ส่วนที่ 1 Acteoside ยับยั้ง Osteoclastogenesis ที่อาศัย RANKL โดยยับยั้งการเหนี่ยวนำ C-Fos และเส้นทาง NF- KB และลดการผลิต ROS
Mar 07, 2022
ซึง-ยอบ ลี1,2., กึนซู ลี3.¤, ซี ฮยอน ยี2., ซองโฮกุ๊ก2, จองแช ลี2,3*
1 Research Institute of Clinical Medicine of Chonbuk National University, Biomedical Research Institute of Chonbuk National University Hospital, Jeonju, Chonbuk, South Korea, 2 ภาควิชาทันตกรรมจัดฟัน, Institute of Oral Biosciences and School of Dentistry, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, South เกาหลี, 3 Department of Bioactive Material Sciences, Research Center of Bioactive Materials, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, South Korea
เชิงนามธรรม
การศึกษาจำนวนมากได้รายงานว่าไซโตไคน์ที่เกิดจากการอักเสบเป็นตัวกลางที่สำคัญสำหรับการสร้างกระดูก ซึ่งทำให้เกิดการสลายของกระดูกและโรคกระดูกพรุนมากเกินไปแอคทีโอไซด์, สารออกฤทธิ์หลักของเรห์มานเนีย กลูติโนซ่าซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายในการแพทย์แผนโบราณของตะวันออก มีศักยภาพในการต้านการอักเสบและต้านอนุมูลอิสระ ในการศึกษานี้ เราพบว่าแอคทีโอไซด์ยับยั้งการสร้างความแตกต่างและการก่อตัวของ osteoclast อย่างเห็นได้ชัดจากมาโครฟาจของไขกระดูก (BMM) และมาโครฟาจ RAW264.7 ที่ถูกกระตุ้นโดยตัวกระตุ้นรีเซพเตอร์ของลิแกนด์ปัจจัยนิวเคลียร์-kappaB (NF-kB) (RANKL) การปรับสภาพด้วย Acteoside ยังป้องกันการสลายของกระดูกโดยเซลล์สร้างกระดูกที่โตเต็มที่ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาแอคทีโอไซด์(10 มิลลิโมลาร์) ลดทอนการกระตุ้นด้วยการกระตุ้น RANKL ของ p38 ไคเนส, ไคเนสที่ควบคุมสัญญาณภายนอกเซลล์ และไคเนสที่ปลาย N ของ c-Jun และยังยับยั้งการกระตุ้น NF-kB โดยการยับยั้งฟอสโฟรีเลชันของหน่วยย่อย p65 และตัวยับยั้ง kBa นอกจากนี้ RANKL-mediated เพิ่มขึ้นในการแสดงออกของ c-Fos และปัจจัยนิวเคลียร์ของ T-cells ที่ถูกกระตุ้น, ไซโตพลาสซึม 1 (NFATc1), และในการผลิตของ tumor necrosis factor-a, interleukin (IL)-1b และ IL-6 เห็นได้ชัดว่าถูกยับยั้งโดยการปรับสภาพด้วยแอกทีโอไซด์ นอกจากนี้ช่องปากแอคทีโอไซด์ลดการสูญเสียกระดูกที่เกิดจากการตัดรังไข่และการผลิตไซโตไคน์อักเสบเพื่อควบคุมระดับ ข้อมูลของเราแนะนำว่าแอคทีโอไซด์ยับยั้งการสร้างความแตกต่างและการเจริญเติบโตของ osteoclast จากสารตั้งต้นของ osteoclast โดยการยับยั้งการกระตุ้นที่เหนี่ยวนำโดย RANKL ของไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นด้วยไมโตเจนและปัจจัยการถอดรหัส เช่น NF-kB, c-Fos และ NFATc1 โดยรวมแล้วผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าแอคทีโอไซด์อาจทำหน้าที่เป็นสารต้านการดูดซับเพื่อลดการสูญเสียกระดูกโดยการปิดกั้นการกระตุ้นของ osteoclast
สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมกรุณาติดต่อ:emily.li@wecistanche.com
บทนำ
กระดูกได้รับการปรับปรุงใหม่อย่างต่อเนื่องโดยการทำงานของเซลล์สร้างกระดูกและกระดูกที่สมดุล [1] Osteoclasts เกิดขึ้นจากเซลล์ตั้งต้นของเม็ดเลือดของสายเลือด monocyte/macrophage ในขณะที่เซลล์สร้างกระดูกมีเชื้อสาย mesenchymal [2] การกระตุ้นภาวะกระดูกพรุนผิดปกติหรือการสร้างกระดูกเสื่อมที่ลดลงสามารถขัดขวางสภาวะสมดุลของกระดูก ทำให้เกิดโรคต่างๆ เช่น โรคกระดูกพรุน โรคข้ออักเสบ และมะเร็งกระดูกในที่สุด [3,4] โรคกระดูกพรุนเป็นโรคกระดูกที่พบได้บ่อยซึ่งนำไปสู่ความเสี่ยงที่จะเกิดการแตกหักเพิ่มขึ้น รูปแบบของโรคกระดูกพรุนที่พบบ่อยที่สุดเกิดจากการขาดฮอร์โมนเอสโตรเจนในสตรีวัยหมดประจำเดือน ยาเช่น corticosteroids และยากันชักอาจก่อให้เกิดความไม่สมดุลระหว่างการสลายและการก่อตัวของกระดูก ซึ่งอาจส่งผลให้เกิดโรคกระดูกพรุนได้ [5] มีการใช้สารยับยั้งการดูดกลืนแสงหลายชนิด เช่น bisphosphonates, calcitonin, estrogen และ selective estrogen receptor modulators ในการรักษาโรคกระดูกพรุน สารยับยั้งเหล่านี้รักษามวลกระดูกโดยการยับยั้งการทำงานของเซลล์สร้างกระดูก [6] การบำบัดทดแทนเอสโตรเจนเป็นการรักษาที่ได้รับความนิยมมากที่สุดในการป้องกันและรักษาโรคกระดูกพรุนในวัยหมดประจำเดือน