กลไกระดับโมเลกุลของ Anti-Melanogenic Gedunin ที่ได้มาจาก Neem Tree

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

Hwang-Ju Jeon 1, Kyeongnam Kim 1, Chaeeun Kim 2, Myoung-Jin Kim 1, Tae-Oh Kim 3,4,5,† และ Sung-Eun Lee 1,2,*,†

เชิงนามธรรม:การสร้างเม็ดสีแสดงถึงชุดของกระบวนการที่สร้างเมลานิน ซึ่งเป็นเม็ดสีผิวที่ป้องกัน (ต่อต้านรังสีอัลตราไวโอเลต) และกำหนดสีผิวของมนุษย์ สารเคมีที่ช่วยลดการผลิตเมลานินเป็นที่ต้องการของตลาดเครื่องสำอางมาโดยตลอด เนื่องจากความสนใจในการดูแลผิว เช่น การฟอกสีฟัน กลไกหลักในการยับยั้งการผลิตเมลานินคือการยับยั้งไทโรซิเนส (TYR) ซึ่งเป็นเอ็นไซม์หลักในการสร้างเมลานิน ที่นี่เราประเมินของแท้ (Ged) ซึ่งเป็นสารลิโมนอยด์ที่เป็นตัวแทนสำหรับการต่อต้านการสร้างเม็ดสี การผลิตเมลานิน ในหลอดทดลอง ถูกกระตุ้นโดยฮอร์โมนกระตุ้นอัลฟา-เมลาโนไซต์ ( -MSH) ในเซลล์มะเร็งผิวหนังของหนูเมาส์ B16F10 Ged ลดการผลิตเมลานินกระตุ้น MSH ยับยั้งการทำงานของ TYR และปริมาณโปรตีน เรายืนยันผลลัพธ์นี้ในแบบจำลอง vivo ina zebrafish สำหรับการสร้างเม็ดสี ไม่มีสัญญาณของความเป็นพิษและความผิดปกติของ zebrafishembryos ในระหว่างการพัฒนาในความเข้มข้นที่ได้รับการบำบัดทั้งหมด Ged ลดจำนวนการผลิตจุดเม็ดสีของตัวอ่อนม้าลายและปริมาณเมลานินของตัวอ่อน ความเข้มข้นสูงของGed (100 ไมโครโมลาร์) ต่ำกว่ากลุ่มควบคุมเชิงบวกอย่างมาก กรดโคจิก (8 มิลลิโมลาร์) ดังนั้น เกดอาจเป็นตัวเลือกที่น่าสนใจสำหรับรีเอเจนต์ต่อต้านการสร้างเม็ดสี

คำสำคัญ: MITF; ปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับไมโครพทาลเมีย ทีอาร์; ไทโรซิเนส; ดีคิว; โดปาควิโนน;TRP-1; โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส 1; TRP-2; โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส 2; MC1R; ตัวรับเมลาโนคอร์ติน 1; -MSH; -ฮอร์โมนกระตุ้นเมลาโนไซต์; ACTH; ฮอร์โมน adrenocorticotropic; งูเห่า; โปรตีน agoutisignaling; ค่าย; ไซคลิกอะดีโนซีนโมโนฟอสเฟต; ครีบ; องค์ประกอบการตอบสนองของค่าย

