใช้การหน่วงเวลาการคลายตัว 1.00 ถูกเพิ่มด้วยข้อมูลที่ซับซ้อน 822

ค่าคงที่การควบคู่ของเฮเทอโรนิวเคลียร์พันธะเดี่ยวและพันธะ n ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับ HSQC และ HMBC คือ 146 และ 8 Hz ตามลำดับ ช่วงถูกกำหนดเป็น –0.5–10.0 ppm ในมิติ F2 และ 0–200 ppm ในมิติ F1 ตามลำดับ

2.5. การวิเคราะห์ทางสถิติหลายตัวแปรของชุดข้อมูล NMR spectroscopic

สเปกตรัม 1H NMR ได้รับการประมวลผลโดยใช้ซอฟต์แวร์ MestReNova (เวอร์ชัน 5.2.5, Mestrelab Research, Santiago de Compostella, สเปน) แต่ละสเปกตรัมถูกปรับขนาดเป็นความเข้มรวมและลดลงเป็นพื้นที่รวมที่มีความกว้างเท่ากัน (0.02 ppm) ระหว่างภูมิภาค δ 0.50–9.50 หลังจากไม่รวมภูมิภาคของ δ 4.70–

5.02 และ δ 3.26–3.36 เพื่อละเว้นสัญญาณตกค้างของน้ำและเมทานอลตามลำดับ การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) ด้วยการปรับมาตราส่วน Pareto (Par) รวมถึงการวิเคราะห์การแบ่งแยกกำลังสองน้อยที่สุดในมุมฉาก (OPLS-DA) ที่มีการปรับขนาดหน่วย (UV) ด้วยซอฟต์แวร์ SIMCA-P 12.0 (Umetrics, Umeå, สวีเดน)

2.6. การหาค่าเอไคนาโคไซด์และแอคทีโอไซด์พร้อมกันโดยใช้ HPLC-UV

เพื่อตรวจสอบข้ามการตรวจสอบสำหรับเทคนิคการประมวลผลทั้งสาม ระบบ HPLC ซีรีส์ Agilent 1260 ประกอบด้วย degasser, quaternary pump, autosampler, เตาอบแบบคอลัมน์และตัวตรวจจับอาร์เรย์ไดโอด (Agilent Technologies, Santa Clara แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) ถูกใช้เพื่อกำหนดเอไคนาโคไซด์และแอกทิโอไซด์ในตัวอย่าง a-, b- และ c ทั้งหมดพร้อมกัน คอลัมน์ Agilent Zorbax SB-C18 (250 มม. × 4.6 มม. ขนาดอนุภาค 5 ไมครอน เทคโนโลยี Agilent) ได้รับการปกป้องโดยคอลัมน์ป้องกัน (10 มม. × 4.6 มม. ขนาดอนุภาค 5 ไมครอน) เพื่อดำเนินการแยกโครมาโตกราฟี โปรโตคอลการเตรียมตัวอย่าง เฟสเคลื่อนที่ และโปรแกรมการชะเป็นไปตามคำอธิบายที่เก็บไว้ในเภสัชตำรับจีน (ฉบับปี 2010)3 โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย โดยสังเขป ทำการสกัดด้วยอัลตราโซนิกช่วยเป็นเวลา 30 นาทีโดยใช้เมทานอลที่เป็นน้ำ 50 เปอร์เซ็นต์; เมทานอลที่เป็นน้ำ 30 เปอร์เซ็นต์ถูกนำมาใช้เป็นเฟสเคลื่อนที่สำหรับการชะแบบไอโซเครติกที่อัตรา flow ที่ 1.0 มล./นาที และเตาอบคอลัมน์ถูกคงไว้ที่

30 องศา . ความยาวคลื่นการตรวจจับถูกตั้งค่าไว้ที่ 330 นาโนเมตร และปริมาตรการฉีดถูกตั้งค่าเป็น 10 ไมโครลิตร

