ส่วนที่ 1 ฤทธิ์ต้านโรคกระดูกพรุนของยาจีนโบราณที่รับประทานได้ Cistanche Deserticola ต่อการเผาผลาญกระดูกของหนูที่ตัดรังไข่ผ่าน RANKL/RANK/TRAF6- เส้นทางการส่งสัญญาณที่เป็นสื่อกลาง

Bo Zhang 1†, Ling-Ling Yang 1†, Shu-Qin Ding 1†, Jing-Jing Liu 1, Yan-Hong Dong 1,

Yan-Ting Li 1, Nan Li 1, Xiao-Jun Zhao 1, Chang-Ling Hu 2, Yiping Jiang 3* และ Xue-Qin Ma 1*

1 ห้องปฏิบัติการหลักของการปรับปรุงการแพทย์ชาติพันธุ์ฮุ่ย ภาควิชาวิเคราะห์ยา กระทรวงศึกษาธิการ คณะเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยการแพทย์หนิงเซี่ย เมืองยินฉวน ประเทศจีน 2 ห้องปฏิบัติการสำหรับอาหารเพื่อการทำงานและสุขภาพของมนุษย์ ศูนย์ความเป็นเลิศด้านเทคโนโลยีหลังการเก็บเกี่ยว รัฐนอร์ทแคโรไลนา วิทยาเขตวิจัย, North Caroline A&T State University, Greensboro, NC, United States, 3 Department of Pharmacognosy, The Second Military Medical University, Shanghai, China

cistancheรักษาได้โรคกระดูกพรุน

เมื่อพิจารณาจากข้อจำกัดของยารักษาโรคที่มีอยู่แล้วในการรักษาโรคกระดูกพรุนในวัยหมดประจำเดือน ยังคงมีความจำเป็นที่จะต้องมีทางเลือกมากขึ้นทั้งในด้านประสิทธิภาพและผลข้างเคียงที่น้อยลงCistanche deserticolaYC Ma เป็นที่รู้จักในฐานะสมุนไพรโทนิคที่นิยมใช้ในการรักษาภาวะขาดพลังงานของไตรวมถึงความอ่อนแอของกล้ามเนื้อในพื้นที่ส่วนน้อยของมณฑลในเอเชีย ตามทฤษฎีของ "ไตครอบงำกระดูก" แบบจำลองหนูที่ตัดรังไข่ (OVX) ของโรคกระดูกพรุนในวัยหมดประจำเดือนถูกนำมาใช้เพื่อประเมินผลการรักษาของค. ทะเลทรายิโคลาสารสกัด (CDE) ต่อการสูญเสียมวลกระดูก หนู Sprague-Dawley เพศเมียสี่สิบแปดตัว ซึ่งมีอายุประมาณ 12 สัปดาห์ ได้รับการสุ่มแบ่งเป็น 6 กลุ่ม รวมทั้งกลุ่มหลอกที่บริหารช่องปากด้วย 0.5 เปอร์เซ็นต์ carboxymethyl cellulose sodium (CMC-Na) (sham) กลุ่มที่เป็นบวก รับการรักษาด้วย estradiol valerate (EV) 1 มก./กก. กลุ่มขนาดยาต่ำ ปานกลาง และสูง โดยให้ CDE 200, 400 และ 800 มก./ กก./วัน ตามลำดับ หลังจาก 3 เดือนของการแทรกแซงอย่างต่อเนื่อง CDE ได้แสดงฤทธิ์ต้านโรคกระดูกพรุนที่มีนัยสำคัญ โดยหลักฐานจากความหนาแน่นของมวลกระดูกที่เพิ่มขึ้น การปรับปรุงโครงสร้างจุลภาคของกระดูก กิจกรรมอัลคาไลน์ฟอสฟาเตสเพิ่มขึ้น ลด deoxypyridinoline, cathepsin K, กรดฟอสฟาเตสที่ทนต่อ tartrate และระดับ malondialdehyde; ในขณะที่น้ำหนักตัว มดลูก และช่องคลอดในหนู OVX ไม่ได้รับอิทธิพลจากการแทรกแซงของ CDE นอกจากนี้ยังพบปรากฏการณ์ที่ดูเหมือนจะขัดแย้งกับระดับแคลเซียมและฟอสฟอรัสระหว่าง OVX กับหนูทดลอง ในทางกลไก CDE ควบคุมระดับของ TRAF6, RANKL, RANK, NF-κB, IKK , NFAT2 และควบคุม phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), AKT, osteoprotegerin และ c-Fos ขึ้น ซึ่งบอกเป็นนัยว่า CDE สามารถยับยั้งการกระตุ้น RANKL / RANK ของเส้นทาง NF-κB และ PI3K/AKT ดาวน์สตรีม และในที่สุดก็ป้องกันกิจกรรมของโปรตีน osteoclastogenic ที่สำคัญ NFAT2 และ c-Fos ข้อมูลทั้งหมดบ่งชี้ว่า CDE มีฤทธิ์ต้านโรคกระดูกพรุนได้ และผลกระทบนี้อย่างน้อยก็ส่วนหนึ่งเกี่ยวข้องกับการปรับ RANKL/RANK/TRAF6-สื่อกลาง NF-κB และ PI3K/AKT การส่งสัญญาณเช่นเดียวกับ c- ระดับ Fos และ NFAT2 ดังนั้น CDE อาจเป็นตัวแทนของตัวเลือกการรักษาที่มีประโยชน์สำหรับการรักษาโรคกระดูกพรุนในวัยหมดประจำเดือน

