ผลกระทบทางระบบประสาทของ Phenylethanoid Glycosides สี่ตัวต่อ H2O2-การเหนี่ยวนำให้เกิดการตายของเซลล์ในเซลล์ PC12 ผ่านทางเส้นทาง Nrf2/ARE
Mar 04, 2022
ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com
Maiquan Li 1, Tao Xu 1, Fei Zhou 1, Mengmeng Wang 1, Huaxin Song 1, Xing Xiao และ Baiyi Lu 1*
1. บทนำ
ความเครียดที่เกิดจากออกซิเดชัน ซึ่งเป็นความไม่สมดุลของสภาวะสมดุลของสารต้านอนุมูลอิสระ ทำให้เกิดลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน การบาดเจ็บของโปรตีนและดีเอ็นเอ การแก่ของเซลล์ และการตายของเซลล์ กระบวนการนี้น่าจะก่อให้เกิดความผิดปกติของระบบประสาทหลายอย่าง เช่น โรคอัลไซเมอร์ (AD), โรคพาร์กินสัน (PD) และภาวะขาดเลือด/การกลับเป็นซ้ำ [1] ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2) ซึ่งเป็นหนึ่งในสายพันธุ์ออกซิเจนปฏิกิริยาหลัก (ROS) เป็นที่ทราบกันดีว่าทำให้เกิดลิพิดเปอร์ออกซิเดชันและความเสียหายของดีเอ็นเอ [2] นอกจากนี้ H2O2 ยังเป็นแหล่งของอนุมูลอิสระไฮดรอกซิลที่ก่อให้เกิดระดับพื้นหลังของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันของเซลล์ [3,4] ดังนั้นกลยุทธ์การรักษาเพื่อป้องกันการตายของเซลล์ที่เกิดจากความเครียดออกซิเดชันอาจมีศักยภาพในการรักษาโรคทางระบบประสาท
ปัจจัยนิวเคลียร์อีรีทรอยด์ 2-ปัจจัยที่เกี่ยวข้อง 2 (Nrf2) เป็นปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องอย่างยิ่งกับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน การกระตุ้น Nrf2 ทำให้เกิดการถอดรหัสของยีนต้านอนุมูลอิสระและล้างพิษจำนวนมาก รวมถึง heme oxygenase-1 (HO-1), NAD(P)H quinone oxidoreductase 1, ต้านการอักเสบ [13] และ immunomodulatory [14 ] ฤทธิ์ทางชีวภาพ Osmanthusfragrans เป็นส่วนผสมทั่วไปในอาหารเอเชียหลายชนิดและมีการบริโภคมานานแล้ว ก่อนหน้านี้เราแสดงให้เห็นว่าสารสกัดจากดอก O.fragrans ช่วยเพิ่มการเรียนรู้เชิงพื้นที่และความจำ ยับยั้งความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน และแสดงกิจกรรมในการป้องกันระบบประสาทในการเสื่อมสภาพที่เกิดจากดีกาแลคโตสในแบบจำลองเมาส์ ICR [15] Salidroside, acteoside และ isoacteoside เป็นการตอบสนองของ PhGs ที่สำคัญสำหรับกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดจากดอก O.fragrans [16]
การศึกษาเกี่ยวกับผลการป้องกันระบบประสาทของ PhGs ได้ผลลัพธ์ที่น่าพอใจ Salidroside ลดการตายของเซลล์ PC12 อย่างมีนัยสำคัญใน MPP plus [17,18] Acteoside ยังช่วยบรรเทา MPP บวก - การตายแบบอะพอพโทซิสและความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในเซลล์ PC12 [19] และ A p25-35-ทำให้เกิดการบาดเจ็บของเซลล์ SH-SY5Y [20] Echinacoside ได้รับการตรวจสอบเกี่ยวกับการตายของเซลล์เนื้องอกที่เกิดจากปัจจัย a (TNFa) ในเซลล์ SH-SY5Y [21], ความเป็นพิษของโดปามีนที่เกิดจาก MPTP ในหนูทดลอง [22], วัฒนธรรมปฐมภูมิที่ได้รับบาดเจ็บจากกลูตาเมตของเซลล์เยื่อหุ้มสมองของหนู [23] และ { {19}}ความเสียหายที่เกิดจาก OHDA ในเซลล์ PC12 [24] ผลลัพธ์บ่งชี้ว่า PhGs แสดงผล cytoprotective และเป็นสารที่มีศักยภาพในการรักษาโรคทางระบบประสาท การศึกษาได้แสดงให้เห็นคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระของ PhGs ภายใต้ฤทธิ์ทางชีวภาพอื่นๆ มากมายสำหรับสารประกอบเหล่านี้ [25] อย่างไรก็ตาม มีการศึกษาเพียงไม่กี่ชิ้นที่ตรวจสอบกลไกระดับโมเลกุลของ PhGs ต่อความเป็นพิษจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน
ในการศึกษาของเรา เราเลือก PhGs ทั่วไปสี่แบบดังนี้: salidroside (phenylethanoid monosaccharides), acteoside (phenylethanoid disaccharides), isoacteoside (phenylethanoid disaccharides) และ echinacoside (phenylethanoid trisaccharides) เราใช้แบบจำลองการตายของเซลล์ประสาทโดยใช้เซลล์ PC12 ที่แตกต่างกัน [26] เพื่อตรวจสอบผลการป้องกันและกลไกระดับโมเลกุลของ PhGs ในแบบจำลองเซลล์ PC12 ที่เกิดจาก H2O2- เราแสดงให้เห็นว่า PhGs กระตุ้นวิถี Nrf2/ARE โดยจับกับโปรตีน 1 ที่เกี่ยวข้องกับ ECH คล้ายเคลช์ (Keap1) กระบวนการนี้ควบคุมเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระและเพิ่มความต้านทานของเซลล์ PC12 ต่อความเครียดออกซิเดชัน
