การวิเคราะห์เมแทบอโลมิกตาม NMR สำหรับผลของการเสริม -Ketoglutarate ต่อ C2C12 Myoblasts ในสถานะพลังงานที่แตกต่างกัน

คลิกที่นี่เพื่อรับผลิตภัณฑ์เสริมอาหารต่อต้านวัยและบรรเทาความเมื่อยล้าของ Cistanche

1. บทนำ

กล้ามเนื้อโครงร่างเป็นอวัยวะที่ใหญ่ที่สุดในร่างกายมนุษย์และดำรงชีวิตตามปกติการฝึกออกกำลังกายเป็นเวลานานหรือพยาธิวิทยาล. กระบวนการของโรคทำให้กล้ามเนื้อเสียหายหรือการจัดหาพลังงานของกล้ามเนื้อไม่เพียงพอในเวลานี้การฟื้นฟูความแข็งแรงและการทำงานของกล้ามเนื้อมีความสำคัญอย่างยิ่ง มีการใช้อาหารเสริมหลายชนิดเพื่อส่งเสริมการเจริญเติบโตมากเกินไปของกล้ามเนื้อโครงร่างและเพิ่มประสิทธิภาพการเล่นกีฬา [1] ในฐานะที่เป็นจุดตัดของเมแทบอลิซึมของคาร์บอนอินทรีย์และไนโตรเจน และในขณะเดียวกันก็เป็นตัวกลางที่สำคัญในวงจร TCA -Ketoglutarate (AKG) ได้แสดงผลแบบ pleiotropic สำหรับการปรับปรุงประสิทธิภาพของกล้ามเนื้อในการทดลองทางคลินิกและในสัตว์ [2–9] ตัวอย่างเช่น AKG สามารถลดความเสียหายของเยื่อบุลำไส้ [8] และการอักเสบ [9] ลดทอนการพัฒนาของมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก[4] และพังผืดในตับ [5] ส่งเสริมการเจริญเติบโต [6] และลดการเจ็บป่วยและชะลอความแก่[7]. งานก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่าการเสริม AKG สามารถบรรเทาการสูญเสียกล้ามเนื้อโดยการบริหารหลอดเลือดในรูปแบบการบาดเจ็บของผู้ป่วยที่ได้รับการเปลี่ยนสะโพกทั้งหมด [2] และส่งเสริมการเจริญเติบโตของกล้ามเนื้อและการสังเคราะห์โปรตีนผ่านเส้นทางการส่งสัญญาณ Akt/mTOR [10,11] ในกรณีของ Duchenne muscular dystrophy การเสริม AKG สามารถป้องกันการฝ่อของกล้ามเนื้อและการทำงานผิดปกติผ่านทาง PHD3/ADRB2-mediated pathway [12] งานก่อนหน้าของเรายังแสดงให้เห็นว่าการเสริม AKG สามารถอำนวยความสะดวกอย่างลึกซึ้งในการเพิ่มจำนวนของ C2C12 myoblasts และลดการฝ่อของ C2C12 myotubes ที่เพาะเลี้ยงในอาหารที่ไม่มีน้ำตาลกลูโคส [13] เนื่องจากกลูโคสเป็นแหล่งพลังงานหลักในการรักษาการทำงานทางสรีรวิทยาตามปกติของกล้ามเนื้อโครงร่าง ผลของการเสริม AKG เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพของกล้ามเนื้อจึงขึ้นอยู่กับระดับน้ำตาลในกล้ามเนื้อโครงร่างเป็นอย่างมาก ความแตกต่างของผลกระทบที่เกิดจาก AKG ในกล้ามเนื้อโครงร่างระหว่างสถานะพลังงานที่แตกต่างกันนั้นไม่ชัดเจน

