สารประกอบเชิงซ้อนของโปรตีนนมนาโน: การจำแนกลักษณะและผลต้านมะเร็ง ตอนที่ 2

ติดต่อสอบถามเพิ่มเติมได้ที่tina.xiang@wecistanche.com

คลิกลิงค์เพื่อเรียนรู้ตอนที่ 1:https://www.xjcistanche.com/news/nano-milk-protein-mucilage-complexes-characte-55049142.html

3. วัสดุและวิธีการ

3.1. วัสดุ

Plantago ovata (เป้าหมายย่อย) แกลบและผลสุกของ Ziziphus Spina-Christi (Nabeq) ถูกซื้อมาจากกิซ่า ประเทศอียิปต์ ซื้อโปรตีนนมเข้มข้น (MP, โปรตีนร้อยละ 81.3) จากบริษัท Fonterra (โอ๊คแลนด์, นิวซีแลนด์) เคซีนและเวย์โปรตีนใน MPC ส่วนใหญ่อยู่ในรูปแบบไมเซลลาร์พื้นเมืองและคล้ายคลึงกันกับที่พบในนม สารเคมีทั้งหมดที่ใช้มีความบริสุทธิ์ในการวิเคราะห์

3.2.การเตรียม Isabgol Husk Mucilage (IHM) และ Nabeg Mucilage (NabM)

เมือกเปลือก Isabgol (IHM) และเมือก Nabeq (NabM) ถูกเตรียมตามวิธีการที่อธิบายโดย El-Maksoud et al [5]. โดยสังเขป สารแขวนลอยของแกลบ isabgol ถูกเตรียมโดยการละลาย 1.2 กรัมในน้ำกลั่น 100 มล. และถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยสารละลายอะซิโตน เจลที่เป็นผลลัพธ์ถูกเก็บไว้ในตู้เย็น (4-5 องศา ) จนกว่าจะใช้

สำหรับ NabM ผลไม้ Nabeq ที่สุกแล้วจะถูกล้างด้วยน้ำประปาอย่างทั่วถึงเพื่อขจัดสิ่งสกปรก ผลไม้สดแยกจากเมล็ดและผสมกับน้ำกลั่นในอัตราส่วน 1:10(w/v) หลังจากหั่นเป็นชิ้นเล็กๆ ผสมส่วนผสมโดยใช้เครื่องปั่นสำหรับห้องปฏิบัติการ (Toshiba Mixie, Japan) และปล่อยให้ยืนเป็นเวลา 12 ชั่วโมงในตู้เย็น

จากนั้นนำสารสกัดเมือกมาปั่นเหวี่ยงที่ความเร็ว 2000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 30 นาที แล้วกรองด้วยผ้ามัสลิน เมือกที่ละลายได้หนืดที่เป็นผลลัพธ์ถูกตกตะกอนด้วยอะซีโตน เมือกที่ยังไม่ผ่านกระบวนการใดๆ ถูกเก็บไว้ในตู้เย็นจนกว่าจะใช้

เพื่อวัตถุประสงค์ในการวิเคราะห์ เมือกถูกทำให้แห้งในเตาอบลมที่ 40 องศาและบดโดยใช้ลูกกลิ้งบด MM400(Retsch, เยอรมนี) มีการวัดองค์ประกอบทางเคมีของผงเมือก psyllium husk (PHMP) และผงเมือก Nabeq (NabMP) ความชื้น โปรตีน ไขมัน เถ้า เส้นใยหยาบ และปริมาณคาร์โบไฮเดรตทั้งหมดเท่ากับ 8.49, 0.34,0.21,2.13,1.53 และ87.44 สำหรับ PHMP และ 9.18,4.72,2.05,2.69,1.70 และร้อยละ 78.26 สำหรับ NabMP ตามลำดับ ผงที่เป็นผลลัพธ์ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิเย็น (4-5 องศา ) จนกระทั่งมีการวิเคราะห์เพิ่มเติม

คลิกเพื่อดูข้อมูลเพิ่มเติม

3.3. การเตรียมโปรตีนนม - เมือกคอมเพล็กซ์ (MPMC)