อย่างไรก็ตาม การบำบัดทดแทนฮอร์โมนเอสโตรเจนในระยะยาวสามารถเพิ่มความเสี่ยงของมะเร็งเยื่อบุโพรงมดลูกและมะเร็งเต้านมได้ ดังนั้น ผู้วิจัยหลายคนจึงมุ่งความพยายามในการพัฒนาสารต้านการดูดกลืนแบบใหม่ที่ไม่มีผลข้างเคียง [7–10] เนื่องจากเซลล์สร้างกระดูกทำหน้าที่ในการสลายของกระดูก การยับยั้งเซลล์สร้างกระดูกโดยเฉพาะจึงถือเป็นเป้าหมายหลักในการศึกษาจำนวนมาก Osteoclasts เป็นเซลล์ยักษ์ที่มีนิวเคลียสหลายนิวเคลียสซึ่งเกิดขึ้นจากต้นกำเนิดที่มีนิวเคลียสเดียวของตระกูล monocyte/macrophage ผ่านการงอกขยาย การแยกตัว และการรวมตัวของเซลล์ตั้งต้นของเม็ดเลือด [11] ปัจจัยกระตุ้นอาณานิคมของมาโครฟาจ (M-CSF) และตัวกระตุ้นตัวรับของปัจจัยนิวเคลียร์ (NF) -kB (RANK) ลิแกนด์ (RANKL) เป็นปัจจัยสำคัญสำหรับการสร้างความแตกต่างของเซลล์กระดูก[12] นอกจากนี้ ไซโตไคน์ที่มีการอักเสบหลายชนิด เช่น tumor necrosis factor (TNF) และ interleukin (IL)-1b มีส่วนทำให้เกิด osteoclastogenesis โดยการปรับการเหนี่ยวนำของ RANKL, osteoprotegerin และ M-CSF [7,13] การจับ RANKL กับตัวรับ RANK บนพื้นผิวเซลล์ทำให้เกิด RANKL/RANK/TNFR
สารเชิงซ้อนของปัจจัยที่เกี่ยวข้อง (TRAF) ที่กระตุ้น NFkB และไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นด้วยไมโทเจน (MAPK) ตามลำดับ ซึ่งรวมถึงไคเนสที่ปลาย N ของ cJun (JNK) ไคเนส p38 และไคเนสที่เกี่ยวข้องกับสัญญาณภายนอกเซลล์ (ERK) [14] การกระตุ้นนี้มีบทบาทสำคัญในการไกล่เกลี่ยการสร้างความแตกต่าง การกระตุ้น และการอยู่รอดของ osteoclast นอกจากนี้ RANKL ยังกระตุ้นการแสดงออกของปัจจัยการถอดรหัส เช่น ปัจจัยนิวเคลียร์ของทีเซลล์ที่ถูกกระตุ้น ไซโตพลาสซึม 1 (NFATc1) และ-Fos ซึ่งจำเป็นสำหรับการพัฒนาออสติโอพลาสต์ [ 7,9]. ดังนั้นการส่งสัญญาณ RANKL จึงเป็นเป้าหมายหลักของสารต้านการดูดซับที่ยับยั้งการกระตุ้นของ osteoclast และไม่มีกระดูกแอคทีโอไซด์เป็นสารประกอบออกฤทธิ์หลักของ Rehmannia glutinosa ซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายในการแพทย์แผนตะวันออก [15,16]แอคทีโอไซด์เป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่แรงและมีฤทธิ์ต้านตับ ต้านการอักเสบ และต้านอาการเจ็บปวดของอวัยวะต่างๆ [17–20] ก่อนหน้านี้เราพบว่าแอคทีโอไซด์ลดกิจกรรมของไทโรซิเนสและการสังเคราะห์เมลานินโดยควบคุมการส่งสัญญาณ ERK [21] ป้องกันความเสียหายของเหงือกที่เกิดจากปฏิกิริยาของออกซิเจน (ROS) [22] และยับยั้งความเสียหายของเซลล์ที่เกิดจากสารพิษจากเชื้อรา [23] ผลกระทบเหล่านี้เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับแอคทีโอไซด์ความสามารถในการลบ ROS และควบคุมการส่งสัญญาณด้วย MAPK โดยเฉพาะอย่างยิ่ง แนะนำให้ใช้ ROS กับช่องทางการส่งสัญญาณที่เหนี่ยวนำโดย RANKL และเหตุการณ์ของเซลล์ในเซลล์สร้างกระดูก การปรับสภาพด้วยสารต้านอนุมูลอิสระยับยั้งการกระตุ้น RANKL ของ NF-kB, ERK และ IkBa ซึ่งจะช่วยยับยั้งการสร้างกระดูก [24] การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นอย่างชัดเจนว่า นอกจากฤทธิ์ต้านการอักเสบแล้ว ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระยังมีความสำคัญต่อสารต้านการดูดกลืนอีกด้วย ดังนั้นแอคทีโอไซด์สามารถยับยั้งการสร้าง osteoclastogenesis ที่เกิดจาก RANKL ในการศึกษาปัจจุบัน เราได้สำรวจว่าแอคทีโอไซด์มีผลการรักษาการสูญเสียกระดูก เราตรวจสอบผลกระทบของแอคทีโอไซด์เกี่ยวกับการสร้างความแตกต่างของ osteoclast และการสลายของกระดูกและกลไกของเซลล์ที่เกี่ยวข้องโดยใช้ระบบการทดลองในหลอดทดลองและในร่างกาย
วัสดุและวิธีการ
คำชี้แจงจริยธรรม
แนวทางปฏิบัติในการดูแลและการใช้สัตว์ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมในการดูแลและการใช้สัตว์ทดลองของมหาวิทยาลัยแห่งชาติชลบุรี (ใบอนุญาตเลขที่ CBU 2010-0007) การทดลองทั้งหมดในการศึกษานี้ดำเนินการตามแนวทางของคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของมหาวิทยาลัย
หนู เคมีภัณฑ์ และเครื่องใช้ในห้องปฏิบัติการ
