โอลิโกแซ็กคาไรด์ช่วยบรรเทาอาการบาดเจ็บเฉียบพลันของไตโดยการบรรเทากลุ่มของความแตกต่าง 44-การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่เป็นสื่อกลางในเซลล์ท่อไต

เชิงนามธรรม:อาการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลัน (AKI)เป็นตอนที่กะทันหันของความเสียหายของไตที่มักเกิดขึ้นในผู้ป่วยที่เข้ารับการรักษาในโรงพยาบาล จนถึงปัจจุบันยังไม่มีการพัฒนาวิธีการรักษาที่เหมาะสมเพื่อลดความรุนแรงของอากิ. โอลิโก-ฟูคอยแดน(FC) รบกวนกลุ่มโปรตีนบนพื้นผิวเซลล์ท่อไตของดิฟเฟอเรนทิเอชั่น 44 (CD44) เพื่อป้องกันการเกิดพังผืดในไต; อย่างไรก็ตามอิทธิพลของโอลิโกแซ็กคาไรด์ต่อ AKI ยังไม่ทราบแน่ชัด ในการศึกษานี้ เลือก FC, กาแลคโต-โอลิโกแซ็กคาไรด์ (GOS) และฟรุกโต-โอลิโกแซ็กคาไรด์ (FOS) เพื่อตรวจสอบอิทธิพลของโอลิโกแซ็กคาไรด์ต่อ AKI โอลิโกแซ็กคาไรด์ทั้งสามชนิดได้รับการพิสูจน์แล้วว่าถูกลำไส้ดูดซึมได้บางส่วน เราพบว่าโอลิโกแซ็กคาไรด์ลดแอนติเจนของ CD44 โดยขึ้นกับขนาดยา และยับยั้งการแสดงออกที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนของ CD44, ฟอสโฟ-JNK, MCP-1, IL-1 และ TNF- ใน NRK-52E เซลล์ท่อไต ในขณะเดียวกันการถ่าย CD44 siRNA และตัวยับยั้ง JNK SP600125 ช่วยลดการแสดงออกของฟอสโฟ-JNK และไซโตไคน์ที่เกิดจากการขาดออกซิเจน ลิแกนด์ของ CD44 หรือไฮยาลูโรแนน ต่อต้านอิทธิพลของโอลิโกแซ็กคาไรด์ต่อ CD44 และฟอสโฟ-JNK ที่ 2 วันหลังการผ่าตัดสำหรับอาการบาดเจ็บที่ขาดเลือดและกลับเป็นเลือดกลับคืน โอลิโกแซ็กคาไรด์ลดการอักเสบของไต, ครีเอทีนในซีรั่ม, MCP-1, IL-1 และ TNF- ในหนู AKI หลังการผ่าตัด 7 วัน ไตได้รับการส่งเสริม ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า FC, GOS และ FOS ยับยั้งน้ำตก CD44/JNK และไซโตไคน์ที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนในเซลล์ท่อไต ซึ่งจะช่วยแก้ไข AKI และการอักเสบของไตในหนู AKI ดังนั้น,การเสริมโอลิโกแซ็กคาไรด์เป็นกลยุทธ์การดูแลสุขภาพที่เป็นไปได้สำหรับผู้ป่วย AKI

คำหลัก: อาการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลัน- กลุ่มของความแตกต่าง 44; ฟรุกโต-โอลิโกแซ็กคาไรด์; กาแลคโตโอลิโกแซ็กคาไรด์; โอลิโก-ฟูคอยแดน; การอักเสบ

