การติดเชื้อตามธรรมชาติของ Parvovirus ในแมวตกปลาป่า (Prionailurus Viverrinus) เผยให้เห็นการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของไวรัสในไต
Feb 25, 2022
เชิงนามธรรม
Carnivore protoparvovirus-1 (CPPV-1) ซึ่งเป็นไวรัสสายพันธุ์ที่มีไวรัส feline panleukopenia virus (FPV) และ canine parvovirus (CPV) สายพันธุ์ แพร่กระจายอย่างกว้างขวางในหมู่สัตว์กินเนื้อในประเทศและสัตว์ป่าที่ก่อให้เกิดโรคร้ายแรงถึงชีวิต พบแมวประมงป่า (Prionailurus viverrinus) ซึ่งเป็นสายพันธุ์ที่อ่อนแอทั่วโลก ชันสูตรพลิกศพ พบรอยโรคในลำไส้ ม้าม และไต. การระบุแอนติเจน CPPV-1 ในเนื้อเยื่อเหล่านี้ โดยใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) และอิมมูโนฮิสโตเคมี (IHC) สนับสนุนการติดเชื้อโดยไวรัส PCR- และ IHC-positivity ใน เนื้อเยื่อไตเผยให้เห็นการโลคัลไลซ์เซชันของไวรัสที่ผิดปรกติในขณะที่การผสมพันธุ์ในแหล่งกำเนิด (ISH) และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM) ด้วยเทคนิคป๊อปออฟยืนยันคำอธิบายแรกของการแปลไวรัสในไต. การวิเคราะห์ลักษณะจีโนมที่สมบูรณ์และการวิเคราะห์กรดอะมิโนที่อนุมานของ CPPV ที่ได้รับ-1จากแมวตกปลาเปิดเผยว่า FPV เป็นตัวแทนเชิงสาเหตุ ลำดับ FPV ที่ตรวจพบแสดงให้เห็นการกลายพันธุ์ของกรดอะมิโนที่ I566M และ M569R ในโปรตีนแคปซิด การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการและวิวัฒนาการของลำดับจีโนมการเข้ารหัสที่สมบูรณ์เปิดเผยว่าจีโนม CPPV-1 ของแมวตกปลานั้นจัดกลุ่มทางพันธุกรรมกับจีโนม FPV ที่แยกได้จากแมวบ้านในประเทศไทย ตั้งแต่ปี 1970 เป็นต้นมา จีโนมเหล่านี้ได้แสดงให้เห็นแล้วว่ามีการวิวัฒนาการทางพันธุกรรมร่วมกับสายพันธุ์ FPV ของจีน การศึกษานี้เป็นหลักฐานแรกของการติดเชื้อ CPPV-1 ในแมวตกปลา และเป็นครั้งแรกที่แสดงให้เห็นถึงการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นในไต. การค้นพบนี้สนับสนุนช่วงที่มีหลายโฮสต์ของไวรัสพาร์โวนี้ และแนะนำว่าการติดเชื้อ CPPV-1 ที่ร้ายแรงอาจส่งผลให้สัตว์กินเนื้อในป่าเสี่ยงภัยอื่นๆ
คำสำคัญ: เนื้อเยื่อไต; โรคไต ไต ไต ท่อไต
บทนำ
สกุล Prionailurus ในวงศ์ Felidae จัดอยู่ในกลุ่มแมวป่าด่างขนาดเล็กที่มีถิ่นกำเนิดในเอเชีย [1] สกุล Prionailurus ประกอบด้วยแมวป่า 4 สายพันธุ์ที่รู้จักอย่างเป็นทางการ ได้แก่ แมวเสือดาว (P. bengalensis) แมวหัวแบน (P. planiceps) แมวที่มีคราบสนิม (P. rubiginosus) และแมวตกปลา (P. viverrinus) [2]. แมวตกปลาส่วนใหญ่อาศัยอยู่ในบริเวณหนองน้ำและป่าชายเลน มันอาศัยอยู่เฉพาะในเอเชียใต้และเอเชียตะวันออกเฉียงใต้และแพร่หลายมากขึ้นในประเทศไทย [3, 4] ปัจจุบัน ประชากรแมวตกปลากำลังถูกคุกคามเนื่องจากพื้นที่ชุ่มน้ำที่พวกมันอาศัยอยู่ถูกทำลายลงในช่วงทศวรรษที่ผ่านมา ด้วยเหตุนี้ สายพันธุ์นี้จึงถือว่าอ่อนแอและอยู่ในบัญชีแดงของสหภาพนานาชาติเพื่อการอนุรักษ์ธรรมชาติ (IUNC) [3] เนื่องจากการสูญเสียถิ่นที่อยู่ของพวกมัน อาณานิคมของแมวประมงมีการอพยพและบางครั้งอาศัยอยู่ในพื้นที่ที่สัตว์เลี้ยงและมนุษย์อาศัยอยู่ [5] ปรากฏการณ์ของสภาพแวดล้อมที่ใช้ร่วมกันนี้อาจนำไปสู่การแพร่กระจายของเชื้อโรคที่เพิ่มขึ้นระหว่างสัตว์ป่าและสัตว์เลี้ยงที่อ่อนแอและในทางกลับกัน รายงานการระบาดร้ายแรงในสัตว์ป่าหรือสัตว์เลี้ยงที่อาจเป็นผลมาจากการแพร่กระจายของเชื้อโรคได้รับการบันทึกไว้ในช่วงสองสามทศวรรษที่ผ่านมา [6–9] ดังนั้นควรตรวจสอบพลวัตการแพร่เชื้อของเชื้อโรคจากสัตว์เหล่านั้นและจำเป็นต้องตรวจสอบเพิ่มเติม
CISTANCHE จะปรับปรุงการทำงานของไต/ไต
โปรโตพาร์โวไวรัสที่กินเนื้อเป็นอาหาร-1 (CPPV-1), ไวรัสสายพันธุ์รวมถึงไวรัสมิงค์ลำไส้อักเสบ (MEV), แรคคูนพาร์โวไวรัส (RPV), ไวรัสแพนลิวโคพีเนียในแมว (FPV) และสายพันธุ์ของพาร์โวไวรัสในสุนัข (CPV) ได้รับการยอมรับว่าเป็นเชื้อก่อโรคที่สำคัญที่เกี่ยวข้องกับโรคร้ายแรงทั้งในครอบครัว Canidae และ Felidae ทั้งในป่าและในประเทศ [10, 11] FPV ซึ่งเป็นเชื้อก่อโรคทั่วไปในสายพันธุ์ Felidae ถูกตั้งสมมติฐานว่าเป็นบรรพบุรุษร่วมของ CPV [12–14] CPV มักแพร่ระบาดในสัตว์ในตระกูล Canidae และมีหลักฐานการติดเชื้อเพิ่มขึ้นในวงศ์ Felidae [9, 15, 16] ก่อนหน้านี้ FPV และ CPV ถูกตั้งสมมติฐานว่าเป็นไวรัสที่จำกัดโฮสต์ อย่างไรก็ตาม ผลการวิจัยหลายชิ้นระบุในเวลาต่อมาว่าสัตว์บางชนิดในวงศ์ Canidae อาจมีบทบาทเป็นแหล่งกักเก็บ FPV หรือในทางกลับกัน [11, 17, 18] นอกจากนี้ รายงานหลายฉบับระบุว่าตัวแปร FPV และ CPV (CPV-2a, -2b และ -2c) แชร์โฮสต์ที่อ่อนแอ โฮสต์เหล่านี้ไม่เพียงแต่เป็นสัตว์เลี้ยงเท่านั้น แต่ยังเป็นสัตว์กินเนื้อหลายชนิดอีกด้วย [15, 19, 20] ซึ่งบ่งชี้ถึงช่วง CPPV ที่มีโฮสต์หลายตัว-1 [11]