หนู ICR เพศเมียอายุ 4 สัปดาห์ซื้อจาก OrientBio Inc. (โซล ประเทศเกาหลี) และเลี้ยงที่อุณหภูมิ 2261uC และความชื้น 5565 เปอร์เซ็นต์ในรอบแสง/มืด 12 ชั่วโมงโดยสามารถเข้าถึงอาหารและน้ำได้ฟรี Acteoside (3,4-dihydroxy-b-phenethyl-Oa-rhamnopyranose syl-(1R3)-4-O-caffeoyl-bD-glucopyranoside; C29H36O15) (รูปที่ S1) ถูกแยกออกจากใบของ Rehmannia กลูติโนซ่า แอกทิโอไซด์ถูกละลายในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) ก่อนใช้ RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 และ M-CSF ถูกซื้อจากระบบ R & D (มินนิอาโปลิส มินนิโซตา สหรัฐอเมริกา) แอนติบอดีที่จำเพาะต่อ c-Fos,p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa และ b-actin ได้มาจากเทคโนโลยีชีวภาพของซานตาครูซ (Santa Cruz, CA, USA ). แอนติบอดีสำหรับ p-p38 และ p38 ถูกซื้อจาก Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) CalciumAssay และ Osteocalcin (OC) EIA Kits ถูกซื้อจาก BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) และ Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA) ตามลำดับ เพื่อกำหนดพารามิเตอร์ทางชีวเคมีในซีรัม ชุดทดสอบกรดฟอสฟาเตสที่ต้านทานทาร์เทรต (TRAP) ของเมาส์ (ระบบอิมมูโนไดอาโนสติค, สกอตส์เดล, แอริโซนา, สหรัฐอเมริกา) ยังใช้เพื่อวัดระดับ TRAP5b ในซีรัม เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น ได้รับสารเคมีเพิ่มเติมจาก Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) และเครื่องใช้ในห้องปฏิบัติการมาจาก SPL Life Sciences (Pochun, South Korea)
การเพาะเลี้ยงเซลล์
เซลล์ไขกระดูกได้มาจากกระดูกแข้งและกระดูกต้นขาของหนู ICR เพศเมียอายุ 6 สัปดาห์ตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [25] สารแขวนลอยของไขกระดูกถูกบ่มในจานเพาะเลี้ยง100-มม. ในการมีอยู่ของ M-CSF 50 นาโนกรัม/มิลลิลิตร หลังจาก 3 วัน เซลล์ยึดเกาะถูกใช้เป็นมาโครฟาจของไขกระดูก (BMM) เพื่อเหนี่ยวนำให้เกิดความแตกต่างของกระดูก เซลล์ไขกระดูกบางเซลล์ยังถูกบ่มเป็นเวลา 48 ชั่วโมงโดยไม่มี M-CSF และเซลล์ที่ยึดติดถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลางสร้างความแตกต่างของเซลล์สร้างกระดูกตามที่อธิบายไว้ในที่อื่น [25] เซลล์มาโครฟาจ RAW264.7 ถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลางของ Eagle (DMEM) ดัดแปลงของ Dulbecco ที่เสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (FBS) กลูตามีน 2 มิลลิโมลาร์ และยาปฏิชีวนะ เซลล์เหล่านี้ถูกใช้เป็นสายเซลล์คู่กันสำหรับ BMM เพื่อสำรวจผลของแอกทิโอไซด์ต่อการสร้างกระดูก
Osteoclastic Differentiation และการย้อมสี TRAP
BMM ถูกปรับสภาพก่อนด้วยความเข้มข้นต่างๆ (0–50 มิลลิโมลาร์)ของแอกทีโอไซด์เป็นเวลา 2 ชั่วโมงก่อนที่จะกระตุ้นด้วย 100 นาโนกรัม/มิลลิลิตร RANKL สื่อเพาะเลี้ยงถูกแทนที่ด้วยอาหารสดในวันที่ 2 และ 5 หลังจากฟักไข่ 7 วัน วัฒนธรรมได้รับการแก้ไขใน 4 เปอร์เซ็นต์ของ PBS-buffered paraformaldehyde และย้อมด้วย TRAP โดยใช้ชุด sigma Aldrich ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เซลล์ที่เป็นบวกของ TRAP ถูกนับโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง และเซลล์ที่มีนิวเคลียส 3 ตัวขึ้นไปถือเป็นเซลล์สร้างกระดูก นอกจากนี้ เซลล์ RAW 264.7 ยังสัมผัสกับ RANKL 100 ng/ml หลังจากปรับสภาพด้วยแอกทิโอไซด์เป็นเวลา 2 ชั่วโมง และหลังจาก 7 วันของการฟักตัว เซลล์ได้รับการประมวลผลสำหรับการย้อมสี TRAP
การวัดความมีชีวิตของเซลล์
ความมีชีวิตของเซลล์ถูกกำหนดหาโดยใช้เกลือเตตตราโซเลียมที่ละลายน้ำได้ (WST)-8 รีเอเจนต์ โดยสรุป BMM หรือเซลล์ RAW264.7 ที่เพาะเลี้ยงในตัวกลางสำหรับการเจริญเติบโตที่มี FBS 10 เปอร์เซ็นต์และยาปฏิชีวนะได้รับการรักษาด้วยแอกเตโอไซด์หรือสารประกอบฟีนอลิก 10 มิลลิโมลาร์ เช่น เควอซิทิน ลูโทลิน อะพิจีนิน หรืออีพิกัลโลคาเทชิน-3-แกลเลต(EGCG) WST-8 รีเอเจนต์ถูกเติมเข้าไปในวัฒนธรรมหลังจาก 48 ชั่วโมงของการฟักตัว หลังจากการฟักตัวเป็นเวลา 4 ชั่วโมงเพิ่มเติม WST-8-การดูดกลืนแสงจำเพาะถูกวัดที่ 450 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA)
การทดสอบการสลายกระดูก