Cistanche: cistanche แอมเวย์

1. บทนำ

เมลานินถูกสังเคราะห์ขึ้นในเมลาโนโซม ออร์แกเนลล์คล้ายไลโซโซมของเมลาโนไซต์ ในเมลาโนโซมนั้น เมลานินจะถูกสร้างขึ้นในสองเม็ดสี คือ ยูเมลานิน และฟีโอเมลานิน ซึ่งมีสีน้ำตาล-ดำ และแดง-เหลือง ตามลำดับ [1] การสังเคราะห์เม็ดสีเมลานินเหล่านี้เริ่มต้นจากสารตั้งต้น L-tyrosine โดยมีปฏิกิริยาออกซิเดชันของ L-tyrosine ไปเป็นสารประกอบที่เรียกว่า dopaquinone (DQ) และ L-DOPA [2] ในขั้นตอนการเกิดออกซิเดชันนี้ ไทโรซิเนส (TYR) ทำหน้าที่เป็นเอนไซม์จำกัดอัตราของวิถีการสังเคราะห์เมลานินโดยรวม [2,3] TRP-1และ TRP-2 ซึ่งมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับโปรตีนสร้างเม็ดสี กระตุ้นเส้นทางการสังเคราะห์ทางชีวสังเคราะห์ของยูเมลานิน และทำให้เสถียรและกระตุ้นการทำงานของ TYR [1] กระบวนการผลิตเม็ดสีเมลานิน (เรียกว่าการสร้างเม็ดสีเมลาโนเจเนซิส) เกิดขึ้นในเมลาโนโซมของเมลาโนไซต์ ซึ่งเป็นการสังเคราะห์และเก็บรักษาฟอร์เมลานินในไซต์ [4] ในเส้นทางการส่งสัญญาณการสร้างเม็ดสี ตัวรับ melanocortin1 (MC1R) เป็นสมาชิกของตัวรับ G-protein-coupled MCIR เป็นจุดเริ่มต้นสำหรับการส่งสัญญาณการสร้างเม็ดสีและเปิดใช้งานโดยตัวเร่งปฏิกิริยา MC1R เช่น -melanocyte-stimulatinghormone ( -MSH), ฮอร์โมน adrenocorticotropic (ACTH) และโปรตีนส่งสัญญาณ agouti (ASP) [1,2] การกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณ -MSH-MC1R จะเพิ่มความเข้มข้นของไซคลิกอะดีโนซินีโมโนฟอสเฟต (cAMP) และฟอสโฟรีเลตองค์ประกอบการตอบสนองของแคมป์ (CREB) microphthalmia-associatedtranscription factor (MITF) ซึ่งเป็นปัจจัยการถอดรหัสที่ควบคุมยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์เมลานิน TYR โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส-1 (TRP-1) และโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส -2 (TRP-2) โดยผูกมัด M-box ของยีนเหล่านี้ [1,5,6] ในบรรดาตัวรับเมลาโนคอร์ตินทั้งห้าตัว MC1Rมีเมลาโนไซต์ที่อุดมสมบูรณ์ที่สุด โดยหลักแล้วจะควบคุมการผลิตยูเมลานิน (เม็ดสีน้ำตาลดำ) โดยกระตุ้น MC1R เมื่อตัวเร่งปฏิกิริยาของรีเซพเตอร์ เช่น a-MSH และACTH ถูกเปลี่ยนเป็นรีเซพเตอร์นี้ [2,4,7]

แม้ว่าสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและปลาจะมีความแตกต่างกัน แต่ปลาม้าลายก็มี MC5R และ MC3R พิเศษ ซึ่งปลาปักเป้าไม่มี [7] และเส้นทางการส่งสัญญาณนี้ยังคงมีอยู่ในปลาม้าลายและทำงานเหมือนกับที่ทำในเมลาโนไซต์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม [7] นอกจากนี้ จำนวนการศึกษาเกี่ยวกับการยับยั้งการสร้างเม็ดสีเมลานินเพิ่มขึ้นเนื่องจากข้อได้เปรียบในการวิจัย เช่น การพัฒนาอย่างรวดเร็วในตัวอ่อนระยะแรกและความง่ายในการสังเกต [8–11] ในปรากฏการณ์เหล่านี้ การศึกษาก่อนหน้านี้จำนวนมากพบว่าการยับยั้งเส้นทางการส่งสัญญาณนี้ช่วยลดการผลิตเมลานินและพบสารยับยั้งหลายตัว รวมทั้ง bisabolol-Angelone, 4-hydroxy-3-methoxy cinnamaldehyde, anddiphenyl-methylene-hydrazine carbo thiamine [12 –14].

Gedunin (Ged) สารยับยั้งโปรตีนช็อกความร้อน 90 ที่รู้จักกันดีคือ limonoid ซึ่งพบในสกุลของพืช Meliaceae ลิโมนอยด์นี้มีอยู่มากมายใน epicarp ของต้นสะเดาอินเดีย (Azadirachta indica) และมีฤทธิ์ทางชีวภาพที่หลากหลาย รวมทั้งต้านมะเร็ง ยาต้านมาเลเรีย ต้านการอักเสบ เบาหวาน แพ้ ยาฆ่าแมลง สารกำจัดวัชพืช และเชื้อรา [15] ไม่มีรายงานเกี่ยวกับกลไกการต่อต้านการสร้างเม็ดสีของ Ged