ตั้งแต่ปี พ.ศ. 2539 ถึง พ.ศ. 2540 ได้มีการตรวจพบสายพันธุ์ CPV ในแมวเสือดาวและในขั้นต้นถูกกำหนดให้เป็นไวรัสพาร์โวแมวเสือดาว (LCPV) ซึ่งเป็นการแนะนำคำอธิบายแรกของ CPPV-1 ในสกุล Prionailurus [21, 22] สายพันธุ์ LCPV เหล่านี้บางสายพันธุ์ถูกเปิดเผยว่ามีความแตกต่างทางพันธุกรรมจาก CPV-2a และ -2b ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้เนื่องจากการกลายพันธุ์ของกรดอะมิโน G300A ในโปรตีนแคปซิด (VP) ส่งผลให้มีการเปลี่ยนแปลงคุณสมบัติของแอนติเจนซึ่งขณะนี้ใช้เป็นจุดการกลายพันธุ์ที่ไม่ซ้ำกันเพื่อแยกความแตกต่างของ CPV-2c จากตัวแปร CPV อื่นๆ [22] การค้นพบตัวแปร CPV ใหม่ (ปัจจุบันรู้จักกันในชื่อ CPV-2c) ในแมวเสือดาวสนับสนุนแนวคิดเรื่องวิวัฒนาการร่วมกันของ CPPV-1 ในบรรดาสัตว์ต่างๆ ต่อมามีรายงานการติดเชื้อของสายพันธุ์ FPV และ CPV ในแมวเสือดาว [9] สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าสายพันธุ์อื่นในสกุลเดียวกับแมวเสือดาว (สกุล Prionailurus) อาจไวต่อการติดเชื้อ CPPV-1 จนถึงปัจจุบัน ความไวต่อการติดเชื้อ CPPV-1 ในสายพันธุ์อื่นในสกุล Prionailurus ยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด การถอดรหัสว่าตัวแปร CPPV-1 มีการพัฒนาอย่างไรและรูปแบบใหม่ที่เกิดขึ้นใหม่มีพฤติกรรมอย่างไร อาจช่วยอธิบายวิธีป้องกันการระบาดของตัวแปรใหม่ที่อาจเกิดขึ้นได้ แม้ว่าไวรัสตัวใหม่จะมีระยะโฮสต์ที่กว้างขึ้น การระบาดที่ร้ายแรงหรือรอยโรคที่ผิดปกติที่เกี่ยวข้องกับการติดเชื้อก็อาจพบได้ในโฮสต์ใหม่ที่อ่อนแอ การศึกษานี้อธิบายการติดเชื้อ CPPV-1 ที่ร้ายแรงในแมวประมงป่า (Prionailurus viverrinus) ลักษณะทางพันธุกรรมของ CPPV ที่ได้รับ-1 เผยให้เห็น FPV เป็นตัวแทนเชิงสาเหตุ การค้นพบนี้เป็นหลักฐานแรกของการติดเชื้อ FPV ในสปีชีส์นี้ และเผยให้เห็นเซลล์เขตร้อนที่มีลักษณะเฉพาะของไวรัสนี้ การชี้แจงเพิ่มเติมของการติดเชื้อ FPV และความหลากหลายของสายพันธุ์ในสายพันธุ์นี้เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับบัญชีสำหรับการติดเชื้อทั่วโลกในสายพันธุ์ที่อ่อนแอจำนวนมาก
วัสดุและวิธีการ
การตรวจสัตว์และชันสูตรพลิกศพตามปกติในเดือนมิถุนายน 2562 แมวประมงป่าสองตัว (P. viverrinus) กำหนดกรณีหมายเลข พบผู้เสียชีวิต 1 และ 2 ราย ในเขตชานเมือง จังหวัดนครราชสีมา ประเทศไทย ต่อมาในเดือนสิงหาคม พ.ศ. 2562 แมวตกปลาอีกตัวหนึ่ง กำหนดเป็นกรณีที่. 3 ได้รับการช่วยเหลือจากพื้นที่ที่พบแมวตกปลาสองตัวแรก เนื่องจากความรุนแรงของภาวะขาดน้ำ กรณีที่ 3 เสียชีวิตระหว่างการส่งต่อไปยังโรงพยาบาลสัตว์ แมวตกปลาทั้งสามตัวนี้ถูกส่งไปทำการชันสูตรพลิกศพตามปกติ น่าเสียดายที่ไม่มีตัวอย่างสัตว์เลี้ยงที่เดินเตร็ดเตร่หรือสัตว์ป่าที่อาศัยอยู่ในพื้นที่เดียวกัน จึงไม่รวมอยู่ในการศึกษาครั้งนี้ การตรวจชันสูตรพลิกศพเป็นประจำสำหรับแมวประมงทุกตัว เลือกอวัยวะสำคัญ ได้แก่ ปอด ตับ หัวใจ ม้าม และไตสุ่มตัวอย่างจากแมวตกปลาทั้งหมด ในขณะที่ลำไส้และต่อมน้ำเหลืองในลำไส้ถูกเก็บเพิ่มเติมจากแมวตกปลาที่ 3 เนื้อเยื่อที่เลือกทั้งหมดถูกส่งสำหรับการตรวจเนื้อเยื่อและเก็บตัวอย่างเป็นรายบุคคลเพื่อการวิเคราะห์ระดับโมเลกุลต่อไป สำหรับเนื้อเยื่อวิทยา เนื้อเยื่อถูกแช่ในฟอร์มาลินที่บัฟเฟอร์เป็นกลาง 10 เปอร์เซ็นต์ (v/v) เป็นเวลาอย่างน้อย 24 ชั่วโมงและผ่านการประมวลผลเป็นประจำ จากนั้นจึงย้อมด้วยฮีมาทอกซิลินและอีโอซิน
(H&E) โดยใช้ขั้นตอนมาตรฐานก่อนการตรวจสอบโดยนักพยาธิวิทยาทางสัตวแพทย์ที่ผ่านการรับรองจากคณะกรรมการ ACVP (TK) ตัวอย่างเนื้อเยื่อสดที่ได้จากแมวตกปลาทั้งสามตัวถูกเก็บไว้ที่ –80˚C สำหรับการศึกษาระดับโมเลกุล ขั้นตอนทั้งหมดดำเนินการตามแนวทางและระเบียบตามความเห็นชอบของคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์แห่งจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย (ฉบับที่ 1931036)
การทดสอบโมเลกุลทางไวรัสวิทยาทั่วไปตัวอย่างเนื้อเยื่อสด ได้แก่ หัวใจ ปอด ตับ ม้าม และไตของแมวตกปลาทั้งหมด รวมทั้งเนื้อเยื่อของต่อมน้ำเหลืองในลำไส้และลำไส้เล็กของแมวตกปลา 3 ถูกสกัดด้วยกรดนิวคลีอิกของไวรัสโดยการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันทีละตัวด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 1 เปอร์เซ็นต์ (v/v) (PBS) ต่อจากนั้น สกัดกรดนิวคลีอิกของไวรัสทั้งหมดโดยใช้ชุดเครื่องมือสกัดกรดนิวคลีอิกจากไวรัสเชิงพาณิชย์ II (Geneaid, ไทเป, ไต้หวัน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต จากนั้น กรดนิวคลีอิกที่สกัดออกมาจะมีคุณสมบัติและหาปริมาณโดยอัตราส่วนการดูดกลืนแสง A260/A280 โดยใช้วิธีสเปกโตรโฟโตเมตรี (NanoDrop, Thermo Scientific™, Waltham, MA, USA) กรดนิวคลีอิกที่สกัดทั้งหมดได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติมจากโมเลกุลของไวรัสโดยใช้การวิเคราะห์ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) กับแผงทดสอบ PCR ในกลุ่ม pan-virologic-family