BMM (16105 เซลล์/มล.) ถูกแขวนลอยใน a-MEM ที่มี 50 ng/ml M-CSF และ 100 ng/ml RANKL จากนั้นแบ่งผ่าน24-หลุมที่เคลือบด้วยแคลเซียมฟอสเฟตนาโนคริสตัล(OAAS{{6}) }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, South Korea) ที่ความหนาแน่น 26104 เซลล์/ซม2 โดยมีและไม่มีแอกทีโอไซด์ หลังจากการฟักไข่เป็นเวลา 7 วัน เซลล์ถูกกำจัดออกจากเพลตที่มีโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 5 เปอร์เซ็นต์ และสังเกตการก่อตัวของหลุมภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบนำแสง พื้นที่ดูดซับยังถูกวัดโดยเครื่องวิเคราะห์ภาพและแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของค่าควบคุม
การวิเคราะห์ Western Blot
โปรตีนไลเซตทั้งหมดถูกเตรียมในบัฟเฟอร์สลายตามที่อธิบายไว้ที่อื่น [26] โปรตีน Cytosolic และนิวเคลียสถูกเตรียมตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [25] ปริมาณโปรตีนที่สกัดเท่ากันถูกแยกโดย SDS-PAGE 12–15 เปอร์เซ็นต์ และซับลงบนเยื่อแผ่นโพลีไวนิลไดฟลูออไรด์ บล็อตถูกตรวจสอบด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิในชั่วข้ามคืนที่ 4uC ก่อนการบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิในบัฟเฟอร์การขัดขวางเป็นเวลา 1 ชั่วโมง รอยเปื้อนได้รับการพัฒนาด้วยเคมีเรืองแสงที่ได้รับการปรับปรุง (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) และสัมผัสกับฟิล์มเอ็กซ์เรย์ (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA)
การทดสอบกิจกรรม MAPK
เซลล์ถูกปรับสภาพด้วยแอกทีโอไซด์เป็นเวลา 2 ชั่วโมงและจากนั้นถูกกระตุ้นด้วย RANKL เป็นเวลาเพิ่มเติม-30 นาที กิจกรรม MAPK ถูกกำหนดโดยใช้ชุดทดสอบอิมมูโนเมตริก เช่น ชุดทดสอบ p-p38kinase (Assay Designs, Inc., MI, USA), ชุดทดสอบเอนไซม์ p-ERK (การออกแบบการทดสอบ) และชุดทดสอบ ELISA แบบแซนวิช p-SAPK/JNK ( Cell Signaling Technology, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา). ขั้นตอนทั้งหมดปฏิบัติตามคำแนะนำของผู้ผลิต และวัดค่าการดูดกลืนแสงโดยเครื่องอ่านไมโครเพลท
การทดสอบการเปลี่ยนแปลงการเคลื่อนที่ด้วยไฟฟ้า (EMSA)
ปฏิกิริยาการจับดีเอ็นเอ-โปรตีนถูกดำเนินการเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง โดยมีโปรตีน 10-15 มก. ในบัฟเฟอร์ 20 มล. ที่มี BSA 1 มก./มล. โพลี 0.5 มก./มล. (dI-dC) กลีเซอรอล 5 เปอร์เซ็นต์ ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 50 mm NaCl, 30,000 CPM ของ [a-32P] โอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่ติดฉลาก dCTP และชิ้นส่วน Klenow ของ DNA พอลิเมอเรส ตัวอย่างถูกแยกบนเจลโพลีอะคริลาไมด์ 6 เปอร์เซ็นต์ ซึ่งถูกทำให้แห้งและสัมผัสกับฟิล์มเอ็กซ์เรย์ (บริษัท Eastman Kodak) เป็นเวลา 12–24 ชั่วโมงที่ 270uC ลำดับไพรเมอร์โอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่จำเพาะสำหรับ NF คือ 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 และ 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.
NF-kB Luciferase Assay
มาโครฟาจ RAW264.7 ใน24-เพลตหลุมถูกทรานส์เฟกด้วย0.8 มก. kB-luciferase รีพอร์ตเตอร์เวคเตอร์โดยใช้ Lipofectamine2000 2 มล. (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ที่ 24 ชั่วโมงหลังการถ่าย เซลล์ถูกกระตุ้นด้วย RANKL เมื่อมีและไม่มีแอคทีโอไซด์เป็นเวลา 24 ชม. เซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์ lysis ของตัวรายงาน 100 มล. (Promega, Madison, WI, USA) ตัวอย่างโปรตีนในปริมาณที่เท่ากันถูกใส่ลงในไมโครเพลท 96-หลุมและผสมกับซับสเตรตลูซิเฟอเรส วัดการเรืองแสงโดยใช้ไมโครเพลทลูมิโนมิเตอร์ (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) ในการทดลองนี้ เปปไทด์ตัวยับยั้ง NF-B ที่ซึมผ่านได้ (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA) ถูกใช้เป็นตัวยับยั้ง kB เชิงบวก
การวัดไซโตไคน์
BMM หรือเซลล์ RAW264.7 ถูกกระตุ้นด้วย RANKL ต่อหน้าแอคทีโอไซด์ในเพลตเพาะเลี้ยง 24-หลุม หลังจากการบ่ม 48 ชั่วโมง สารเหนือตะกอนจากการเพาะเลี้ยงถูกรวบรวมและประเมินโดย ELISA โดยใช้ชุดเครื่องมือ OptEIATM จำเพาะของ TNF-a-, IL-1b- และ IL-6- ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสการถอดรหัสย้อนกลับแบบเรียลไทม์ (RT-PCR)