คอมเพล็กซ์โปรตีนนม (MP) ที่มี IHM และ NabM ถูกเตรียมตาม Morr และคณะด้วยการดัดแปลงบางอย่าง [44] โปรตีนนมเข้มข้นถูกสร้างใหม่ในน้ำกลั่น(10 เปอร์เซ็นต์ ) คอลลอยด์โปรตีนนมที่เป็นผลลัพธ์ถูกผสมกับ IHM และ NabM ที่อัตราส่วน 1:3 (o/o) pH ของของผสมถูกปรับเป็น 10 และปล่อยให้ยืนเป็นเวลา 10 นาที หลังจากนั้น pH จะลดลงเหลือ 3.5 โดยใช้ 0.1 N HCl และทิ้งไว้อีก 10 นาที จากนั้น pH ถูกปรับเป็น pH 4.6 โดยใช้ 0.5 โมลาร์ NaOH เพื่อรวบรวม MPMC โดยการกรองบนกระดาษกรอง: MP และ MPMC ที่เป็นผลลัพธ์ถูกทำให้แห้งโดยการทำแห้งโดยทำแห้งที่อุณหภูมิ -45 องศา C เป็นเวลา 24 ชั่วโมงโดยใช้เครื่องทำแห้งแบบแห้ง Novalyphe-NL500 , Savant Instruments, Holbrook, นิวยอร์ก, สหรัฐอเมริกา

3.4. ลักษณะทางกายภาพเคมีและการทำงาน

การวัด 3.4.1.pH

pH ของผลิตภัณฑ์ที่เป็นผลลัพธ์ที่สารละลาย 10 เปอร์เซ็นต์ วัดโดยใช้เครื่องวัดค่า pH ที่สอบเทียบแล้ว (HANNA, HI 902 m, Germany)

3.4.2.การกำหนดความหนาแน่นเป็นกลุ่ม (BD) ความหนาแน่นเคาะ (TD) และดัชนีของคาร์

ผง MPMC ถูกเทลงในกระบอกตวงขนาด 50 มล. จนถึง 25 มล. ซึ่งสอดคล้องกับปริมาตรที่ไม่ได้ใช้ จากนั้นแตะ 5-10 ครั้งจนกว่าจะไม่มีการเปลี่ยนแปลงใดๆ ของปริมาตรของผงที่สอดคล้องกับปริมาตรที่เคาะ

ความหนาแน่นรวม ความหนาแน่นของต๊าป และดัชนีของคาร์ถูกกำหนดโดยใช้สมการต่อไปนี้ [45]:

(1)BD=มวล/ ปริมาณที่ไม่ได้ใช้

(2)TD=มวล/ปริมาตรที่เคาะ

(3)ดัชนีคาร์ ( เปอร์เซ็นต์ )= (TD-BD)/TD×100

3.4.3. ดัชนีการดูดซึมน้ำ (WAI) และดัชนีความสามารถในการละลายน้ำ (WSD)

ดัชนีการละลายน้ำและการดูดซึมน้ำของ MP และ MPMC ได้รับการตรวจสอบตามวิธีการที่ Yagc และ Gogus อธิบายไว้ด้วยการดัดแปลงบางอย่าง [46] ตัวอย่าง(0.5 กรัม)ถูกกระจายในน้ำกลั่น 10 มล. ที่ 25 องศาในหลอดสำหรับการปั่นแยก หลังจากยืนเป็นเวลา 30 นาที โดยเปลี่ยนท่อทุกๆ 5 นาที ตัวอย่างจะถูกหมุนเหวี่ยงที่ 3500 รอบต่อนาที เป็นเวลา 15 นาที ของกรองถูกถ่ายโอนไปยังแผ่นอะลูมิเนียมและถูกทำให้แห้งเป็นเวลา 3 ชั่วโมงที่ 105 องศา บันทึกน้ำหนักของเจลที่เหลือและ WSI และ WAI ถูกกำหนดดังนี้:

(4)WAI(g/g)= การเพิ่มน้ำหนักของเจล/น้ำหนักแห้งของกลุ่มตัวอย่าง

(5) เปอร์เซ็นต์ WSI=น้ำหนักของของแข็งแห้งในส่วนลอยเหนือตะกอน ×100/น้ำหนักแห้งของตัวอย่าง