ในฐานะที่เป็นยารักษาโรคหรือตัวแทนเครื่องสำอางในการรักษาโรคที่เกี่ยวข้องกับเมลานินหรือการเปลี่ยนแปลงของสีผิว Ged อาจมีข้อดีเนื่องจากคุณสมบัติที่ปลอดภัยและเป็นธรรมชาติของพืช [19] ฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีของ Ged ได้รับการประเมินในหลอดทดลองและในร่างกายโดยใช้เซลล์มะเร็งผิวหนังของเมาส์ B16F10 และตัวอ่อนของม้าลายตามลำดับ เพื่อค้นหาตัวแทนไวท์ติ้งที่เหมาะสม ซึ่งเป็นหนึ่งในส่วนที่ใหญ่ที่สุดของตลาดเครื่องสำอางเชิงพาณิชย์ พร้อมกันผ่านปลาม้าลายที่มีความเป็นพิษเฉียบพลัน ได้ทำการทดสอบเพื่อแสดงให้เห็นว่า Ged อาจมีผลกระทบต่อสัตว์อย่างไร

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. เคมีภัณฑ์และรีเอเจนต์

Ged ถูกซื้อจาก Microsource Discovery Systems, Inc. (Gayloardville, CT, USA) เครื่องกระตุ้นการสร้างเม็ดสี -MSH, สารประกอบต่อต้านการสร้างเม็ดสี และกรดโคจิกซื้อจาก Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) รีเอเจนต์อื่นๆ ทั้งหมดสูงกว่าระดับอณูชีววิทยา

สารสกัดจากซิสแทนเช่

2.2. การเพาะเลี้ยงเซลล์

สายเซลล์มะเร็งเมลาโนมา-มะเร็งในหนูเมาส์ B16F10 ได้มาจาก American TypeCulture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) และเพาะเลี้ยงด้วยซีรั่มวัวในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (v/v) และเพนิซิลลินจัดหาสื่อของ Eagle (GE ที่ดัดแปลงโดย Dulbecco) สถานพยาบาล เมืองชิคาโก รัฐอิลลินอยส์ สหรัฐอเมริกา) ในบรรยากาศที่มีความชื้น โดยมี CO2 ร้อยละ 5 เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงจนกระทั่งเกิดการบรรจบกันถึง 80 เปอร์เซ็นต์ และแบ่งสามครั้งต่อสัปดาห์ด้วยอัตราส่วนการหาร 1:8 เซลล์ถูกสังเกตทุก 12 ชั่วโมง และตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยา จำนวนเซลล์ที่ใช้แล้วมีจำนวนน้อย

2.3. การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์

เพื่อประเมินผลการงอกของ Ged ต่อสายเซลล์เมลาโนมาของเมาส์ B16F10 การทดสอบ MTS ดำเนินการตามโปรโตคอลที่รายงานก่อนหน้านี้ [20] โดยใช้ CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit (Promega, Madison, WI, USA) โดยสังเขป 1 × 103 เซลล์ถูกเพาะในแต่ละหลุมของจานหลุม 96- หลุมและบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงสำหรับการกู้คืน หลังจากการฟักไข่ Ged ได้รับการบำบัดด้วยความเข้มข้นต่างๆ: 0, 3.12, 6.25,12.5 25, 50 และ 75 µM หลังจาก 48 ชั่วโมง, 20 ไมโครลิตรของสารละลายสำหรับการสอบวิเคราะห์ MTS ถูกเติมไปยังตัวกลาง 100-ไมโครลิตรที่มี Ged และปราศจาก Ged แต่ละตัว หลังจากการฟักตัวเพิ่มเติมเป็นเวลา 4 ชั่วโมง การดูดกลืนแสงถูกวัดที่ 490 นาโนเมตร โดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ Multiskan GO (ThermoScientific, Waltham, MA, USA) ข้อมูลการดูดกลืนแสงถูกทำให้เป็นมาตรฐานด้วยกลุ่มควบคุมและแสดงเป็นอัตราส่วนการยับยั้ง

2.4. การกำหนดปริมาณเมลานิน

ปริมาณเมลานินนอกเซลล์และภายในเซลล์ถูกกำหนดตามวิธีการแก้ไขที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ [21] -MSH (200 นาโนโมลาร์) เซลล์เมลาโนมาที่บำบัดไว้ล่วงหน้าถูกบ่มเป็นเวลา 72 ชั่วโมงโดยมีและไม่มีกรดโคจิก (200 ไมโครโมลาร์) และ Ged (25 และ 50 ไมโครโมลาร์) หลังจากการบ่ม สื่อเพาะเลี้ยงที่ปราศจากฟีนอล-เรดถูกรวบรวม และเซลล์ที่เพาะเลี้ยงถูกเก็บเกี่ยวด้วยบัฟเฟอร์การสลาย RIPA เซลล์ที่เก็บเกี่ยวถูกหมุนเหวี่ยงที่ 4 ◦C, 13,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 15 นาทีและเม็ดถูกละลายใน 1 โมลาร์ NaOH, สารละลาย DMSO 10 เปอร์เซ็นต์ที่ 95 ◦C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง การดูดกลืนแสงของตัวกลางที่เก็บรวบรวมและเมลานินที่ละลายถูกวัดที่ 470 นาโนเมตรโดยใช้สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ ตัวอย่างทั้งหมดถูกทำให้เป็นมาตรฐานด้วยความเข้มข้นของโปรตีนที่กำหนดหาตามวิธี BCA