การแสดงออกของ mRNA ของมาร์คเกอร์เกี่ยวกับกระดูก เช่น c-Fos, NFATc1 และ TNF-a ถูกกำหนดหาโดย RT-PCR แบบเรียลไทม์ โดยสรุป RNA ทั้งหมดถูกสกัดจากมาโครฟาจด้วย Trizolreagent ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Invitrogen) cDNA ถูกสังเคราะห์ด้วย RNA ทั้งหมด 1 มก. โดยใช้ SuperScriptReverse Transcriptase II และไพรเมอร์ (Invitrogen) Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ถูกใช้เพื่อตรวจจับการสะสมของผลิตภัณฑ์ PCR ระหว่างการปั่นจักรยานด้วยระบบตรวจจับลำดับ ABI 7500 (ApplidBiosystems) หลังจากการเสียสภาพที่ 95uC เป็นเวลา 10 นาที PCR มีค่าเท่ากับ
การวัด ROS ภายในเซลล์
สารละลายสต็อกของ 29,79-dichlorodihydrofluorescein-diacetate(DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Germany) ถูกเตรียมใน DMSO และเก็บไว้ที่ 220uC ในที่มืด โดยสรุป BMM (106 เซลล์/มล. ในเพลต 6-หลุม) ถูกเพาะเลี้ยงด้วย 50 ng/MLM-CSF เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และจากนั้นบำบัดด้วยความเข้มข้นต่างๆ (0–10 มิลลิโมลาร์) ของแอคทีโอไซด์ 2 ชั่วโมงก่อนการกระตุ้นด้วย 100 ng/mlRANKL. หลังจากการบ่มร่วม 1 ชั่วโมง เซลล์เหล่านี้ถูกบ่มในเวลาต่อมาด้วย DCFH-DA 25 มิลลิโมลาร์ เป็นเวลา 30 นาที การเรืองแสงสีเขียวของ 29,79-dichlorofluorescein (DCF) ถูกบันทึกที่515 นาโนเมตร (FL 1) โดยใช้ระบบ FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) และ 10,000 เหตุการณ์ ถูกนับต่อตัวอย่าง
การชักนำให้เกิดโรคกระดูกพรุนที่เกิดจากการตัดรังไข่
หนู ICR เพศเมีย (อายุ 6 สัปดาห์) ถูกใช้สำหรับการศึกษานี้ หนูได้รับการผ่าตัดหลอก (Sham, n=10) หรือการผ่าตัดรังไข่ออก (OVX, n=20) ภายใต้การดมยาสลบ หนึ่งสัปดาห์หลังการผ่าตัด หนู OVX ถูกสุ่มแบ่งออกเป็น 2 กลุ่ม กลุ่มละ 10 หนู: OVX ทวิภาคีและ OVX ทวิภาคีเสริมด้วย PBS 200 มล. ที่มีแอคทีโอไซด์ 1 มิลลิโมลาร์โดยทางปาก (กลุ่ม AC) ออรัลแอคทีโอไซด์ได้รับการบริหารทุกๆ 3 วันเป็นเวลา 8 สัปดาห์หลังการผ่าตัด และให้ PBS ในปริมาณเท่ากันกับกลุ่ม Sham และ OVX หลังจาก 1 วันของการบริหารครั้งสุดท้าย หนูถูกสังเวย จากนั้นจึงวิเคราะห์พารามิเตอร์ทางชีวเคมีในซีรัมและ3-โครงสร้างกระดูกเชิงมิติ
การกำหนดพารามิเตอร์ทางชีวเคมีในซีรัม
เก็บตัวอย่างเลือดโดยการเจาะหัวใจและเก็บซีรัมโดยการหมุนเหวี่ยง ตัวอย่างซีรัมถูกเก็บไว้ที่280uC เพื่อวิเคราะห์พารามิเตอร์ทางชีวเคมี ระดับซีรัมของ IL-1b และ IL-6 ถูกประเมินโดยใช้ชุดเครื่องมือ ELISA ตามที่อธิบายข้างต้น ในขณะที่กิจกรรมของอัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (ALP) ถูกกำหนดโดยใช้การทดสอบสีทางชีวเคมีที่วัดปริมาณของ p -ไนโตรฟีนอลที่ผลิตจากสารตั้งต้น p-nitrophenol ฟอสเฟต ตามที่อธิบายไว้ในที่อื่น [27] ในการประมาณค่าไบโอมาร์คเกอร์ของการสร้างกระดูกและการสลายของกระดูก ระดับซีรั่ม OC แคลเซียม และ TRAP5b ก็ถูกกำหนดตามคำแนะนำของผู้ผลิตเช่นกัน
การวิเคราะห์โครงสร้างกระดูกและพารามิเตอร์ทางสัณฐานวิทยา
กระดูกต้นขาของหนู (กลุ่ม Sham, OVX และ AC) ถูกผ่าและเติมด้วยน้ำเกลือทางสรีรวิทยาสำหรับการทดสอบทางกล วัดความแข็งแรงทางกลของกระดูกโคนขาตามที่อธิบายไว้ที่อื่น [28] ภาระการแตกหักถูกบันทึกเป็นแรงสูงสุดในหน่วยนิวตัน ณ จุดที่แกนกลางของกระดูกโคนขาขวาหัก นอกจากนี้ กระดูกโคนขาแบบเบาของสัตว์แต่ละตัวยังได้รับการวิเคราะห์ทาง histomorphometrically โดยใช้ระบบไมโครคอมพิวเตอร์เอกซ์เรย์ (micro-CT) (ระบบเอ็กซ์เรย์ไมโครโฟกัส SkyScan 1076, Kontich ประเทศเบลเยียม) โดยสังเขป กระดูกในที่เก็บฟอร์มาลดีไฮด์ 4% ถูกทำให้แห้งอย่างผิวเผินบนกระดาษทิชชู่ก่อนที่จะห่อด้วยพลาสติก ''ฟิล์มติด'' หรือพาราฟิล์ม เพื่อป้องกันไม่ให้แห้งระหว่างการสแกน กระดูกที่ห่อด้วยพลาสติกแต่ละชิ้นถูกวางลงในหลอดพลาสติก/โพลีสไตรีนโฟมซึ่งติดตั้งในแนวตั้งในแนวนอนในห้องตัวอย่างเครื่องสแกน 1076 สำหรับการสร้างภาพ micro-CT การสแกนดำเนินการโดยใช้แรงดันแหล่งจ่าย 100 kV และกระแสไฟแหล่ง 140 mA ที่มีความละเอียด 35 มม. แบบจำลองสามมิติของกระดูก trabecular ของกระดูกโคนขาถูกสร้างขึ้นใหม่โดยใช้ SkyScan CT Analyzer เวอร์ชัน 1.11 พารามิเตอร์ทางโครงสร้าง เช่น ความหนาแน่นของมวลกระดูก trabecular (BMD, g/cm3), เปอร์เซ็นต์ปริมาตรของกระดูก (ปริมาตรกระดูก (BV)/ปริมาตรของเนื้อเยื่อ (TV), เปอร์เซ็นต์ ), ความหนา (Tb.Th, มม.), การแยกตัว (Tb.Sp , มม.)และจำนวน (Tb.N, 1/มม.) จากนั้นจึงวัด