3. ผลลัพธ์และการอภิปราย

3.1. การเพิ่มประสิทธิภาพของการสกัดและพารามิเตอร์ทางสเปกโตรสโกปี

เพื่อให้ได้สเปกตรัม 1H NMR คุณภาพสูงสำหรับตัวอย่างทั้งหมด พารามิเตอร์ต่างๆ ได้รับการปรับให้เหมาะสมอย่างระมัดระวังโดยใช้ตัวอย่างที่เป็นตัวแทน (CD1-GUI) ประการแรก ตัวทำละลายสำหรับการสกัดถูกเลือกในหมู่เมทานอลที่เป็นน้ำ 30 เปอร์เซ็นต์ เมทานอลที่เป็นน้ำ 50 เปอร์เซ็นต์ และเมทานอล ผลการวิจัยชี้ให้เห็นว่าการตอบสนองโดยรวมที่มากขึ้นนั้นมาจาก 50 เปอร์เซ็นต์ของเมทานอลที่เป็นน้ำเมื่อเทียบกับอีกสองสิ่ง โดยสอดคล้องกันเป็นอย่างดีกับโปรโตคอลการสกัดที่รับรองความถูกต้องในตำรับยาจีน (ฉบับปี 2015)3 การสกัดด้วยอัลตราโซนิกช่วยได้รับเลือกเนื่องจากมีการทำงานที่สะดวกโดยให้ผลผลิตเทียบเท่ากับการสกัดด้วยความร้อนซ้ำและการแยก Soxhlet (ไม่แสดงข้อมูล) หลังจากนั้นเปรียบเทียบระยะเวลาที่ใช้อัลตราโซนิกระหว่าง 40 ถึง 60 นาทีและการอาบน้ำอัลตราโซนิก 60 นาทีไม่ได้แสดงศักยภาพในการสกัดมากกว่า 40 นาที ดังนั้นจึงตั้งเวลา 40 นาทีสำหรับอุปกรณ์อัลตราโซนิกเพื่อประหยัดเวลา

ในทางกลับกัน {{0}}.5 มล. ของบัฟเฟอร์ CD3OD–ฟอสเฟตใน D2O (1:1, pH 7.4) ถูกเปรียบเทียบกับ 0.5 มล. ของ CD3OD–D2O (1: 1) และผลการวิจัยพบว่าการเสริมด้วยบัฟเฟอร์ฟอสเฟตสามารถป้องกันโปรไฟล์สเปกตรัมจากการแปรผันและการย้ายถิ่น อะลิควอต 2.0 มล. ของสารสกัดถูกทำให้เข้มข้นขึ้นอย่างต่อเนื่อง, สร้างใหม่, และอยู่ภายใต้การวิเคราะห์ NMR เพื่อให้ได้การตอบสนองที่เหมาะสมสำหรับสัญญาณส่วนใหญ่ นอกจากนี้ พบว่าวิธีการเปียกนั้นดีกว่าโปรแกรมปรับความอิ่มตัวของสีเพื่อลดความเข้มข้นสูงสุดของน้ำที่เหลือ (ประมาณ δ 4.8) ในสเปกตรัม นอกจากนี้เรายังพบว่าจำนวนการสแกนที่เพิ่มขึ้นนั้นมีประโยชน์สำหรับการปรับปรุงอัตราส่วนสัญญาณรบกวน (S/N) ซึ่งค่อนข้างมีประโยชน์สำหรับการตรวจจับที่มีความละเอียดอ่อน (โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับส่วนประกอบการติดตาม) อย่างไรก็ตาม เนื่องจากวิธีการนี้เป็นอันตรายต่อการวัดอย่างรวดเร็ว ในที่สุดจึงใช้การสแกน 256 ครั้งสำหรับการทดสอบ 1H NMR แต่ละครั้งเพื่อให้ได้ความไวที่ยอมรับได้

3.2. การกำหนดสัญญาณของสเปกตรัม 1H NMR

การระบุส่วนประกอบทางเคมีในซีดีทำได้โดยร่วมกันวิเคราะห์สเปกตรัม 1H NMR, 13C NMR และ 2D NMR (รูปที่ 1 และข้อมูลเสริม รูปที่ S1–S10) และเปรียบเทียบกับตัวอย่างของสารประกอบแท้ รวมทั้งอ้างอิงถึงสารที่เข้าถึงได้ ฐานข้อมูล เช่น MMCD การกำหนดสัญญาณที่เป็นไปได้ใน 1H NMR แสดงไว้ในรูปที่ 1 ค่าการเปลี่ยนแปลงทางเคมีสำหรับตัวตนสมมุติสรุปไว้ในตาราง S2 (ข้อมูลเสริม)