1. บทนำ

อาการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลัน(AKI) มีลักษณะพิเศษคืออัตราการกรองของไตลดลงอย่างกะทันหัน และส่งผลให้ครีเอตินีนในเลือดเพิ่มขึ้นตามมา ความเสียหายนี้พบได้บ่อยในผู้ป่วยที่เข้ารับการรักษาในโรงพยาบาลและห้องผู้ป่วยหนัก โดยเฉพาะผู้สูงอายุ ภาวะขาดเลือด ภาวะติดเชื้อ และพิษต่อไตเป็นสาเหตุหลักของ AKI ที่มักเกิดขึ้นร่วมกัน ส่งผลให้การวินิจฉัยและการรักษามีความซับซ้อน [1] AKI ระดับรุนแรงทำให้ผู้ป่วยที่ออกจากโรงพยาบาลมีความเสี่ยงต่อเหตุการณ์ไม่พึงประสงค์ เช่น โรคไตเรื้อรัง โรคหัวใจและหลอดเลือด มะเร็ง และการติดเชื้อ [2] AKI มีการพัฒนาอย่างรวดเร็ว และไม่มีการรักษาที่มีประสิทธิภาพเพื่อหลีกเลี่ยงหรือลดความรุนแรงได้ การบริโภคสารอาหารจำเพาะสามารถลดการบาดเจ็บของท่อไตใน AKI ได้ [3] ดังนั้น การศึกษาอิทธิพลของโภชนาการเฉพาะต่อ AKI จะช่วยในการปรับปรุง AKI และความเสี่ยงที่มาพร้อมกับผู้ป่วยที่ออกจากโรงพยาบาลแล้ว

การอักเสบและการสรรหาเม็ดเลือดขาวเป็นผู้ไกล่เกลี่ยที่สำคัญของ AKI ไต โดยเฉพาะเซลล์ท่อไตจะถูกสร้างขึ้นไซโตไคน์อักเสบในช่วง AKI เช่น IL-1, IL-6, โปรตีนดึงดูดเคมีมอนอไซต์-1 (MCP-1) และปัจจัยเนื้อร้ายของเนื้องอก- (TNF- ) [4,5] . ไซโตไคน์เหล่านี้ยังกระตุ้นให้เกิดการอักเสบอย่างเป็นระบบและการสรรหาเม็ดเลือดขาวอีกด้วย แม้ว่าเซลล์ย่อยของเม็ดเลือดขาวหลายเซลล์จะมีผลในการป้องกัน AKI (เช่น เซลล์ควบคุม T) แต่นิวโทรฟิล โมโนไซต์ และเซลล์เดนไดรต์ส่วนใหญ่เป็นอันตรายต่อการฟื้นฟู AKI [6] การอักเสบทั่วร่างกายยังเป็นอันตรายต่อการฟื้นตัวจาก AKI เนื่องจากมีระดับไซโตไคน์สูง [7] ในบรรดาไซโตไคน์ที่ถูกหลั่งออกมาจากไต MCP-1 มีหน้าที่หลักในการจัดหาเม็ดเลือดขาว ตอบสนองต่อไซโตไคน์ต่างๆ รวมถึง IL-1 และ TNF- [8,9] และมีบทบาทสำคัญในการเกิดโรค การบาดเจ็บของไตต่างๆ [10] ในเซลล์ tubular ใกล้เคียงของมนุษย์ HK-2 การแสดงออกของ MCP ที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจน-1 จะถูกสื่อกลางโดยวิถีทางเทอร์มินัลไคเนส (JNK) ของ c-Jun NH2- วิถีทาง p38 ยังเกี่ยวข้องกับการแสดงออกของ MCP-1 ที่เกิดจากอัลบูมินในเซลล์เยื่อบุผิวท่อไต [12] ดังนั้นกฎระเบียบของเส้นทาง JNK และ p38 อาจส่งผลต่อการอักเสบและการรับสมัครเม็ดเลือดขาวใน AKI