การทดสอบความแตกต่างของ Osteogenic และการทำให้เป็นแร่
เซลล์ไขกระดูกที่เพาะเลี้ยงในจานเพาะเลี้ยง {{{{10}}}หลุม ถูกบำบัดด้วย DAG (10 นาโนโมลาร์ เดกซาเมทาโซน, กรดแอสคอร์บิก 50 มิลลิโมลาร์, และบี-กลีเซอโรฟอสเฟต 20 มิลลิโมลาร์) ในการมีอยู่ของแอกซีโอไซด์ 10 มิลลิโมลาร์ หลังจาก 2 สัปดาห์ของการแยกความแตกต่าง เซลล์ถูกตรึงด้วยน้ำแข็งเย็น 70 เปอร์เซ็นต์ (ปริมาตร/ปริมาตร) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงและย้อมด้วยน้ำกลั่น alizarin red Sin 0.2 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากที่เซลล์ถูกกำจัดและทำให้แห้งด้วยอากาศ แผ่นเพาะเลี้ยงเซลล์ได้รับการประเมินโดยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัว (Nikon TS100, Japan) ในการหาปริมาณของสีย้อมสีแดง คราบนั้นถูกชะด้วยแอซีทิล ไพริดิเนียม คลอไรด์ 10 เปอร์เซ็นต์โดยการเขย่าเป็นเวลา 20 นาที และวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 560 นาโนเมตร ปริมาณแคลเซียมที่สะสมในชั้นเซลล์ยังวัดโดยใช้ชุดแคลเซียม (Wako Chemical Inc. โอซาก้า ประเทศญี่ปุ่น) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต นอกจากนี้ การแสดงออกของเครื่องหมาย mRNA ที่จำเพาะต่อกระดูก เช่น ปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับ runt-2(Runx2), osterix, bone sialoprotein (BSP) และ OC ถูกกำหนดโดย RT-PCR แบบเรียลไทม์ ไพรเมอร์ Oligonucleotide ของเครื่องหมายเหล่านี้ได้รับการออกแบบด้วยขนาดผลิตภัณฑ์น้อยกว่า 200 bp โดยใช้ PrimerExpress Software 3.0 (Applied Biosystems) ตามที่อธิบายไว้ในที่อื่น[27]
การวิเคราะห์ทางสถิติ
เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น ข้อมูลทั้งหมดจะแสดงเป็นค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานเฉลี่ย (SD) เฉลี่ยของการทดลองอิสระ 3 รายการขึ้นไป ANOVA แบบทางเดียวใช้สำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการโดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS เวอร์ชัน 120 p-value ,0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ
ผลลัพธ์
Acteoside ยับยั้งการสร้าง Osteoclast โดย Macrophagesin ในลักษณะที่ขึ้นอยู่กับปริมาณ
เพื่อตรวจสอบผลของแอกทีโอไซด์ต่อความแตกต่างของ BMM ในเซลล์สร้างกระดูก เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงด้วยความเข้มข้นต่างๆ (0–20 mM) ของแอคทีโอไซด์เป็นเวลา 7 วันต่อหน้า 50 ng/ml M CSF และ 100 ng/ml RANKL . Acteoside ลดจำนวนเซลล์สร้างกระดูกในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา เมื่อเซลล์ถูกปรับสภาพด้วยแอกทีโอไซด์ 10 มิลลิโมลาร์เป็นเวลา 2 ชั่วโมง จำนวน osteoclast ลดลง 43 เปอร์เซ็นต์เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่เสริมด้วย M-CSFและ RANKL (รูปที่ 1A) รูปที่ 1B แสดงความแตกต่างของ osteoclast ที่อาศัย RANKL และการยับยั้งโดยการบำบัดร่วมกับแอกทิโอไซด์ สอดคล้องกับผลลัพธ์นี้ การปรับสภาพของแอกทิโอไซด์ลดความแตกต่างที่กระตุ้นด้วย RANKL ของ RAW264.7 เซลล์และการสร้างเซลล์สร้างกระดูก (รูปที่ 1C และ D) เมื่อเปรียบเทียบศักยภาพในการต้านการสลายกระดูกของแอกทิโอไซด์บน BMM กับศักยภาพในการต้านการเสื่อมของกระดูกของสารประกอบฟีนอลิกหลายชนิดที่ความเข้มข้นเท่ากัน (10 mM) ลูเทโอลินแสดงกิจกรรมสูงสุด (รูปที่ 2A) อย่างไรก็ตาม ลูเทโอลิน เควอซิทิน หรือเอพิจีนินเองทำให้ความมีชีวิตของเซลล์ลดลง (รูปที่ 2B) สารประกอบทั้งหมดยับยั้งการสร้างความแตกต่างของ osteoclastic โดยมาโครฟาจ RAW264.7 ด้วยกิจกรรมสัมพัทธ์ต่อไปนี้: luteolin เควอซิทิน=apigenin .EGCG=แอคทีโอไซด์ (รูปที่ 2C) Luteolin, quercetin หรือ apigenin เองก็แสดงให้เห็นถึงการมีชีวิตที่ลดลงของเซลล์ (รูปที่ 2D) ในทางตรงกันข้าม การบำบัดด้วยเควอซิทินทำให้เกิดการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ BMM และ RAW264.7 เมื่อเซลล์เหล่านี้สัมผัสกับ 10 มิลลิโมลาร์ของสารประกอบแต่ละชนิดเป็นเวลา 2 วันด้วย 50 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml RANKL, หรือทั้งสองอย่าง (ไม่แสดงข้อมูล) เมื่อความเข้มข้นของสารเหล่านี้จำเป็นต้องยับยั้ง 50 เปอร์เซ็นต์ของ