3.4.4. การย่อยโปรตีนจากนม

การย่อยได้ของโปรตีนถูกกำหนดโดย Abd El-Ghany et al [47]. โดยย่อ ตัวอย่าง MP และ MPMC ถูกกระจายในน้ำกลั่นที่ความเข้มข้น 6.38 มก./มล. และ pH ถูกปรับเป็น 80 สารละลายสต็อกของเอนไซม์ที่เตรียมใหม่หนึ่งมิลลิลิตร (ทริปซิน 1.6 มก./มล., ไคโมทริปซิน 3.1 มก./มล. และ ER อะมิโนเปปติเดส 1.3 มก./มล.1

(ERAP1) ผสมกับโปรตีนแขวนลอยที่ 37 องศา pH ถูกบันทึกหลังจาก 10 นาที และการออกฤทธิ์ของเอนไซม์ถูกกำหนดหาโดยใช้เคซีนเป็นข้อมูลอ้างอิง สมการต่อไปนี้ใช้ในการคำนวณการย่อยได้ของโปรตีน [47]:

(6) เปอร์เซ็นต์การย่อยได้=210.46-18.10 (pH)

3.5.ฟีนอลิกเศษส่วนของ PHM และ NabM

สารประกอบฟีนอลิกของตัวอย่างเมือกโดยใช้การวิเคราะห์ HPLC ถูกดำเนินการโดยโปรโตคอลที่บรรยายโดย Elsayed และคณะ [48]. โดยสังเขป สารสกัดเมือกถูกวิเคราะห์โดยใช้ระบบ HPLC ซีรีส์ Agilent 1260 (Agilent Technologies Inc., ซานตาคลารา, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) การแยกผ่านโดยใช้คอลัมน์ C18 (100 มม. × 4.6 มม. id,5 um) เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วย (A) น้ำ 0.2 เปอร์เซ็นต์ H3PO4, (B)เมทานอลและ(C) อะซีโตไนไตรล์ที่อัตราการไหล 0.6 มล./นาที ตัวปรับความลาดชันเป็นไปตามรูปแบบถัดไป: 0-11 นาที (96 เปอร์เซ็นต์ A., 2 เปอร์เซ็นต์ B);11-13 นาที (50 เปอร์เซ็นต์ A, 25 เปอร์เซ็นต์ B);13-17นาที (40 เปอร์เซ็นต์ A, 30 เปอร์เซ็นต์ B);17-20.5 นาที (50 เปอร์เซ็นต์ B,50 เปอร์เซ็นต์ C) และ 20.{27}} นาที (96 เปอร์เซ็นต์ A,2 เปอร์เซ็นต์ B) ความยาวคลื่นการตรวจจับ (UV ตัวตรวจจับ,284 นาโนเมตร) ถูกตั้งค่าไว้ที่ 284 นาโนเมตร ขนาดการฉีดคือ 20 ไมโครลิตร และอุณหภูมิคอลัมน์ถูกคงไว้ที่ 30 องศา สารประกอบเป็นที่รู้จักโดยการเปรียบเทียบเวลาเก็บรักษากับมาตรฐานที่แท้จริง กราฟการปรับเทียบถูกใช้เพื่อประเมินปริมาณของสารประกอบ

3.6.ปริมาณฟีนอลิกและฟลาโวนอยด์รวมของ MP และ MPMC

ปริมาณโพลีฟีนอลถูกกำหนดโดยวิธี Folin-Ciocalteu โดยมีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง [5] โดยสรุป 2.8 มล. มิลลิคิววอเตอร์ที่มี MP หรือ MPMC 10 มก. ผสมกับโซเดียมคาร์บอเนต 2 เปอร์เซ็นต์ 2 มล. และ 0.1 มล. ของสารทำปฏิกิริยา Folin-Ciocalteau 50 เปอร์เซ็นต์ หลังจากการบ่ม 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง การดูดกลืนแสงของของผสมปฏิกิริยาถูกวัดที่ 750 นาโนเมตรเทียบกับน้ำที่ปราศจากไอออนในรูปของสารเปล่าโดยใช้สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ (ฮิตาชิ โมเดล 100-20) กรดแกลลิก (GA) ถูกใช้เป็นสารประกอบฟีนอลิกมาตรฐาน และสร้างเส้นโค้งมาตรฐานเจ็ดจุด (0-200 มก./ลิตร) ผลลัพธ์ถูกแสดงเป็นมิลลิกรัมเทียบเท่ากรดแกลลิกต่อโปรตีนกรัม (GAE/g)