ลักษณะโครงสร้างของ PhGs ในสกุล Cistanche ได้รับการอธิบายไว้ในวรรณกรรม1 เนื่องจากโครงสร้างที่คล้ายคลึงกันอย่างมากระหว่าง PhGs เช่น echinacoside กับ acteoside สัญญาณโปรตอนของ phenylethanoid moieties จึงซ้อนทับกันอย่างกว้างขวางในสเปกตรัม 1H NMR การทับซ้อนกันนี้ก่อให้เกิดปัญหาการวิเคราะห์ที่ท้าทายในการเลือกปฏิบัติระหว่างสัญญาณเหล่านี้อย่างน่าเชื่อถือ ในการศึกษาปัจจุบัน สัญญาณที่เป็นของอิไคนาโคไซด์และแอกทิโอไซด์ซึ่งเป็นส่วนประกอบหลักในพืชดั้งเดิม ได้รับมอบหมายให้ชัดเจนด้วยความช่วยเหลือของสารประกอบอ้างอิงและสเปกตรัม NMR ที่หลากหลาย (ตารางที่ S2 รูปที่ 1 และรูปที่ S1–S6) สัญญาณการวินิจฉัยที่ δ 7.73 (d, J 16.0 Hz) ระบุการกระจายของ Castano-

ด้าน B/D หรือ PhG ที่ถูกแทนที่ด้วย feruloyl อื่นๆ (ตารางที่ S2 และรูปที่ 1)22 นอกจากนี้ยังพบ PhGs ประเภท cis (coumaroyl ชนิด cis หรือ caffeoyl แทนที่ PhGs) ในสารสกัดโดยอิงจากการมีอยู่ของ δ 6.95 (d, J 12.0 Hz) ในสเปกตรัม (ตาราง S2 และรูปที่ . 1).

ตรวจพบสัญญาณที่ชัดเจนหลายตัวในบริเวณ δ 8.0–9.5 สัญญาณที่ δ 9.15, 8.88 และ 8.09 ถูกกำหนดเบื้องต้นให้กับนิโคตินาไมด์ (ตารางที่ S2 และรูปที่ 1) และ 13C NMR เช่นเดียวกับ 2D