โอลิโกแซ็กคาไรด์เป็นโพลีเมอร์แซ็กคาไรด์ที่มีโมโนแซ็กคาไรด์ 3-10 ชนิดซึ่งย่อยไม่ได้และเป็นส่วนประกอบหลักของพรีไบโอติกที่มีอยู่ทั้งหมดเป็นอาหารเสริม [13] ฟรุกโต-โอลิโกแซ็กคาไรด์ (FOS) ส่วนใหญ่ที่กินเข้าไปในร่างกายมนุษย์จะถูกหมักอย่างสมบูรณ์โดยพืชในลำไส้ และส่วนเล็กๆ จะถูกกู้คืนในปัสสาวะ [14] กาแลกโต-โอลิโกแซ็กคาไรด์ (GOS) สามารถดูดซึมในเลือดและขับออกทางปัสสาวะในภายหลังได้ [15] สถานการณ์เดียวกันนี้ใช้กับฟูคอยแดนในสาหร่ายทะเลสีน้ำตาล [16] โอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ถูกดูดซึมสามารถส่งผลต่อปฏิกิริยาทางชีวเคมีและการจดจำเซลล์ได้ [17] การศึกษาก่อนหน้านี้ของเราเผยให้เห็นว่าโอลิโก-ฟูคอยแดน (FC) รบกวนการทำงานร่วมกันระหว่างโปรตีนที่ผิวเซลล์ท่อไต CD44 และลิแกนด์ที่อยู่นอกเซลล์ ซึ่งจะช่วยป้องกันการเกิดพังผืดในไต [18] ปฏิสัมพันธ์ระหว่าง CD44 และลิแกนด์นอกเซลล์ช่วยส่งเสริมเส้นทางการส่งสัญญาณ JNK [19] ดังนั้นการบริโภคโอลิโกแซ็กคาไรด์ในแต่ละวันอาจช่วยลดการอักเสบของไตในผู้ป่วย AKI ได้ อย่างไรก็ตาม อิทธิพลของโพลีเมอร์เหล่านี้ที่มีต่อ AKI ยังไม่ทราบแน่ชัด การศึกษานี้ตรวจสอบผลของ FC, FOS และ GOS ต่อเซลล์ท่อไตที่ได้รับภาวะขาดออกซิเจนและหนู AKI ที่มีอาการบาดเจ็บขาดเลือดกลับคืนมา (IRI) ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าโอลิโกแซ็กคาไรด์ทั้งสามชนิดยับยั้ง44-ซีดีซึ่งเป็นสื่อกลางการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของไต และลดความรุนแรงหลัง AKI ดังนั้น การใช้โพลีเมอร์เหล่านี้เป็นอาหารเสริมจึงถือเป็นกลยุทธ์การรักษา AKI ใหม่

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. วัสดุ

FOS (ระดับเฉลี่ยของการเกิดพอลิเมอไรเซชัน < 10), GOS (ระดับเฉลี่ยของการเกิดพอลิเมอไรเซชัน < 8) และ FC (ระดับเฉลี่ยของการเกิดพอลิเมอไรเซชัน < 5) ได้มาจาก Sigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์, มิสซูรี, สหรัฐอเมริกา, Cat. No. F8052), Carbosynth (Berkshire, UK, Cat. No. OG32134) และ Hi-Q Marine Biotech International (ไทเป ไต้หวัน) ตามลำดับ โอลิโกแซ็กคาไรด์ถูกละลายใน H2O กลั่นสองครั้งและกรองโดยใช้ตัวกรองปลอดเชื้อ 0.22 ไมโครเมตร (เมอร์ค มิลลิพอร์, ดาร์มสตัดท์, เยอรมนี) Hyaluronan (HA) และสารเคมีอื่นๆ ทั้งหมดของเกรดรีเอเจนต์ได้มาจาก Sigma แอนติบอดีต่อ JNK (sc-7345), ฟอสโฟ-JNK (sc-6254), MCP-1 (sc-52701), IL-1 (sc{{17 }}) และ TNF- (sc-52746) ถูกซื้อจากเทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ (ดัลลัส เท็กซัส สหรัฐอเมริกา) แอนติบอดีต่อ p38 (9212) และ phospho-p38 (9211) ได้มาจากเทคโนโลยีการส่งสัญญาณเซลล์ (Danvers, MA, USA) ซื้อแอนติบอดีต่อ Ly6G (ab25377) และ F4/80 (ab100790) จาก Abcam (Cambridge, UK) แอนติบอดีต่อ HIF-1 (NB100-105) ซื้อจาก Novus Biologicals (Centennial, CO, USA)