สารฟลาโวนอยด์กำหนดเนื้อหาโดยใช้วิธีอะลูมิเนียมคลอไรด์ตามที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย Abedelmaksoud et al มีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง [5]. โดยสรุป น้ำ 2.8 มล. มิลลิคิวที่มี MP หรือ MPMC 10 มก. ถูกผสมกับ 0.1 มล. ของอะลูมิเนียม คลอไรด์ 10 เปอร์เซ็นต์ เฮกซาไฮเดรต และ 0.1 มล. ของโพแทสเซียม อะซิเตต 1 โมลาร์ หลังจากการบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 40 นาที การดูดกลืนแสงของของผสมปฏิกิริยาถูกวัดที่ 415 นาโนเมตรเทียบกับน้ำที่ปราศจากไอออนในลักษณะที่ว่างเปล่า เควอซิทินถูกใช้เป็นมาตรฐานโดยใช้เส้นโค้งมาตรฐานเจ็ดจุด (0-50 มก./ลิตร) ปริมาณฟลาโวนอยด์ทั้งหมดถูกแสดงออกเป็นมิลลิกรัมเทียบเท่าเควอซิติน (QE/g)

3.7. ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของ MP และ MPMC

ความสามารถในการกำจัดอนุมูลอิสระทั้งหมดของ MP และ MPMC ถูกประเมินโดยใช้การวิเคราะห์สารต้านอนุมูลอิสระที่แตกต่างกันสามแบบ: Stable 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline{{5 }}กรดซัลโฟนิก (ABTS) และอนุมูลไฮดรอกซิลเรดิคัล (HS) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย El-Maksoud et al. [5]

3.8. โปรไฟล์กรดอะมิโนของ MP และ MPMC

ตัวอย่างโปรตีนถูกไฮโดรไลซ์ด้วยกรดโดยใช้ 6 N HCl ตาม Peksa และคณะ [49. เครื่องวิเคราะห์กรดอะมิโนอัตโนมัติ (AAA 400, INGOs Ltd.) ใช้สำหรับกำหนดกรดอะมิโน

3.9. คุณสมบัติทางรีโอโลจี

ตัวอย่างถูกจัดเตรียมตามที่ Barnes [50] บรรยายไว้ โดยมีการดัดแปลงบางอย่าง ความหนืดของสารละลาย 2.5 เปอร์เซ็นต์ (w/w) ที่ pH7 ถูกกำหนดที่ 25±1 องศาโดยใช้เครื่องวัดความหนืดของ Brookfield (DV-II plus Pro, Rheocalc Software, Germany) ความเค้น (σ) และความหนืด (n) ถูกพล็อตเป็นฟังก์ชันของอัตราเฉือน คำนวณดัชนีความสอดคล้อง (K) และดัชนีพฤติกรรมการไหล (n) ของแบบจำลองกฎกำลังไฟฟ้า:

ค่าของ n เท่ากับ 1 สำหรับของไหลของนิวตันและแปรผันจาก 0 ถึง 1 สำหรับของไหลที่ทำให้บางลงด้วยแรงเฉือนและมากกว่า 1 สำหรับของไหลที่ให้ความหนืดสูง [51]

3.10.Differential Scanning Calorimetry (DSC)

คุณสมบัติทางความร้อนของ MP และ MPMC ถูกวัดโดยใช้เครื่องวัดความร้อนแบบดิฟเฟอเรนเชียล (PerkinElmer, USA) ตัวอย่าง (4-6 มก.) ถูกวางลงในแผ่นอะลูมิเนียมและปิดผนึก จากนั้นแต่ละกระทะถูกให้ความร้อนถึง 350 องศาด้วยการไหลของก๊าซไนโตรเจนแห้งที่ 20 มล. min-I ที่อัตราการให้ความร้อน 10 องศา นาที-1 จากพีคดูดความร้อนของเทอร์โมแกรม DSC อุณหภูมิเริ่มต้นของการลดทอนสภาพ อุณหภูมิการเปลี่ยนแปลงสูงสุด และจุดการเสื่อมสภาพถูกประมาณค่าไว้ [52] ค่าเอนทาลปีการเปลี่ยนแปลง (AH) จากพื้นที่ใต้พีคดูดความร้อนในกราฟ DSC ถูกกำหนดหา และใช้ถาดอะลูมิเนียมเปล่าเป็นข้อมูลอ้างอิง