AKG มีส่วนร่วมในการสังเคราะห์กรดอะมิโน วิตามิน และกรดอินทรีย์และการเผาผลาญพลังงานในร่างกายซึ่งเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยน AKG เป็นกลูตาเมตโดยกลูตาเมตดีไฮโดรจีเนส และการเปลี่ยนแปลงของกลูตาเมตด้วยแอมโมเนียโดยกลูตามีนซินทีเทส AKG ให้พลังงานสำหรับการเจริญเติบโตของเซลล์ผ่านวงจร TCA และออกซิเดทีฟฟอสโฟรีเลชั่น และส่งเสริมการเผาผลาญของเซลล์และการส่งสัญญาณโดยการโต้ตอบกับตัวรับ OXGR (ตัวรับคู่โปรตีน G) บนเยื่อหุ้มเซลล์ [14,15] ยิ่งไปกว่านั้น AKG สามารถควบคุมเมแทบอลิซึมของไมโตคอนเดรียลออกซิเดชันและส่งเสริมสถานะ epigenetic ที่อนุญาตโดยไกล่เกลี่ยการเปลี่ยนสถานะของเซลล์ตัวอ่อนในระยะแรกและการพัฒนาเซลล์สืบพันธุ์ [16] นอกจากนี้ AKG ที่เกิดจากการออกกำลังกายสามารถกระตุ้นตัวรับ OXGR1 ในต่อมหมวกไตเพื่อควบคุมการสร้างความร้อนและการสลายของไตรกลีเซอไรด์ในเนื้อเยื่อไขมันและสร้างผลประโยชน์ต่อการเผาผลาญ [17]

อย่างไรก็ตาม มีการศึกษาเพียงไม่กี่ชิ้นที่เผยให้เห็นการเปลี่ยนแปลงเมแทบอลิซึมของกล้ามเนื้อโครงร่างที่เกิดจาก AKG ในสภาวะพลังงานต่างๆ และกลไกเมแทบอลิซึมพื้นฐาน เมื่อเร็ว ๆ นี้ การวิเคราะห์เมแทบอโลมิกได้ถูกนำมาใช้เพื่ออธิบายกลไกระดับโมเลกุลที่อยู่ภายใต้ผลประโยชน์ของการเสริมอาหารอย่างเป็นระบบ การสลับสารที่ทำหน้าที่เป็นผลิตภัณฑ์ปลายน้ำของการถอดรหัสยีนอาจสะท้อนถึงการเปลี่ยนแปลงเมตาบอลิซึมโดยรวมโดยสัญชาตญาณ เนื่องจากเทคนิคที่เหมาะสมอย่างยิ่งสำหรับการตรวจจับการเปลี่ยนแปลงของระดับเมแทบอไลต์เชิงปริมาณในไบโอฟลูอิด เนื้อเยื่อ และเซลล์ สเปกโทรสโกปีที่มีความละเอียดสูง 1H นิวเคลียร์แมกเนติกเรโซแนนซ์ (NMR) จึงถูกนำมาใช้อย่างกว้างขวางในการวิเคราะห์เมแทบอโลมิก ที่สำคัญ การทำโปรไฟล์เมแทบอโลมิกตาม NMR มีข้อดีหลายประการ เช่น ความสามารถในการทำซ้ำสูง การวัดเชิงปริมาณโดยไม่มีอคติ และการเตรียมตัวอย่างที่สะดวก [18,19] ก่อนหน้านี้ เราทำการวิเคราะห์เมแทบอโลมิกตาม NMR เพื่ออธิบายทั้งผลของการเสริมครีเอทีนต่อเซลล์มัยโอบลาสต์ C2C12 [20] และผลของการเสริมอลานิล-กลูตามีนต่อเซลล์มัยโอบลาสต์ที่ได้รับบาดเจ็บจากการขาดพลังงาน [21]

2. ผลลัพธ์

2.1. การเพิ่มจำนวนและความแตกต่างของ C2C12 Myoblasts ด้วยการเสริม AKG

เซลล์ไมโอบลาสต์ C2C12 ที่เลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อปกติที่มีและไม่มีการเสริม AKG ถูกจัดกลุ่มเป็น Nor-A และ Nor ในขณะที่เซลล์ในอาหารเลี้ยงที่มีน้ำตาลกลูโคสต่ำที่มีหรือไม่มีการเสริม AKG ถูกจัดกลุ่มเป็น Low-A และ Low สอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้า [10] เซลล์ Nor-A ที่มีการเสริม AKG ที่ความเข้มข้น 2 มม. แสดงความมีชีวิตของเซลล์ที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับเซลล์ Nor (รูปที่ S1)