การรักษาความผิดปกติของระบบประสาท:PhGs จาก cistanche
2. ผลลัพธ์
2.1. PhGs ยับยั้ง H2O2-ความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เหนี่ยวนำในเซลล์ PC12
ผลที่เป็นพิษต่อเซลล์ของ H2O2 และ PhGs (0.1,1,5 และ 10 卩g/mL) บนเซลล์ PC12 ได้รับการทดสอบ ผลการศึกษาพบว่า H2O2 ทำให้เกิดการสูญเสียความมีชีวิตของเซลล์ PC12 ในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้นและขึ้นกับเวลา (รูปที่ 1A) การเปิดรับเซลล์ PC12 ต่อ 200 H2O2 เป็นเวลา 2 ชั่วโมงส่งผลให้เซลล์มีชีวิตได้ 57.4 เปอร์เซ็นต์ การปรับสภาพเซลล์ด้วย PhGs ที่ 0.1,1, 5 และ 10 昭/มล. ไม่มีผลต่อความมีชีวิตของเซลล์ (รูปที่ 1B) และเซลล์ PC12 ที่ได้รับการปกป้องไว้อย่างชัดเจนจาก H2O2- ความเสียหายที่เกิดจากการปรับปรุง ความมีชีวิตของเซลล์เท่ากับ 9.549-22.141 เปอร์เซ็นต์ , 12.092-25.289 เปอร์เซ็นต์ , 1.470-9.289 เปอร์เซ็นต์ และ 3.411-11.441 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ ( รูปที่ 1C) อย่างไรก็ตาม การปรับสภาพซาลิโดรไซด์ (0.1 ^g/mL), isoacteoside (0.1, 1, 5 และ 10 ^g/mL), echinacoside (0.1,1 และ 5 ^g/mL) ก่อนการบำบัดไม่มีความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในเซลล์ที่เกิดจาก HzOz บาดเจ็บ. การปรับสภาพเซลล์ด้วย PhGs ยังช่วยปรับปรุงลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่เหนี่ยวนำโดย H2O2 (รูปที่ 1D)
รูปที่ 1.PhGs ยับยั้ง H2O2-ที่เหนี่ยวนำให้เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์ในเซลล์ PC12 ตรวจพบความมีชีวิตของเซลล์โดยการทดสอบ MTT พิษต่อเซลล์ของ H2O2 (A) และ PhGs (B) ที่ความเข้มข้นต่างกันในเซลล์ PC12 (C) PhGs ลดทอน H2O2- เหนี่ยวนำให้เซลล์มีชีวิตรอด เซลล์ PC12 ถูกบ่มด้วย PhGs (0.1 และ 10 มก./มล.) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และจากนั้นบ่มด้วย 200 pM H2O2 เป็นเวลา 2 อีก 2 h หลังจากถอด PhGs แล้ว (D) การสังเกตทางสัณฐานวิทยา เซลล์หลังการรักษาถูกสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบ phase-contrast microscope (x100), CK: กลุ่มปกติ, H2O2: กลุ่มที่ได้รับ H2O2, HL: กลุ่มที่ได้รับยา salidroside ในปริมาณต่ำ, HH: กลุ่มที่ได้รับยา salidroside ในปริมาณสูง, ML: กลุ่มที่ได้รับยา acteoside ในปริมาณต่ำ, MH: กลุ่มที่ได้รับยากลุ่ม Acteoside สูง, IL: กลุ่มที่ได้รับยา isoacteoside ในปริมาณต่ำ, IH: กลุ่มที่ได้รับยา isoacteoside ในปริมาณสูง, SL: กลุ่มที่ได้รับยา echinacoside ในปริมาณต่ำ, SH: กลุ่มที่ได้รับยา echinacoside ในปริมาณสูง ** p < 0.01="" เทียบกับกลุ่มที่ไม่ได้รับการรักษา="" #="" p="">< 0.05="" เทียบกับกลุ่มที่บำบัดด้วย="" h2o2;="" ##="" p="">< 0.01="" เทียบกับกลุ่มที่บำบัดด้วย="">
2.2. PhGs Suppressed H2O2-กระตุ้นการสะสมภายในเซลล์ของ ROS, Lipid Peroxidation (MDA) และกิจกรรม Superoxide Dismutase (SOD) ในเซลล์ PC12
การเปิดรับเซลล์ PC12 ต่อ 200 pM H2O2 เป็นเวลา 2 ชั่วโมง เพิ่มระดับ ROS, เนื้อหา MDA และกิจกรรม SOD ที่ลดลง (รูปที่ 2) การปรับสภาพด้วย PhGs ช่วยลดระดับ ROS, ซาลิโดรไซด์ และแอกทิโอไซด์ และปริมาณที่สูงของการปรับสภาพไอโซแอคทีโอไซด์และเอไคนาโคไซด์ทำให้ระดับ ROS ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.01)="" การปรับสภาพด้วยซาลิโดรไซด์ไม่มีผลต่อเนื้อหาของ="" mda="" แต่การปรับสภาพแอกทีโอไซด์ก่อนทำให้เนื้อหา="" mda="" อ่อนลงอย่างมีนัยสำคัญ="" (p="">< 0.05)="" การปรับสภาพ="" isoacteoside="" และ="" echinacoside="" ลดทอนเนื้อหา="" mda="">