คำสำคัญ:Cistanche deserticola, ต้านโรคกระดูกพรุน, TRAF6, RANKL, RANK

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมกรุณาติดต่อ:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola มีเอฟเฟกต์มากมาย คลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

การแนะนำ

เนื่องจากโรคกระดูกพรุนไม่ถือว่าเป็นส่วนหนึ่งของการสูงวัยตามปกติ จึงมีความก้าวหน้าอย่างมากในด้านโรคกระดูกพรุน วันนี้ โรคกระดูกพรุนได้กลายเป็นอันตรายต่อสุขภาพที่สำคัญ ซึ่งส่งผลกระทบต่อประชากรมากกว่า 200 ล้านคนทั่วโลก โดยมีคนใช้เงินจำนวน 10 พันล้านดอลลาร์ทุกปีเพื่อดูแลบุคคลเหล่านี้ (Ma et al., 2015) โรคกระดูกพรุน รวมถึงโรคกระดูกพรุนในวัยหมดประจำเดือนและในวัยชรา มีลักษณะเฉพาะด้วยการเสื่อมสภาพของสถาปัตยกรรมขนาดเล็กและความหนาแน่นของมวลกระดูกต่ำ (BMD) อันเป็นผลมาจากความไม่สมดุลระหว่างการสร้างกระดูกที่อาศัยเซลล์สร้างกระดูกและการดูดซึมของกระดูกโดยอาศัยการสลายของกระดูก ตามลำดับ (Kanis et al., 2015 ). เมื่อพิจารณาถึงข้อจำกัดของตัวเลือกการรักษาในปัจจุบันและผลข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์บางอย่างของสารสังเคราะห์ (Ye et al., 2015) สำหรับการรักษาโรคกระดูกพรุน จึงจำเป็นสำหรับทางเลือกอื่นที่มีทั้งประสิทธิภาพและผลข้างเคียงน้อยที่สุด (Tan et al., 2560). ในฐานะที่เป็นวิธีการรักษาแบบเสริมและทางเลือกที่โดดเด่นสำหรับการรักษาโรคต่างๆ รวมถึงโรคกระดูกพรุนในวัยหมดประจำเดือน สมุนไพรธรรมชาติโดยเฉพาะยาจีนโบราณ (TCM) ได้รับการยอมรับและรับประกันอย่างสูง (Czerwinska and Melzig, 2018; Ma et al., 2018) เมื่อสองพันปีที่แล้วCistanche deserticolaพบว่า YC Ma มีประโยชน์ต่อสุขภาพของมนุษย์และบันทึกไว้ในหนังสือยาจีนคลาสสิกชื่อ Shen Nong Herbal (Anonymous, 1981) ปัจจุบันเป็น TCM ที่สำคัญที่บันทึกอย่างเป็นทางการในตำรับยาจีน (Chinese and Pharmacopoeia, 2015) และยังเป็นยาบำรุงที่มีชื่อเสียงซึ่งใช้กันในมณฑลต่างๆ ในเอเชีย รวมทั้งจีนและญี่ปุ่นมานานหลายศตวรรษ (Wong et al., 2006) .ค. ทะเลทรายิโคลาพบว่ามีความปลอดภัยที่ดี (Liao et al., 2018) และหน้าที่ทางยาในวงกว้าง: ในพื้นบ้าน มีการใช้อาหารสมุนไพรหลายชนิดในการรักษาภาวะไตบกพร่อง กล้ามเนื้ออ่อนแรง และเอวอ่อนแรง ; ทุกวันนี้ มีการให้ความสนใจเพิ่มมากขึ้นสำหรับการทำงานทางเภสัชวิทยาต่างๆ ของมัน รวมถึงการต้านการอักเสบ ต้านความเหนื่อยล้า การต้านเนื้องอก ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ การเสริมสร้างภูมิคุ้มกัน และอื่นๆ (Gu et al., 2016; Fu et al., 2018) นอกจากนี้ยังเป็นที่รู้จักในนาม "โสมแห่งทะเลทราย" ในประเทศจีนเนื่องจากมีผลการรักษาทางคลินิกที่ยอดเยี่ยม การประยุกต์ใช้ทั้งแบบดั้งเดิมและสมัยใหม่ของค. ทะเลทรายิโคลาทำให้สมุนไพรชนิดนี้เป็นที่นิยมทั้งในวงการแพทย์และอุตสาหกรรมอาหารเพื่อสุขภาพ จึงได้พัฒนาเป็นของเหลวยาและสารอาหารที่ได้รับการรับรองจากสำนักงานคณะกรรมการอาหารและยาแห่งรัฐ ที่ให้ไว้ค. ทะเลทรายิโคลามักใช้เพื่อจัดการกับโรคไตในการแพทย์พื้นบ้านของจีน ซึ่งหมายความว่าสมุนไพรที่รับประทานได้นี้ถือได้ว่าเป็นตัวแทนทางเลือกที่มีแนวโน้มว่าจะแทรกแซงโรคกระดูกพรุนตามทฤษฎีของ "ไตครอบงำกระดูก" (Wang et al., 2016) ข้อมูลที่ตีพิมพ์ได้พิสูจน์แล้วว่ามีฤทธิ์ต้านโรคกระดูกพรุนของสารสกัด C. deserticola ทั้งในร่างกายและในหลอดทดลอง (Liang et al., 2011; Li et al., 2012; Liang et al., 2013; Xu et al., 2017; Song et al., 