2.2. การเพาะเลี้ยงเซลล์

เซลล์ท่อไตใกล้เคียงของหนู (NRK -52 E) และสายมาโครฟาจของหนู RAW264.7 ถูกซื้อจากสถาบันวิจัยและพัฒนาอุตสาหกรรมอาหาร (ซินจู๋ ไต้หวัน); เพาะเลี้ยงใน DMEM ที่เสริมด้วยสารละลายยาปฏิชีวนะ/เชื้อราและซีรั่มน่องของทารกในครรภ์ 10% และเก็บที่อุณหภูมิ 37 ◦C และความชื้น 95% ในตู้อบ CO2 หลังจากการบรรจบกันถึง 70% เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลางที่ปราศจากซีรั่มและฟักตัวข้ามคืนก่อนการทดลอง สำหรับการทดลองภาวะขาดออกซิเจน เซลล์ NRK-52E และ Anaero Pack (Mitsubishi Gas Chemical America, New York, NY, USA) ถูกฝากไว้ในขวดทรงสี่เหลี่ยม (Mitsubishi Gas Chemical America) และการตั้งค่าทั้งหมดถูกวางไว้ใน 37 ◦C ตู้ฟัก 4 ชม. จากนั้นเพาะเลี้ยงเซลล์ข้ามคืนภายใต้สภาวะปกติ

2.3. การวิเคราะห์แบบ Western Blot

โดยสรุป มีการใช้โปรตีนไลเซต NRK-52E 15 ไมโครกรัมกับแต่ละเลน และผลลัพธ์ถูกวิเคราะห์โดยเวสเทิร์นบล็อต ระดับแถบโปรตีนสัมพัทธ์ถูกหาปริมาณจากการทดลองอิสระห้าครั้งโดยซอฟต์แวร์ Quantiscan จาก Biosoft (Cambridge, UK)

2.4. การรบกวนสั้น (si) การเปลี่ยน RNA ของ CD44

ซื้อ Rat CD44 siRNA (4390771) จาก Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) หลังจากที่การบรรจบกันเพิ่มขึ้นถึง 70% เซลล์จะถูกทรานส์เฟกด้วย siRNA โดยใช้ไลโปเฟกตามีน 2000 ทรานส์เฟกชัน รีเอเจนต์ (Thermo Scientific) ตามคำแนะนำของมานูแฟคเทอร์เรอร์

2.5. การทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์

หลังจากการเพาะเลี้ยงเซลล์ NRK{0}}E ที่ไม่เป็นพิษเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ตัวกลางเดียวกันถูกใช้เพื่อเพาะเลี้ยงเซลล์ RAW264.7 ใน 96-เพลตหลุม (2000 เซลล์/หลุม) หลังจากการฟักตัวเป็นเวลา 24 ชั่วโมง การแพร่กระจายของเซลล์ RAW264.7 ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ SRB Assay Kit (Abcam, Cat. No. ab235935) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต

2.6. การทดสอบแอนติเจนของ CD44

CD44 ของหนูชนิดรีคอมบิแนนท์ได้มาจากระบบ R&D (มินนิอาโปลิส, มินนิโซตา, สหรัฐอเมริกา, ประเภทแมว หมายเลข 6577-CD) และใช้เพื่อสร้างปฏิกิริยาการจับกับ HA ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยสรุป CD44 ของหนูชนิดรีคอมบิแนนท์ 20 ng/mL ถูกผสมกับความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ FC, FOS หรือ GOS เป็นเวลา 10 นาทีเพื่อตรวจสอบอิทธิพลของโอลิโกแซ็กคาไรด์ต่อแอนติเจนของ CD44 วิเคราะห์ของผสมโดยใช้ชุด CD44 ELISA (Abcam, Cat. No. ab213928) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต

2.7. สัตว์ทดลองและ IRI ของไต

หนู 129S1/SvImJ ตัวผู้อายุแปดสัปดาห์ถูกซื้อจาก Lasco Technology (ไทเป, ไต้หวัน) การทดลองกับสัตว์ทั้งหมดได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ทดลองของมหาวิทยาลัยการแพทย์ไทเป (หมายเลขการอนุมัติ LAC-2019-0511) และจัดทำโดยแนวทาง NIH สำหรับการดูแลและการใช้สัตว์ทดลอง สำหรับการเหนี่ยวนำด้วย IRI หนู (น้ำหนัก 21–23 กรัม) จะถูกจับที่หัวขั้วไตทวิภาคีเป็นเวลา 30 นาทีโดยการกรีดด้านข้าง [20] หนูถูกดมยาสลบโดยการดมยาสลบด้วยไอโซฟลูเรนก่อนการผ่าตัด หนูที่ได้รับการผ่าตัดเสแสร้งได้รับการผ่าตัดที่คล้ายกัน ยกเว้นการหนีบหัวขั้วไต หนูทุกตัวได้รับอาหารด้วยโอลิโกแซ็กคาไรด์ผ่านทางปากตั้งแต่ 1 วันก่อนถึง 2 วันหลังการผ่าตัด IRI หนูทดลองถูกแบ่งออกเป็นห้ากลุ่มต่อไปนี้โดยมี n=8 สำหรับผลลัพธ์ในวันที่ 3 และวันที่ 7: (1) กลุ่มเสแสร้ง; (2) กลุ่มอากิ (3) กลุ่ม AKI ที่ได้รับ FC (10 มก./กก./วัน); (4) กลุ่ม AKI ที่ถูกเลี้ยงด้วย FOS (10 มก./กก./วัน); และ (5) กลุ่ม AKI ที่ได้รับ GOS (10 มก./กก./วัน) หนูถูกสังเวย 3 หรือ 7 วันหลังการผ่าตัด และเก็บเลือดและวิเคราะห์โดยใช้เครื่องวิเคราะห์ทางชีวเคมีและชุด ELISA วิเคราะห์ระดับครีเอตินีนในซีรั่มของหนูแต่ละตัวเพื่อประเมินการพัฒนาของ AKI ตรวจสอบสัณฐานวิทยาของไตโดยการย้อมด้วยกรดเป็นระยะ – ชิฟฟ์ (PAS) และการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมี (IHC) ในส่วนพาราฟิน 2 µm ที่ตรึงฟอร์มาลิน

2.8. การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมี

เนื้อเยื่อไตได้รับการแก้ไขด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์บัฟเฟอร์ 4% ฝังในพาราฟินและตัดเป็นส่วน 2 µm สำหรับการย้อมด้วยชุด UltraVision Quanto Detection System HRP DAB (Thermo Scientific, Fremont, CA, USA) และผสมกับไพรม์แอนติบอดีตามคำแนะนำของผู้ผลิต .

2.9. การย้อมสี PAS

ส่วนไตถูกย้อมด้วย PAS Stain Kit (Abcam, Cat. No. ab150680) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต

2.10. การทดสอบเอลิซา

อาหารเลี้ยงเชื้อของเซลล์ NRK-52E และตัวอย่างซีรัมของหนูทดลองถูกรวบรวมและวิเคราะห์โดยใช้ชุด MCP-1 ELISA (Abcam, Cat. No. ab208979) และ IL-1 ชุดอุปกรณ์ ELISA (Abcam, Cat. No. ab197742) ตัวอย่างซีรั่มยังถูกวิเคราะห์โดยใช้ชุด TNF- ELISA (R&D Systems, Cat. No. MTA00B) และ lipocalin ที่เกี่ยวข้องกับนิวโทรฟิลเจลาติเนส (NGAL) ELISA kit (R&D Systems, Cat. No. MLCN20) โดย คำแนะนำของผู้ผลิต

2.11. การทดสอบทางสถิติ

ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่างทั้งสองกลุ่มถูกกำหนดโดยใช้การทดสอบของนักเรียน ถือว่าความแตกต่างมีนัยสำคัญสำหรับค่า p<0.05

3. ผลลัพธ์

3.1. โอลิโกแซ็กคาไรด์ยับยั้งการเพิ่มขึ้นของ CD44 และไซโตไคน์ในเซลล์ Hypoxic NRK-52