รูปที่ 2PhGs บล็อกการสะสม ROS และ MDA และเพิ่มกิจกรรมของ SOD ในเซลล์ PC12 เซลล์ PC12 ถูกบ่มด้วย PhGs (0.1 และ 10 4g/mL) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นบ่มด้วย 200 |^M H2O2 สำหรับอีกเซลล์หนึ่ง 2 ชั่วโมงหลังจากถอด PhGs (A) PhGs ขัดขวางการสะสม ROS และ MDA (B) PhGs ปิดกั้นการสะสม MDA (C) PhGs เพิ่มกิจกรรมของ SOD CK: กลุ่มปกติ, รุ่น: กลุ่มที่ได้รับ H2O2, Salidroside: กลุ่มที่ได้รับ salidroside, Acteoside: กลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย acteoside, Isoacteoside: กลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย isoacteoside, Echinacoside: กลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย echinacoside ** p < 0.01="" เทียบกับกลุ่มที่ไม่ได้รับการรักษา="" #="" p="">< 0.05="" เทียบกับกลุ่มที่บำบัดด้วย="" h2o2="" ##="" p="">< 0.01="" เทียบกับกลุ่มที่บำบัดด้วย="">
2.3.PhGs Reversed H2O2-กระตุ้นการตายของเซลล์ในเซลล์ PC12
การบำบัดด้วย H2O2 (200 |1M) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงเพิ่มการตายของเซลล์ PC12 อย่างมีนัยสำคัญ โดยมีอัตราการตายแบบอะพอพโทซิสทั้งหมดสูงถึง 16.02 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 3) อย่างไรก็ตาม การปรับสภาพด้วย PhGs (0.1 และ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงช่วยลดอัตราการตายของเซลล์ในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้น (p < 0.01)="" salidroside,="" acteoside,="" isoacteoside="" และ="" echinacoside="" ลดเปอร์เซ็นต์ของการตายของเซลล์="" apoptosis="" ลงได้="" 4.750-6.627="" เปอร์เซ็นต์="" 4.413-5.800="" เปอร์เซ็นต์="" ,="" 6.593-10.047="" เปอร์เซ็นต์="" และ="" 1.530-7.510="" เปอร์เซ็นต์="">
รูปที่ 3. PhGs กลับ H2O2-ที่เหนี่ยวนำให้เกิดการตายของเซลล์ในเซลล์ PC12 เซลล์ PC12 ถูกบ่มด้วย PhGs (0.1 และ 10 卩g/mL) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง แล้วบ่มด้วย 200 pM H2O2 อีก 2 ชั่วโมงหลังจาก PhGs ถูกลบออก จากนั้น วัดการตายของเซลล์โดยโฟลว์ไซโตเมทรีโดยใช้โพรบฟลูออเรสเซนต์ PI/FITC CK: กลุ่มปกติ, รุ่น: กลุ่มที่ได้รับ H2O2, Salidroside: กลุ่มที่ได้รับ salidroside, Acteoside: กลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย acteoside, Isoacteoside: กลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย isoacteoside, Echinacoside: กลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย echinacoside ** p < 0.01="" เทียบกับกลุ่มที่ไม่ได้รับการรักษา="" ##="" p="">< 0.01="" เทียบกับกลุ่มที่บำบัดด้วย="">
2.4. PhGs กลับด้าน H2O2-ที่ชักนำให้เกิดการปรับลดการแสดงออกของโปรตีนของ HO-1, NQO1, GCLC และ GCLM
H O{{0}}, NQO1 และกลูตาเมต-ซิสเทอีน ลิเกส (GCL) เป็นเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระระดับเซลล์ที่สำคัญ และ HO-1, NQO1 และหน่วยย่อยเร่งปฏิกิริยาหรือดัดแปลงของ GCL (GCLC หรือ GCLM) คือ Nrf2-ควบคุมยีนดาวน์สตรีม [27] การแสดงออกของโปรตีนของ H2O-1, NQO1, GCLC และ GCLM สังเกตพบหลังการบำบัด พบความแตกต่างที่เห็นได้ชัดระหว่างการแสดงออกของโปรตีนของ H2O-1 และ NQO1 ที่มีหรือไม่มี H2O2 (รูปที่ 6A-C) (p < 0.01)="" phgs="" (0.1="" และ="" 10="" p^g/ml)="" กลับการควบคุม="" h2o2-="" ที่เหนี่ยวนำให้ลดการแสดงออกของโปรตีนของ="" h2o-1="" (ยกเว้นซาลิโดรไซด์ที่="" {{32}="" }.1="" pg/ml),="" nqo1="" (ยกเว้นแอคทีโอไซด์ที่="" 0.1="" pg/ml)="" (p="">< {{40}}.01)="" นอกจากนี้="" h2o2="" ยังปรับลดการแสดงออกของโปรตีน="" gclc="" และ="" gclm="" (p="">< 0.05)="" (รูปที่="" 6a,d,e)="" phgs="" (0.1="" และ="" 10="" pg/ml)="" กลับด้าน="" h2o2-="" ที่ชักนำให้เกิดการปรับลดการแสดงออกของโปรตีนของ="" gclc="" (ยกเว้นอิชินาโคไซด์ที่="" 0.1="" pg/ml)="" (p="">< 0.01)="" และ="" gclm="" (ยกเว้นซาลิโดรไซด์ที่="" 0.1="" pg/ml)="" (p="">< 0.01)="" จากนั้น="" สารยับยั้งทางเคมีสำหรับ="" h2o-1="" ถูกใช้เพื่อประเมินบทบาทของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระเพิ่มเติมในการควบคุมการป้องกัน="" phgs="" ต่อความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจาก="" h2o2-="" phgs="" (0.1="" และ="" 10="" pg/ml)="" ป้องกัน="" h2o2-ความเป็นพิษต่อเซลล์="" แต่ผลการป้องกันดังกล่าวถูกย้อนกลับโดย="" ho-1="" ตัวยับยั้ง="" znpp="" (p="">< 0.01)="" ที่="" 20="" pm="" (รูปที่="" 6f,="" p="">< 0.01)="">