NMR spectra (รูปที่ S4–S6) ก็สนับสนุนงานนี้เช่นกัน สัญญาณที่ δ 8.48 ถูกกำหนดอย่างน่าเชื่อถือให้กับกรดฟอร์มิก ในขณะที่สัญญาณที่ δ 8.13 และ 8.11 ถูกสร้างขึ้นจากอะดีโนซีนและอะดีนีน ตามลำดับ (ตารางที่ S2 และรูปที่ 1) สัญญาณคาร์โบไฮเดรตมักจะอยู่ที่บริเวณระหว่าง δ 3.00 ถึง 5.50 เห็นได้ชัดว่า ซูโครสเป็นไดแซ็กคาไรด์ที่มีมากที่สุดในซีดี โดยแสดงเรโซแนนซ์ที่สำคัญที่ δ 4.04, 4.18 และ 5.41 (ตารางที่ S2 และรูปที่ 1 และ S7) สัญญาณที่ชัดเจนของโปรตอนอะโนเมอร์ของ -กาแลคโตส -กลูโคส และ -กลูโคสถูกสะท้อนที่ δ 5.24, 5.20 และ 4.60 ตามลำดับ (ตารางที่ S2, รูปที่ 1 และ S8, S9) การเกิดขึ้นของแมนนิทอลถูกเปิดเผยโดยการสังเกตสัญญาณที่ δ 400 รวมทั้งโดยการเปรียบเทียบกับสารประกอบอ้างอิง (ตารางที่ S2, รูปที่ 1 และ S10) สัญญาณการวินิจฉัยของ 1-O-เอทิล-กลูโคไซด์ถูกสังเกตพบที่ 1.16 ppm โดยการอ้างถึง HMDB กรดอะมิโน รวมทั้งลิวซีน (0.93 ppm), ไอโซลิวซีน/วาลีน (0.98 ppm), ทรีโอนีน (1.27 ppm), อะลานีน (1.49 ppm), ไลซีน (1.71 ppm), กลูตามีน (2.30 ppm), กรดแอสพาราจีน (2.96 ppm), โพรลีน (4.09 ppm), ไทโรซีน (7.12 ppm) และฟีนิลอะลานีน (7.33 ppm) ถูกกำหนดโดยคร่าวๆ ผ่านการเปรียบเทียบพฤติกรรมการวินิจฉัยทางสเปกโตรสโกปีของพวกมันกับสิ่งที่เก็บถาวรไว้ใน HMDB (ตารางที่ S2 และรูปที่ 1) Iridoids และ lignans ถูกกล่าวถึงข้างต้นว่าเป็นสารเคมีที่คล้ายคลึงกันในซีดี ในสเปกตรัม 1 H NMR ที่เป็นตัวแทน (รูปที่ 1) สังเกตสัญญาณของ syringaresinol (อนุพันธ์ของลิกแนน) และ 8-epiloganic acid (อนุพันธ์ของ iridoid) ที่ δ 7.02 และ 0.98 ตามลำดับ ยิ่งไปกว่านั้น สัญญาณมัลติเพล็ตอยู่ในช่วงตั้งแต่ δ 6.56–6.64 สามารถกำหนดคร่าวๆ ให้กับส้ม A, alaschanioside A หรือ dehydeodiconiferyl alcohol glucoside (อนุพันธ์ของลิกแนนทั้งหมด) ในขณะที่สัญญาณระหว่าง δ 6.18–6.33 อาจถูกสร้างขึ้นโดย iridoids (ตาราง S2 และ มะเดื่อ 1). นอกจากนี้ การเกิดกรดอะลิฟาติกคาร์บอกซิลิกบางชนิดในซีดี ได้แก่ กรดฟูมาริก กรดมาเลอิก กรดมาลิก กรดไอโซซิตริก กรดซิตริก กรดคีโตกลูตาริก กรดไพรูวิก กรดซัคซินิก กรดอะซิติก และกรดไขมันอื่นๆ การสังเกตสัญญาณการวินิจฉัยที่δ 6.54, 6.02, 4.27, 3.04, 2.73, 2.52, 2.49, 2.42, 1.97 และ 1.33 ตามลำดับ (ตาราง S2 และรูปที่ 1) นอกจากนี้ สัญญาณบางอย่าง เช่น สัญญาณมัลติเพล็ตประมาณ 3.80 ppm และ singlet ที่ 1.97 ppm22 ถือเป็นคุณลักษณะของหมู่เมทอกซีและอะเซทิล (ตารางที่ S2 และรูปที่ 1) ตามลำดับ ซึ่งเป็นสารทดแทนทั่วไปของอนุพันธ์ฟีนิล โดยเฉพาะ PhGs ในกรณีนี้ ในขณะเดียวกัน สัญญาณที่ 1.06 ppm สามารถกำหนดคร่าวๆ ให้กับเศษแรมโนสได้ เป็นที่ทราบกันดีว่า 1 H NMR spectroscopy สามารถให้ข้อมูลเชิงปริมาณได้โดยตรง เนื่องจากความเข้มของสัญญาณโปรตอนเป็นสัดส่วนกับความเข้มข้นของโมลาร์ของตัววิเคราะห์19 ดังนั้น การเปรียบเทียบเชิงปริมาณเบื้องต้นสามารถทำได้สำหรับส่วนผสมในซีดี เห็นได้ชัดว่าคาร์โบไฮเดรตโดยเฉพาะซูโครสให้การตอบสนองสูงสุดในสเปกตรัมที่เป็นตัวแทน (รูปที่ 1) ในฐานะที่เป็นพืชโฮโลปาราซิติกที่เติบโตใต้ดินภายในเกือบตลอดทั้งวงจรชีวิต การสังเคราะห์ด้วยแสงจึงไม่จำเป็นและไม่มีให้สำหรับซีดี ดังนั้นจึงไม่น่าแปลกใจที่ไม่พบเมตาโบไลต์หลักที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ด้วยแสง เช่น ผู้เข้าร่วมในวงจรเคลวิน (หรือที่เรียกว่าวัฏจักร C3) ในสเปกตรัม23 ในทางตรงกันข้าม ตรวจพบโมเลกุลจำนวนมากที่เข้าร่วมในวัฏจักรกรดไตรคาร์บอกซิลิก (วงจร TCA หรือที่เรียกว่าวงจรกรดซิตริกและวงจรเครบส์) เช่น กรดซิตริก กรดคีโตกลูตาริก กรดไพรูวิก และกรดซัคซินิก ซึ่งบ่งชี้ว่าศูนย์กลางที่แข็งแรง การเผาผลาญคาร์บอน (CCM) เกิดขึ้นในโรงงานเดิม ในอีกทางหนึ่ง PhGs ถูกตั้งข้อสังเกตว่าเป็นตระกูลเคมีที่โดดเด่นในบรรดาสารเมตาโบไลต์ทุติยภูมิต่างๆ ในขณะที่ลิกแนนและอิริดอยด์ให้ผลเพียงเล็กน้อยสำหรับโพรไฟล์สเปกตรัมทั้งหมด