หลายชุด รวมถึงการตรวจหาไวรัสเริม [23], paramyxovirus [24], pneumovirus [25], calicivirus [26], ไวรัสไข้หวัดใหญ่ [27], โบคาไวรัส [26, 28], พาร์โวไวรัส [29] และไวรัสโคโรนา [30, 31] โปรโตคอล PCR รีเอเจนต์ สภาวะการวน และการควบคุมเชิงบวก/เชิงลบที่ใช้ในปฏิกิริยามีอธิบายไว้ในไฟล์ S1 การตรวจหา PCR ที่จำเพาะของยีน glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) ของแมวถูกใช้เป็นตัวควบคุมภายในตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [32] ต่อจากนั้น แอมพลิคอน PCR ที่เป็นบวกถูกแสดงภาพโดยใช้แพลตฟอร์มอิเล็กโตรโฟรีซิส QIAxcel (Qiagen, Hilden, Germany) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [33] แอมพลิคอนเชิงบวกของการทดสอบ PCR แต่ละครั้งได้รับการทำให้บริสุทธิ์และอยู่ภายใต้การจัดลำดับ Sanger แบบสองทิศทาง (Macrogen Inc, โซล, เกาหลีใต้) เนื่องจากการแยกเนื้อเยื่ออัตโนมัติในระดับปานกลาง จึงไม่สามารถทำการตรวจสอบแบคทีเรียในแมวประมงเหล่านี้ได้
การตรวจหา CPPV ในแหล่งกำเนิด-1โดยใช้อิมมูโนฮิสโตเคมี (IHC) การผสมพันธุ์ในแหล่งกำเนิด (ISH) และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM)
การตรวจคัดกรองระดับโมเลกุลทางไวรัสวิทยาเบื้องต้นเผยให้เห็นแอมพลิคอนเชิงบวกของ pan-parvovirus PCR และผลการจัดลำดับยังแสดงลำดับ DNA ที่เป็นไปได้ของ CPPV-1 การค้นพบนี้กระตุ้นให้เรายืนยันการมีอยู่ของ CPPV-1 เพิ่มเติม และเพื่อกำหนดการกระจายของ CPPV-1 ในเนื้อเยื่อของแมวที่ตกปลา เนื้อเยื่อฝังพาราฟินตรึงฟอร์มาลิน (FFPE) ได้แก่ ปอด ตับ หัวใจ ม้ามไตและลำไส้อยู่ภายใต้การตรวจหา CPPV-1 IHC โดยใช้โมโนโคลนัลแอนติ-canine parvovirus แอนติบอดีของหนูเมาส์ (ab59832, Abcam, Cambridge, UK) ด้วยระบบตรวจจับฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส (HRP) (EnVision polymer, Dako, Glostrup, Denmark) . โดยสังเขป ส่วน FFPE ถูกตัดให้มีความหนา 4-μm และทำให้ปราศจากพาราฟินเพิ่มเติมและนำความชื้นกลับมาใช้ใหม่ จากนั้นสไลด์จะถูกปรับสภาพก่อน เปอร์ออกซิเดสภายนอกจะถูกบล็อกและประมวลผลตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [11] ส่วนของเนื้อเยื่อลำไส้ของแมวที่ติดเชื้อ FPV และสุนัขที่ติดเชื้อ CPV ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก ในขณะที่ส่วนเดียวกันนั้นฟักด้วย IgG ของหนูแพะและกระต่ายบริสุทธิ์ (IHC universal negative control reagent, code ADI-950-231-0025, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ ว่าด้วยเรื่องไตเนื้อร้ายท่ออยู่ในพื้นที่ที่สังเกตสัญญาณบวกของ CPPV-1 IHC, theไตส่วนของแมวตกปลาทั้งหมดได้รับการย้อมสีพิเศษจาก Periodic AcidSchiff (PAS) เพื่อแสดงโครงสร้างเซลล์ของไตเนื้อเยื่อ
CISTANCHE จะปรับปรุงโรคไต/โรคไต
นอกจากนี้ FFPEไตส่วนของแมวตกปลา nos. 1 และ 3 ได้รับการวิเคราะห์ ISH และ TEM เพื่อสนับสนุนผลลัพธ์ของการย้อมสี CPPV-1 IHC ที่เป็นบวก และเพื่อแสดงให้เห็นโครงสร้างพิเศษของอนุภาคไวรัสในเนื้อเยื่อไตตามลำดับ สำหรับ ISH นั้น CPPV-1 DNA probe ครอบคลุม 393 bp [34] ของยีน capsid ของ CPPV-1 ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) ตาม คำแนะนำของผู้ผลิต ปฏิกิริยาและสภาวะของวงจรความร้อนได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [34] โดยมีข้อยกเว้นโดยใช้โอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่ติดฉลากดิจอกซิเจนิน (DIG) โพรบไฮบริไดเซชันที่สร้างขึ้นถูกแสดงภาพและยืนยันโดยความละเอียดของขนาดที่ 1.5 เปอร์เซ็นต์ (w/v) agarose gel electrophoresis ISH ที่มี chromogenic DNA ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [26] โดยมีการดัดแปลงเล็กน้อย โดยสังเขป หลังจากการดีพาราฟินไลเซชัน การคืนน้ำ และการชะล้างที่ตามมาใน PBS สไลด์ FFPE ที่มีความหนา 4-ไมโครเมตรถูกย่อยด้วยการย่อยโปรตีน การตรึงหลังการตรึง และพรีไฮบริไดเซชัน จากนั้น สไลด์ถูกไฮบริไดซ์กับโพรบ ISH ขนาด 25 ng/μL ที่ 42˚C ค้างคืน สัญญาณไฮบริไดเซชันถูกมองเห็นได้โดยการจับคู่กับ 100 ไมโครลิตรของชิ้นส่วนต้าน DIG-AP Fab (โรช, บาเซิล, สวิตเซอร์แลนด์) (1:200 ใน 1X Blocking solution) ร่วมกับ Liquid Permanent Red (LPR) (Dako, Glostrup, Denmark) . จากนั้นจึงทาสีสไลด์ด้วยฮีมาทอกซิลิน ตกตะกอนสีแดงในความสัมพันธ์ของสัณฐานวิทยาของเซลล์คิดว่าเป็นผลบวกต่อ ISH สำหรับการควบคุมเชิงลบ ใช้โพรบไวรัสทะเลสาบปลานิล (TiLV) [35] แทนโพรบ CPPV-1 ตัวอย่าง TEM จัดทำขึ้นตามเทคนิคการลอกออกด้วยการดัดแปลง [36–38] และย้อมด้วยโลหะหนักตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [39, 40] โครงสร้างพื้นฐานได้รับการตรวจสอบโดยใช้ TEM (HT7800; Hitachi, Tokyo, Japan) ที่ทำงานที่ 80 kV