2.5. Keap1 Expression and Molecular Docking Analysis
ภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยา Keap1 ทำหน้าที่เป็นโปรตีนปราบปรามของ Nrf2 โดยการผูกมัดกับโดเมน Neh2 ของ Nrf2 และกำหนดเป้าหมาย Nrf2 ไปที่ E3 ubiquitin ligase ตาม Cul3- สำหรับการแพร่หลายและการย่อยสลายที่ตามมาโดย 26S proteasome [28] ความสามารถในการจับกับ Keap1 ของ PhGs ได้รับการประเมินโดยการวิเคราะห์การเทียบท่าระดับโมเลกุลเพื่อตรวจสอบกลไกภายใต้ผลของสารต้านอนุมูลอิสระ
ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ: Cistancheปริญญาเอก
3. อภิปราย
เราตรวจสอบการป้องกันระบบประสาทของ PhGs เกี่ยวกับความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจาก H2O2 ในเซลล์ PC12 ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าการปรับสภาพด้วย PhGs ยับยั้งความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจาก HzOz อย่างมีนัยสำคัญ ทำให้ระดับ ROS ภายในเซลล์อ่อนลง ปรับปรุงระดับของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระภายในเซลล์ และทำให้ H2O2-เกิดพิษต่อเซลล์ในเซลล์ PC12 กลับด้านในที่สุด นอกจากนี้ PhGs ยังเพิ่มการกระตุ้นการถอดรหัสของ Nrf2 ย้อนกลับการปรับลดการควบคุมที่เกิดจาก HzOz ของการแสดงออกของโปรตีน HO-1, NQO1, GCLC และ GCLM นอกจากนี้ PhGs ยังแสดงปฏิสัมพันธ์ที่อาจเกิดขึ้นกับตำแหน่งการจับ Nrf2 ในโปรตีน Keap1
ในการบาดเจ็บของเซลล์ PC12 ที่เกิดจาก H2O2- ลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน ซึ่งหมายถึงการเสื่อมสภาพออกซิเดชันของลิพิด ทำให้การซึมผ่านของเยื่อหุ้มเซลล์เพิ่มขึ้น นำไปสู่ความเสียหายของเซลล์ [29] การก่อตัวของ MDA ใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นดัชนีของลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน [30] H2O2 ช่วยเพิ่มการผลิต ROS และเอ็นไซม์ป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระที่หมดแล้ว เช่น SOD, catalase และ GPx กระบวนการนี้นำไปสู่ความเครียดออกซิเดชัน [31] ซึ่งมีบทบาทสำคัญในสาเหตุและความก้าวหน้าของความผิดปกติของระบบประสาทส่วนใหญ่ สอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้ เราสังเกตเห็นระดับ ROS ที่เพิ่มขึ้น เอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระภายในเซลล์ลดลง และเพิ่มการตายของเซลล์ PC12 หลังการรักษาด้วย H2O2 การปรับสภาพด้วย PhGs ได้ลดทอนการเพิ่มขึ้นของ ROS ภายในเซลล์ที่เกิดจาก HzOz อย่างมีนัยสำคัญ ปรับปรุงเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระภายในเซลล์ และทำให้ความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจาก HzOz ในเซลล์ PC12 ลดลงในที่สุด
กวง et al. [32] รายงานว่า echinacoside แสดงผลทางประสาทที่มีนัยสำคัญต่อความเป็นพิษต่อเซลล์ของ H2O2-ในเซลล์ PC12 ผ่านทางวิถีอะพอพโทติกของไมโตคอนเดรีย ในการศึกษานี้ เราพบว่า echinacoside, salidroside, acteoside และ isoacteoside แสดงผลทางประสาทโดยการเพิ่มฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของเซลล์ PC12 เนื่องจากเพิ่มการกระตุ้นการถอดรหัสของ Nrf2 และเพิ่มการควบคุมการแสดงออกของโปรตีนปลายน้ำของ H2O-1, NQO1 GCLC และ GCLM การศึกษาจำนวนมากแสดงให้เห็นอย่างชัดเจนว่าการกระตุ้นยีนเป้าหมาย Nrf2 โดยเฉพาะอย่างยิ่ง HO-1 ในแอสโตรไซต์และเซลล์ประสาทสามารถป้องกันการอักเสบ ความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน และการตายของเซลล์ได้อย่างมาก มีรายงานว่าระบบ HO-1 มีบทบาทอย่างมากในระบบประสาทส่วนกลาง และดูเหมือนว่าการมอดูเลตนั้นมีบทบาทสำคัญในการก่อโรคของความผิดปกติของระบบประสาท [33] การศึกษาล่าสุดยังชี้แจงบทบาทของ Nrf2 ในความก้าวหน้าและความเสี่ยงของ PD [9] และ Keap1 เป็นเป้าหมายที่มีประสิทธิภาพสำหรับการเปิดใช้งาน Nrf2 อีกครั้งใน AD [34] ผลลัพธ์ดังกล่าวสนับสนุนหลักฐานใหม่สำหรับ Nrf2 ว่าเป็นเป้าหมายในการรักษาโรคทางระบบประสาท