3.11. ฟูเรียร์-ทรานส์ฟอร์มอินฟราเรดสเปกโทรสโกปี (FTIR)

สเปกตรัมอินฟราเรดระหว่าง 600 ถึง 3500 cm-I ถูกวัดที่ 25 องศาโดยใช้ FTIR spectrophotometer (QFA Flex, USA) โดยวิธีการสะท้อนแสงทั้งหมดแบบลดทอนโดยใช้ความละเอียด 4 cm-I และได้รับการสแกน 10 ครั้งต่อวินาที

3.12. กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน

โครงสร้างจุลภาคของ MP และ MPMC แสดงภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (JEOL, JEM 1400 Flash, Japan) ที่ 80 kV ใช้ขั้นตอนไครโอในวิธีการย้อมติดลบ [53]

3.13.การศึกษาทางชีววิทยาเกี่ยวกับ MP และ MPMC

3.13.1.กิจกรรมต้านมะเร็งในหลอดทดลอง

เซลล์ทุกสายพันธุ์ที่ใช้ในการทดลองนี้ได้มาจาก American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) สายพันธุ์ของเซลล์มะเร็งของมนุษย์สองสายพันธุ์ถูกใช้ในการสอบวิเคราะห์นี้: มะเร็งต่อมน้ำเหลืองของเต้านม (MCF{0}}, ATCCHTB-22TM)และมะเร็งเซลล์ตับ (HepG2, ATCC4 HB-8065TM) กลุ่มเซลล์ไฟโบรบลาสต์ BJ-1(ATCC⑧ CRL-2522TM) ของผิวหนังที่ไม่เป็นมะเร็ง และ MCF ของเยื่อบุผิวเต้านม MCF-12F(ATCC CRL-10782TM) ที่ไม่เป็นมะเร็งยังได้รับการทดสอบเพื่อการเปรียบเทียบ สายพันธุ์ของเซลล์เติบโตในอาหารเลี้ยงเชื้อ Eagle's modified ของ Dulbecco (DMEM/กลูโคสสูง HyCloneTM สหรัฐอเมริกา) เสริมด้วยซีรัมของวัวในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (FBS, Gibco, Brazil), 100 U/mL penicillin, 100 ug/mL streptomycin และ 25 ng/ mL amphotericin B (Sigma, Oakville, ON, Canada) และเพาะเลี้ยงที่ 37 องศาโดยมี CO 5 เปอร์เซ็นต์ในตู้อบที่มีความชื้น อาหารเลี้ยงเชื้อถูกแทนที่วันเว้นวันด้วยอาหารสด เมื่อเซลล์ถึงจุดบรรจบกันถึง 70 เปอร์เซ็นต์ เซลล์เหล่านี้จะถูกแยกออกโดยใช้ Trypsin-EDTA(1X) Gibco ในประเทศแคนาดา 0.25 เปอร์เซ็นต์ และย้ายไปยังขวดเพาะเชื้อใหม่ หลังจากทางเดินที่สอง เซลล์ถูกทริปซิไนซ์และชุบในจาน 96-หลุมที่ความเข้มข้น 2×10* เซลล์/หลุม หลังจากการบ่ม 24 ชั่วโมง ตัวกลางถูกแยกออก และเซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS จากนั้นบำบัดด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อ 200 ไมโครลิตรที่มีความเข้มข้นต่างกันของตัวอย่างโปรตีน (1, 5,10 และ 20 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) Doxorubicin HCl(4 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก ในขณะที่เซลล์ที่บำบัดด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม่ได้เสริมถูกนำมาเป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ เพลตถูกฟักที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมงและต้านมะเร็งกิจกรรมของตัวอย่างถูกกำหนดหาโดยใช้การสอบวิเคราะห์การรับสีแดงที่เป็นกลางตาม Repetto et al [54]. โดยย่อ หลังจากระยะฟักตัว ตัวกลางถูกแทนที่ด้วยสีย้อมสีแดงที่เป็นกลาง 150 uL(100 มก./มล.) ที่ละลายในตัวกลางที่ปราศจากซีรัม และเซลล์ถูกบ่มที่ 37 องศา C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง ถัดไป เซลล์ถูกล้างด้วย PBS และ 150 ไมโครลิตรของตัวกลางสำหรับชะ （EtOH/AcCOOH,50∶1) ถูกเติมตามด้วยการเขย่าเบาๆ เป็นเวลา 10 นาทีเพื่อให้แน่ใจว่ามีการละลายอย่างสมบูรณ์ วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 540 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านเพลทไมโครไทเทอร์ (BioTek,96 Well Plates, ELX808, USA)