2.5. การทดสอบกิจกรรมไทโรซิเนสภายในเซลล์

กิจกรรมของไทโรซิเนสของเซลล์ถูกกำหนดโดยการวัดอัตราการออกซิเดชันของ L-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ โดยมีการดัดแปลงเล็กน้อย [22].B16F10 เซลล์เมลาโนมาของหนูเมาส์ถูกปรับสภาพด้วย -MSH 200 nM เป็นเวลา 1 ชั่วโมงตามด้วยการบำบัดด้วย 200 µM กรดโคจิก ที่มีและไม่มี Ged (25 และ 50 µM) และบ่ม 72 ชั่วโมง หลังจากการฟักไข่ เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวด้วยไลซิสบัฟเฟอร์ที่มีตัวยับยั้งโปรตีน และตัวอย่างถูกหมุนเหวี่ยงที่ 13,000× ก., 4 ◦ซ ​​เป็นเวลา 15 นาที supernatant ถูกย้ายไปยังหลอดใหม่ แต่ละตัวอย่าง (20 ไมโครลิตร) และ 80 ไมโครลิตรของ L-DOPA 40 มิลลิโมลาร์ถูกผสมในจานหลุม 96-หลุมและบ่มที่ 37 ◦C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง การดูดซับที่ 475 นาโนเมตรโดยออกซิเดชันL-DOPA ถูกกำหนดหาโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท ค่าการดูดกลืนแสงถูกทำให้เป็นมาตรฐานด้วยความเข้มข้นของโปรตีนของแต่ละตัวอย่าง

ประโยชน์ของสารสกัดจาก Cistanche: ยับยั้งการแสดงออกของไทโรซิเนส

2.6. การแยก RNA และ qRT-PCR

การแยก RNA ทั้งหมดและ qRT-PCR ถูกทำขึ้นตามวิธีการที่บรรยายไว้ก่อนหน้านี้โดย [18] RNA ทั้งหมดถูกสกัดโดยย่อจากแต่ละตัวอย่างโดยใช้รีเอเจนต์ Trizol (Ambion, Austin, TX, USA) ความเข้มข้นของอาร์เอ็นเอที่สกัดได้ทั้งหมดถูกกำหนดโดยการดูดกลืนแสงที่ 260 นาโนเมตร และตรวจสอบคุณภาพของอาร์เอ็นเอทั้งหมดด้วยอัตราส่วนการดูดกลืนแสงที่ 260:280 และ 260:230 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท Multiskan GO (Thermo Scientific) TotalRNA (5 ไมโครกรัม) ถูกสังเคราะห์เป็น cDNA ด้วยชุดสังเคราะห์ cDNA สายแรกของแม็กซิมา (Thermo Scientific) และ cDNA สังเคราะห์ ระดับการแสดงออกของ mRNA ของ Mitf, Tyr, Trp-1 และ Trp-2 ถูกกำหนดโดยใช้ Luna Universal qPCR Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) และ QuantStudio 3 Real-Time PCR ( Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ตามระเบียบวิธีของผู้สอน ระดับการแสดงออกของยีนถูกทำให้เป็นมาตรฐานด้วย glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)

2.7. การวิเคราะห์ภูมิคุ้มกัน

การวิเคราะห์อิมมูโนโบลต์ดำเนินการตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [23] โปรตีนของเซลล์ B16f10 ถูกรวบรวมโดยใช้บัฟเฟอร์ Ceti lysis (Translab, Daejeon, เกาหลี) และกำหนดความเข้มข้นด้วยชุดทดสอบโปรตีน Pierce BCA (Thermo Scientific) ปริมาณโปรตีนที่เท่ากัน (30 ไมโครกรัม) ของแต่ละตัวอย่างถูกบรรจุลงบนเจลโซเดียมโดเดซิล ซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์และอิเล็กโตรโฟเรส หลังจากแยกจากกัน โปรตีนถูกถ่ายโอนไปยังเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลส และเมมเบรนถูกบล็อกในสารละลายนมที่ไม่ใช่ไขมัน 10 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 2 ชั่วโมง เยื่อหุ้มที่ถูกปิดกั้นถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิในชั่วข้ามคืนที่ 4 ◦C ตามด้วยการฟักตัวอีกครั้งด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ 26 ◦C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง แอนติบอดีปฐมภูมิและทุติยภูมิถูกเจือจางในอัตราส่วน 1:1000 และ 1:3000 ตามลำดับ สุดท้ายนี้ เยื่อกระดาษซับถูกบันทึกโดยใช้ ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) กับรีเอเจนต์ ECL (SuperSignal, Thermo Scientific) ซื้อแอนติบอดีหลักและรองจากเทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ (ดัลลัส, เท็กซัส, สหรัฐอเมริกา)

