หลักฐานระดับโมเลกุลของศักยภาพการยับยั้งของเมลาโทนินต่อ NaAsO2-การเจริญวัยในหนูเพศผู้ ตอนที่ 2

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

3. อภิปราย

นอกจากนี้ยังใช้กันอย่างแพร่หลายในการเกษตรเนื่องจากมีคุณสมบัติต้านเชื้อรา ต้านแบคทีเรีย กำจัดวัชพืช และกำจัดหนู อันเป็นผลมาจากการใช้สารกำจัดวัชพืช ยาฆ่าแมลง และยาปฏิชีวนะที่ใช้สารหนูอย่างแพร่หลาย [28] ในทางกลับกัน MLT ได้แสดงฤทธิ์ต้านการอักเสบ ต่อต้านอนุมูลอิสระ และต่อต้านอนุมูลอิสระ [29] การกำจัดออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยาและไนโตรเจนชนิดต่างๆ และการกระตุ้นการต่อต้านอนุมูลอิสระจะช่วยป้องกันความเสียหายของเนื้อเยื่อและสกัดกั้นปัจจัยการถอดรหัสของโปรโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบ [30] MLT ช่วยลดความเครียดออกซิเดชันที่เกิดจากสารหนูให้น้อยที่สุด ดังที่แสดงในการศึกษานี้ การสัมผัสกับ ÷, 1/3 และ 1/10 LD50 NaAsO ทำให้ความเข้มข้นของเนื้อเยื่อโดยรวมเพิ่มขึ้นในเนื้อเยื่อหัวใจและปอดในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา ในทางกลับกันการรักษาด้วย MLT พบว่าความเข้มข้นของเนื้อเยื่อลดลงcistanche ก้านMDA เป็นเครื่องหมายของไขมันเปอร์ออกซิเดชันที่มีบทบาทสำคัญในการเพิ่มขึ้นของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันโดยการเพิ่ม ROS และเครื่องหมายการอักเสบในระยะเริ่มต้น เช่น TNF-o [31,32] ตรงกันข้ามกับกลุ่มควบคุมและกลุ่ม MLT เราพบว่าการได้รับ NaAsO2 ทำให้ MDA เพิ่มขึ้นตามขนาดยาอย่างมีนัยสำคัญ และต่อมาคือระดับ ROS การบำบัดด้วย MLT แสดงให้เห็นว่าสามารถย้อนกลับระดับ MDA และ ROS ของ NaAsO2- ที่เหนี่ยวนำทั้งในตัวอย่างหัวใจและปอด ผลลัพธ์ของเราคล้ายกับผลลัพธ์ของ Taysi et al. ซึ่งระบุว่า MLT สามารถย้อนกลับการบาดเจ็บจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่เกิดจากการฉายรังสี [33] HMGB1 เป็นไซโตไคน์ที่มีการอักเสบซึ่งถูกปล่อยออกมาในช่วงระยะที่ล่าช้าของการอักเสบ เราพบระดับสูงสุดของ HMGB1 ในเนื้อเยื่อหัวใจและปอดที่สัมผัสกับ 1/2 LD50 NaAsO2 แม้หลังจากการสกัดเนื้อเยื่อในวันที่ 30 ของการวิเคราะห์ ในทางกลับกัน การบำบัดด้วย MLT ส่งผลให้ระดับ HMGB1 ลดลง

ในทำนองเดียวกัน ตัวอย่างพลาสมาที่สัมผัส 1/2, 1/3 และ 1/10 LD50 NaAsO2 แสดงระดับ TNF- และ 8OHdG ในระดับสูง ซึ่ง MLT ป้องกันไว้ได้ ซึ่งชี้ให้เห็นถึงบทบาทของมันในการป้องกันความเสียหายของ DNA ออกซิเดชัน [34] ระดับแลคเตทสูงถูกใช้เป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพสำหรับเนื้อเยื่อขาดออกซิเจนและความไม่เพียงพอของยล [35] หลังจากผ่านไป 30 วัน ระดับแลคเตทเพิ่มขึ้นทั้งในเนื้อเยื่อหัวใจและปอด ซึ่งบ่งชี้ว่า NaAsO มีผลเสียต่อไมโตคอนเดรีย ในทางกลับกัน พบว่า MLT ช่วยป้องกันผลกระทบนี้ โดยลดระดับแลคเตทในเนื้อเยื่อทั้งสอง