การแสดงออกของ CD44 ในเซลล์ NRK-52 E ที่บำบัดด้วย FC, FOS และ GOS ได้รับการตรวจติดตามเป็นครั้งแรกเพื่อประเมินอิทธิพลของโอลิโกแซ็กคาไรด์ต่อเซลล์ท่อไต การแสดงออกของ CD44 ที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนถูกยับยั้งโดยโอลิโกแซ็กคาไรด์ทั้งสามชนิดในช่วง 0.05–0.5 มก./มล. (รูปที่ 1A) ดังนั้น จึงใช้ขนาดยาโอลิโกแซ็กคาไรด์ 0.1 มก./มล. ในการทดลองเซลล์ต่อไปนี้ ในระบบที่เตรียมไว้ การรักษาภาวะขาดออกซิเจนได้กระตุ้นการแสดงออกของภาวะขาดออกซิเจนมาร์กเกอร์ HIF-1 ในเซลล์ NRK-52E อย่างน่าทึ่ง ซึ่งบ่งชี้ว่าเซลล์เหล่านั้นอยู่ในสถานะภาวะขาดออกซิเจน (รูปที่ 1B) ภาวะขาดออกซิเจนทำให้ระดับของ phosphorylated JNK, MCP -1, IL -1 และ TNF- เพิ่มขึ้น แต่ไม่ได้อยู่ในเซลล์ที่ได้รับโอลิโกแซ็กคาไรด์ (รูปที่ 1B, C) การแสดงออกของ JNK เพิ่มขึ้นในเซลล์ที่ขาดออกซิเจน แต่ไม่ได้อยู่ในเซลล์ที่ได้รับ FC หรือ FOS GOS ไม่ส่งผลกระทบต่อการแสดงออกของ JNK ในเซลล์ที่เป็นพิษ แต่ยับยั้งการควบคุมของ phosphorylated JNK ดังนั้นโอลิโกแซ็กคาไรด์สามารถยับยั้งการส่งสัญญาณ JNK ที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนและการแสดงออกของไซโตไคน์ในเซลล์ท่อไต แม้ว่า FC และ GOS จะควบคุม phos phorylated p38 ในเซลล์ที่เป็นพิษ แต่การแสดงออกของโปรตีนนี้ไม่เพิ่มขึ้นในเซลล์ที่เป็นพิษ การค้นพบนี้บ่งชี้ว่า p38 ไม่ได้มีบทบาทสำคัญในการตอบสนองที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนในเซลล์ NRK-52E

3.2. CD44 และ JNK มีบทบาทสำคัญในการเพิ่มขึ้นของไซโตไคน์ในเซลล์ E Hypoxic NRK-52

การแสดงออกของ CD44, phosphorylated JNK และไซโตไคน์ในเซลล์ท่อไตล้วนได้รับผลกระทบจากโอลิโกแซ็กคาไรด์ แต่ความสัมพันธ์ของพวกมันยังคงต้องมีการชี้แจง เพื่อตรวจสอบบทบาทของ CD44 ในการถ่ายทอดสัญญาณ JNK และการแสดงออกของไซโตไคน์ในเซลล์ที่ขาดออกซิเจน เซลล์ NRK-52E ได้รับการแปลงสภาพด้วย CD44 siRNA ในขนาดที่ต่างกัน CD44 siRNA ที่ 50 และ 100 PM ปิดกั้นการแสดงออกของ CD44 ที่เพิ่มขึ้นจากภาวะขาดออกซิเจนได้อย่างมีประสิทธิภาพ และยับยั้งการเพิ่มขึ้นของระดับของ phosphorylated JNK, MCP - 1, IL -1 และ TNF- ที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 2A) อิทธิพลของการปิดกั้น CD44 ต่อการแสดงออกของ JNK มีความสัมพันธ์กับปริมาณ siRNA การแสดงออกของ JNK ในเซลล์ที่ขาดออกซิเจนถูกกระตุ้นโดย CD44 siRNA ที่ 50 พิโคโมลาร์ แต่ถูกยับยั้งที่ 100 พิโคโมลาร์ ปริมาณทั้งสองยับยั้งการควบคุมของ phosphorylated JNK สารยับยั้งแบบเลือกสรรสำหรับ JNK, SP600125 ลดการแสดงออกของ MCP-1, IL-1 และ TNF- ในเซลล์ NRK-52 E ที่ไม่เป็นพิษอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 2B) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าผลการยับยั้งของการถ่าย CD44 siRNA ต่อไซโตไคน์ที่เกิดจากการขาดออกซิเจนนั้นมีสาเหตุมาจากการลดลงของ JNK ฟอสโฟรีเลชั่น