2.8. การทดสอบตัวอ่อนของปลาม้าลาย

Wild-type zebrafish were thankfully obtained from Professor Tae-Lin Huh, the School of Life Science and Biotechnology, Kyungpook National University, Daegu, Republic of Korea. The strain was kept for more than eight generations in a laboratory condition of 26 ◦C ± 1 ◦C, and a day-to-night ratio of 8:16. General fish care and breeding conditions, as previously described, were followed [24]. Ten groups of zebrafish were mated to obtain embryos with a mating ratio (male: female, 1:2), and among obtained embryos, healthy embryos had >อัตราการผสมพันธุ์ร้อยละ 80 คัดเลือกและนำไปใช้ในการทดลอง ตัวอ่อนที่แข็งแรงสิบสองตัวในแต่ละกลุ่มที่บำบัดถูกตั้งอยู่ในแต่ละหลุมของ96-เพลตที่มีและไม่มี Ged (25, 50, 75 และ 100 µM) และกรดโคจิก (8 mM) ในตัวกลาง E3 ที่ระยะโล่ 24 ชั่วโมงหลังการปฏิสนธิ (h/pf) เอ็มบริโอถูกกำจัดออก และตรวจสอบความผิดปกติทุก 24 ชั่วโมงจนถึง 72 ชั่วโมง/พีเอฟ ฟีโนไทป์ของตัวอ่อนถูกถ่ายภาพในมุมมองด้านข้างและด้านหลังเพื่อเปรียบเทียบความแตกต่างระหว่างกลุ่มต่างๆ โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบตั้งตรง BX53 กับ DP80CCD (Olympus Life Science Solutions, Waltham, MA, USA) หลังจากถ่ายภาพ ตัวอ่อนถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วย Ceti lysis buffer (TransLab) และดำเนินการหาความเข้มข้นของเมลานิน ซึ่งเท่ากับการกำหนดปริมาณเมลานินของเซลล์ B16F10

2.9. การวิเคราะห์ทางสถิติ

การวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดที่นำเสนอในการศึกษานี้ดำเนินการโดยใช้ GraphPad Prismv.8.0 (ซอฟต์แวร์ GraphPad, ซานดิเอโก, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) ANOVA ทางเดียวกับการทดสอบของ Tukey ใช้สำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการ ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติที่ p <>

3. ผลลัพธ์

3.1. ผลพิษต่อเซลล์ของไพเพอร์ลองกูมีนในเซลล์ B16F10

ก่อนตรวจสอบฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีของ Ged เราทำการทดสอบความมีชีวิตในเซลล์ B16F10 เพื่อกำหนดช่วงขนาดยาในการศึกษานี้ ในช่วงความเข้มข้นตั้งแต่ 3.12 ถึง 50 ไมโครโมลาร์ เซลล์ไม่แสดงผลการยับยั้งใดๆ ต่อการเจริญเติบโต และการเพิ่มจำนวนสัมพัทธ์ของพวกมันอยู่ระหว่าง 91.0 เปอร์เซ็นต์ ถึง 118.7 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 1) ในทางตรงกันข้าม แม้ว่าจะมีนัยสำคัญทางสถิติ แต่กลุ่มที่ได้รับการบำบัด 75 µM มีการยับยั้งการเจริญเติบโตเล็กน้อย (89.3 เปอร์เซ็นต์ ; รูปที่ 1) ดังนั้น ความเข้มข้นสูงสุดถูกตั้งค่าเป็น 50 ไมโครโมลาร์ในการทดลองสายเซลล์ที่เหลือ