KSL15

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

ผลการป้องกันของ MLT ยังได้รับการยืนยันโดยการประเมินระดับการแสดงออกของ KL, TERT และ TRADD mRNA KL ได้รับการระบุว่าเป็นยีนที่มีบทบาทในกระบวนการชราภาพ [36] ในหนู arsenite ช่วยลดการไหลเวียนและการทำงานของไต KL และทำให้เกิดความเสียหายต่อท่อ [37] ในเนื้อเยื่อหัวใจที่สัมผัสกับ NaAsO2 เราพบว่าการลดลงอย่างมีนัยสำคัญตามขนาดยา (p<0.0001) in="" the="" expression="" of="" mrna="" kl,="" which="" was="" recovered="" after="" mlt=""><0.0001). our="" results="" were="" similar="" to="" those="" of="" a="" study="" conducted="" on="" kl="" mutant="" mice,="" a="" genetic="" model="" of="" aging,="" in="" which="" mlt="" minimized="" oxidative="" stress="" and="" memory="" loss="" associated="" with="" kl="" deficiency="" [38].="" the="" counteracting="" effect="" of="" mlt="" on="" aging="" was="" further="" confirmed="" in="" our="" study="" by="" the="" mrna="" tert="" gene="" expression="" level.="" in="" telomeres,="" which="" are="" strongly="" conserved="" and="" susceptible="" to="" age-dependent="" gradual="" attrition="" [39],="" naaso2="" effectively="" doubled="" tert="" gene="" mrna="" expression="" in="" a="" dose-dependent="" manner.="" at="" the="" same="" time,="" mlt="" appeared="" to="" reduce="" and="" normalize="" tert="" overexpression="" in="" the="" treatment="" groups,="" indicating="" that="" mlt="" counteracts="" naaso2-induced="" heart="" tissue="" aging.="" tradd="" is="" a="" cell="" death="" gene="" that="" contributes="" to="" tissue="" aging="" by="" activating="" nf-kb="" and="" inducing="" apoptosis="" [4041].="" the="" apoptosis-inducing="" effect="" of="" naaso,="" on="" heart="" tissues,="" was="" confirmed="" by="" a="" significant="" increase="" in="" tradd="" gene="" mrna="" expression,="" which="" was="" decreased="" by="" mlt="" treatment.="" this="" indicates="" that="" mlt="" treatment="" restores="" regular="" tradd="" gene="" mrna="" expression="" and="" thus="" prevents="" heart="" tissue="" injury="" (figure="" 5).="">ประโยชน์ของ cistanche tubulosa และผลข้างเคียงในการศึกษานี้ การให้ยา IP ของสารทั้งสองชนิดเป็นที่ต้องการมากกว่าทางช่องปากเพื่อหลีกเลี่ยงการปรับเปลี่ยนและการย่อยสลายของระบบทางเดินอาหารที่อาจเกิดขึ้นได้ นอกจากนี้ การบริหารทรัพย์สินทางปัญญายังให้การดูดซึมที่รวดเร็วและเชื่อถือได้มากกว่าทางปาก ทำให้มั่นใจว่าการดูดซึมที่เหมาะสมของสารทั้งขนาดเล็กและขนาดใหญ่ในการศึกษาทดลองของหนู [42]