การก่อรูปเซลล์กระดูกใน BMM (IC50) คำนวณโดยใช้กราฟความเข้มข้น-แอคติวิตี, IC50 ของแอกทีโอไซด์, เควอซิทิน, ลูโอลิน, อะพิจีนิน และ EGCG คือ 5.1, 2.3, 2.6, 4.8 และ 6.6 มิลลิโมลาร์ ตามลำดับ (รูปที่ 2E) ผลลัพธ์นี้คล้ายกับกรณีที่ตรวจสอบมาโครฟาจ RAW264.7 ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า luteolin และ quercetin มีฤทธิ์ต้าน clastogenic สูงกว่า acteoside ในทางตรงกันข้าม เควอซิทินที่ IC50 ยังมีผลที่เป็นพิษเล็กน้อยต่อเซลล์ (ไม่แสดงข้อมูล)
แอคทีโอไซด์ยังยับยั้งการสลายของกระดูกโดย MacrophagesActeoside ยังป้องกันการสลายของกระดูกที่อาศัย RANKL ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา ตามที่วัดโดยระบบแบบจำลองในหลอดทดลอง (รูปที่ 3A) การสลายของกระดูกถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญเมื่อ BMM ถูกบ่มด้วยแอกทีโอไซด์ 1 มิลลิโมลาร์ (รูปที่ 3B) การบำบัดด้วยแอกทีโอไซด์ 10 มิลลิโมลาร์ทำให้การก่อตัวของหลุมที่เกิดจาก RANKL เกือบหมดฤทธิ์โดย BMM ในทำนองเดียวกัน แอกทิโอไซด์ลดการสลายของกระดูกในเซลล์ RAW264.7 ที่กระตุ้นด้วย RANKL (รูปที่ S2A และ B) ความสามารถของแอคทีโอไซด์เพื่อยับยั้งการสลายของกระดูกขึ้นอยู่กับระยะเวลาของการรักษาที่สัมพันธ์กับการกระตุ้น RANKL Acteoside(10 mM) เพิ่มขึ้น 4 วันหลังจากการกระตุ้น RANKL ไม่ได้ลดการก่อตัวของหลุมใน BMM ในขณะที่มันยับยั้งจำนวนของ osteoclasts ที่เกิดขึ้น (รูปที่ 3C) ผลลัพธ์ที่แตกต่างกันนี้เป็นส่วนหนึ่งเนื่องจากพื้นที่หลุมได้ก่อตัวขึ้นแล้วหลังจาก 4 วันของการสร้างการกระตุ้น RANKL (รูปที่ 3D)
แอคทีโอไซด์Down-Regulates Early RANKL SignalingPathways
RANKL กระตุ้นการเปิดใช้งาน MAPK และ NF-kB ที่รู้จักกันดี 3 รายการในสารตั้งต้นของ osteoclast และการเปิดใช้งานนี้จำเป็นสำหรับการสร้างความแตกต่างของ osteoclast ในระยะแรก เพื่อให้เข้าใจกลไกที่เป็นไปได้ที่แอกทีโอไซด์ยับยั้งการสร้างกระดูกพรุน เราจึงตรวจสอบผลของแอกทิโอไซด์ต่อ MAPK และการกระตุ้น NF-B ในมาโครฟาจ BMM และเซลล์ RAW264.7 ถูกปรับสภาพด้วยแอกทีโอไซด์ 10 มิลลิโมลาร์เป็นเวลา 2 ชั่วโมงและจากนั้นถูกกระตุ้นด้วย 100 นาโนกรัม/มิลลิลิตร RANKL เป็นเวลา 30 นาที ฟอสโฟรีเลชั่น MAPK ถูกตรวจสอบโดย Western blotting และการวิเคราะห์อิมมูโนเมตริก RANKL เหนี่ยวนำให้เกิดฟอสโฟรีเลชั่นของ p38, ERK และ JNK inBMMs (รูปที่ 4A) และเซลล์ RAW264.7 (รูปที่ 4B) Acteoside ป้องกันการเพิ่มขึ้นที่เกิดจาก RANKL ใน p-p38, p-ERK และ p-JNK ผลลัพธ์นี้ได้รับการสนับสนุนโดยการวิเคราะห์ทางอิมมูโนเมตริก ซึ่งการปรับสภาพด้วยแอคทีโอไซด์ 10 มิลลิโมลาร์นั้นยับยั้งระดับของ MAPK ที่มีฟอสโฟรีเลตอย่างมีนัยสำคัญในมาโครฟาจเหล่านี้ (รูปที่ 4C) การบำบัดด้วย RANKL เพิ่มการจับดีเอ็นเอของ NF-kB ในขณะที่แอกทิโอไซด์ยับยั้งการกระตุ้นที่เหนี่ยวนำโดย RANKL ของการจับ NF-kB-DNA (รูปที่ 5A) การยับยั้งนี้มีความโดดเด่นใน BMM มากกว่าในเซลล์ RAW264.7 นอกจากนี้ Acteoside ยังลด p65 และ IkBa phosphorylation ที่กระตุ้นด้วย RANKL ในเซลล์ BMM และ RAW264.7 (รูปที่ 5B และ C) การเพิ่ม 10 mMacteoside เกือบจะยับยั้งทั้งการเสื่อมสภาพและการกระตุ้น IkBa ใน BMM เกือบทั้งหมด (รูปที่ 5B) เพื่อยืนยันเพิ่มเติมว่าการเปิดใช้งาน NF kB เกี่ยวข้องกับการกระทำของแอคทีโอไซด์ โครงสร้างโปรโมเตอร์-ลูซิเฟอเรส kB ถูกทรานส์เฟกชั่วคราวไปเป็น RAW264.7 เซลล์ เซลล์ที่ถูกบ่มด้วย RANKL 100 ng/ml มีกิจกรรมโปรโมเตอร์ kB ที่สูงกว่า 3- เท่า ซึ่งถูกทำให้อ่อนฤทธิ์อย่างมีนัยสำคัญโดยแอคทีโอไซด์ 10 มิลลิโมลาร์ (รูปที่ 5D)
Acteoside ยับยั้งการผลิตไซโตไคน์ที่มีการอักเสบและการแสดงออกของ TNF-a, c-Fos และ NFATc1in RANKL-Stimulated Macrophages