ดังนั้นจึงใช้ความเข้มข้นของ AKG ที่ 2 มม. ในการทดลองเพื่อประเมินการเปลี่ยนแปลงที่เกิดจาก AKG ในการเพิ่มจำนวนและความแตกต่างของ myoblasts เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ Nor เซลล์ต่ำแสดงอัตราการเพิ่มจำนวนที่ลดลงอย่างมากเนื่องจากการขาดพลังงาน (รูปที่ 1A) แม้ว่าการเสริม AKG ไม่ได้ทำให้เกิดลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญของ myoblasts ในสถานะพลังงานสองสถานะ มันไม่เพียงเพิ่มอัตราการเพิ่มจำนวนของเซลล์ต่ำที่เพาะเลี้ยงในอาหารที่มีน้ำตาลกลูโคสต่ำ แต่ยังปรับปรุงเซลล์ Nor ที่เลี้ยงในอาหารปกติตาม การศึกษาก่อนหน้า [10,12] จำนวนเซลล์ต่อพื้นที่ที่กำหนดถูกนับสำหรับสี่กลุ่มของไมโอบลาสต์ (n=4 สำหรับกลุ่ม): ไม่, 563.8 ± 10.4; ไม่ใช่-A, 624.0 ± 10.8; ต่ำ 493.8 ± 14.5; ต่ำ A, 547.0 ± 11.7 (รูปที่ 1B) เป็นที่น่าสังเกตว่าเซลล์ Low-A ไม่แสดงจำนวนเซลล์ที่แตกต่างกันทางสถิติจากเซลล์ Nor ซึ่งบ่งชี้ว่าการเสริม AKG สามารถกู้คืนจำนวนเซลล์สำหรับ myoblasts ภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงกลูโคสต่ำ (รูปที่ 1B)

รูปที่ 1 ความสามารถในการเพิ่มจำนวนและความแตกต่างของ C2C12 myoblasts ภายใต้เงื่อนไขของวัฒนธรรมปกติและต่ำ วัฒนธรรมกลูโคส (A) สัณฐานวิทยาของไมโอบลาสต์ (B) หมายเลขเซลล์ที่ตรงกับแผง A (n=4) (C) ความมีชีวิตของเซลล์ที่สัมพันธ์กับเซลล์ Nor ที่วิเคราะห์โดยการทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์ MTS (n=5) (D) การแสดงออกของ MyoD1 ใน myoblasts ที่วิเคราะห์โดย Western blot แอนติบอดีต่อต้าน GAPDH ถูกนำมาใช้เพื่อสร้างมาตรฐานปริมาณโปรตีนในแต่ละเลน (E) การวิเคราะห์ทางสถิติที่สอดคล้องกับแผง (D) (n=4) * p < 0.{{10}}5,** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.

นอกจากนี้ยังทำการทดสอบ MTS เพื่อเปรียบเทียบอัตราการเพิ่มจำนวนของเซลล์ทั้งสี่กลุ่มในเชิงปริมาณ (รูปที่ 1C) เซลล์ต่ำมีอัตราการเพิ่มจำนวนที่ลดลงอย่างชัดเจนเมื่อเทียบกับเซลล์ Nor ซึ่งบ่งชี้ว่าอาหารที่มีน้ำตาลกลูโคสต่ำไม่ชอบการเพิ่มจำนวนเซลล์ อย่างมีนัยสำคัญ การเสริม AKG ช่วยเพิ่มอัตราการเพิ่มจำนวนของเซลล์ Nor-A และ Low-A ที่สัมพันธ์กับเซลล์ Nor และ Low ตามลำดับ โปรดทราบว่าเซลล์ Low-A แสดงความสามารถในการเพิ่มจำนวนที่ต่ำกว่าเซลล์ Nor ซึ่งหมายความว่าการเสริม AKG ช่วยฟื้นฟูการเพิ่มจำนวนของเซลล์ที่เพาะเลี้ยงในอาหารที่มีน้ำตาลกลูโคสต่ำเพียงบางส่วนเท่านั้น

การแสดงออกของโปรตีน myogenic differentiation 1 (MyoD1) มักจะใช้เพื่อระบุลักษณะความสามารถในการสร้างความแตกต่างของเซลล์ ดังนั้นเราจึงเปรียบเทียบการแสดงออกของ MyoD1 ระหว่างเซลล์ทั้งสี่กลุ่มในเชิงปริมาณ (รูปที่ 1D) เซลล์ต่ำแสดงความสามารถในการสร้างความแตกต่างที่ลดลงอย่างมากเมื่อเทียบกับเซลล์ Nor อย่างมีนัยสำคัญ AKGsupplementation up-regulated ความสามารถในการสร้างความแตกต่างของเซลล์ที่เพาะเลี้ยงทั้งในอาหารปกติและอาหารที่มีน้ำตาลกลูโคสต่ำ ตามที่ระบุโดยเพิ่มขึ้นประมาณ 30 เปอร์เซ็นต์ของการแสดงออกของ MyoD1 ในเซลล์ Nor-A และ Low-A โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เซลล์ Low-A ไม่แสดงการแสดงออกของ MyoD1 ที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติจากเซลล์ Nor ซึ่งหมายถึงประสิทธิภาพสูงของการเสริม AKG สำหรับการฟื้นฟูความสามารถในการแยกความแตกต่างของเซลล์ที่เพาะเลี้ยงในอาหารที่มีน้ำตาลกลูโคสต่ำ

นอกจากนี้ เราวิเคราะห์ความสามารถในการสร้างความแตกต่างของ myotube สำหรับ myoblasts C2C12 สี่กลุ่ม Myotubes เกิดขึ้นจากการหลอมรวมของ myoblasts ที่เพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อปกติและน้ำตาลกลูโคสต่ำที่มีหรือไม่มีการเสริม AKGรูปที่ S3) สัณฐานวิทยาของ myotubes C2C12 แสดงให้เห็นว่าการเพาะเลี้ยงที่มีน้ำตาลกลูโคสต่ำทำให้ความสามารถในการสร้างความแตกต่างของเซลล์ myotube ลดลง และการเสริม AKG สามารถส่งเสริมการสร้างความแตกต่างของ myotube ของ myoblasts ที่เพาะเลี้ยงทั้งในอาหารเลี้ยงเชื้อปกติและอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีน้ำตาลกลูโคส

2.2. NMR Spectra ของสารสกัดจากน้ำของ C2C12 Myoblasts

สเปกตรัม NMR 850 MHz 1H ทั่วไปถูกบันทึกบนสารสกัดน้ำที่ได้จากกลุ่มไมโอบลาสต์ C2C12 ของ C2C12 Nor, Nor-A, Low และ Low-A (รูปที่ 2A) มีการกำหนดสารเมแทบอไลต์ทั้งหมด 34 รายการและสรุปไว้ในตารางที่ S1 การกำหนดเสียงสะท้อนของเมแทบอไลต์ได้รับการยืนยันโดยใช้ 2D 1H-13C HSOC และ 1H-H TOCSY สเปกตรัม (รูปที่ S4 และ S5) การตรวจสอบด้วยสายตาของ NMR spectra ระบุว่าการเพาะเลี้ยง myoblasts ด้วยการเสริม AKG ส่งผลให้เกิดการสะสมของ AKG ภายในเซลล์อย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ Nor-A และ Low-A (รูปที่ 2B)

รูปที่ 2 สเปกตรัมนิวเคลียร์เรโซแนนซ์เรโซแนนซ์ (NMR) เฉลี่ย 850 MHz lH ที่บันทึกบนสารสกัดที่เป็นน้ำที่ได้มาจากกลุ่มไมโอบลาสต์ C2C12 ของ C2C12 Nor, Nor-A, Low และ Low-A (A) การเปรียบเทียบสเปกตรัม NMR เฉลี่ยของทั้งสี่กลุ่ม สเกลแนวตั้งนั้นคงที่ในสเปกตรัม lH NMR ทั้งหมด พื้นที่น้ำ (4.7-5.2 ppm) ถูกลบออก (B) บริเวณที่มีการขยายในท้องถิ่นของพีค a-Ketoglutarate (AKG) เส้นสีน้ำเงิน/เขียว/เหลือง/แดง: พื้นที่สเปกตรัมจากกลุ่ม Nor/Nor-A/Low/Low-A AKG, เอ-คีโตกลูตาเรต; PC, O-ฟอสโฟโคลีน; GPC, sn-glycero-3-phosphocholineUDP-กลูโคส, Uridine diphosphate glucose: CTP, sn-glycero-3-phosphocholine; NAD บวก , นิโคตินาไมด์ อะดีนีน ไดนิวคลีโอไทด์ AXP อะดีนีน โมโน /di /ไตรฟอสเฟต