3.3. การทดสอบความแม่นยำของ 1H NMR spectroscopy

ความแม่นยำทางสเปกโตรสโกปีมีบทบาทสำคัญในความน่าเชื่อถือของการกำหนดลักษณะเฉพาะของเมตาบอลิซึม ในการศึกษาปัจจุบัน ความแม่นยำของวิธีการทั้งหมดได้รับการทดสอบโดยการเตรียมตัวอย่างที่เป็นตัวแทน (CD1-GUI) ในรูปแบบ quintuplicate และวิเคราะห์ในภายหลังในสองวันติดต่อกัน สเปกตรัมที่ได้รับแสดงความคล้ายคลึงกันโดยรวมอย่างมากโดยการซ้อนทับสเปกตรัมทั้งหมด ซึ่งบ่งชี้ว่าโปรโตคอลการเตรียมตัวอย่างและการวัด 1H NMR สามารถทำซ้ำได้ และตัวอย่างสามารถคงความเสถียรไว้ได้ภายในสองวันเป็นอย่างน้อย

3.4. การเลือกปฏิบัติของส่วนบนและส่วนล่างของพืช

จนถึงขณะนี้ ยังไม่มีหลักฐานใดที่แสดงให้เห็นว่าส่วนบนของแผ่นซีดีจะเทียบเท่ากับส่วนล่างเกี่ยวกับรายละเอียดทางเคมีและคุณสมบัติทางเภสัชวิทยา โดยมีวัตถุประสงค์เพื่อชี้แจงว่าการสะสมของเมแทบอไลต์ปฐมภูมิหรือทุติยภูมิเกิดขึ้นในบางส่วนของซีดีหรือไม่ ก้านที่ชุ่มฉ่ำทั้งหมดถูกตัดเป็นส่วนบนและส่วนล่าง ซึ่งทั้งสองส่วนได้รับการประมวลผล สกัด และวัดโดยใช้ 1 H NMR spectroscopy รูปที่ 2 แสดงสเปกตรัมตัวแทนของทั้งสองส่วน โดยรวมแล้ว สัญญาณส่วนใหญ่ในส่วนล่างจะสูงกว่าสัญญาณในส่วนบน ในช่วง δ 60–9.5 ไม่พบสัญญาณเฉพาะในส่วนใดส่วนหนึ่ง อย่างไรก็ตาม ความเข้มโดยรวมของสัญญาณเหล่านั้นในส่วนล่างนั้นสูงกว่าในส่วนบนเล็กน้อย ซึ่งบ่งชี้ว่าอนุพันธ์ของอะโรมาติกสามารถเสริมสมรรถนะในโดเมนใกล้กับจุดกาฝาก23 ส่วนล่างยังอุดมไปด้วยกรดไขมัน กรดอะมิโนบางชนิด และสารกักเก็บพลังงานอื่นๆ เนื่องจากการตอบสนองสัญญาณโดยรวมของบริเวณอะลิฟาติก (δ 0.5–3.{{10} }) ในส่วนล่างสูงกว่าส่วนบน นอกจากนี้ ยังสามารถสังเกตความแตกต่างที่ชัดเจนบางอย่างได้ภายในบริเวณน้ำตาล (δ 3.0–5.0) และสัญญาณส่วนใหญ่อยู่ในช่วง δ 30– 5.0 สำหรับส่วนบนสูงกว่าส่วนล่าง ซึ่งบ่งชี้ว่าคาร์โบไฮเดรต ซึ่งเป็นโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่โดดเด่น สามารถสะสมในส่วนบนได้ เพื่อเน้นความแตกต่างระหว่างส่วนบนและส่วนล่าง และเพื่อระบุผู้สนับสนุนหลักที่รับผิดชอบการเลือกปฏิบัติ การวิเคราะห์ข้อมูลหลายตัวแปรจึงถูกนำมาใช้ในการประมวลผลชุดข้อมูลสเปกโทรสโกปีของส่วนต่างๆ วิธีการที่ไม่ได้รับการดูแลชื่อ PCA ซึ่งใช้ข้อมูลจากเมทริกซ์เดียวเท่านั้น ถูกนำมาใช้ในขั้นต้นเพื่อจำแนกตัวอย่างทั้งหมดตามคุณลักษณะ 1 H NMR spectra อย่างไรก็ตาม มีการทับซ้อนกันอย่างมากสำหรับสองส่วนที่แตกต่างกันนี้ (ไม่แสดงข้อมูล) หลังจากนั้น OPLS-DA ซึ่งเป็นแนวทางภายใต้การดูแลได้เปิดตัวขึ้นเพื่อเพิ่มความคมชัดการแยกระหว่างกลุ่มต่างๆ รวมทั้งเพื่อทำความเข้าใจตัวแปรที่มีข้อมูลการแยกชั้นเรียน OPLS-DA สามารถแยกส่วนต่างๆ ของซีดีได้อย่างดี รูปที่ 3A และ B แสดงกราฟคะแนนและแผนภาพ S ของ OPLS-DA