รูปที่ 1. ความเป็นพิษต่อเซลล์ของ gedunin (Ged) ในเซลล์ B16F10

3.2. Gedunin ยับยั้งการผลิตเมลานินและกิจกรรมของไทโรซิเนสภายในเซลล์ในเซลล์มะเร็งเมลาโนมาของเมาส์ B16F10

เราประเมินผลการต่อต้านการสร้างเม็ดสีของ Ged ในเซลล์มะเร็งผิวหนังของเมาส์ B16F10 ตัวเอก MC1R, -MSH, เหนี่ยวนำการผลิตเมลานินภายในเซลล์และนอกเซลล์อย่างมีประสิทธิผล (รูปที่ 2a–c) สีของสื่อที่เก็บรวบรวมมีสีเข้มด้วย -MSH (รูปที่ 2a) สีจางลงด้วยการเติม Ged และผลกระทบขึ้นอยู่กับขนาดยา (รูปที่ 2a) ผลลัพธ์ของปริมาณเมลานินทั้งหมด -MSH เพิ่มการผลิตเมลานินในเมลาโนไซต์ได้สูงกว่ากลุ่มควบคุมประมาณเจ็ดเท่าและกระตุ้นการสร้างเมลานินให้ลดลงโดยการเติมกรดโคจิก ซึ่งเป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวกที่รู้จักกันดีในการสร้างเมลานิน (รูปที่ 2d) เกดยังลดการผลิตเมลานินที่กระตุ้นสิ่งเร้าในเมลาโนไซต์ที่ความเข้มข้นทั้งหมดที่ทดสอบในการศึกษานี้ (รูปที่ 2d) นอกจากนี้ ในการทดสอบกิจกรรมของไทโรซิเนส Ged ยังแสดงผลการยับยั้งอย่างแข็งแกร่งต่อเอ็นไซม์ที่จำกัดอัตรา ไทโรซิเนส ในการสร้างเมลาโนเจเนซิส (รูปที่ 2e) กิจกรรมการทบทวนของไทโรซิเนสในกลุ่มที่ได้รับการบำบัดด้วย Ged 50 µM ลดลง 20 เปอร์เซ็นต์ และ 12.24 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมและกลุ่มที่กระตุ้นด้วย a-MSH ตามลำดับ

รูปที่ 2. ฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีของของแท้ (Ged) ต่อฮอร์โมนกระตุ้นอัลฟา-เมลาโนไซต์ ( -MSH) - กระตุ้นการสร้างเมลานินในเซลล์ B16F10

3.3. Gedunin ลดการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสี -MSH

-MSH (200nM) เหนี่ยวนำระดับ mRNA ของ Mitf; ปัจจัยการถอดรหัสการสร้างเม็ดสีและยีนเป้าหมาย Tyr, Trp-1 และ Trp-2 (รูปที่ 3) การรักษา Ged ลดระดับ mRNA ของยีนทั้งหมดในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาที่ความเข้มข้น 25 และ 50 µM (รูปที่ 3) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมเชิงบวก กรดโคจิก (200 µM) Ged มีประสิทธิภาพในการลด mRNA มากกว่า ระดับของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสีในเซลล์ B16F10 นอกจากนี้ ระดับของ Mitfand Tyr ลดลง 0.10- และ 0.26-เท่าต่ำกว่าเซลล์ที่เหนี่ยวนำโดย -MSH ตามลำดับที่ความเข้มข้น 50 µM (รูปที่ 3a,b) ระดับ mRNA ที่ควบคุมต่ำของยีนเหล่านี้ทำให้ระดับ Tyr ลดลง และลดปริมาณการผลิต TYR ของเมลานินน้อยกว่ากลุ่มควบคุม

รูปที่ 3 ผลของการลดยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสี

3.4. Gedunin ลด TYR และ TYR-1 จำนวน

TYR มีบทบาทสำคัญในการสร้างเม็ดสี และระดับโปรตีนของเอนไซม์นี้ส่งผลต่อการสร้างเม็ดสีโดยตรง เราพยายามยืนยันการเปลี่ยนแปลงของปริมาณโปรตีน TYR ซึ่งเกิดจากระดับ mRNA ที่ลดลงผ่านการวิเคราะห์อิมมูโนบลอต TYR ลดลงอย่างเห็นได้ชัดเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม และ -MSH ถูกบำบัดโดยขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 4a) นอกจากนี้ TRP-1 ซึ่งเป็นปัจจัยการถอดรหัสที่จำเป็นของ TYR ก็ลดลงเล็กน้อย (รูปที่ 4a) ผลลัพธ์ชัดเจนมากขึ้นเมื่อแต่ละแถบของโปรตีนถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดย GAPDH ในครัวเรือน (รูปที่ 4b,c)

รูปที่ 4 Western blotting ของ alpha-melanocyte-stimulating hormone ( -MSH) ทำให้เกิดเซลล์ B16F10 ด้วยการรักษาที่แท้จริง