2018) และสารประกอบที่แยกได้หลายชนิดรวมถึง echinacoside (Li et al., 2013), acteoside (Lee et al., 2013) และ cistanoside A (Xu et al., 2017) ซึ่งได้รับรายงานด้วยว่าการต่อต้านการประมวลผล -กิจกรรมโรคกระดูกพรุน และสารประกอบอื่นๆ เช่น 2'-acetylacteoside ได้รับการยืนยันว่ามีสารต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ ปกป้องระบบประสาท ปกป้องตับ เสริมสร้างภูมิคุ้มกัน (Li et al., 2016) และศักยภาพในการต่อต้านริ้วรอย (Peng et al., 2016) จนถึงปัจจุบัน มีการระบุฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพหลายสิบชนิดจากสมุนไพร Cistanche(Wang et al., 2012), echinacoside และ acteoside เป็นสารประกอบหลักที่มีอยู่ในสายพันธุ์ Cistanche ส่วนใหญ่ที่มีเนื้อหาอยู่ที่ 1.83–41.49 และ 0.27–8.28 มก./ กก. , ตามลำดับ; ในขณะที่ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์อื่นๆ ได้แก่ 2'-อะซิติแลคติโอไซด์, 6'-อะซิติแลคติโอไซด์, ซิสตาโนไซด์ A, ซิสตาโนไซด์ C และไอโซแอคทีโอไซด์คือ 1.56–3.16 มก./กรัม, 0.49–1.66 มก./กก., 1.41–1{{ 29}}.11 มก./กก. 0.33–2.24 มก./กก. และ 0.08–5.00 มก./ กก. ตามลำดับ (Dong et al., 2018) จากข้อมูลที่เผยแพร่ข้างต้น เราพบว่ากลไกระดับโมเลกุลต่อต้านโรคกระดูกพรุนของค. ทะเลทรายิโคลาโดยเฉพาะสัญญาณต้นน้ำไม่ชัดเจน และสารประกอบเองไม่สามารถแสดงถึงผลของสมุนไพรซึ่งมีคุณสมบัติการทำงานร่วมกันที่เกิดจากส่วนประกอบประเภทต่างๆ นอกจากนี้เป้าหมายเฉพาะของเส้นทางการส่งสัญญาณยังแตกต่างกันโดยสิ้นเชิงระหว่างส่วนประกอบต่างๆ งานปัจจุบันมีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบผลการป้องกันที่อาจเกิดขึ้นของค. ทะเลทรายิโคลาต่อต้านหนูที่ตัดรังไข่ (OVX) ในร่างกาย โดยเน้นที่การควบคุมของปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับตัวรับเนื้อร้ายเนื้องอก 6 (TRAF6) ตัวกระตุ้นตัวรับของลิแกนด์ปัจจัยนิวเคลียร์คัปปา B (RANKL) การแสดงออกของ RANK และ RANKL/RANK/TRAF{{3} } เหนี่ยวนำให้เกิดปัจจัยนิวเคลียร์แคปปา B (NF-κB) และการส่งสัญญาณฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส (PI3K)/โปรตีนไคเนส (AKT) การเปลี่ยนแปลงรูปร่างของกระดูก ซึ่งรวมถึงการสร้างและการซ่อมแซมใหม่ เป็นกระบวนการที่ซับซ้อนซึ่งควบคุมโดยความสมดุลระหว่างการสร้างกระดูกที่สร้างกระดูกและการสลายตัวของกระดูก osteoclastic และการสลายของกระดูกที่เพิ่มขึ้นซึ่งส่วนใหญ่เกิดจากการสร้างกระดูกที่เพิ่มขึ้นมักจะนำไปสู่โรคกระดูกพรุนแม้กระทั่งการแตกหักของกระดูก สัญญาณของเซลล์ ฮอร์โมน และปัจจัยการเจริญเติบโตส่วนใหญ่ที่จำเป็นสำหรับการสร้างความแตกต่างและการทำงานของ osteoclast ถูกควบคุมโดย RANK และลิแกนด์สองตัวของมัน RANKL และ osteoprotegerin (OPG) (Lacey et al., 1998) และการค้นพบล่าสุดที่ค้นพบเพิ่มเติม TRAF6 เป็นปัจจัยด้านกฎระเบียบที่สำคัญในลำดับการส่งสัญญาณการส่งสัญญาณ RANKL/RANK (Tan et al., 2017) โดยการสรรหา TRAF6 นั้น RANKL ผูกติดกับตัวรับ RANK จากนั้นสัญญาณสัญญาณดาวน์สตรีมรวมถึง NF-κB และ PI3K/AKT ถูกกระตุ้น จากนั้นจึงกระตุ้นโปรตีน osteoclastogenic ที่สำคัญของ c-Fos และปัจจัยนิวเคลียร์ของ T เซลล์ที่เปิดใช้งาน c2 (NFAT2) ( Takayanagi, 2007) ได้รับการควบคุม และในที่สุด ความแตกต่างของ osteoclast ก็เริ่มขึ้น ในการศึกษานี้ กลไกการต่อต้านโรคกระดูกพรุนที่เป็นพื้นฐานของ CDE ต่อ RANKL/RANK/TRAF6-การสลายของกระดูกที่เป็นสื่อกลางได้รับการตรวจสอบและอภิปราย