ตามลำดับ ทั้งความพอดีโดยรวม (R2Y¼{{30}}.910) และค่าสัมประสิทธิ์การตรวจสอบข้ามโดยรวม (Q2Y¼0.981) ใกล้เคียงกับ 1.0 ดังนั้น แบบจำลองการแยกต้นฉบับจึงมีเสียงทางสถิติที่คาดการณ์ได้สูง เห็นได้ชัดว่าส่วนบนสามารถแยกความแตกต่างจากส่วนล่างเมื่อตัวอย่างถูกแท็กด้วยสองกลุ่ม และแผนผัง S ให้สัญญาณที่อาจมีส่วนทำให้เกิดความแตกต่าง โดยรวมแล้ว มีการกระจายจุดเพิ่มเติมในภูมิภาคที่สอดคล้องกับส่วนล่างในแผนภาพ S ซึ่งมีการกระจายเนื้อหาของกรดไขมัน (δ 1.32–1.35) และปัจจัยวงจร TCA (เช่น กรดซัคซินิกที่ δ 2.42) อย่างไรก็ตาม ส่วนบน (กระจุกด้านขวาในรูปที่ 3A) อุดมไปด้วยคาร์โบไฮเดรตบางชนิด (ส่วนใหญ่ δ 3.70–4.10 รูปที่ 3B) ตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่เป็นไปได้จากแผนภาพ S มีความสอดคล้องอย่างยิ่งกับการเปรียบเทียบสเปกตรัมของทั้งสองส่วนโดยการสังเกตโดยตรงและการซ้อนทับ มีการกำหนดไว้อย่างดีว่าเมแทบอไลต์ถูกสังเคราะห์ในรูปแบบเนื้อเยื่อ อวัยวะ และพัฒนาการเฉพาะโดยเอนไซม์สังเคราะห์ทางชีวภาพจำเพาะ แล้วเก็บสะสม บางครั้งในปริมาณที่สูงในโดเมนการผลิต ซึ่งสอดคล้องกับหน้าที่ที่หลากหลายของพวกมันสำหรับทั้งโรงงาน ตัวอย่างเช่น ทั้งสองชนิดและเนื้อหาของ ginsenosides แสดงความแตกต่างที่สำคัญระหว่างเหง้า ราก ใบ และผู้ติดตามของ Panax notoginseng24 เกี่ยวกับซีดี จากมุมมองเชิงคุณภาพ โปรไฟล์เมแทบอไลต์ทุติยภูมิมีความคล้ายคลึงกันสูงระหว่างส่วนบนและส่วนล่าง เนื่องจากส่วนล่างของพืชทั้งหมดทำหน้าที่ส่งผ่านสารอาหาร ซึ่งส่วนใหญ่เป็นเมแทบอไลต์หลัก เช่น คาร์โบไฮเดรต จากเจ้าบ้าน Haloxylon ammodendron ไปจนถึงจุดเมแทบอลิซึมที่แข็งแรง ซึ่งบ่งชี้ว่าควรมีเมแทบอไลต์หลักในปริมาณมากมากขึ้นใน ส่วนล่าง. นอกจากนี้ การไฮโดรไลซิสอย่างกว้างขวางของพอลิแซ็กคาไรด์ไปเป็นโอลิโกแซ็กคาไรด์และต่อมาเป็นโมโนแซ็กคาไรด์ ซึ่งสามารถถ่ายโอนทางชีวภาพในกรดอะลิฟาติกคาร์บอกซิลิกได้ในที่สุด ควรเกิดขึ้นอย่างกว้างขวางที่ส่วนบน เนื่องจากมีการใช้เมทานอลในน้ำร้อยละ 50 ในการสกัดในการศึกษานี้ และสามารถสกัดโมเลกุลต่ำที่ชอบน้ำแทนโมเลกุลขนาดใหญ่ (เช่น พอลิแซ็กคาไรด์) จึงไม่น่าแปลกใจที่จะสังเกตว่าการสะสมของปัจจัยวงจร TCA และกรดไขมันได้แสดงให้เห็นในระดับล่าง ชิ้นส่วน อย่างไรก็ตาม โอลิโกแซ็กคาไรด์บางชนิด ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ไฮโดรไลติกของพอลิแซ็กคาไรด์ ถูกพบว่ามีการเสริมสมรรถนะในส่วนบน ในทางกลับกัน มีการสังเกตความแตกต่างเล็กน้อยสำหรับ PhGs ระหว่างส่วนต่างๆ จากมุมมองเชิงปริมาณ และโดยรวมแล้ว พบ PhGs สะสมเล็กน้อยที่ส่วนล่าง23,25 มีรายงานว่า haustorium phloem น่าจะเป็นอวัยวะสังเคราะห์รองสำหรับ PhGs ใน CD23; ดังนั้นส่วนล่างซึ่งใกล้กับจุดกาฝากจึงควรเป็น PhGs ที่ร่ำรวย