3.5. ความเป็นพิษของ Gedunin ต่อ Zebrafish ในการพัฒนาระยะแรก

การประเมินทางพิษวิทยาของ Ged ต่อการพัฒนาในระยะเริ่มต้นของปลาม้าลายได้ดำเนินการก่อนที่จะประเมินการทดสอบการต่อต้านการสร้างเม็ดสีของ Ged ในร่างกาย ความผิดปกติทางสัณฐานวิทยาของตัวอ่อนม้าลายไม่ได้สังเกตพบในความเข้มข้นใดๆ ที่บำบัดแล้วของ Ged (รูปที่ 5a) ความเข้มข้นของ Ged ที่ทดลองแล้ว 25, 50, 75 และ 100 µM อัตราการรอดชีวิตของกลุ่มที่ได้รับ Ged ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญที่ 72 ชั่วโมงของระยะเวลาที่บำบัดด้วยสารเคมี (รูปที่ 5b)

รูปที่ 5. ความเป็นพิษของปลาดุกแท้ (เกด) ต่อการพัฒนาระยะเริ่มต้นของปลาม้าลาย

3.6. Gedunin ลดปริมาณเมลานินในตัวอ่อนม้าลาย

เนื่องจาก Ged ไม่มีความเป็นพิษต่อพัฒนาการในตัวอ่อนของ zebrafish เราจึงตรวจสอบฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีที่ระดับความเข้มข้นของ Ged, 25, 50, 75 และ 100 µM ในการสังเกตเชิงทฤษฎี เราตรวจสอบจุดของรงควัตถุ zebrafish; มุมมองด้านข้างเหนือศีรษะของตัวอ่อนม้าลายแสดงไว้ในรูปที่ 5a กรดโคจิกมีฤทธิ์ยับยั้งการสร้างเม็ดสีการผลิตตัวอ่อนของปลาม้าลาย เอ็มบริโอของปลาเซบราฟิชที่บำบัดด้วยเจดยังมีจุดสีบนศีรษะน้อยกว่าด้วย (รูปที่ 6a) นอกจากนี้ ปริมาณเมลานินทั้งหมดที่สกัดจากตัวอ่อนของ zebrafish ลดลงหลังจากสัมผัส Ged เป็นเวลา 72 ชั่วโมง ทั้งในกรดโคจิก กลุ่มควบคุมเชิงบวก และกลุ่มที่ได้รับ Ged (รูปที่ 6b,c)

รูปที่ 6 ผลของของแท้ต่อการผลิตเมลานินในร่างกาย

4. การอภิปราย

ในการศึกษานี้ ประเมินคุณสมบัติการยับยั้งของ Ged ต่อการผลิตเมลานิน จากการค้นพบของเรา ความสามารถในการยับยั้งของ Ged นั้นสูงกว่ากรดโคจิกประมาณ 1198-เท่า (รูปที่ 2) และความเข้มข้นของ Ged ( 50 ไมโครโมลาร์) ต่ำกว่ากรดโคจิก (200 ไมโครโมลาร์) กลุ่มควบคุมเชิงบวก จับคู่กับกิจกรรมในเซลล์ไทโรซิเนสที่อ่อนแอลง ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่เปลี่ยน L-Dopa เป็น DQ ซึ่งเป็นสารตั้งต้นหลักของยูเมลานินและฟีโอเมลานิน กิจกรรม Tyr ที่ลดลงทำให้เกิดการชะลอตัวของกระบวนการผลิตทั้งเมลานินและการขาดแคลนผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายทั้งสองอย่าง ยูเมลานินและฟีโอเมลานิน [1–3] ระดับการถอดเสียงและ TYR ถูกควบคุมโดยชุดของปัจจัยการถอดรหัส: Mitf, Trp-1 และ Trp-2 [1,2] ปริมาณโปรตีนและระดับ mRNA ที่ลดลงหมายถึงการกระตุ้น MC1R ผ่านแกนส่งสัญญาณ -MSH–MC1R–PKA–CREB โดย -MSH ถูกลดระดับด้วยการบำบัด Ged ที่ความเข้มข้น 25 และ 50 µM โดยขึ้นอยู่กับขนาดยาทั้งใน PCR เชิงปริมาณและ Western blotting ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ การลดปริมาณของ MITF ทำให้เกิดการขาดแคลน Tyr, Trp-1 และ Trp-2 ผ่านการผูกมัดกับบริเวณโปรโมเตอร์ของยีนเหล่านี้น้อยลง [25–27] การลดปัจจัยการถอดรหัสเหล่านี้ทำให้ TYR ลดลงและยับยั้งการผลิตเม็ดสีเมลานินในเซลล์ B16F10 นอกจากนี้ ผลลัพธ์ในปัจจุบันยังแสดงให้เห็นผลการยับยั้ง TYR ของ Ged ซึ่งเป็นจุดวิกฤตอีกจุดหนึ่งของการผลิตเมลานินในเมลาโนไซต์ Ged ยังแสดงผลการยับยั้งการผลิตเม็ดสีในระหว่างการพัฒนาระยะเริ่มต้นของปลาม้าลายในแบบจำลอง ในหลอดทดลอง และในร่างกาย ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าการรักษาด้วย Ged เป็นเวลา 72 ชั่วโมงช่วยลดการสร้างเม็ดสี zebrafish ลงอย่างเห็นได้ชัด ปริมาณเมลานินทั้งหมดและระดับ mRNA ของยีนที่เกี่ยวข้องลดลงเมื่อมี Ged และแนวโน้มของผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนคุณสมบัติในการต่อต้านการสร้างเม็ดสีในหลอดแก้วของ Ged อย่างมาก