ลักษณะทางพันธุกรรมแบบเต็มความยาวของ CPPV ของแมวตกปลา-1เนื่องจากผลของการตรวจ PCR ไวรัสและการตรวจคัดกรอง IHC สอดคล้องกัน และผลลัพธ์ของลำดับจีโนม VP-2 บางส่วนที่ได้รับจาก PCR ของ pan-parvoviral ได้เสนอแนะความคล้ายคลึงกันทางพันธุกรรมระหว่างจำนวนผู้ป่วย 1 & 2 แต่ไม่ใช่สำหรับกรณีที่ 3 เราได้ระบุลำดับ CPPV-1 แบบเต็มความยาวเพิ่มเติมจากแมวตกปลาเหล่านี้ (กรณีที่ 1 และ 3) และจำแนก CPPV-1 แหล่งกำเนิดโดยใช้ ชุดไพรเมอร์คู่ที่เสื่อมโดยเฉพาะสำหรับ FPV และ CPV ที่ดึงมาจากสิ่งพิมพ์ก่อนหน้า [26] โดยสังเขป กรดนิวคลีอิกที่สกัดได้จากม้ามและไตของแมวตกปลาสองตัวบวกเนื้อเยื่อลำไส้เพิ่มเติมของแมวตกปลาหมายเลข 3 ถูกขยายทีละส่วนโดยใช้ GoTaq1 Hot Start Green Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) และไพรเมอร์เฉพาะ (ไฟล์ S1) เงื่อนไข PCR ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้แล้ว [26] แอมพลิคอนเป้าหมายถูกมองเห็นโดยใช้ 2 เปอร์เซ็นต์ (w/v) agarose gel electrophoresis และถูกทำให้บริสุทธิ์เพิ่มเติมโดยใช้ชุดสกัด Monarch DNA Gel (New England Biolab, แฟรงก์เฟิร์ต, เยอรมนี) ก่อนการจัดลำดับ Sanger เชิงพาณิชย์ ลำดับจีโนมที่สมบูรณ์ของ CPPV-1 ที่แยกได้จากแมวตกปลาสองตัวถูกฝากไว้ใน GenBank (หมายเลขภาคยานุวัติ MW145540-MW145541)
การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการ การรวมตัวกันใหม่ และวิวัฒนาการของ CPPV ของแมวตกปลา-1 ลำดับจีโนมแบบเต็มความยาวของสายพันธุ์ CPPV ของแมวตกปลา-1 ถูกจัดวางให้สอดคล้องกับลำดับ CPPV-1 ที่สมบูรณ์ที่เผยแพร่ซึ่งได้จากสปีชีส์ต่างๆ มีให้ใน GenBank โดยใช้ MAFFT V. 7 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) และซอฟต์แวร์ MEGA7 (http://www.megasoftware.net) การจัดตำแหน่งตามลำดับจึงอยู่ภายใต้การสร้างต้นไม้สายวิวัฒนาการ แผนผังสายวิวัฒนาการถูกสร้างขึ้นโดยใช้วิธีความเป็นไปได้สูงสุด (ML) ด้วยโมเดล Hasegawa–Kishino–Yano พร้อมการกระจายแกมมา (HKY plus G) ซึ่งได้รับการคัดเลือกโดยใช้อัลกอริธึมของโมเดล find-best-fit ใน MEGA7 ตามเกณฑ์ข้อมูลแบบเบย์ . ต้นไม้ถูกบูตด้วย 1,{10}} ซ้ำ ความคล้ายคลึงกันของลำดับคู่ระหว่างจีโนม CPPV-1 คำนวณโดยใช้แบบจำลองความน่าจะเป็นแบบผสมสูงสุดและวิเคราะห์ระยะทางวิวัฒนาการของพวกมันใน MEGA7 ข้อมูลระบุนิวคลีโอไทด์ที่เป็นคู่ของเอาต์พุตถูกสร้างขึ้นและแสดงเป็นภาพในรูปแบบ Microsoft Excel (ไฟล์ S2) จากนั้นจึงใช้ลำดับการจัดตำแหน่งเอาต์พุตของ CPPV-1 เป็นเทมเพลตสำหรับการวิเคราะห์การรวมตัวใหม่ของยีนโดยใช้ชุดซอฟต์แวร์สองชุดที่เป็นอิสระทางสถิติ โดยสังเขป การจัดตำแหน่งระบุสายพันธุ์ที่อาจเกิดขึ้นใหม่โดยใช้ซอฟต์แวร์ Recombination Detection Program 4 (RDP4) Package V. Beta 4.94 แบบบูรณาการ และสิ่งนี้ถูกตรวจสอบด้วยแผนภาพความคล้ายคลึงกันและการวิเคราะห์การบูตในซอฟต์แวร์ SimPlot อายุ V 3.5.1 การตั้งค่าโปรแกรมและการตีความผลลัพธ์ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [26, 41]
Fสำหรับการวิเคราะห์วิวัฒนาการของ CPPV ของแมวตกปลา{{0}} ชุดข้อมูลของลำดับจีโนมที่สมบูรณ์ 224 ลำดับซึ่งประกอบด้วยลำดับ FPV-, 6 MEV- และ 192 CPV ทั้งหมดมาจาก 18 ประเทศระหว่างปี 2522 ถึง 2562 จากฐานข้อมูล GenBank การวิเคราะห์เชิงวิวัฒนาการดำเนินการด้วยลำดับ CPPV-1 ที่เป็นไปได้ 2 ลำดับที่ได้จากแมวตกปลาโดยใช้แบบจำลอง Bayesian Markov chain Monte Carlo (BMCMC) ที่นำมาใช้ใน BEAST V. 2.4.8 [42] jModelTest [43] ถูกดำเนินการเพื่อระบุแบบจำลองการแทนที่นิวคลีโอไทด์ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับลำดับการจัดตำแหน่งหลายลำดับ แบบจำลองการทดแทนที่เหมาะสมที่สุดภายใต้แบบจำลองนาฬิกาที่ผ่อนคลายและเข้มงวดของ lognormal ที่ขนาดประชากรคงที่ตามระดับก่อนถูกนำมาใช้เพื่อพิจารณาอัตราการวิวัฒนาการที่หลากหลายระหว่างเชื้อสาย ต้นไม้เส้นขอบฟ้าแบบเบย์ที่ผสานเข้าด้วยกันก่อนหน้าและความถี่พื้นฐานเชิงประจักษ์นั้นได้มาภายใต้โมเดลนาฬิกาที่พอดีที่สุดและเรียกใช้สำหรับ 100 ล้านโซ่ โดยสุ่มตัวอย่างทุกๆ 10 000 รุ่นที่แล้ว โดย 10 เปอร์เซ็นต์แรกจะถูกยกเลิกเมื่อเกิดการเบิร์นอิน การบรรจบกันของพารามิเตอร์ได้รับการยืนยันโดยการคำนวณขนาดตัวอย่างที่มีประสิทธิผลโดยใช้โปรแกรม TRACER V. 1.7.0 [44] ต้นไม้ความน่าเชื่อถือสูงสุดของ clad ถูกใส่คำอธิบายประกอบโดยใช้ TreeAnnotator V. 1.8.3 [42] ต้นไม้สายวิวัฒนาการที่มีการประมาณความแตกต่าง ไทม์ไลน์ตัวแปร ความน่าจะเป็นหลัง และความหนาแน่นหลังสูงสุด 95 เปอร์เซ็นต์ (HPD) ถูกสร้างขึ้นและแสดงโดยใช้ FigTree V. 1.4.3 [45]