รูปที่ 1 ผลการยับยั้งของโอลิโกแซ็กคาไรด์ต่อการถ่ายโอนสัญญาณ CD44 ในเซลล์ E ที่ขาดออกซิเจน NRK-52 เซลล์ถูกเตรียมล่วงหน้าด้วย FC, FOS หรือ GOS เป็นเวลา 30 นาที และจากนั้นนำไปเพาะเลี้ยงภาวะขาดออกซิเจน วิเคราะห์การแสดงออกของโปรตีนโดย Western blotting (A) ผลที่ขึ้นกับปริมาณของโอลิโกแซ็กคาไรด์ต่อการแสดงออกของ CD44 (B) ผลของโอลิโกแซ็กคาไรด์ต่อสัญญาณที่เกี่ยวข้องกับซีดี44- ความเข้มข้นของโอลิโกแซ็กคาไรด์ตั้งไว้ที่ 0.1 มก./มล. การเพิ่มขึ้นสัมพัทธ์ของแถบโปรตีนยังแสดงในรูปแบบแผนภูมิแท่ง (C) อีกด้วย ผลลัพธ์แสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD (n=4)

รูปที่ 2 บทบาทของ CD44 และ JNK ต่อการตอบสนองการอักเสบที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนในเซลล์ NRK-52E วิเคราะห์การแสดงออกของโปรตีนโดย Western blot ( A ) ผลการยับยั้งของการถ่าย CD44 siRNA ต่อ phosphorylated JNK และไซโตไคน์ (B) ผลการยับยั้งของ SP600125 ต่อไซโตไคน์ เซลล์ถูกบำบัดล่วงหน้าด้วย 20 ไมโครโมลาร์ SP600125 เป็นเวลา 30 นาทีก่อนการบำบัดภาวะขาดออกซิเจน การเพิ่มขึ้นสัมพัทธ์ของแถบโปรตีนจะแสดงในรูปแบบแผนภูมิแท่งด้วย ผลลัพธ์แสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD (n=4)

3.3. การหลั่งไซโตไคน์ที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนในเซลล์ท่อไตส่งเสริมการแพร่กระจายของแมคโครฟาจ

การอักเสบเป็นตัวกลางของการบาดเจ็บของไตใน AKI ดังนั้นจึงมีการตรวจสอบอิทธิพลของการขี่โอลิโกแซคชาต่อเม็ดเลือดขาว รูปที่ 3A แสดงให้เห็นว่า FC, FOS และ GOS ไม่มีอิทธิพลต่อการแพร่กระจายของเซลล์ RAW264.7 มาโครฟาจ การแพร่กระจายของเซลล์ RAW264.7 ได้รับการส่งเสริมโดยอาหารเลี้ยงเชื้อ 24- ชั่วโมงสำหรับเซลล์ NRK ที่ขาดออกซิเจน-52 (รูปที่ 3B) แต่ไม่ใช่โดยอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับเซลล์ E ที่ขาดออกซิเจน NRK-52 ที่บำบัดด้วย โอลิโกแซ็กคาไรด์ แบบแรกมีระดับ MCP-1 และ IL-1 ที่สูงกว่าแบบหลัง (รูปที่ 3C, D) โอลิโกแซ็กคาไรด์ทั้งสามลด MCP-1 และ IL-1 ลงอย่างมีนัยสำคัญในอาหารเลี้ยงเชื้อของเซลล์ NRK-52E ที่ขาดออกซิเจน ดังนั้น FC, FOS และ GOS จึงสามารถลดการแสดงออกและการหลั่งของไซโตไคน์ในเซลล์ท่อไตที่ขาดออกซิเจน และผลที่ตามมาคือลดการอักเสบที่เกิดจากเซลล์ท่อไตที่ได้รับบาดเจ็บ