การวิเคราะห์การเทียบท่าระดับโมเลกุลแสดงให้เห็นว่า PhGs สามารถจับกับ Keap1 ด้วยความสามารถในการจับดังต่อไปนี้: echinacoside > isoacteoside > acteoside > salidroside สอดคล้องกับผลลัพธ์เหล่านี้ การปรับสภาพของ PhGs นำไปสู่การเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ Nrf2 ด้วยการแสดงออกของ Nrf2 ในนิวเคลียสต่อไปนี้: echinacoside > isoacteoside * acteoside > salidroside เราคิดว่าจำนวนของไกลโคไซด์ส่งผลต่อโหมดการจับที่เป็นไปได้ของ PhGs และ Keap1 และโหมดการจับทำให้เกิดการปลดปล่อย Nrf2 จาก Keap1 ต่อไป กระบวนการนี้ส่งผลให้เกิดการกระตุ้นของ Nrf2 และยีนดาวน์สตรีม และในที่สุดก็ปกป้องเซลล์ PC12 จากความเครียดออกซิเดชันที่เกิดจาก H2 O2 -
ผลต่อระบบประสาทของ cistancheปริญญาเอก
4. วัสดุและวิธีการ
4.1. สารประกอบทางเคมีและรีเอเจนต์
Salidroside (CAS No. {{0}}), acteoside (CAS No. 61276-17-3), isoacteoside (CAS No. 61303-13-7) และ echinacoside (CAS No. {{3} }) ถูกซื้อจาก YYuanye Biotechnology Company (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) PhGs ถูกละลายใน PBS เพื่อผลิตสารละลายสต็อก 10 มก./มล. ซึ่งถูกเก็บไว้ที่ -20 องศา ซื้อ H2O2 จาก Aladdin® (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) RPMI-1640 ซีรั่มโคนมและทารกในครรภ์ถูกซื้อจากไฮโคลน (โลแกน รัฐยูทาห์ สหรัฐอเมริกา) และซื้อทริปซิน EDTA เพนิซิลลิน และสเตรปโตมัยซิน 0.5 เปอร์เซ็นต์จากเคอิ (หางโจว ประเทศจีน) MDA, ชุดตรวจวินิจฉัย SOD, MTT และ DCFH-DA ถูกซื้อจากสถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Beyotime (หนานจิง มณฑลเจียงซู ประเทศจีน) Annexin V-FITC/PI double staining Kit ซื้อมาจาก Solarbio Life Sciences (ปักกิ่ง ประเทศจีน) ซื้อแอนติบอดีต่อ Nrf2, Histone H3, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM และ p-actin, IgG ต้านหนู-พืชชนิดหนึ่ง (HRP) และสารต้านกระต่าย-HRP-IgG จาก Abcam (ลอนดอน สหราชอาณาจักร). ซื้อสารยับยั้ง HO-1 และ ZnPP จาก Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) ซื้อ RNAiso Plus, PrimeScript™ RT reagent Kit พร้อม gDNA Eraser และ SYBR® Premix Ex Taq™ II จาก Takara (เมืองชิงะ ประเทศญี่ปุ่น) ซื้อ Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent จาก Thermo Fisher Scientific (Waltham, UK) ลำดับ Nrf2 siRNA มีดังนี้: ไปข้างหน้า CCGAAUUACAGUGUCUCUUA; และย้อนกลับ UUAAGACACUGUAAUUCGG ในขณะเดียวกัน ลำดับ siRNA ควบคุมมีดังนี้: ไปข้างหน้า UUCUCCGAACGUGUCACGU; และย้อนกลับ ACGUGACACGUUCGGAGAA
4.2. การเพาะเลี้ยงเซลล์
สาย pheochromocytoma ต่อมหมวกไตของเมาส์ (เซลล์ PC12) ได้รับจากสถาบันชีวเคมีและเซลล์ชีววิทยา SIBS (CAS เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) เซลล์ถูกคงรักษาไว้ใน RPMI-1640 (Hyclone) ที่มี 10 เปอร์เซ็นต์ของซีรัมของวัวในครรภ์ (Hyclone), 100 U/mL เพนิซิลลินและ 0.1 มก./มล. สเตรปโตมัยซินที่ 37 องศาโดยมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์ สื่อถูกเปลี่ยนวันเว้นวัน
4.3. การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์
เซลล์ PC12 ถูกเพาะในเพลต 96-หลุมที่ 2 x 104 เซลล์/หลุม หลังจากการยึดติด เซลล์ถูกบ่มล่วงหน้าโดยมีหรือไม่มีตัวยับยั้งเป็นเวลา 20 นาที บ่มโดยมีหรือไม่มี PhG เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และจากนั้นบ่มด้วย H2O2 อีก 2 ชั่วโมงหลังจากที่ PhG ถูกกำจัดออก หลังจากการฟักไข่ เซลล์ถูกบำบัดด้วย MTT 5 มก./มล. เป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่ 37 องศา และตัวกลางถูกกำจัดออกอย่างระมัดระวัง ผลึกฟอร์มาซานที่ก่อตัวขึ้นโดยเซลล์ที่รอดตายถูกละลายใน DMSO 150 rL เพื่อสร้างสีน้ำเงิน [35] และการดูดกลืนแสงถูกวัดที่ 570 นาโนเมตรบนเครื่องอ่านเพลต กลุ่มควบคุมใช้สื่อที่มีความเข้มข้นเท่ากันกับ DMSO เพียงอย่างเดียว ความมีชีวิตของเซลล์ถูกทำให้เป็นมาตรฐานเป็นเปอร์เซ็นต์ของกลุ่มควบคุม