3.5. ข้อเสนอวิธีการประมวลผลใหม่สำหรับCD

เห็นได้ชัดว่าชิ้นยาของตัวอย่างประเภท c นั้นเหนือกว่าในแง่ของรูปลักษณ์ที่ดี สีขาวนวล แสง และเนื้อสัมผัสที่คมชัด รูปที่ 4 แสดงตัวแทน 1 H NMR spectra สำหรับตัวอย่างทั้งสามประเภท อย่างไรก็ตาม หลังจากการตรวจวัดแบบขนาน ได้โปรไฟล์สเปกตรัมที่แตกต่างกันสำหรับชิ้นยาที่ผ่านกระบวนการเหล่านั้น จากการสังเกตโดยตรงและการซ้อนทับ ความแตกต่างที่ชัดเจนสามารถสังเกตได้ ประการแรก ในบริเวณ δ 6.00–8.00 ซึ่งส่วนใหญ่รวมสัญญาณที่เป็นของ PhGs และอนุพันธ์ฟีนอลิกอื่นๆ การตอบสนองของตัวอย่างประเภท c (รูปที่ 4C) คือ ค่อนข้างสูงกว่าอีกสองประเภท ประการที่สอง การตอบสนองของคาร์โบไฮเดรตส่วนใหญ่และผู้เข้าร่วม TCA ในตัวอย่างประเภท b (รูปที่ 4B) เกือบจะเทียบเท่ากับในตัวอย่างประเภท c (รูปที่ 4C) แต่สูงกว่าในตัวอย่างประเภท a (รูปที่ 4A) มาก . ประการที่สาม เนื้อหาของกลูโคส (δ 5.20 สำหรับ -กลูโคส และ δ 4.60 สำหรับ -กลูโคส) ในตัวอย่างประเภท b (รูปที่ 4B) สูงกว่าตัวอย่างในตัวอย่างประเภท c เล็กน้อย (รูปที่ 4C) สุดท้าย ตรวจพบกรดไขมันในตัวอย่างประเภท a และ c มากกว่าในตัวอย่างประเภท b (รูปที่ 4) เหนือสิ่งอื่นใด อนุพันธ์ฟีนอลที่มีมากที่สุด เช่นนี้ ซึ่งได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวางว่าเป็นส่วนผสมที่มีประสิทธิภาพในซีดี ถูกพบในตัวอย่างที่ประมวลผลด้วยวิธีการใหม่ (ตัวอย่างประเภท c) เมื่อเปรียบเทียบระหว่าง a- และ b- พิมพ์ตัวอย่าง นอกจากนี้ยังพบสารเมแทบอไลต์หลักจำนวนมาก เช่น คาร์โบไฮเดรต ผู้เข้าร่วม TCA และกรดไขมันในตัวอย่างประเภท c ต่อจากนั้น การเปรียบเทียบตัวอย่างทั้งหมดผ่านการวิเคราะห์ข้อมูลหลายตัวแปรได้ดำเนินการเพื่อเน้นความคล้ายคลึงและความแตกต่างระหว่างชิ้นยาทั้งสามประเภท PCA ที่มี Par scaling และ OPLS-DA พร้อม UV scaling ถูกดำเนินการเพื่อประมวลผลชุดข้อมูล NMR spectroscopic ตามลำดับ (ไม่แสดงข้อมูล) การแยกสารที่มีนัยสำคัญไม่สามารถทำได้โดยใช้ PCA; อย่างไรก็ตาม แผนภาพคะแนนของ OPLS-DA สำหรับทั้งสามกลุ่ม (จุดสีเขียว สีน้ำเงิน และสีแดงในรูปที่ 5A) แสดงการจำแนกประเภทที่ชัดเจน ซึ่งบ่งชี้ว่ากลุ่มตัวอย่างทั้งสามกลุ่มนี้มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติเกี่ยวกับโปรไฟล์การเผาผลาญของพวกเขา ดิ