โดยที่ Ac คือค่าการดูดกลืนแสงของตัวควบคุม และ As คือการดูดกลืนแสงของตัวอย่าง เปอร์เซ็นต์การตายของเซลล์ที่แสดงเป็นความเป็นพิษต่อเซลล์ ( เปอร์เซ็นต์ ) และความเข้มข้นที่ฆ่า 50 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ (IC50) ถูกคำนวณสำหรับแต่ละตัวอย่าง

3.13.2.การหาระดับโปรตีน p53, Bax, Caspase-3 และ Bcl-2

ระดับเซลล์ของตัวบ่งชี้โปรตีนอะพอพโทซิสที่สำคัญถูกกำหนดหาหลังจาก 24 ชั่วโมงหลังการบำบัดด้วย ICso ของ MP และ MPMC โดยย่อ เซลล์ Hep G-2, MCF-7, Bj-1 และ MCF-12F ถูกเพาะที่ 5× 10* เซลล์/หลุมใน 6-หลุม จาน หลังจาก 24 ชั่วโมงของการฟักตัวกับตัวอย่างที่ 37 องศา เซลล์ถูกรวบรวมและแยกส่วนแล้วหมุนเหวี่ยงที่ 10,{12}} รอบต่อนาที เป็นเวลา 20 นาทีที่ 4 องศา ความเข้มข้นของโปรตีนถูกหาปริมาณในส่วนลอยเหนือตะกอนโดยการทดสอบแบรดฟอร์ด [55] กิจกรรมของแคสเปส-3 ถูกวิเคราะห์โดยใช้ชุดทดสอบสี (Abcam, ab39401) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต [56] โดยสรุป โปรตีน 10 มก. ถูกเติมลงใน 50 uL ของสารตั้งต้นของแคสเปสและปริมาตรสุดท้ายถูกปรับเป็น 200 ไมโครลิตรโดยใช้บัฟเฟอร์ของปฏิกิริยาที่ 37 องศา และของผสมถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงในที่มืดตามด้วยการวัดค่าแคสเปส{{24} } ความเข้มข้นที่ 405 นาโนเมตร

ระดับของเครื่องหมายโปรอะพอพโทซิส p53, X(Bax) ที่เกี่ยวข้องและมะเร็งต่อมน้ำเหลืองบีเซลล์มาร์กเกอร์ต้านอะพอพโทซิส-2(Bcl-2)ถูกกำหนดหาในเซลล์ไลเซตโดยใช้ขั้นตอนง่าย ๆ ของการทดสอบภูมิคุ้มกันที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ ELISA ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (ab207225, ab119506 และ ab199080; Abcam, USA) ตามลำดับ [57,58]

3.13.3.ความเสียหายของ DNA ที่เกิดจากการป้องกันความเครียดออกซิเดชัน

การทดสอบความเสียหายของ DNA ได้ดำเนินการตามที่ Leba et al อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [59] มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย โดยสรุป 3 ไมโครลิตรของพลาสมิดตัวยับยั้งไรโบนิวคลีเอส RNH1 (NM_203387) โคลน ORF ที่แท็กโดยมนุษย์ 10 ไมโครกรัม/ไมโครลิตรถูกผสมกับรีเอเจนต์ของเฟนตัน (5 มิลลิโมลาร์ของ H2O2 และ 0.3 มิลลิโมลาร์ ของ FeSO4 และ 0.6 mM ของ EDTA) และปริมาตรสุดท้ายถูกปรับเป็น 25 ไมโครลิตรโดยใช้บัฟเฟอร์ฟอสเฟต (H2POA, 8.3 mM, pH 7.4) จากนั้น นำสารละลายไปบ่มเป็นเวลา 20 นาที ที่ 37 องศา เพื่อประเมินความสามารถในการป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระของ MP และ MPMC ต่อความเสียหายของ DNA ที่เกิดจากรีเอเจนต์ของเฟนตัน ให้เติม MP/NabM, MP/IHM และ MP 5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรก่อนการฟัก RNH1 พลาสมิด DNA (3 ไมโครลิตร, 10 ไมโครกรัม/ไมโครลิตร) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมการป้องกันดีเอ็นเอ