ความเข้มข้นของ PhGs (0.1,1,5 และ 10 Rg/mL) ถูกเลือกโดยขึ้นอยู่กับการวิเคราะห์ความเป็นพิษต่อเซลล์ของ PhGs และรายงานผลการป้องกันเซลล์ของเอไคนาโคไซด์ [32] ตามรายงาน ไม่มีผลต่อความเป็นพิษต่อเซลล์ที่แสดงด้านล่าง 10 Rg/mL และรายงานว่าอิชินาโคไซด์แสดงผลต่อเซลล์ในแบบจำลองเซลล์ที่ได้รับบาดเจ็บจาก HzOz
4.4. การทดสอบอะพอพโทซิส
ตรวจพบอะพอพโทซิสด้วย Annexin V-FITC/PI double staining Kit (Solarbio) เซลล์ PC12 ถูกเพาะในเพลต 6-หลุมที่ 2 x 105 เซลล์/หลุม หลังจากการยึดติด เซลล์ถูกบำบัดด้วย PhG (0.1 และ 10 Rg/mL) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและบ่มด้วย H2O2 เป็นเวลา 2 ชั่วโมงหลังจากที่ PhG ถูกกำจัดออก หลังจากการฟักไข่ เซลล์ถูกล้างใน PBS เย็น หมุนเหวี่ยงสองครั้งที่ 1500 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที และแขวนลอยใหม่อีกครั้งใน 500 rL ของบัฟเฟอร์การจับ Annexin V ที่ติดฉลาก FITC (5 rL) และโพรพิเดียมไอโอไดด์
ตัวย่อ
GCLC กลูตาเมต-ซิสเทอีน ลิเกส-ตัวเร่งปฏิกิริยาหน่วยย่อย
GCLM กลูตาเมต-ซิสเทอีน ไลกาส-ตัวเร่งปฏิกิริยา subunit
ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ H2O2
H2O-1 heme oxygenase 1
Keap1 Kelch ECH โปรตีน 1
NQO1 NAD(P)H ควิโนน ออกซิโดเรดักเตส 1
Nrf2 ปัจจัยนิวเคลียร์อีรีทรอยด์ 2-ปัจจัยที่เกี่ยวข้อง 2
PhGs ซาลิโดรไซด์ แอกทิโอไซด์ ไอโซแอคทีโอไซด์ และอิชินาโคไซด์
ROS ออกซิเจนชนิดปฏิกิริยา
ZnPP สังกะสีโปรโตพอร์ไฟริน
สารสกัด Cistanche deserticola: PHG ของ cistanche
อ้างอิง
1. ซัน, AY; Chen, YM ความเครียดออกซิเดชันและความผิดปกติของระบบประสาท เจ. ไบโอเมด. วิทย์. 1998, 5, 401-414. [CrossRef] [PubMed]
2. Maheshwari, A.; ไมโคร, มม.; Aggarwal, A.; ชาร์มา RK; Nandan, D. เส้นทางที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์สืบพันธุ์ของอัณฑะที่เกิดจาก H2O2 ในหลอดทดลอง FEBS J. 2009,276, 870-881. [CrossRef] [PubMed]
3. Halliwell, B. ออกซิเจนชนิดปฏิกิริยาและระบบประสาทส่วนกลาง เจ. นิวโรเคม. 1992, 59,1609-1623. [CrossRef] [PubMed]
4. ริชาร์ดสัน เจเอส; ซับบาเรา, KV; Ang, LC เกี่ยวกับบทบาทที่เป็นไปได้ของการเกิดอนุมูลอิสระที่เกิดจากเหล็กในการเสื่อมสภาพของระบบประสาทในโรคอัลไซเมอร์ แอน. นิวยอร์ก อเคด วิทย์. 1992, 648, 326-327. [CrossRef] [PubMed]
5. Zhang, DD การศึกษากลไกของ Nrf2-เส้นทางการส่งสัญญาณ Keap1 ยาเมตาบ. รายได้ 2549, 38, 769-789 [CrossRef] [PubMed]
6. Itoh, K.; ตอง KI; Yamamoto, M. กลไกระดับโมเลกุลที่กระตุ้น Nrf2-เส้นทาง Keap1 ในการควบคุมการตอบสนองแบบปรับตัวต่ออิเล็กโทรไลต์ ฟรี Radic ไบโอล. เมดิ. 2004, 36,1208-1213. [CrossRef] [PubMed]
7. กง AN; Owuor, E.; ยูอาร์ .; เฮบบาร์, วี.; เฉิน, ค.; หู, ร.; Mandlekar, S. การเหนี่ยวนำของเอนไซม์ซีโนไบโอติกโดยเส้นทางไคเนสของแผนที่และองค์ประกอบการตอบสนองของสารต้านอนุมูลอิสระหรืออิเล็กโตรไฟล์ (ARE/EpRE) ยาเมตาบ. รายได้ 2001, 33, 255-271. [CrossRef] [PubMed]
8. บวนเดีย ฉัน.; มิคาลสกา, พี.; นาวาร์โร อี.; กาเมโร, ฉัน.; Egea, เจ.; Leon, R. Nrf2-คือวิถีทาง: เป้าหมายใหม่ที่ต่อต้านความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการอักเสบของเส้นประสาทในโรคทางระบบประสาท ฟา. เธอ. 2016, 157, 84-104. [CrossRef] [PubMed]
9. สกีบินสกี้, จี.; ฮวัง วี; อันโด DM; Daub, A.; ลี อลาสกา; Ravisankar, A.; Modan, S.; Finucane, MM; โทรม, บริติชแอร์เวย์; Finkbeiner, S. Nrf2 บรรเทา LRRK2- และการเสื่อมสภาพของระบบประสาทที่เกิดจาก a-synuclein โดยการปรับ proteostasis Proc. นัท อคาเด วิทย์. สหรัฐอเมริกา 2016, 114, 1165-1170 [CrossRef] [PubMed]
10. จิเมเนซ ซี.; Riguera, R. Phenylethanoid glycosides ในพืช: โครงสร้างและกิจกรรมทางชีวภาพ. แนท. แยง. ตัวแทน. 1994, 11, 591-606. [CrossRef] [PubMed]