วัสดุและวิธีการ

สัตว์ เซลล์ แอนติบอดี และรีเอเจนต์

หนู Sprague-Dawley ตัวเต็มวัยเพศเมีย (มหาวิทยาลัยการแพทย์หนิงเซี่ย เมืองยินฉวน ประเทศจีน); เซลล์ RAW264.7 (Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China); macrophage colony stimulating factor (M-CSF) และ RANKL (PerroTech, Inc. USA); estradiol valerate [estradiol valerate (EV), Delpharm Lille SAS, ปารีส, ฝรั่งเศส]; cathepsin K (CK) ชุด ELISA (BioVision, American); deoxypyridinoline (DPD) และ bone gla-protein (BGP) cross-links ELISA kits (Xinyu Biological Engineering Co., Ltd, Shanghai, China); malondialdehyde (MDA), กลูตาไธโอน (GSH) และชุดรีเอเจนต์ superoxide dismutase (SOD) (Jianchen Biological Engineering, Nanjing, China); เพนิซิลลินและสเตรปโตมัยซิน (Gibco, USA); เมมเบรนโพลีไวนิลลิดีนฟลูออไรด์ (PVDF) (Millipore Life Sciences, USA); แอนติบอดีปฐมภูมิรวมถึง GAPDH (18AF0401), -แอกติน (17AV0411), IκB kinase (IKK ) (AD01134589), TRAF6 (2), RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), NFκBIA (AH04138226), PI3K ( AC09021266), OPG (AG06292776), c-Fos (AG12059411), AKT (AF05173234), NFAT2 (AO11015648) และแอนติบอดีทุติยภูมิ (มะรุมเปอร์ออกซิเดส-คอนจูเกตแพะต้านกระต่ายอิมมูโนโกลบูลิน G, 134658) ถูกนำเสนอโดย ZSGB-BIO (ปักกิ่ง) , จีน); สื่อกลางของนกอินทรีดัดแปลง (DMEM) ของ Dulbecco ชุดทดสอบการหาปริมาณโปรตีนกรด bicinchoninic เซรั่มวัวในครรภ์ (FBS) และน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟตของ Dulbecco (PBS) ที่ซื้อจาก Hylcone (โลแกน รัฐยูทาห์ สหรัฐอเมริกา); echinacoside [โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC) มากกว่าหรือเท่ากับ 98 เปอร์เซ็นต์ , 11167-200503, สถาบันแห่งชาติเพื่อการควบคุมอาหารและยา ประเทศจีน]; แอคทีโอไซด์ (HPLC มากกว่าหรือเท่ากับ 98 เปอร์เซ็นต์ , AB0497, ALFA, จีน); isoacteoside (HPLC มากกว่าหรือเท่ากับ 98 เปอร์เซ็นต์ , AB17021202, ALFA, China); 2'-acetyl acteoside (HPLC มากกว่าหรือเท่ากับ 98 เปอร์เซ็นต์ , PRF7081243, Chengdu Pu Rui Fa Technology, Co., Ltd. China); cistanoside A, cistanoside C และ 6'-acetyl acteoside (HPLC มากกว่าหรือเท่ากับ 95 เปอร์เซ็นต์ แยกออกและทำให้บริสุทธิ์ในห้องปฏิบัติการของเรา) (Xu et al., 2017)