2.3. การวิเคราะห์ข้อมูลหลายตัวแปรสำหรับการสำรวจโปรไฟล์เมตาบอลิซึมของเซลล์

เราทำการวิเคราะห์ข้อมูลหลายตัวแปรต่อไปในข้อมูลสเปกตรัม NMR สำหรับการทำโปรไฟล์เมตาบอลิซึมของ myoblasts C2C12 สี่กลุ่ม อันดับแรก เราสร้างแบบจำลอง PCA ที่ไม่มีการควบคุม 3 แบบโดยมีส่วนประกอบ 2 ชิ้นแรก (PC1, PC2) เพื่อดูภาพรวมของแนวโน้มการจัดกลุ่มและเปิดเผยความแตกต่างทางเมแทบอลิซึมระหว่างกลุ่มของไมโอบลาสต์ แผนคะแนน ThePCA แสดงให้เห็นว่าโปรไฟล์การเผาผลาญของเซลล์ที่เพาะเลี้ยงในอาหารที่มีน้ำตาลกลูโคสต่ำนั้นแตกต่างอย่างชัดเจนจากการเพาะเลี้ยงในอาหารปกติ (รูปที่ 3A) และการเสริม AKC เปลี่ยนรูปแบบการเผาผลาญของเซลล์ที่เพาะเลี้ยงอย่างมีนัยสำคัญทั้งในอาหารปกติและ ในอาหารที่มีน้ำตาลกลูโคสต่ำ (ภาพที่ 3B,C) อย่างไรก็ตาม ความแตกต่างทางเมตาบอลิซึมระหว่างกลุ่ม Nor-A และ Nor นั้นมากกว่าระหว่างกลุ่ม Low-A และกลุ่ม Low ซึ่งหมายความว่าผลของการเสริม AKG ต่อโปรไฟล์การเผาผลาญของ myoblasts นั้นขึ้นอยู่กับสถานะพลังงานของเซลล์อย่างมาก

รูปที่ 3 การวิเคราะห์หลายตัวแปรสำหรับ 'สเปกตรัม HNMR ถูกบันทึกบนสารสกัดน้ำที่ได้มาจาก C2C12 myoblasts ของกลุ่ม Nor, Nor-A, Low และ Low-A (AC) พล็อตคะแนน PCA ของกลุ่ม Low และ Nor, กลุ่ม Low-A และ Low ของกลุ่ม Nor-A และ Nor; (DF) พล็อตคะแนน OPIS-DA ของกลุ่ม Low และ Nor (R2: 0.999, 02: 0.996), กลุ่ม Low-A และ Low (R2: 0.918: 02: 0.761) กลุ่ม Nor-A และ Nor (R2: 0.927: 02: 0.838) วงรีระบุขีดจำกัดความเชื่อมั่น 95 เปอร์เซ็นต์

นอกจากนี้ เรายังได้สร้างแบบจำลอง OPLS-DA 3 แบบภายใต้การดูแลเพื่อแสดงการแยกเมตาบอลิซึมระหว่างกลุ่มของไมโอบลาสต์ทั้งสี่กลุ่ม (รูปที่ 3D-F) ตามที่คาดไว้ แบบจำลอง OPLSDA เพิ่มความแตกต่างทางเมตาบอลิซึมระหว่างสี่กลุ่มให้มากที่สุดโดยสงวนข้อมูลตัวแปรมุมฉากที่สัมพันธ์กัน และกรองข้อมูลตัวแปรมุมฉากที่ไม่สัมพันธ์กันออก นอกจากนี้ เราทำการทดสอบการเรียงสับเปลี่ยนแบบสุ่ม (n=200) เพื่อประเมินความน่าเชื่อถือของแบบจำลอง OPLS-DA (รูปที่ S6) ซึ่งระบุความถูกต้องของแบบจำลอง OPLS-DA ที่สร้างขึ้น