ยิ่งไปกว่านั้น ความสามารถในการยับยั้งของ Ged นั้นแข็งแกร่งกว่ากรดโคจิกมาก ซึ่งเป็นหนึ่งในสารประกอบที่รู้จักกันทั่วไปว่าเป็นน้ำยาฟอกสีฟันในอุตสาหกรรมเครื่องสำอาง [6,28] ความเข้มข้นที่ Ged กระทำนั้นค่อนข้างต่ำกว่ากรดโคจิก นอกจากนี้ รายงานก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าสารทำปฏิกิริยาไวท์เทนนิ่งอีกชนิดหนึ่ง อาร์บูติน มีฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีที่คล้ายคลึงกันกับกรดโคจิก [2] ดังนั้น Ged จึงควรได้รับการพิจารณาว่าเป็นน้ำยาฟอกสีฟันเพื่อทดแทนอาร์บูตินหรือกรดโคจิกที่ใช้อยู่ในปัจจุบัน และเป็นยาต้านเมลาโนมาดรักในแง่ของคุณสมบัติที่มีแนวโน้มดี

ก่อน [29,30] แนะนำให้ใช้คุณสมบัติต่อต้านการสร้างเม็ดสีของ Ged แต่การศึกษาเหล่านี้ไม่ได้เน้นที่กลไกเฉพาะของผลกระทบ และพวกเขาเพียงแค่สังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงของผลต่อเซลล์และปริมาณการผลิตเมลานินในหลอดทดลอง ในขณะที่ฤทธิ์ต้านการงอกขยายและผลการยับยั้งต่อ นิพจน์ HSP 90 ถูกเน้น [31–33] มีการรายงานความเป็นไปได้ของ Ged ในฐานะตัวแทนต่อต้านการสร้างเม็ดสี อย่างไรก็ตาม การศึกษาเหล่านี้ไม่ได้มุ่งเน้นไปที่กลไกเฉพาะของผลกระทบ และพวกเขาเพียงแค่สังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงของผลกระทบต่อเซลล์และปริมาณการผลิตเมลานินในหลอดทดลอง เราลองกำหนดกลไกระดับเซลล์โดยยืนยันระดับ mRNA และปริมาณโปรตีนของยีนที่เกี่ยวข้องกับการผลิตเมลานิน ร่วมกับรายงานก่อนหน้านี้ การศึกษานี้แสดงให้เห็นมุมมองใหม่ของ Gedas ซึ่งเป็นส่วนประกอบของส่วนผสมเครื่องสำอางเพื่อประโยชน์สองประการ ได้แก่ การต้านมะเร็งที่โดดเด่นและการต่อต้านการสร้างเม็ดสี ซึ่งอาจนำไปใช้กับทั้งมะเร็งผิวหนังที่เกิดจากรังสียูวีและการสะสมของเม็ดสี โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ในเวลาเดียวกัน

cistanche extract powder : ล้างอนุมูลอิสระ

5. สรุปผลการวิจัย

โดยสรุป ผลลัพธ์ทั้งหมดเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าสารประกอบใหม่ Ged อาจใช้เป็นตัวทำปฏิกิริยาการสร้างเม็ดสีสำหรับการสังเคราะห์ทางเมลานิน ซึ่งทำให้โปรตีนปลายน้ำ TYR, TRP-1 และ TRP-2 สั้นลงด้วยปริมาณที่ลดลงเมื่อเทียบกับต้นแบบ ระเบียบโปรตีน MITF ทั้งในหลอดทดลองและในร่างกายของแบบจำลองม้าลาย

เม็ด cistanche