วัสดุและการเตรียมพืช

ลำต้นแห้งของค. ทะเลทรายิโคลาYC Ma ถูกซื้อมาจากเขต Yongning County จังหวัด Ningxia เมื่อวันที่ 2 กันยายน015 พิกัดเฉพาะของการเลือกโรงงานคือ (106.026597, 38.262816) สมุนไพรถูกระบุโดยศาสตราจารย์หลิงตง (แผนกเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยการแพทย์หนิงเซี่ย) โดยมีตัวอย่างใบสำคัญ (#20150901) อยู่ในสมุนไพรของการวิเคราะห์ทางเภสัชกรรม รวม 10.0 กก. แบบแห้งและแบบผงค. ทะเลทรายิโคลาสกัดโดยวิธี Heat reflux โดยมีรายละเอียดดังนี้ ตัวทำละลายเป็นเอทานอล 75 เปอร์เซ็นต์ อัตราส่วนของค. ทะเลทรายิโคลาวัสดุที่ใช้ทำตัวทำละลายคือ 1:8 เวลาในการรีฟลักซ์นาน 2 ชั่วโมง และวัสดุถูกรีฟลักซ์ถึงสามครั้ง จากนั้นกรองทั้งหมดจะถูกผสมเข้าด้วยกันและทำให้เข้มข้นภายใต้สภาวะความดันที่ลดลงเพื่อให้ได้ 6.5 กก.ค. ทะเลทรายิโคลาสารสกัดจากเอทานอล (CDE) สำหรับการทดลองในสัตว์ทดลอง {{0}}.5 เปอร์เซ็นต์ คาร์บอกซีเมทิล เซลลูโลส โซเดียม (CMC-Na) ถูกใช้เพื่อระงับ CDE และขนาดการให้ยาทางปากถูกกำหนดเป็น 200, 400 และ 800 มก./กก./วัน โดยปริมาตร 1 มล./100 กรัมของน้ำหนักตัวของสัตว์แต่ละตัว สำหรับการวิเคราะห์ western blot ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ถูกใช้เพื่อละลาย CDE แล้วเจือจางด้วย DMEM เพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายที่ 0.01, 01 1 มก./มล.; สำหรับการวิเคราะห์ HPLC เมทานอลถูกใช้เพื่อละลาย CDE ตามด้วยกรองและเจือจางด้วยเฟสเคลื่อนที่เริ่มต้นเพื่อให้ได้ความเข้มข้นที่เหมาะสม

การวิเคราะห์โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงของสารสกัดจาก Cistanche Deserticola

องค์ประกอบทางเคมีที่สำคัญของ CDE ถูกระบุโดยใช้ HPLC กับสารอ้างอิงที่สอดคล้องกัน เงื่อนไขโครมาโตกราฟีถูกกำหนดดังนี้: เครื่องมือ RP-HPLC แบบ Agilent 1220 ที่มีคอลัมน์ C18 (4.6 id × 250 มม.; 5 ไมโครเมตร) ใช้เฟสเคลื่อนที่ของตัวชะแบบเกรเดียนท์ที่มีน้ำเป็นส่วนใหญ่และอะซิโตไนไตรล์ เพื่อให้ได้พีคที่แยกจากกันอย่างดี: ตัวทำละลาย A (น้ำที่มีกรดอะซิติก 0.5 เปอร์เซ็นต์) และ B (อะซิโตไนไตรล์): 0–4 นาที, 85–83 เปอร์เซ็นต์ A; 4–10 นาที 83–80 เปอร์เซ็นต์ A; 10–30 นาที 80–75 เปอร์เซ็นต์ A; 30-40 นาที 75–70 เปอร์เซ็นต์ A. ปริมาณการฉีดตัวอย่างคือ 5 ul อุณหภูมิถูกควบคุมที่ 30 องศา และการตรวจจับ UV ดำเนินการที่ 333 nm (Dong et al., 2018) สารอ้างอิงซึ่งรวมถึงอิชินาโคไซด์, แอกทิโอไซด์, ไอโซแอคทีโอไซด์, ซิสตาโนไซด์ A, ซิสตาโนไซด์ C, 2'-อะซิติลแอกเตโอไซด์ และ 6'-อะซิติลแอกทีโอไซด์ถูกใช้เพื่อระบุพีคที่สอดคล้องกัน

cistancheสามารถแอนตี้อะพอพโทซิส

การทดลองกับสัตว์

สำหรับการทดลองกับสัตว์ ขั้นตอนทั้งหมดได้ดำเนินการอย่างเคร่งครัดตามโปรโตคอลที่ได้รับอนุมัติโดยคำแนะนำของคณะกรรมการการดูแลสัตว์ในสถาบันและการใช้งานของมหาวิทยาลัยการแพทย์หนิงเซี่ย (NXMU{{0}}) ได้รับหนู Sprague-Dawley เพศเมียที่โตเต็มวัยจำนวนสี่สิบแปดตัวที่มีน้ำหนักประมาณ 237 ± 25 กรัม (มหาวิทยาลัยการแพทย์หนิงเซี่ย เมืองยินฉวน ประเทศจีน) และเลี้ยงเป็นเวลา 1 สัปดาห์ด้วยอาหารเม็ดมาตรฐานและน้ำประปาภายใต้สภาวะที่ควบคุมโดยสิ่งแวดล้อม จากนั้น หนูแต่ละตัวได้รับการดมยาสลบ (chloral hydrate, 100 มก./กก., ip) เท่านั้น, sham ovariectomized (sham) หรือรังไข่สองอันถูกเอาออกแล้วสุ่มแบ่งออกเป็นห้ากลุ่ม: กลุ่มแบบจำลอง (OVX) ถูกบริหารด้วยปากเปล่าด้วย 0.5 เปอร์เซ็นต์ CMC-นา; กลุ่มบวก (EV) ที่มี estradiol valerate 1 มก./กก./วัน; กลุ่มขนาดยาต่ำ (CDEL), ปานกลาง (CDEM) และสูง (CDEH) ที่มี CDE 200, 400 และ 800 มก. / กก. / วันตามลำดับ การทดลองกินเวลา 12 สัปดาห์; วัดน้ำหนักตัวของหนูแต่ละตัวทุกสองสัปดาห์โดยปรับขนาดยาให้เหมาะสม หลังจากวันสุดท้ายของการแทรกแซง รวบรวมและเก็บปัสสาวะ 24 ชั่วโมง ซีรั่ม กระดูกต้นขา กระดูกหน้าแข้ง และมดลูกที่ −80 องศาเพื่อการวิเคราะห์ที่ต่างกันต่อไป