3.13.4.PCR-Based Genomic DNA Damage Assay

ยีน Homo sapiens methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) ถูกขยายโดยใช้ PCR จากจีโนมเลือดที่สกัดก่อนหน้านี้จากตัวอย่างเลือดที่มีสุขภาพดีโดยใช้ชุดสกัดดีเอ็นเอมาตรฐาน [60] ดีเอ็นเอถูกบ่มเป็นเวลา 10 นาทีโดยมีหรือไม่มีรีเอเจนต์ของเฟนตันที่เสริมด้วย MP หรือ MPMC แฟรกเมนต์ 198-bp ถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์ forward5'-TGAAGGAAGGTGTCTGCGGGA-3' และไพรเมอร์ 5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3' การใช้ DNA ที่บำบัดแล้ว 50ng การขยาย PCR ดำเนินการตามเทอร์โมไซเคิลถัดไป (94 องศาเป็นเวลา 5 นาที ตามด้วยการเปลี่ยนสภาพ 25 รอบ, 30 วินาทีที่ 94 องศา; การหลอม 30 วินาทีที่ 60 องศา และการขยาย 30 วินาทีที่ 72 องศา) สำหรับ 25 รอบและ 1 รอบขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเป็นเวลา 5 นาที ตัวอย่างปฏิกิริยา PCR ถูกนำไปใช้กับ agarose gel electrophoresis (2 เปอร์เซ็นต์)

3.13.5. การทำโปรไฟล์การแสดงออกของยีนโดย RT-qPCR

การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนของยีนมาร์กเกอร์โปรและแอนติ-อะพอพโทซิสที่สำคัญได้ดำเนินการกับเซลล์ HepG-2, MCF-7, Bj-1 และ MCF-12F ที่สัมผัสกับ IC50 ที่ได้รับ ข้อมูล (ตารางที่ 3) เป็นเวลา 72 ชั่วโมง โดยสังเขป RNA ทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้ Total RNA Purification Kit(QIAGEN., Thorold, ON, Canada) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต cDNA

การสังเคราะห์ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย Aboul-Sound et al [61]. โปรแกรมขยายสัญญาณและความจำเพาะของเครื่องขยายสัญญาณ PCR ถูกดำเนินการและประเมินโดยการใช้ Rotor-Gene O 5-Plex HRM thermal cycler (Qiagen, Germany) กับ Quanti-Tect SYBR-Green PCR Kit (Qiagen, Germany) ตามที่ได้บันทึกไว้ก่อนหน้านี้ ตามโปรโตคอลมาตรฐาน [61] ใช้ไพรเมอร์ต่อไปนี้: Hs_P53_1 SG QuantiTect Primer Assay (QT00060235); Hs_CASP3_1_SG Quan-tiTect Primer Assay (QT00023947); มะเร็งต่อมน้ำเหลืองบีเซลล์ 2 Hs_BCL2_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00025011);Bcl-2-โปรตีนคล้าย Hs_BAX_1_SG QuantiTect Primer Assay ( QT00031192); และ 18S rDNA house-keeping (HK) ยีน Hs_RRN18S_1_SGQuantiTect Primer Assay(QT00199367) โปรแกรมการหมุนเวียนความร้อนด้วย PCR และการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนเพื่อกำหนดหาการเปลี่ยนแปลงแบบพับที่สัมพันธ์กับยีน 18S โดยพื้นฐานแล้วถูกดำเนินการตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ [61]

3.14.การวิเคราะห์ทางสถิติ

ผลลัพธ์ที่ได้แสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน สถิติทำได้โดยใช้ SPSSsoftware 11.5 (SPSS, Inc.Chicago, IL, USA) การทดสอบหลายช่วงของ Duncan ใช้เพื่อกำหนดความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในกลุ่มตัวอย่างทั้งหมด และพิจารณาความแตกต่างที่มีนัยสำคัญที่ p<>