การเสื่อมสภาพของ PhGs ที่เกิดจากเอนไซม์ในพืชต้นทางหรือการเก็บรักษาที่อุณหภูมิสูง ผลที่ตามมาก็คือ ชิ้นส่วนที่ผ่านกระบวนการแล้ว (ตัวอย่างประเภท c) โดยใช้วิธีการใหม่นี้จึงได้เปรียบทั้งในด้านรูปลักษณ์ที่สวยงามและปริมาณสารประกอบที่มีประสิทธิผลสูงกว่า เพื่อตรวจสอบความถูกต้องของผลลัพธ์ที่กล่าวไว้ข้างต้นสำหรับเทคนิคการประมวลผลทั้งสาม วิธี HPLC–UV ที่ได้รับการพัฒนาและรับรองความถูกต้องในตำรับยาจีน (ฉบับปี 2015)3 ถูกนำมาใช้เพื่อกำหนดเนื้อหาของเอไคนาโคไซด์และแอกทิโอไซด์พร้อมกัน ซึ่งมีบทบาทสำคัญใน แยกแยะผลิตภัณฑ์แปรรูปสามประเภทข้างต้น ปริมาณเฉลี่ยของอิชินาโคไซด์ในตัวอย่าง a-, b- และ c คือ 8.33, 4.10 และ 16.19 มก./กรัม ตามลำดับ ในขณะที่ปริมาณแอกทิโอไซด์เท่ากับ 1.57, 1.14 และ 3.66 มก./กรัม ตามลำดับ เห็นได้ชัดว่าเนื้อหา PhGs ในวัสดุประเภท c นั้นสูงกว่าในตัวอย่างประเภท a และ b 2-4 เท่า ซึ่งเข้ากันได้ดีกับผลลัพธ์เมตาโบโลมิกส์แบบ 1 H NMR ในบรรดาเทคนิคการวิเคราะห์ที่มีอยู่โดยทั่วไปที่ใช้ในการศึกษาเมตาโบโลมิกส์ วิธีที่ใช้ NMR และ MS มักจะได้รับการยอมรับว่าเป็นทางเลือกที่ดี NMR spectroscopy โดยเฉพาะอย่างยิ่ง 1 H NMR มีความเหนือกว่าเทคนิคอื่นๆ เช่น การไม่คัดเลือก การเตรียมตัวอย่างที่สะดวก และความง่ายในการตรวจหากลุ่มเมแทบอไลต์ที่หลากหลายพร้อมกันในเวลาวัดที่ค่อนข้างสั้น จนถึงตอนนี้ มีการใช้เมตาโบโลมิกส์ที่อิงตาม NMR 1 H เพื่อรับรองความถูกต้องของพืช17 เพื่อเปรียบเทียบสมุนไพรแอนะล็อก18 เพื่อแยกความแตกต่างของแหล่งที่อยู่อาศัย26 และเพื่อระบุลักษณะการย่อยสลายของสมุนไพร26 ในที่นี้ มีการใช้ 1 H NMR เพื่อแยกแยะส่วนต่างๆ ของซีดี และเพื่อเสนอเวิร์กโฟลว์กระบวนการใหม่ ซึ่งระบุว่า 1 H NMR สเปกโทรสโกปีเป็นเครื่องมือวิเคราะห์ที่ยืดหยุ่นและมีประสิทธิภาพเพื่อเสนอแนวทางที่มีความหมายสำหรับการใช้ประโยชน์จากซีดีรวมถึงอื่นๆ ยาสมุนไพรโดยการให้ข้อมูลเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณที่ครอบคลุมของเมทริกซ์สารสกัดที่ซับซ้อน