พารามิเตอร์ทางชีวเคมี

ระดับของ SOD, GSH, MDA, cathepsin K, BGP และ DPD ในปัสสาวะถูกกำหนดโดยชุดรีเอเจนต์ที่เกี่ยวข้อง ในขณะที่กิจกรรมของกรดฟอสฟาเตสที่ดื้อต่อทาร์เทรต (TRAP) ถูกประเมินตามข้อมูลอ้างอิง (Jiao et al., 2552). กิจกรรมของอัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (ALP) และระดับ Ca และ P ประเมินโดยใช้เครื่องวิเคราะห์อัตโนมัติ (Ciba-Corning 550, USA)

ความหนาแน่นของกระดูกและการวิเคราะห์เอกซเรย์คอมพิวเตอร์ไมโครคอมพิวเตอร์

ใช้เครื่องดูดกลืนรังสีเอกซ์แบบใช้พลังงานคู่ (Lunar, USA) เพื่อประเมินความหนาแน่นของแร่ธาตุของกระดูก (BMD, g/ cm2) ของกระดูกโคนขาขวาของหนูแต่ละตัวที่มีโหมดสแกนถูกตั้งค่าเป็นสัตว์ขนาดเล็ก จากนั้น ใช้กระดูกโคนขาเดียวกันเพื่อประเมินภาพ 3 มิติของสถาปัตยกรรมไมโครกระดูก trabecular โดยใช้เครื่องสแกน micro-CT (GE, American) พื้นที่ที่น่าสนใจ (ROI) ถูกเลือกโดยการตั้งค่าพิกัดเดียวกันในแผ่นการเจริญเติบโตของ กระดูกโคนขาของแต่ละตัวอย่าง พารามิเตอร์ไมโครสถาปัตยกรรม รวมถึงปริมาณแร่ธาตุกระดูก (BMC) ปริมาณแร่ธาตุในเนื้อเยื่อ (TMC) ความหนาแน่นของแร่ธาตุในเนื้อเยื่อ (TMD) การแยก trabecular (Tb. Sp) หมายเลข trabecular (Tb. N) และความหนา trabecular ( Tb. Th) ได้มาจากการวิเคราะห์ ROI

การกำหนด Western Blot

Osteoclasts ถูกเหนี่ยวนำโดยการใช้เซลล์ RAW 264.7 ที่เติมด้วย MCSF (25 ng/ml) และ RANKL (20 ng/ml) (Yang et al., 2019) หลังจาก 6 วันของการกระตุ้นเป็นเวลานาน เซลล์ osteoclast ที่เจริญเต็มที่ซึ่งถูกระบุสำหรับการออกฤทธิ์ของ TRAP จะถูกบำบัดด้วยหรือไม่มี CDE (0.01, 0.1 และ 1 มก./มล. ตามลำดับ) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นเซลล์จะถูกสลายโดยบัฟเฟอร์ lysis และ ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกหมุนเหวี่ยงและแยกจากกันโดยโซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์ เจล อิเล็กโทรโฟรีซิส 10 เปอร์เซ็นต์ และถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF เมมเบรนถูกบล็อกด้วยนมที่ไม่มีไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์ที่อุณหภูมิแวดล้อมเป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นจึงบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิต้าน TRAF6 (1:400), RANKL (1:400), RANK (1:400), IKK (1:400) ), NFκBIA (1:400), OPG (1:400), PI3K (1:400), AKT (1:400), c-Fos (1:400), NFAT2 (1:400), -actin และ GAPDH (1:1,000) เยื่อแผ่นเดียวกันถูกถอดออกและตรวจสอบอีกครั้งด้วยแอนติบอดีที่สอดคล้องกัน ซึ่งตรวจพบโดยซอฟต์แวร์ Image Lab ในตอนท้าย การทดลองแต่ละครั้งทำซ้ำสามครั้ง โดยมี -แอกตินหรือ GAPDH เป็นตัวควบคุมภายใน