การศึกษาย้อนหลังของ CPPV-1 แอนติเจนในสัตว์กินเนื้อสัตว์ป่าเพื่อที่จะสำรวจบทบาทของ CPPV-1 ที่เกี่ยวข้องกับการเจ็บป่วยและการตายโดยไม่ทราบสาเหตุในสัตว์กินเนื้อในป่าในอดีตอันไกลโพ้นและล่าสุด เราได้รวมตัวอย่างสดที่คัดเลือกแล้ว 305 ตัวอย่างสำหรับการสกัดจีโนมและการระบุเป้าหมายของ CPPV{{2} } ยีนแคปซิดตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ตัวอย่างเหล่านี้ได้รับมาตั้งแต่ปี พ.ศ. 2556 ในรูปแบบอุจจาระหรือเนื้อหาในลำไส้ ได้มาจากสัตว์สวนสัตว์ 136 ตัวจาก 27 สายพันธุ์ที่กินเนื้อเป็นอาหาร (ตาราง S1) ผลลัพธ์ ผลการชันสูตรพลิกศพและการแปลเนื้อเยื่อของแมวตกปลา CPPV-1 แมวตกปลาที่ผ่าแล้วทั้งหมดมีความผอมแห้งในระดับปานกลางโดยมีระดับการคายน้ำที่แตกต่างกัน ในขณะที่แมวตกปลา 2 ใน 3 ตัว (กรณีที่ 1 และ 2) มีการย่อยสลายอัตโนมัติในระดับปานกลาง เด่นม้ามและไตแออัดในแมวตกปลาทั้งหมด แมวตกปลาหมายเลข 3 มีแผลขนาดมหึมาของลำไส้อักเสบด้วยโรคหวัดที่มีเนื้อหาเป็นน้ำสีน้ำตาลเหลืองในลูเมนและความแออัดของต่อมน้ำเหลือง mesenteric Histologically ปอดของแมวตกปลา no. 3 เผยให้เห็นความแออัดอย่างรุนแรงด้วยการแทรกซึมของเซลล์โมโนนิวเคลียร์ในถุงลม ตับมีอาการตับอักเสบเฉียบพลันเล็กน้อย โดยมีลักษณะเฉพาะด้วยการแทรกซึมของเซลล์นิวเคลียร์เดี่ยวที่ตับตับอักเสบ พบระดับความแออัดของม้ามที่คล้ายคลึงกันซึ่งมีรูขุมน้ำเหลืองม้ามจำนวนน้อยในแมวที่ตกปลาทั้งหมด ต่อมน้ำเหลืองหมดสภาพและต่อมน้ำเหลืองที่เหลืออยู่ท่ามกลางโครงสร้างม้ามที่ยุบตัวด้วยจำนวนที่เพิ่มขึ้นของม้ามโต trabeculae (รูปที่ 1A) มีเศษ karyorrhectic กระจัดกระจายของลิมโฟไซต์ด้วย
รูปที่ 1 CPPV-1 การติดเชื้อในแมวตกปลา ภาพสาธิต H&E (A, C) และ CPPV-1 IHC (B, D) จากแมวตกปลา (A) ตกปลาแมว no. 1. กระจายม้ามที่แออัดด้วยจำนวนรูขุมน้ำเหลืองที่กระจัดกระจาย ศูนย์กลางของต่อมน้ำเหลืองที่เหลืออยู่มีวัสดุไฟบริล eosinophilic (ไฟบริน) ผสมกับเศษเซลล์เม็ดเลือดขาวที่กระจัดกระจาย (lymphocytolysis) (ภาพประกอบ) จำนวนเซลล์ลิมโฟไซต์เหล่านี้มีจำนวน 5-7 ไมโครเมตรที่มีการรวมตัวภายในนิวเคลียร์แบบเบโซฟิลิกที่ขอบโครมาตินนิวเคลียร์ (ลูกศร) (B) ตกปลาแมว no. 3. การตัดทอนวิลลี่ที่มีสัจจะขยายออกเป็นครั้งคราวซึ่งมีสารโปรตีน eosinophilic และเรียงรายไปด้วยเซลล์เยื่อบุผิวฝังศพใต้ถุนโบสถ์ที่ลดทอนหรือตายลงอย่างเห็นได้ชัด (สิ่งที่ใส่เข้าไป) เซลล์เยื่อบุผิวฝังศพใต้ถุนโบสถ์จำนวนมากเป็น pyknotic และ karyorrhectic และเซลล์ที่หายากมีร่างกายรวม intranuclear basophilic (ลูกศร) ที่คล้ายคลึงกัน (C) ตกปลาแมว no. 1. CPPV-1 immunoreactivity มักพบในไซโตพลาสซึมของเซลล์โมโนนิวเคลียร์ในบริเวณของ splenic lymphoid follicle (D) ตกปลาแมว no. 3. CPPV-1 สัญญาณ IHC ถูกตรวจพบอย่างกระจัดกระจายและสัญญาณอิมมูโนปฏิกิริยาถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นอย่างเด่นชัดในไซโตพลาสซึมของเซลล์เยื่อบุผิวที่เข้ารหัส (สิ่งที่ใส่เข้าไป) แท่งระบุ 25 µm สำหรับ (A) และ 120 µm สำหรับ (B–D)
การสะสมของวัสดุ eosinophilic fibrillar ในใจกลางของรูขุมขนดังกล่าว จำนวนเซลล์ลิมโฟไซต์เหล่านี้มีจำนวน 5-7 ไมโครเมตรที่มีการรวมตัวของเบสโซฟิลิกภายในนิวเคลียร์ที่จำกัดนิวเคลียสโครมาติน การหดตัวของวิลลี่ในลำไส้ด้วยการยุบตัวของโครงสร้างเยื่อเมือกพบได้ในส่วนลำไส้ของแมวตกปลาหมายเลข 3 (รูปที่ 1B) ห้องใต้ดินบางส่วนถูกขยายออกและมีวัสดุที่เป็นโปรตีนอีโอซิโนฟิลิกและถูกเรียงรายไปด้วยเซลล์เยื่อบุผิวฝังศพใต้ถุนโบสถ์ที่ถูกลดทอนอย่างเห็นได้ชัดหรือเป็นเนื้อตาย เซลล์เยื่อบุผิวที่เข้ารหัสลับจำนวนมากมีลักษณะเป็น pyknotic และ karyorrhectic และเซลล์ที่หายากมีส่วนประกอบภายในเซลล์ที่แยกจากนิวเคลียส basophilic ที่คล้ายคลึงกัน CPPV-1 IHC ถูกใช้เพื่อแสดงการมีอยู่ของไวรัสในเนื้อเยื่อและเพื่ออธิบายบทบาททางพยาธิวิทยาของ CPPV-1 ในรอยโรคที่สังเกตพบในการตรวจชันสูตรศพตามปกติ เซลล์โมโนนิวเคลียร์ที่พำนักอยู่ในม้ามเผยให้เห็นอิมมูโนปฏิกิริยาทางภูมิคุ้มกันที่รุนแรงในเชิงบวกของ CPPV-1 ในแมวตกปลาทั้งหมด (รูปที่ 1C) ปฏิกิริยาทางภูมิคุ้มกันยังพบได้ในพลาสซึมส่วนใหญ่ของเซลล์เยื่อบุผิวที่เข้ารหัสลับและเข้ากันได้กับแผลในลำไส้ของแมวตกปลาหมายเลข 3 (รูปที่ 1D) โดยเฉพาะอย่างยิ่งองศาต่างๆของท่อไตvacuolation และ multifocalไตอาการตกเลือดปรากฏชัดในแมวตกปลาทั้งหมด (รูปที่ 2A) บางไตเซลล์เยื่อบุผิวแบบท่อมีภาวะ hypereosinophilic ที่มีนิวเคลียส pyknosis ในขณะที่เซลล์เยื่อบุผิวแบบท่อแวคคิวโอเลตที่หายากเผยให้เห็นนิวเคลียสที่เป็น vesiculated ที่มีนิวเคลียสโครมาติน (รูปที่ 2B) ว่าด้วยเรื่องไตรอยโรค เรายังทำการย้อมสี PAS เพื่อสาธิตสถาปัตยกรรมเซลล์ของเนื้อเยื่อไตและไม่รวมการขาดออกซิเจนในระบบว่าเป็นสาเหตุที่เป็นไปได้ของรอยโรคนี้ การย้อมสี PAS แสดงให้เห็นถึงท่อไตเยื่อหุ้มชั้นใต้ดินไม่บุบสลาย (รูปที่ 2B, สิ่งที่ใส่เข้าไป) ภายในไตส่วน CPPV-1 อิมมูโนลาเบลลิ่งรุนแรงและพบได้บ่อยในไซโตพลาสซึมของท่อไตเซลล์เยื่อบุผิว (รูปที่ 2C) และเซลล์ urothelial