4. บทสรุป

โดยสรุป จากการศึกษาครั้งนี้พบว่าการผสมโปรตีนนมกับพอลิแซ็กคาไรด์ผ่านการแยกความแตกต่างของค่า pH ของสารละลายเป็นเทคนิคที่เหมาะสมสำหรับการทำให้เกิดสารเชิงซ้อน สารเชิงซ้อนของโปรตีนนมที่เป็นผลลัพธ์ (MPMC) มีฟีนอลิกและ . สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญฟลาโวนอยด์เนื้อหามากกว่าโปรตีนนม (MP) ผล DSC พบว่าการซ้อนของ MP ที่มีพอลิแซ็กคาไรด์เพิ่มความเสถียรทางความร้อนอย่างมีนัยสำคัญด้วยการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิการทำให้เสียสภาพ การวิเคราะห์ FTIR ถูกดำเนินการเพื่อระบุกลุ่มการทำงาน และทำการศึกษาพฤติกรรมการไหลของสารเชิงซ้อนที่เตรียมไว้ WSI และ WAI ของโปรตีนนมเพิ่มขึ้นโดยการสร้างสารเชิงซ้อนด้วย NabM หรือ IHM TEM ถูกใช้เพื่อแสดงภาพโครงสร้างจุลภาคของสารเชิงซ้อนที่เตรียมไว้ ในทางกลับกัน สารเชิงซ้อนของโปรตีนนมที่เป็นผลลัพธ์ที่มี isabgol husk mucilage (HM) หรือ Nabeq mucilage(NabM) คาดว่าจะมีประสิทธิภาพเหนือกว่าโปรตีนจากนมพื้นเมืองในด้านสารต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ต้านมะเร็ง โดยสรุป MPMC แสดงคุณสมบัติต้านมะเร็งที่มีลักษณะเฉพาะกับมะเร็งเต้านมแบบจำลองและสายพันธุ์ของเซลล์มะเร็งตับ (MCF7 และ HEPG2 ตามลำดับ) ตามที่พิสูจน์โดยการสอบวิเคราะห์การดูดซึมสีแดงที่เป็นกลาง

MPMC ปรับปรุงทั้งสารต้านอนุมูลอิสระและกิจกรรมต่อต้านการแพร่ขยายพันธุ์ แคสเปสเป็นโปรตีนควบคุมหลักที่เกี่ยวข้องกับการเหนี่ยวนำให้เกิดการตายของเซลล์ การเพิ่มการควบคุมของโปรตีนแคสเปส 3 และการถอดเสียง mRNA (รูปที่ 9A, B) ควบคุมโปรตีนอื่น ๆ ในเส้นทางของการตายของเซลล์ ซึ่งมีลักษณะเฉพาะจากการล่มสลายของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียด้วยการปล่อยไซโตโครม c ที่เกิดจาก Bax และการกระตุ้นของแคสเปส 9 นำไปสู่การมีส่วนร่วมในภายหลังของ caspase 3. การเพิ่มกฎระเบียบของ Casp3, p53 และ Bax พร้อมกับการลดการแสดงออกของ Bcl-2 เปิดเผยว่า MPMC เหนี่ยวนำให้เกิดการตายแบบอะพอพโทซิส โดยการควบคุม p53 จะกระตุ้นการแสดงออกของ Bax ซึ่งจะทำให้เกิดไซโตโครมค ปล่อย ตามด้วยการเปิดใช้งาน caspase-9 และ-3 นอกจากนี้ เป็นที่ทราบกันดีว่า Bcl-2 ยับยั้งการปลดปล่อยไซโตโครมซี ในการศึกษาของเรา การปรับลด Bcl-2 ที่เหนี่ยวนำโดย MPMC แสดงให้เห็นเพื่ออำนวยความสะดวกในการปลดปล่อยไซโตโครมซีที่เหนี่ยวนำโดย Bax ที่ไม่ถูกขัดขวางและการตายของเซลล์ที่ตามมา

ฤทธิ์ต้านมะเร็งของโปรตีน-โพลีแซ็กคาไรด์เชิงซ้อนช่วยให้เกิดความกระจ่างเพิ่มเติมเกี่ยวกับการบังคับใช้ของสารเชิงซ้อนเหล่านี้เพื่อใช้ในการพัฒนาวิธีการรักษามะเร็งที่ราคาไม่แพงและมีประสิทธิภาพโดยมีผลข้างเคียงน้อยที่สุด