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลการทดลองของเรา ซึ่งอธิบายว่าเป็นค่าเฉลี่ย± SD ถูกวิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวตามด้วยการทดสอบของ Dennett (ซอฟต์แวร์ SPSS 22.0, SPSS, สหรัฐอเมริกา), p < {{3} }.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ

cistancheยังเป็นที่รู้จักกันในนามทะเลทรายโสม

ผลลัพธ์ องค์ประกอบทางเคมีหลักของCistanches deserticola

สารสกัด โดยใช้สารอ้างอิงที่สอดคล้องกันเจ็ดสารประกอบฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์เป็นหลักรวมถึงอีไคนาโคไซด์ซิสตาโนไซด์A, แอคทีโอไซด์, ไอโซแอคทีโอไซด์,ซิสตาโนไซด์C, 2'-อะซิติลแอคทีโอไซด์,และ 6'-acetylแอคทีโอไซด์ถูกระบุอยู่ในสารสกัดนี้ พีคโครมาโตกราฟีที่สอดคล้องกันและโครงสร้างของพวกมันถูกแสดงไว้ในรูปที่ 1

ผลกระทบของCistanches deserticolaสารสกัดในร่างกาย มดลูก และน้ำหนักช่องคลอด

ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในน้ำหนักตัวเริ่มต้นก่อนการผ่าตัด อย่างไรก็ตาม 3 เดือนหลังการผ่าตัดตัดรังไข่ น้ำหนักตัวของหนูในกลุ่มโมเดล OVX เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ 35.7 เปอร์เซ็นต์ ในขณะที่น้ำหนักเปียกของมดลูกและช่องคลอดลดลงอย่างรวดเร็ว 91.2 และ 61.8 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ เมื่อเทียบกับหลอก หนู (p < 0.001)="" cde="" ที่มีขนาด="" 200–800="" มก./กก./วัน="" ไม่มีผลต่อน้ำหนักตัวที่เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดเหล่านี้="" และน้ำหนักเปียกของมดลูกและช่องคลอดที่ลดลง="" ดังรูปที่="" 2="" แสดงให้เห็น="" อย่างไรก็ตาม="" ในทางตรงกันข้ามกับ="" cde="" โดยสิ้นเชิง="" 1="" มก./กก./วัน="" ของ="" ev="" แสดงผลฮอร์โมนเอสโตรเจนอย่างมีนัยสำคัญ="" ซึ่งน้ำหนักตัวที่เพิ่มขึ้นและน้ำหนักมดลูกและช่องคลอดที่ลดลงในหนู="" ovx="" ได้รับการกลับรายการอย่างมีนัยสำคัญโดยการเสริม="">

ผลกระทบของCistanches deserticolaสารสกัดความหนาแน่นของกระดูกและโครงสร้างจุลภาคของกระดูก

มีแนวโน้มลดลงอย่างสังหรณ์ใจในกลุ่ม OVX ที่มี BMD คือ {{0}}.158 ± 0.016 g/cm2 เมื่อเปรียบเทียบกับหนูทดลองที่มี BMD คือ {{10}}.180 ± 0.010 g/cm2 (p < 0.001)="" ซึ่งบอกเป็นนัยว่า="" bmd="" ของหนูในกลุ่มโมเดล="" ovx="" ลดลงประมาณ="" 12.2="" เปอร์เซ็นต์หลังจาก="" 12="" สัปดาห์ของการผ่าตัดตัดรังไข่เมื่อเทียบกับหนูหลอก="" ดังรูปที่="" 3="" แสดงให้เห็นว่าหนูที่ได้รับการรักษาด้วย="" cde="" ทั้งหมดมี="" bmd="" เพิ่มขึ้น="" 15.1="" เปอร์เซ็นต์="" (p="">< 0.001),="" 8.1="" เปอร์เซ็นต์="" (p="">< 0.05)="" และ="" 9.2="" เปอร์เซ็นต์="" (p="">< 0.05)="" ตามลำดับ="" เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มโมเดล="" ovx="" ภาพ="" 3="" มิติและผลลัพธ์เชิงปริมาณที่สอดคล้องกันของโครงสร้างไมโครกระดูก="" trabecular="" ของหนูถูกแสดงในรูปที่="" 4="" สอดคล้องกับผลลัพธ์ของ="" bmd="" การลดลงของพื้นที่="" trabecular="" อย่างเห็นได้ชัดในกลุ่มแบบจำลอง="" ovx="" เมื่อเปรียบเทียบกับหนูทดลอง="" อย่างไรก็ตาม="" การเสื่อมสภาพของกระดูก="" trabecular="" ดีขึ้นบางส่วนโดยการแทรกแซงของ="" cde="" ยกเว้น="" tmd="" และ="" tb="" th="" พารามิเตอร์อื่นๆ="" ของกระดูก="" trabecular="" ได้แก่="" bmc,="" tmc="" และ="" tb="" n="" เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญและ="" tb="" sp="" ลดลงอย่างเห็นได้ชัดหลังการรักษาด้วย="">