ที่กระดูกเชิงกรานของไตในทุกกรณี. ไม่พบหลักฐานของปฏิกิริยาอิมมูโนเจนิกในกลุ่มควบคุมเชิงลบ (S1 รูปที่) การแปล CPPV-1 ผิดปรกติในเนื้อเยื่อไตเปิดเผยโดย IHC แนะนำว่าเราควรดำเนินการตรวจสอบเพิ่มเติมเพื่อยืนยันการมีอยู่และการปรับให้เข้ากับท้องถิ่นของ CPPV-1 ในไตใช้ ISH และ TEM พร้อมเทคนิคการเปิดปิด CPPV-1 ISH-immunoreactivity เป็นบวกในแมวตกปลาทั้งหมดและมีการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นอย่างกระจัดกระจายในนิวเคลียสของไตเซลล์เยื่อบุผิวแบบท่อ ซึ่งสังเกตพบรอยโรคในท่อ (รูปที่ 2D) ไม่พบปฏิกิริยาใด ๆ ในกลุ่มควบคุมเชิงลบ (รูปที่ S1) ตามผลของสัญญาณภูมิคุ้มกันเชิงบวกของ ISH ที่แปลเป็นภาษาท้องถิ่นในนิวเคลียสของไตเซลล์เยื่อบุผิว ซึ่งเป็นอนุภาคไวรัสขนาดเล็กที่มีอิเล็กตรอนหนาแน่นประมาณเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 19–22 นาโนเมตร เหล่านี้ถูกรวมกลุ่มไว้ในนิวเคลียสของสิ่งเหล่านี้ท่อไตและเซลล์ urothelial (รูปที่ 3)
การตรวจหา CPPV ของแมวตกปลา-1และการวิเคราะห์จีโนมในขั้นต้น แผง PCR ในกลุ่ม pan-family สำหรับไวรัสต่างๆ รวมถึง herpesvirus, paramyxovirus, pneumovirus, calicivirus, ไวรัสไข้หวัดใหญ่, bocavirus, coronavirus และ parvovirus ได้รับการทดสอบในตัวอย่างกรดนิวคลีอิกของไวรัสที่สกัดได้ ซึ่งเผยให้เห็นผลลัพธ์ที่เป็นบวกเฉพาะกับ pan-parvovirus PCR ในลำไส้ ต่อมน้ำเหลือง และไตตัวอย่างแมวตกปลาสามตัว ในทางกลับกัน pan-PCRs อื่น ๆ สำหรับการตรวจหาไวรัสตัวอื่น ๆ มีค่าเป็นลบในตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ทดสอบทั้งหมด จากผลบวกของ PCR pan-parvovirus PCR ที่ได้รับก่อนหน้านี้ในแมวที่ตกปลาทั้งหมด เราได้ระบุลำดับจีโนมการเข้ารหัสในแมวตกปลาสองตัวโดยใช้คู่ไพรเมอร์หลายคู่ใน ตัวอย่างกรดนิวคลีอิกที่ได้จากลำไส้ (กรณีที่ 1) และไต(กรณีที่ 3). ตรวจพบคู่เบส 4,462 และ 4,430 คู่เบสของรหัสจีโนมที่สมบูรณ์ของแมวตกปลาสองตัว CPPV-1 สายพันธุ์ ถูกตรวจพบและกำหนดเป็นสายพันธุ์ 19ZP004-TH/2019 (กรณีที่ 1 ภาคยานุวัติหมายเลข MW145540) และ 19ZP{ {12}}TH/2019 (กรณีที่ 3 ภาคยานุวัติ MW145541) ตามลำดับ หลังจากการวิเคราะห์ทางพันธุกรรม การเข้ารหัสจีโนมที่สมบูรณ์เผยให้เห็นผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันทางพันธุกรรมของสายพันธุ์ CPPV-1 ที่ได้จากแมวตกปลาโดยแสดงให้เห็นว่า CPPV ของแมวตกปลาเหล่านี้คือ FPV การเปรียบเทียบโดยสรุปของกรดอะมิโนระหว่างสายพันธุ์ CPPV-1 กับแมวตกปลา FPV ได้อธิบายไว้ในตารางที่ 1 ในหมายเหตุ แมวตกปลา FPV เปิดเผยการกลายพันธุ์ของกรดอะมิโนที่ไม่ซ้ำกันของ I566M และ M569R ในโปรตีนโครงสร้าง (VP1 & 2) ที่ตรวจไม่พบในตัวแปร CPPV-1 ก่อนหน้า
รูปที่ 2 CPPV-1 การติดเชื้อในแมวตกปลา การสาธิต H&E (A), การย้อมสี PAS (B), CPPV-1 IHC (C) และการทำสำเนาภาพถ่ายในแหล่งกำเนิด (ISH) (D) ของไตจากแมวตกปลา (A, B) แมวตกปลา No.3. (A) มัลติโฟคอลไตตกเลือดด้วยท่อไตการอพยพ เซลล์เยื่อบุผิวท่อไม่กี่เซลล์มีภาวะ hypereosinophilic ที่มีนิวเคลียส pyknotic (สิ่งที่ใส่เข้าไป, ลูกศร) (ข)ท่อไตเซลล์เยื่อบุผิวแสดงแวคิวโอลของไซโตพลาสซึมและนิวเคลียสของเซลล์เยื่อบุผิวที่หายากนั้นมีลักษณะเป็นตุ่มพองด้วยนิวเคลียสโครมาติน การย้อมสี PAS เน้นที่เมมเบรนชั้นใต้ดินที่ไม่บุบสลาย (สิ่งที่ใส่เข้าไป) (C) ตกปลาแมว no. 2. CPPV-1 IHC-immunoreactivity (สีน้ำตาลเข้ม) ถูกสังเกตอย่างกระจายในท่อไตและมักตรวจพบในไซโตพลาสซึมของท่อไตเยื่อบุผิว (สิ่งที่ใส่เข้าไป) (D) แมวตกปลา no.1. CPPV-1 ISH-immunoreactivity (สีชมพูอมแดง) พบได้มากในท่อไต(เครื่องหมายดอกจัน) และแปลเป็นภาษาท้องถิ่นในนิวเคลียสของท่อไตเยื่อบุผิว (สิ่งที่ใส่เข้าไป, ลูกศร) แท่งระบุ 50 µm สำหรับ (A, C) และ 120 µm สำหรับ (B, D)
การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการและวิวัฒนาการสำหรับการเปรียบเทียบความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมระหว่าง CPPV ของแมวตกปลาที่ตรวจพบ-1กับจีโนม CPPV-1 ที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้ การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการบนพื้นฐานของลำดับจีโนมการเข้ารหัสที่สมบูรณ์ได้ดำเนินการ ต้นไม้สายวิวัฒนาการ ML แสดงให้เห็นว่า FPV, MEV และ CPV ส่วนใหญ่สร้างกลุ่มที่แตกต่างกันมากในกลุ่ม (รูปที่ 4) จีโนม CPPV-1 สองตัวจากแมวตกปลาที่ศึกษา (ระบุด้วยสามเหลี่ยมสีแดง) ถูกรวมกลุ่มไว้ด้วยกันกับสายเลือดเดียวกันของลำดับ FPV ที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้ซึ่งได้รับจากโฮสต์ต่างๆ
รูปที่ 3 CPPV-1 อนุภาคไวรัสในนิวเคลียสของท่อไตเซลล์เยื่อบุผิว กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM) โดยใช้เทคนิคการเปิดปิด การสาธิตโครงสร้างพิเศษของการรวมกลุ่มของอนุภาคที่มีอิเล็กตรอนหนาแน่น (ลูกศร) ขนาดอนุภาคไอโคซาเฮดรัลมีเส้นผ่านศูนย์กลาง 19–22 นาโนเมตร ตั้งอยู่ในนิวเคลียสของท่อไตเซลล์เยื่อบุผิว (สิ่งที่ใส่เข้าไป) แถบมาตราส่วนตามที่แสดงในรูป