11. Georgiev, M.; Alipieva, K.; Orhan, ฉัน.; Abrashev, R.; เดเนฟ, พี.; Angelova, M. ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและยับยั้ง cholinesterases ของ Verbascum xanthophoeniceum Griseb และฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ของมัน เคมีอาหาร. 2011, 128, 100-105. [CrossRef] [PubMed]
12. หลี่ N.; วังเจ .; หม่า เจ.; Gu, Z.; เจียงซี.; Yu, L.; Fu, X. ผลกระทบต่อระบบประสาทของซิสตันเชส เฮอร์บาการบำบัดในผู้ป่วยโรคอัลไซเมอร์ระดับปานกลาง Evid.-Based Complement. ทางเลือก เมดิ. 2558, 2558,103985. [CrossRef] [PubMed]
13. หลิว วายแอล; เขา WJ; โม, แอล.; ชิ MF; จู้, ปปปป; แพน, ส.; หลี่ XR; Xu, QM; Yang, SL ฤทธิ์ต้านจุลชีพ ฤทธิ์ต้านการอักเสบ และพิษวิทยาของฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์จาก Monochasma savatieri Franch อดีตแม็กซิม เจ. เอธโนฟาร์มาคอล. 2013,149, 431-437. [CrossRef] [PubMed]
14. ดง, คิว; ยาว, เจ.; ฝาง JN; Ding, K. ลักษณะโครงสร้างและฤทธิ์ทางภูมิคุ้มกันของพอลิแซ็กคาไรด์สกัดเย็นสองชนิดจากCistanche Deserticola YC Ma. คาร์โบไฮเดรต ความละเอียด 2007, 342,1343-1349. [CrossRef] [PubMed]
15. Xiong, L.; เหมา, S.; ลู, บี.; หยาง เจ.; โจว, เอฟ.; หูย.; เจียง, วาย.; เซิน ซี.; Zhao, Y. Osmanthusfragrans Flower Extract และ Acteoside ป้องกันริ้วรอยที่เกิดจาก d-Galactose ในรูปแบบเมาส์ ICR เจ เมด อาหาร 2016, 19, 54-61. [CrossRef] [PubMed]
16. เจียง วาย.; เหมา, S.; หวาง W.; ลู, บี.; Cai, Z .; โจว, เอฟ.; หลี่, ม.; ลู, ต.; Zhao, Y. โปรไฟล์ Phenylethanoid Glycoside และกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระของ Osmanthusfragrans Lour ดอกไม้ตาม UPLC/PDA/MS และแบบจำลองการย่อยอาหารจำลอง เจ. อากริก. เคมีอาหาร. 2016, 64, 2459-2466. [CrossRef] [PubMed]
17. หลี่ X.; ครับ X.; หลี่ X .; ซัน, X.; เหลียง, คิว.; เต๋า, ล.; คัง, X.; Chen, J. Salidroside ปกป้องจากการตายแบบอะพอพโทซิสที่เกิดจาก MPP plus ในเซลล์ PC12 โดยการยับยั้งวิถี NO ความละเอียดของสมอง 2011,1382, 9-18. [CrossRef] [PubMed]
18. จางแอล.; ดิง, ว.; ซัน, เอช.; โจว Q.; หวางเจ .; หลี่ X .; Xie, Y.; Chen, J. Salidroside ปกป้องเซลล์ PC12 จากกระบวนการอะพอพโทซิสที่เกิดจาก MPP บวกด้วยการเปิดใช้งานวิถีทาง PI3K/Akt เคมีอาหาร. ท็อกซิคอล 2012, 50, 2591-2597. [CrossRef] [PubMed]
19. เซิง GQ; จาง เจอาร์; ปู, XP; หม่า เจ.; Li, CL ผลการป้องกันของ verbascoside ต่อ 1-methyl-4- ความเป็นพิษต่อระบบประสาทที่เกิดจากฟีนิลไพริดิเนียมไอออนในเซลล์ PC12 ยูโร เจ. ฟาร์มาคอล. 2002, 451,119-124. [ข้ามอ้างอิง]
20. วัง H.; Xu, Y.; ยาน เจ.; จ้าว X.; ซัน, X.; จาง, วาย.; กัว เจ.; Zhu, C. Acteoside ปกป้องเซลล์ neuroblastoma SH-SY5Y ของมนุษย์จากการบาดเจ็บของเซลล์ที่เกิดจาก beta-amyloid ความละเอียดของสมอง 2552, 1283, 139-147 [CrossRef] [PubMed]
21. มิน ดี.; จิน YZ; ยง เจ.; เจิ้ง BL; Yao, HW Echinacoside ช่วยชีวิตเซลล์ประสาท SHSY5Y จากการตายของเซลล์ที่เกิดจาก TNFa คาง. ฟา. วัว. 2005, 505,11-18.
22. จ้าว คิว; เกา เจพี; หลี่ WW; Cai, DF Neurotrophic และ neurorescue effects ของ Echinacoside ในรูปแบบเมาส์กึ่งเฉียบพลัน MPTP ของโรคพาร์กินสัน ความละเอียดของสมอง 2010,1346, 224-236. [CrossRef] [PubMed]
23. คู KA; สูง SH; ปาร์ค เจเอช; คิม SH; ลี KY; Kim, YC กิจกรรมป้องกันระบบประสาทในหลอดทดลองของ phenylethanoid glycosides จาก Callicarpa dichotoma แพลนตา เมด. 2005, 71, 778-780. [CrossRef] [PubMed]
24. หลิว วายจี; หลี่ X .; Xiong, C .; ยู, บี.; ปู่ X .; ใช่ XS อนุพันธ์ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์สังเคราะห์เป็นสารป้องกันระบบประสาทที่มีศักยภาพ ยูโร เจ เมด เคมี. 2015, 95, 313-323. [CrossRef] [PubMed]
25. Fu, G.; ปาง, เอช.; Wong, YH phenylethanoid glycosides ที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติ: โอกาสในการใช้ในการรักษาแบบใหม่ สกุลเงิน เมดิ. เคมี. 2008, 15, 2592-2613. [CrossRef] [PubMed]