TNF-a, IL-1b และ IL-6 มีความสำคัญในการก่อรูปและการทำงานของเซลล์สร้างกระดูก ซึ่งเป็นสื่อกลางโดยการส่งสัญญาณ NF-kB ในมาโครฟาจที่กระตุ้นด้วย RANKL RANKL กระตุ้นการผลิตไซโตไคน์เหล่านี้ และการผลิตนี้ลดลงอย่างเห็นได้ชัดโดยการปรับสภาพแอคทีโอไซด์ 10 มิลลิโมลาร์ใน BMM (รูปที่ 6A) ในทำนองเดียวกัน แอกทีโอไซด์ลดการผลิตไซโตไคน์ที่เหนี่ยวนำโดย RANKL ยกเว้น IL-6 ในมาโครฟาจ RAW264.7 (รูปที่ S3) เพื่อให้เข้าใจกลไกระดับโมเลกุลของการกระทำของแอกทิโอไซด์ใน osteoclastogenesis เราจึงตรวจสอบผลกระทบของแอกทีโอไซด์ต่อการแสดงออกของ TNF-a, c-Fos และ NFATc1 เพิ่มเติม RANKL ควบคุมการแสดงออกของ mRNA ของปัจจัยเหล่านี้ในเซลล์ BMM และ RAW264.7 (รูปที่ 6B และ C) การปรับสภาพด้วยแอกทีโอไซด์ 10 มิลลิโมลาร์ช่วยยับยั้งการแสดงออกของปัจจัยเหล่านี้ที่เกิดจาก RANKL อย่างมีนัยสำคัญในทั้งสอง
BMM และเซลล์ RAW264.7 การปรับสภาพด้วย Acteoside ยังลดระดับโปรตีนของ c-Fos และ NFATc1 ลงใน BMM ที่กระตุ้นด้วย RANKL ลงอย่างมาก (รูปที่ 6D) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าแอคทีโอไซด์ลง-ควบคุม RANKL ที่ชักนำผู้ไกล่เกลี่ยของการสร้าง osteoclast ที่ระดับยีนและโปรตีน
Acteoside ลดการสร้าง ROS ภายในเซลล์ใน BMM ในลักษณะที่ขึ้นอยู่กับปริมาณ
เนื่องจากเป็นที่ทราบกันดีว่าการผลิต ROS ภายในเซลล์มีความสัมพันธ์กับการสร้างกระดูกพรุนที่กระตุ้นด้วย RANKL เราจึงตรวจสอบว่าแอกเตโอไซด์ยับยั้งการผลิต ROS ในระหว่างการสร้างความแตกต่างของออสติโอคลาสต์ที่อาศัย RANKL โดยใช้สีย้อมที่ไวต่อการเกิดออกซิเดชันและซึมผ่านเซลล์ได้ DCFH-DA การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีแสดงให้เห็นว่าสัญญาณการเรืองแสงเฉลี่ยที่จำเพาะต่อ DCF ใน BMM เห็นได้ชัดว่ามีการเลื่อนไปทางขวาหลังจากการกระตุ้นด้วย RANKL เปรียบเทียบกับเซลล์ควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษา (รูปที่ 7A) การเปลี่ยนแปลงนี้คล้ายกับกรณีที่สังเกตมาโครฟาจ RAW264.7 หลังจากการกระตุ้น RANKL (ไม่แสดงข้อมูล) การบำบัด BMM ด้วยแอคทีโอไซด์ลดความเข้มของสัญญาณของ DCF ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา การปรับสภาพด้วยแอกทีโอไซด์ 10 มิลลิโมลาร์ เกือบจะลดระดับของ ROS ภายในเซลล์ที่ผลิตขึ้นในระหว่างการสร้างความแตกต่างของ osteoclast จนถึงระดับการควบคุมที่ไม่ผ่านการบำบัด (รูปที่ 7B)
การบริหารช่องปากด้วย Acteoside ยับยั้งการเปลี่ยนแปลงของตัวบ่งชี้ทางชีวเคมีเกี่ยวกับโรคกระดูกพรุนและการสูญเสียกระดูกในหนูที่ตัดรังไข่
เพื่อสำรวจผลของแอกทีโอไซด์ต่อการสูญเสียมวลกระดูก เราได้เตรียมแบบจำลองสัตว์ที่เป็นโรคกระดูกพรุนโดยการตัดรังไข่ ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในน้ำหนักตัวระหว่าง OVX และ Shammice ระหว่างช่วงทดลอง (ไม่แสดงข้อมูล) กลุ่มมีระดับ IL-1b และ IL-6 ในซีรัมสูงกว่ากลุ่ม Sham (รูปที่ 8) อย่างมีนัยสำคัญ การเพิ่มขึ้นของไซโตไคน์ที่เกิดจากการอักเสบที่เกิดจากรังไข่ถูกทำให้อ่อนฤทธิ์โดยการบริหารช่องปากทางปาก (กลุ่ม AC) ระดับซีรัมของตัวบ่งชี้การหมุนเวียนของกระดูก เช่น ALP, แคลเซียม, TRAP5b และ OC เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม OVX จากตัวบ่งชี้โรคกระดูกพรุนเหล่านี้ ระดับแคลเซียม, TRAP5b และ OC ที่เพิ่มขึ้นในหนู OVX ถูกยับยั้งอย่างเห็นได้ชัดโดยการรักษาด้วยแอกทีโอไซด์ ในขณะที่ระดับซีรั่มของ ALP ไม่ได้เปลี่ยนแปลงโดยการรักษา ภาระการแตกหักสูงสุดโดยเฉลี่ยจนถึงตรงกลางของกระดูกต้นขาด้านขวาในกลุ่ม OVX ต่ำกว่าในกลุ่ม Sham (รูปที่ 9A) อย่างมีนัยสำคัญ การรักษาด้วย Acteoside ช่วยเพิ่มการสำรองกระดูกหักสูงสุดในกลุ่ม Sham เมื่อกระดูกคอร์เทกซ์ของกระดูกโคนขาถูกผ่าและสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์แก้วนำแสง ลักษณะของโรคกระดูกพรุนที่แสดงในกลุ่ม OVX ได้หายไปเกือบหมดในหนู AC (รูปที่ 9B) เพื่อตรวจสอบผลของแอกทิโอไซด์ต่อแบบจำลองโรคกระดูกพรุนที่เกิดจาก OVX, BMD และพารามิเตอร์ทางสัณฐานวิทยาของกระดูกใน trabecular ของกระดูกโคนขาอ่อนถูกวิเคราะห์โดย micro-CT ดังแสดงในรูปที่ 9C พบการเปลี่ยนแปลงของโครงสร้างกระดูกต้นขาในหนู OVX ในขณะที่การเปลี่ยนแปลงนี้ลดลงโดยการรักษาด้วยแอกทิโอไซด์ ผลจากการวิเคราะห์ micro-CT เปิดเผยว่า BMD ซึ่งเป็นตัววัดความแข็งแรงของกระดูกลดลงอย่างมากใน OVXmice (รูปที่ 9D) เมื่อเทียบกับกลุ่ม Sham หนู OVX ยังแสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญใน BV/TV, Tb Sp และ Tb. N แต่ไม่ใช่ Tb.Th การรักษาด้วยแอคทีโอไซด์ในช่องปากของหนูเมาส์ OVX ช่วยป้องกันการเปลี่ยนแปลงใน BMD รวมทั้ง BV/TV และ Tb.N.