CPPV ของแมวตกปลา-1คือ FPV จีโนมที่ตรวจพบถูกรวมกลุ่มเข้าด้วยกันและสัมพันธ์กันอย่างใกล้ชิดที่สุดกับจีโนม FPV ที่ตรวจพบในแมวบ้านในประเทศไทย (ภาคยานุวัติหมายเลข MN127780) เพื่ออธิบายเพิ่มเติมเกี่ยวกับกระบวนการวิวัฒนาการของ CPPV ของแมวตกปลาที่ตรวจพบ-1 การตรวจจับการรวมตัวใหม่และการวิเคราะห์เชิงวิวัฒนาการบนชุดข้อมูลของ 224 CPPV-1 ลำดับจีโนมที่สมบูรณ์ได้ดำเนินการ การวิเคราะห์การรวมตัวใหม่พบว่าไม่พบเหตุการณ์การรวมตัวใหม่ในลำดับ CPPV ของแมวตกปลา แผนผังวิวัฒนาการของข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นเคลดที่แยกจากกันอย่างชัดเจนสองกลุ่ม (รูปที่ 5) หนึ่งกลุ่มรวมถึง FPV และ MEV และอีกกลุ่มหนึ่งรวมลำดับ CPV ทั้งหมด อัตราวิวัฒนาการโดยรวมประมาณการที่ 1.08 × 10-4 การแทนที่/ไซต์/ปี (95 เปอร์เซ็นต์ HPD: 1.95– 2.87 × 10-4 ) ต้นไม้วิวัฒนาการแสดงให้เห็นว่าลำดับ FPV ของแมวตกปลาถูกจัดกลุ่มในเชื้อสายเดียวกันกับ FPV ที่แยกได้จากประเทศไทย พวกเขาได้แบ่งปันวิวัฒนาการทางพันธุกรรมกับจีโนมของ FPV ที่ตรวจพบในแมวบ้านในประเทศจีน และอาจมีต้นกำเนิดเดียวกันตั้งแต่ประมาณปี 1970
การอภิปราย
การไหลเวียนของ CPPV-1 สายพันธุ์ที่มี CPV และ FPV ได้รับการระบุทั้งในสัตว์กินเนื้อในประเทศและสัตว์ป่า แม้ว่าการติดเชื้อ CPPV ที่ร้ายแรงถึงชีวิต-1ในสุนัขและแมวในบ้านเป็นเรื่องปกติ การติดเชื้อนี้พบได้เป็นระยะๆ ในสัตว์กินเนื้อในป่า [46] การศึกษาหลายชิ้นระบุว่าสัตว์กินเนื้อในป่าจำนวนมากไวต่อการติดเชื้อ CPPV-1 ซึ่งรวมถึงสัตว์ป่าป่า มิงค์ นาก สกั๊งค์ แรคคูน สุนัขจิ้งจอก หมาป่า โคโยตี้ ชะมด และมาร์เทน [11, 19] โดยเฉพาะอย่างยิ่งในสกุล Prionailurus มีรายงานเพียงแมวเสือดาวเท่านั้นที่ติดเชื้อ CPPV-1 สายพันธุ์ [9] ในการศึกษานี้ เราอธิบายการติดเชื้อตามธรรมชาติของ FPV ซึ่งเป็นสมาชิกของ CPPV-1 ในแมวตกปลาป่า (Prionailurus viverrinus) นี่เป็นรายงานฉบับแรกที่มีคำอธิบายการกระจายตัวของไวรัสและเขตร้อนในเนื้อเยื่อไตตามที่ได้รับการยืนยันผ่านการตรวจหาแอนติเจนโดยใช้การวิเคราะห์ PCR, IHC, ISH และ TEM ของโครงสร้างพิเศษ
มีการสังเกตการแพร่กระจายข้ามสายพันธุ์ของ CPPV-1 สายพันธุ์ระหว่างสัตว์กินเนื้อในประเทศและสัตว์ป่า และคาดว่าการระบาดของโรค CPPV-1 ที่ร้ายแรงบางอย่างอาจเกี่ยวข้องกับการแพร่กระจายของเชื้อโรคในแหล่งที่อยู่อาศัย [9, 11] เนื่องจากการสูญเสียถิ่นที่อยู่ของสัตว์ป่าในปัจจุบัน อาณานิคมป่าได้อพยพและแบ่งปันแหล่งที่อยู่อาศัยกับสัตว์เลี้ยง ซึ่งนำไปสู่การแพร่กระจายของเชื้อโรคที่เพิ่มขึ้นระหว่างสัตว์ที่อ่อนแอ ในการศึกษานี้ เราพบว่าจีโนมของแมวตกปลา CPPV-1 มีรูปแบบวิวัฒนาการร่วมกับสายพันธุ์ FPV ที่ตรวจพบใน
รูปที่ 4 โทโพโลยีสายวิวัฒนาการเผยให้เห็นความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมของลำดับการเข้ารหัสแบบเต็มความยาวระหว่าง CPPV ของแมวจับปลา-1และตัวแปร CPPV-1 อื่นๆ ต้นไม้สายวิวัฒนาการแสดงให้เห็นว่าลำดับ CPPV ของแมวตกปลา-1 (ระบุด้วยสามเหลี่ยมสีแดง) ถูกจัดกลุ่มร่วมกับจีโนม FPV ที่มีจีโนมที่เกี่ยวข้องกับจีโนม FPV ที่ตรวจพบในแมวไทยมากที่สุด (MN127780) หมายเลขทะเบียน GenBank ของลำดับ CPPV-1 ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ที่ใช้ในการวิเคราะห์นี้ถูกระบุ
แมวบ้านในประเทศไทย. ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นรูปแบบวิวัฒนาการที่คล้ายคลึงกันกับสายพันธุ์ FPV จากบรรพบุรุษทั่วไปที่แยกได้จากแมวบ้านในประเทศจีนตั้งแต่ทศวรรษ 1970 ผลลัพธ์นี้อาจบ่งบอกถึงหลักฐานที่เป็นไปได้ของการแพร่ข้ามสายพันธุ์ระหว่างแมวบ้านกับแมวตกปลา หรือวิวัฒนาการร่วมกันของสายพันธุ์ CPPV-1 อย่างไรก็ตาม เนื่องจากข้อจำกัดของตัวอย่างที่ได้จากสัตว์ที่เดินเตร็ดเตร่ในแหล่งที่อยู่อาศัยเดียวกันและแมวประมงที่ตรวจสอบจำนวนน้อย จึงไม่สามารถระบุแหล่งกักเก็บหลักของ CPPV-1 ในการศึกษานี้และจำเป็นต้องมีการตรวจสอบเพิ่มเติม . แม้ว่าการศึกษาหลายชิ้นได้บ่งชี้ว่าสารตกค้างของกรดอะมิโนหลายชนิดในยีนแคปซิดมีความเกี่ยวข้องกับทั้งความสามารถในการแพร่เชื้อไปยังโฮสต์ใหม่และแอนติเจนของ CPPV-1 [18, 47] การกลายพันธุ์ของกรดอะมิโนเดี่ยวที่ตำแหน่ง 300 ของ โปรตีนแคปซิด (VP2) ได้รับการรายงานว่าเป็นตัวกำหนดหลักสำหรับช่วงโฮสต์หลายช่วง [48] ในการศึกษานี้ ตัวแปร CPPV-1 ที่ได้จากแมวตกปลาเผยให้เห็นรูปแบบกรดอะมิโนเดียวกับที่พบในลำดับ FPV โดยมีอะลานีน (A) เป็นตัวกำหนดกรดอะมิโนหลักที่ตำแหน่งแคปซิด 300 ในขณะที่ โปรตีนแคปซิดของแมวตกปลาของ CPPV-1 เปิดเผยกรดอะมิโนแอสพาราจีน (N) และอะลานีน (A) ที่ตำแหน่ง 564 และ 568 ตามลำดับ (ซึ่งถือว่ามีความสำคัญต่อการจำลองแบบ FPV ในโฮสต์ของแมว) พวกมันมี การกลายพันธุ์ของกรดอะมิโนที่ไม่ซ้ำกัน 2 ตัวที่ตำแหน่ง I566M และ M569R การกลายพันธุ์เหล่านี้สามารถแยกความแตกต่างของไวรัสนี้จากตัวแปร CPPV-1 ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ การวิเคราะห์ก่อนหน้านี้เกี่ยวกับการสร้างใหม่ของบรรพบุรุษพบว่า FPV สามารถแพร่เชื้อไปยังสัตว์กินเนื้อที่แตกต่างกันได้โดยมีการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในยีน VP2 [49] ดังนั้น Parvovirus ที่มีลักษณะคล้าย FPV จึงได้รับการตั้งชื่ออย่างไม่แน่นอนว่าเป็นไวรัสที่อาจตรวจพบในแมวตกปลา และอาจสนับสนุนการระบุไวรัสชนิดนี้ในสายพันธุ์นี้เป็นครั้งแรก อย่างไรก็ตาม แมวจับปลาจำนวนน้อยที่ถูกสอบสวนเมื่อเปรียบเทียบกับลำดับอื่นๆ เพียงเล็กน้อยอาจไม่ให้การตีความที่ชัดเจน สิ่งนี้จำเป็นต้องศึกษาเพิ่มเติมเพื่อหาข้อสรุปที่ชัดเจนยิ่งขึ้น
พบการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของแมว CPPV-1 ในเนื้อเยื่อต่างๆ รวมทั้งเซลล์เยื่อบุผิวในลำไส้และเซลล์น้ำเหลือง ซึ่งพบการแปลเนื้อเยื่อที่พบบ่อยที่สุดของการติดเชื้อ CPPV-1 ในสายพันธุ์อื่น [20, 26, 50, 51 ]. ที่น่าสนใจ เนื่องจากการตรวจสอบเบื้องต้นของการตรวจหาจีโนมไวรัสโดยใช้ PCR และการแปลไวรัสโดยใช้ IHC เผยให้เห็นการโลคัลไลซ์เซชันของไวรัสที่แตกต่างกันในเนื้อเยื่อไตเราทำการย้อมสี PAS เพื่อแสดงสถาปัตยกรรมเซลลูลาร์ของเนื้อเยื่อไตและไม่รวมการขาดออกซิเจนในระบบว่าเป็นสาเหตุที่เป็นไปได้ของเนื้อร้ายในท่อ การย้อมสี PAS เผยให้เห็นเยื่อชั้นใต้ดินที่เป็นท่อส่วนใหญ่ไม่บุบสลาย บ่งบอกว่ารอยโรคนี้อาจไม่ได้เกิดจากการขาดออกซิเจนในร่างกาย [52] อย่างไรก็ตาม สาเหตุอื่นๆ เช่น เนื้อร้ายท่อที่เกิดจากสารพิษ อาจทำให้เกิดแผลนี้ได้ ดังนั้นบทบาทของการติดเชื้อ parvovirus เหมือน FPV ที่เกี่ยวข้องกับไตรอยโรคยังคงต้องได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติม ยิ่งกว่านั้น เราพยายามอธิบายเพิ่มเติมเกี่ยวกับการแปลไวรัสที่ยังหลงเหลืออยู่ในเนื้อเยื่อไตใช้ ISH และ TEM ด้วยเทคนิคการเปิดออก [37] ในพื้นที่ที่ตรวจพบ CPPV-1 IHC-immunoreactivity อนุภาคที่มีอิเล็กตรอนหนาแน่นพบได้ในนิวเคลียสของท่อไตเซลล์เยื่อบุผิวและเซลล์ urothelial ซึ่งสนับสนุนการกระตุ้นภูมิคุ้มกันในแหล่งกำเนิดที่เป็นบวกของ CPPV-1 ในเนื้อเยื่อไต. แมวที่ติดเชื้อ FPV หลั่งไวรัสส่วนใหญ่ในอุจจาระ แต่มีการอธิบายการมีอยู่ของไวรัสที่ใช้งานอยู่ในปัสสาวะ [53, 54] การศึกษาล่าสุดระบุว่าการติดเชื้อ parvovirus มีบทบาทในภาวะไตวาย[55]. อย่างไรก็ตาม การโลคัลไลซ์เซชันของ FPV และคู่ซีพีวีในเนื้อเยื่อไตยังไม่เคยถูกสอบสวนมาก่อน นอกจากนี้ เมาส์ไตparvovirus (MKPV) ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นไวรัส nephrotropic โดยแสดงความสัมพันธ์ในการติดเชื้อและแปลเป็นภาษาท้องถิ่นท่อไตเซลล์เยื่อบุผิวส่งผลให้โรคไต [56, 57].
จากความรู้ของเรา CPPV-1 การแปลเป็นภาษาท้องถิ่นในไตไม่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ สิ่งนี้ชี้ให้เห็นถึงคำอธิบายที่แปลกใหม่ของการโลคัลไลซ์เซชันของไวรัสในสายพันธุ์นี้ หรือแม้แต่พบได้ในแมวที่ติดเชื้อ FPV การค้นพบนี้อาจสนับสนุนการศึกษาก่อนหน้านี้ซึ่งพบ FPV ในปัสสาวะ การค้นพบทางพยาธิวิทยาที่ไม่ซ้ำกันอาจเป็นเรื่องส่วนตัวและอาจสังเกตได้จากการติดเชื้อในบุคคล ดังนั้น การตรวจสอบ CPPV ของแมวตกปลาในวงกว้าง-1จะช่วยอำนวยความสะดวกในการตีความที่ชัดเจน นอกจากนี้ ตัวอย่างที่ส่งมาส่วนใหญ่มาจากสัตว์ที่ตายแล้วและได้รับการชันสูตรพลิกศพแล้วไม่เหมาะสำหรับการเก็บอวัยวะจากสัตว์เหล่านี้ต่อไป ดังนั้นเราจึงไม่สามารถระบุตำแหน่งของไวรัสในอวัยวะอื่นได้ การอธิบายการโลคัลไลซ์เซชันของไวรัสที่ผิดปรกติของ CPPV ของแมวตกปลา-1จะเป็นการตรวจสอบที่มีประโยชน์
CISTANCHE จะปรับปรุงโรคไต/โรคไต
CPPV-1 ได้รับการระบุในสัตว์กินเนื้อในป่าหลายชนิดและเกี่ยวข้องกับการระบาดที่ร้ายแรง หลักฐานเชิงลบของการตรวจหา CPPV-1 ย้อนหลังในตัวอย่างสัตว์ป่าในสวนสัตว์ในการศึกษานี้อาจเป็นผลมาจากการไม่สัมผัสใกล้ชิดระหว่างสัตว์ที่อ่อนแอ หรือในทางกลับกัน การเก็บตัวอย่างเป็นเวลานานซึ่งส่งผลต่อความเสถียรของวัสดุจีโนม การระบุแบบใหม่ของ CPPV-1 ที่เกี่ยวข้องกับการติดเชื้อในแมวที่เสียชีวิตในการศึกษานี้ทำให้เกิดความกังวลเกี่ยวกับโรคที่แปลกใหม่ที่อาจก่อให้เกิดโรคในสัตว์ที่เปราะบางนี้ ดังนั้น การศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับการแพร่กระจายของ CPPV-1 ในแมวตกปลาจึงเป็นสิ่งจำเป็นเพื่อป้องกันการสูญเสียสัตว์ชนิดอื่นๆ ที่อ่อนแอ ดังนั้น จึงควรเน้นย้ำถึงกลยุทธ์ในการป้องกันเพื่อจัดการกับการติดเชื้อ CPPV-1 ไม่เพียงแต่ในสายพันธุ์นี้เท่านั้น แต่ยังรวมถึงในสัตว์เลี้ยงที่เดินเตร็ดเตร่ซึ่งอาจทำหน้าที่เป็นโฮสต์สำหรับไวรัสนี้ด้วย