2.4. การระบุความแตกต่างและเมตาโบไลต์ที่สำคัญ

ในการเปรียบเทียบระดับสารเมตาโบไลต์เชิงปริมาณระหว่างสี่กลุ่มของ C2C12 myoblasts เราคำนวณระดับสัมพัทธ์ของสารที่ระบุโดยพิจารณาจากอินทิกรัลสัมพัทธ์ (ตาราง S2) การเสริม AKG อย่างมากช่วยเพิ่มระดับ AKG ภายในเซลล์ในกลุ่ม Nor-A และ Low-A แต่ไม่ได้เปลี่ยนระดับในกลุ่ม Nor และ Low อย่างมีนัยสำคัญ เราทำการทดสอบ t-test ของนักเรียนเพื่อระบุสารเมตาบอไลต์ที่แตกต่างกันด้วยเกณฑ์ p < 0.05 (รูปที่ 4) การเปรียบเทียบระหว่าง Nor กับ Low ระบุเมตาโบไลต์ที่แตกต่างกัน 29 ชนิด (รูปที่ 4A) รวมถึงเมตาโบไลต์ที่ปรับปรุงแล้ว 18 ชนิด (ลิวซีน ไอโซลิวซีน วาลีน อะซีเตต กลูตาเมต กลูตามีน เมไทโอนีน แอสปาร์เตต ไลซีน ครีเอทีน PC (O-ฟอสโฟโคลีน) ทอรีน ไทโรซีน , ฟีนิลอะลานีน, ฮิสทิดีน, NAD บวก , รูปแบบ, AXP) และ 11 ปฏิเสธ Metabo ไลต์ (กลูตาไธโอน, ไพโรกลูตาเมต, ฟอสโฟครีเอทีน, เบต้าอะลานีน, GPC, กลูโคส, ไกลซีน, อะซีเตต, ธรีโอนีน, GTP, UDP-กลูโคส) การเปรียบเทียบสารเมแทบอไลต์ที่มีอนุพันธ์ชนิด Low-A กับการระบุต่ำ (รูปที่ 4B) รวมถึงสารเมตาโบไลต์ที่เพิ่มขึ้น 7 รายการ (เอทานอล, AKG เบต้าอะลานีน, PC, ทอรีน, ไกลซีน และ GTP) และสารเมตาบอไลท์ที่ลดลง 3 รายการ (กลูตามีน ไลซีน และไมโออิโนซิทอล) การเปรียบเทียบระหว่าง Nor-A กับ Nor ระบุเมแทบอไลต์ที่แตกต่างกัน 18 ชนิด (รูปที่ 4C) รวมถึงเมแทบอไลต์ควบคุม 6 ชนิด (AKG, ไพโรกลูตาเมต, กลูตามีน, ไลซีน, กลูโคส, แลคเตต) และสารเมตาโบไลต์ควบคุม 12 ชนิด (อะลานีน อะซีเตต กลูตาไธโอน เมไทโอนีน, ฟอสโฟครีเอทีน, พีซี, ไมโออิโนซิทอล, ไกลซีน, ธรีโอนีน, GTP, UDP-กลูโคส และ AXP)

รูปที่ 4 ความเข้มสัมพัทธ์ของเมตาโบไลต์ที่แตกต่างกันถูกระบุจากการเปรียบเทียบแบบคู่ระหว่างสี่กลุ่มของ C2C12 myoblasts (A) ต่ำเทียบกับ Nor; (B) ต่ำ-A เทียบกับต่ำ; (C) Nor-A กับ Nor * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.n { {13}} สำหรับแต่ละกลุ่ม

นอกจากนี้ เราใช้แบบจำลอง OPLS-DA เพื่อระบุเมแทบอไลต์ที่สำคัญด้วยเกณฑ์ VIP > 1 (รูปที่ 5) เมแทบอไลต์ที่สำคัญทั้งหมด 12, 10 และ 10 รายการได้รับการระบุจากแบบจำลอง OPLS-DA ของ Nor-A เทียบกับ Nor, Nor เทียบกับ Low, Low-A เทียบกับ Low

รูปที่ 5 คะแนนวีไอพีของเมแทบอไลต์ที่สำคัญถูกระบุจากการเปรียบเทียบแบบคู่ระหว่างสี่กลุ่มของ C2C12myoblasts (A) ต่ำเทียบกับ Nor; (B) ต่ำ-A เทียบกับต่ำ; (C) Nor-A กับ Nor แบบอักษรสีแดง/สีน้ำเงินหมายถึงระดับเมแทบอไลต์ที่เพิ่มขึ้น/ลดลง