26. กรีน แอลเอ; Tischler, AS การจัดตั้งกลุ่ม noradrenergic clonal ของเซลล์ pheochromocytoma ต่อมหมวกไตของหนูที่ตอบสนองต่อปัจจัยการเจริญเติบโตของเส้นประสาท Proc. นัท อคาเด วิทย์. สหรัฐอเมริกา 1976, 73, 2424-2428 [CrossRef] [PubMed]
27. เหลียง QN; เซิง วายซี; เจียง, พี.; จิ, LL; เซี่ย YY; มิน, วาย.; Wang, ZT ความแตกต่างของระบบสารต้านอนุมูลอิสระกลูตาไธโอนในตับหนูที่เพิ่งหย่านมและหนูน้อยและการมีส่วนร่วมในความเป็นพิษต่อตับที่เกิดจากไอโซลีน โค้ง. ท็อกซิคอล 2011, 85, 1267-1279. [CrossRef] [PubMed]
28. โคบายาชิ ก.; คัง, ม.; โอกาวะ, เอช.; โอทสึจิ, ม.; เซนเก้, วาย; ชิบะ, ต.; อิการาชิ, K.; Yamamoto, M. Oxidative stress Sensor Keap1 ทำหน้าที่เป็นอะแดปเตอร์สำหรับ Cul3-Based E3 Ligase เพื่อควบคุมการย่อยสลายโปรตีอาโซมของ Nrf2 มล. เซลล์. ไบโอล. 2004,24, 7130-7139. [CrossRef] [PubMed]
29. คอร์นีเลียส ซี.; ครูปิ, อาร์.; Calabrese, วี; กราเซียโน, A.; ไมโลน, พี.; เพนนีซี, จี.; Radak, Z.; Calabrese, EJ; Cuzzocrea, S. บาดแผลที่สมอง: ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการป้องกันระบบประสาท สารต้านอนุมูลอิสระ สัญญาณรีดอกซ์ 2013, 19, 836-853. [CrossRef] [PubMed]
30. โฮ Z.; หลัว, W.; ซัน, X.; เฮา, เอส.; จาง, วาย.; Xu, F.; วัง Z .; Liu, B. น้ำเกลือที่อุดมด้วยไฮโดรเจนช่วยป้องกันความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการขาดดุลทางปัญญาหลังจากได้รับบาดเจ็บที่สมองเล็กน้อย ความละเอียดของสมอง วัว. 2012, 88, 560-565. [CrossRef] [PubMed]
31. อันซารี แมสซาชูเซตส์; โรเบิร์ตส์ KN; Scheff, SW ระยะเวลาของความเครียดออกซิเดชันที่เหนี่ยวนำให้เกิดฟกช้ำและโปรตีน synaptic ในเยื่อหุ้มสมองในแบบจำลองหนู TBI เจ. Neurotrauma 2008, 25, 513-526 [CrossRef] [PubMed]
32. กวง ร.; ซัน, วาย.; หยวน, ว.; เล่ยแอล.; Zheng, X. ผลการป้องกันของ echinacoside ซึ่งเป็นหนึ่งใน phenylethanoid glycosides ต่อความเป็นพิษต่อเซลล์ H2O2- ในเซลล์ PC12 แพลนตา เมด. 2552, 75, 1499-1504 [CrossRef] [PubMed]
33. Scapagnini, G.; Vasto, S.; อับราฮัม NG; คารูโซ, C.; เซลล่า, D.; Fabio, G. Modulation of Nrf2/ARE pathway โดยอาหารโพลีฟีนอล: กลยุทธ์ทางโภชนาการทางโภชนาการสำหรับโรคทางสมองและความผิดปกติของระบบประสาท มล. นิวโรไบโอล. 2011, 44, 192-201. [CrossRef] [PubMed]
34. เคอร์, เอฟ.; Sofolaadesakin, O.; อีวานอฟ, ดีเค; แกตลิฟฟ์ เจ.; โกเมซ, PB; เบอร์ทรานด์ HC; มาร์ติเนซ, พี.; คัลลาร์ด, อาร์.; Snoeren, ฉัน.; Cochem, HM Direct Keap1-การหยุดชะงักของ Nrf2 เป็นเป้าหมายการรักษาที่เป็นไปได้สำหรับโรคอัลไซเมอร์ ป.ล. เจเนท 2017, 13, e1006593. [CrossRef] [PubMed]
35. แฮนเซ่น, MB; นีลเส็น เซาท์อีสต์; Berg, K. ตรวจซ้ำและพัฒนาวิธีการย้อมสีที่รวดเร็วและแม่นยำสำหรับการวัดการเติบโตของเซลล์/การฆ่าเซลล์ เจ. อิมมูนอล. วิธีการ 1989, 119, 203-210 [ข้ามอ้างอิง]
36. กด, C. การตรวจคัดกรองเสมือนในการค้นพบยา; สำนักพิมพ์ Crc: Boca Raton, FL, USA, 2005
37. Muegge ฉัน.; มาร์ติน วายซี; Hajduk, PJ; Fesik, SW การประเมินการให้คะแนน PMF ในการเชื่อมต่อลิแกนด์ที่อ่อนแอกับโปรตีนการจับ FK506 เจ เมด เคมี. 2542, 42, 2498–2503. [CrossRef] [PubMed]
38. คุนซ์ ID; บลานีย์ เจเอ็ม; โอ๊ตลีย์ เอสเจ; แลงกริด, อาร์.; Ferrin, TE วิธีการทางเรขาคณิตเพื่อปฏิสัมพันธ์ระหว่างโมเลกุลขนาดใหญ่และลิแกนด์ เจ โมล. ไบโอล. 1982,161, 269-288. [ข้ามอ้างอิง]
39. นพ. อี.; เมอร์เรย์, CW; ออโต้, TR; เปาลินี, GV; Mee, RP ฟังก์ชันการให้คะแนนเชิงประจักษ์: I. การพัฒนาฟังก์ชันการให้คะแนนเชิงประจักษ์อย่างรวดเร็วเพื่อประเมินความสัมพันธ์ที่มีผลผูกพันของลิแกนด์ในคอมเพล็กซ์ของตัวรับ เจ. Comput.-Aided โมล. เดส 1997,11,425-445.
© 2018 โดยผู้เขียน ผู้ได้รับอนุญาต MDPI, บาเซิล, สวิตเซอร์แลนด์ บทความนี้เป็นบทความแบบเปิดที่เผยแพร่ภายใต้ข้อกำหนดและเงื่อนไขของใบอนุญาต Creative Commons Attribution (CC BY) (http:ZZcreativecommons.org/licenses/byZ4.0Z)