ผลกระทบของCistanches deserticolaสารสกัดจากปัสสาวะและเซรั่มพารามิเตอร์ทางชีวเคมี

12 สัปดาห์หลังการผ่าตัดตัดรังไข่ออก พบว่าระดับ Ca ที่ขับออกมาในปัสสาวะมีแนวโน้มลดลงแต่ไม่มีสถิติในกลุ่มแบบจำลอง OVX ดังรูปที่ 5 แสดง ในขณะที่ระดับ P ของปัสสาวะในหนูกลุ่มตัวอย่าง OVX ลดลงประมาณ 3 น้อยกว่าหนูหลอก (p < 0001)="" หลังการรักษาด้วย="" cde="" (200–400="" มก./กก./วัน)="" เป็นเวลา="" 12="" สัปดาห์="" จะป้องกันไม่ให้ซีรั่ม="" ca="" และ="" p="" ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ="" (p="">< 0.05)="" และระดับการขับปัสสาวะที่ลดลงของ="" p="" ก็ถูกยับยั้งในทุก="" cde="" ที่ได้รับการรักษาด้วย="" cde="" กลุ่ม="" (p=""><>

ผลกระทบของCistanches deserticolaสารสกัดจากการสร้างกระดูกและเครื่องหมายการสลาย

เกี่ยวกับเครื่องหมายการสร้างกระดูกของ ALP และ BGP (รูปที่ 6) กิจกรรมของ ALP ไม่ใช่ BGP ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มที่ได้รับ CDE (200–800 มก./กก./วัน) ทั้งสามขนาดเมื่อเทียบกับหนูหลอก เกี่ยวกับเครื่องหมายการสลายกระดูกของ TRAP, DPD และ cathepsin K (รูปที่ 7) กิจกรรมของการสลายกระดูกทั้งสาม

เครื่องหมายเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญประมาณ 20.9~74.8 เปอร์เซ็นต์ในหนูของกลุ่มโมเดล OVX เมื่อเปรียบเทียบกับหนูทดลอง และคาดว่า CDE มีศักยภาพในการปราบปรามดัชนีเหล่านี้ทั้งหมด โดยที่กิจกรรมของ cathepsin K ลดลง 49.9~66.7 เปอร์เซ็นต์ (p < 0.001)="" ระดับของ="" dpd="" คือ="" ลดลง="" 22.9~39.3="" เปอร์เซ็นต์="" (p="">< 0.01)="" และคุณสมบัติของ="" trap="" ถูกป้องกันโดย="" 20.1~27.6="" เปอร์เซ็นต์="" (p="">< 0.01)="" ตามลำดับ="" เมื่อเปรียบเทียบกับหนูในกลุ่มโมเดล="">

ผลของสารสกัด Cistanches deserticola ต่อกิจกรรมของ Glutathione และ Superoxide Dismutase รวมทั้งปริมาณ Malondialdehyde

ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในกิจกรรมของ SOD และ GSH ระหว่าง OVX และกลุ่มหลอกหลังจากการผ่าตัดรังไข่ 3 เดือนดังรูปที่ 8 แสดงในขณะที่เนื้อหาของ MDA เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดในหนูของ OVX

กลุ่มแบบจำลองโดยร้อยละ 68.2 เมื่อเปรียบเทียบกับหนูทดลอง และระดับ MDA ที่เพิ่มขึ้นเหล่านี้ถูกระงับอย่างมีนัยสำคัญโดยปริมาณต่ำ ปานกลาง และสูงของกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย CDE ที่มีเปอร์เซ็นต์การยับยั้งเท่ากับ 66.1, 440 และ 62.8 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับหนูในกลุ่มโมเดล OVX

ผลกระทบของCistanches deserticolaแยกในระดับการแสดงออกของโปรตีนของ TRAF6, RANKL, RANK, NFκBIA, IKK , PI3K, AKT, OPG, c-Fos และ NFAT2

ดังรูปที่ 9 แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ TRAF6, RANKL, RANK, IKK , NFκBIA และ NFAT2 ถูกควบคุมอย่างมีนัยสำคัญในขณะที่ระดับของ PI3K, AKT, OPG และ c-Fos ได้รับการควบคุมอย่างเห็นได้ชัดหลังการรักษาด้วย CDE เมื่อเปรียบเทียบ เพื่อควบคุม กลไกสมมุติฐาน (รูปที่ 10) โดยที่ CDE สามารถลดระดับของ RANKL, RANK และ TRAF6 และควบคุมการแสดงออกของ OPG ดังนั้นปริมาณการผูกมัดของ RANKL กับ RANK จึงลดลง ดังนั้น เส้นทางดาวน์สตรีมรวมถึงสัญญาณ NF-κB ถูกระงับและ PI3K/AKT ถูกกระตุ้น และน้ำตกสัญญาณเหล่านี้ร่วมกันทำให้เกิดการกระตุ้น c-Fos และยับยั้ง NFAT2 และในที่สุดก็ป้องกันการสลายตัวของกระดูก osteoclastic อภิปรายผล