การรวมกันของสารเมตาโบไลต์ที่สำคัญที่ระบุและสารเมตาโบไลต์ที่แตกต่างกันทำให้สารที่มีลักษณะเฉพาะ (ตารางที่ 1) การเปรียบเทียบแบบคู่ของ Low vs. Nor, Low-A vs. Low และ Nor-A vs. Nor ระบุสารที่มีลักษณะเฉพาะ 10, 6 และ 10 รายการตามลำดับ ซึ่งบ่งชี้ว่าผลของการเสริม AKG ต่อ myoblasts มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับพลังงาน สถานะของเซลล์

2.5. การระบุเมตาบอลิซึมที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ

เส้นทาง เราทำการวิเคราะห์เส้นทางการเผาผลาญเพื่อระบุเส้นทางการเผาผลาญที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ (เส้นทางที่มีนัยสำคัญ) ตามระดับของสารที่ระบุจากการเปรียบเทียบแบบคู่ระหว่างสี่กลุ่มของ C1C12 myoblasts (รูปที่ S7; ตารางที่ 2 และตาราง S3) การวิเคราะห์ Nor vs. Low ระบุเส้นทางที่สำคัญ 11 เส้นทาง: (1) เมแทบอลิซึมของอะลานีน แอสปาร์เทต และกลูตาเมต; (2) เมแทบอลิซึมของไกลซีน ซีรีน และทรีโอนีน (3) เมแทบอลิซึมของกลูตาไธโอน; (4) เมแทบอลิซึมของดี-กลูตามีนและดี-กลูตาเมต; (5) เมแทบอลิซึมของแป้งและซูโครส (6) เมแทบอลิซึมของเบต้าอะลานีน; (7) เมแทบอลิซึมของทอรีนและไฮโปทอรีน (8) เมแทบอลิซึมของฟีนิลอะลานีน; (9) การสังเคราะห์ฟีนิลอะลานีน ไทโรซีน และโพรไบโอ (10) เมแทบอลิซึมของนิโคติเนตและนิโคตินาไมด์ (11) การเผาผลาญของฮิสทิดีน เส้นทางที่สำคัญนี้เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญพลังงาน ความเครียดออกซิเดชัน และวัฏจักร TCA anaplerotic fluflux

การวิเคราะห์ Nor-A เทียบกับ Nor ระบุเฉพาะเส้นทางสำคัญ 5 เส้นทางแรก 1–5 โดยไม่รวมอีก 6 เส้นทาง 6–11 แตกต่างกัน การวิเคราะห์ Low-A vs. Low ระบุเส้นทางที่สำคัญเพียงหกเส้นทาง: สี่เส้นทางแรก 1–4 แบ่งปันโดยการเปรียบเทียบระหว่าง Low vs. Nor, Nor-A vs. Nor; สองเส้นทาง 6–7 ใช้ร่วมกันโดยการเปรียบเทียบระหว่าง Low กับ Nor โปรดทราบว่าการเสริม AKG ไม่ได้เปลี่ยนแปลงวิถีที่ 5 (เมแทบอลิซึมของแป้งและซูโครส) อย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ที่เพาะเลี้ยงในอาหารที่มีน้ำตาลกลูโคสต่ำ แต่รบกวนวิถีอื่นอีกสองวิถี (เมแทบอลิซึมของเบต้าอะลานีน และเมแทบอลิซึมของทอรีนและไฮโปทอรีน) เพื่อให้เห็นภาพการเปลี่ยนแปลงที่เกิดจาก AKG ในเมแทบอไลต์ที่มีลักษณะเฉพาะ เราฉายเมตาโบไลต์เหล่านี้ลงบนแผนที่เมแทบอลิซึมตามฐานข้อมูล Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (รูปที่ 6) KEGG ถูกใช้อย่างกว้างขวางในฐานะหนึ่งในแหล่งข้อมูลหลักเพื่อสร้างเครือข่ายเมแทบอลิซึมขึ้นใหม่ และเน้นเส้นทางเมตาบอลิซึมที่สำคัญ ทั้งเมแทบอไลต์ที่มีลักษณะเฉพาะที่เปลี่ยนไปและวิถีเมแทบอลิซึมที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับกลไกระดับโมเลกุลที่อยู่ภายใต้ผลกระทบของการเสริม AKG ต่อ C2C12 myoblasts