การศึกษาและบทวิจารณ์หลายชิ้นระบุว่าเมลาโทนินมีผลในการป้องกันที่สูงกว่าสารต่อต้านอนุมูลอิสระแบบคลาสสิกอย่างมีนัยสำคัญ [43] ในการศึกษาเหล่านี้ พบว่าเมลาโทนินมีประสิทธิภาพมากกว่าวิตามินอี[44-46] เบต้าแคโรทีน [47l และกรดแอสคอร์บิก[48,49] นอกจากนี้ ในการตั้งค่าทางคลินิก รวมถึงโรคเรื้อรัง เช่น โรคข้ออักเสบรูมาตอยด์ [50] ความดันโลหิตสูงในเลือด [51] และภาวะขาดเลือดขาดเลือด [52] มีรายงานผลการต่อต้านอนุมูลอิสระที่เป็นประโยชน์ของเมลาโทนินเมื่อเปรียบเทียบกับวิตามิน ในทำนองเดียวกัน เราพบว่าการได้รับ NaAsO2 ทำให้เกิดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในปอดและเนื้อเยื่อของหัวใจ ขึ้นอยู่กับขนาดยาและความเป็นพิษของสารเคมี ที่ระดับสูง ระดับการสัมผัส LD50 NaAsO2, TNF- และ 8OHdGin พลาสมาและ MDA, ROS และ HMGB1 ในเนื้อเยื่อหัวใจและปอดเพิ่มขึ้น ข้อเท็จจริงเหล่านี้บ่งชี้ว่า NaAsO การได้รับสารกระตุ้นความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในเนื้อเยื่อปอดและหัวใจโดยการผลิต MDA และ ROS และเพิ่มการไหลเวียนของไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบ เช่น TNF- เนื้อเยื่อขาดออกซิเจน ไมโทคอนเดรียไม่เพียงพอ และการอักเสบอาจเกิดจากเนื้อเยื่อแลคเตทและระดับ HMGB1 สูง ระดับ 8OHdG ในพลาสมาที่เพิ่มขึ้นแนะนำว่า NaAsO2 ทำให้เกิดความเสียหายต่อ DNA จากการวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อ ปริมาณ 1/2 ของ NaAsO2 ในเนื้อเยื่อหัวใจของหนูทำให้เกิดเนื้อร้ายของเซลล์มีความสัมพันธ์กับผลลัพธ์ของการแสดงออก mRNA ของยีน TERT และ TRADD ซึ่งแสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในผลของการกระตุ้นการตายของเซลล์ของสารหนูต่อเนื้อเยื่อหัวใจ 4 และ 5) อย่างไรก็ตาม ด้วยการใช้ MLT และ NaAsO2 ร่วมกัน การกำจัดเนื้อร้ายมีศักยภาพและเร็วกว่าในการมีอยู่ของ MLT มากกว่าในกรณีที่ไม่มี การกวาดล้างนี้เห็นได้จากระดับการแสดงออกของ mRNA ที่ลดลงของยีน TERT และ TRADD ในทำนองเดียวกัน MLT ได้ลดทอนพิษของสารหนูในตัวอย่างปอดที่ตรวจทางจุลพยาธิวิทยา โดยมีความสัมพันธ์กับผลลัพธ์ที่ได้จากตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของความเครียดจากการอักเสบและการออกซิเดชัน และคะแนนของภาวะเลือดคั่งในเลือดสูง อาการบวมน้ำ และเซลล์อักเสบที่ลดลง (ตารางที่ 4) นอกจากนี้ การได้รับ NaAsO2 ส่งผลให้การแสดงออกของ KL mRNA ลดลงและการแสดงออกของ TERT และ TRADD mRNA ที่สูงขึ้น ซึ่งบ่งชี้ถึงความเสี่ยงของการแก่ของเนื้อเยื่อหัวใจและการตายของเซลล์

ในทางกลับกัน การรักษาด้วย MLT ช่วยลดระดับ MDA, ROS, HMGB1 และแลคเตทในเนื้อเยื่อปอดและหัวใจ รวมทั้งระดับ TNF-c และ 8OHdG ในพลาสมา นอกจากนี้ยังเพิ่มการแสดงออกของ mRNA ของยีน KL ในขณะที่ยับยั้งการแสดงออกของ mRNA ของยีน TERT และ TRADD สิ่งนี้บ่งชี้ว่า MLT ปกป้องเนื้อเยื่อปอดและหัวใจโดยการย้อนกลับความเสี่ยงของการแก่ชราที่เกิดจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันซึ่งกระตุ้นโดย NaAsO อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่อสำรวจบทบาทการป้องกันของ MLT ต่อการเสื่อมสภาพที่เกิดจากสารหนูในเนื้อเยื่ออื่นๆ เช่น ตับและไต และประสิทธิภาพของ MLT ในการลดระดับสารหนูในเนื้อเยื่อ

KSL16

Cistanche สามารถต่อต้านริ้วรอย

4. วัสดุและวิธีการ

4.1.เคมีภัณฑ์

MLT(หมายเลข CAS 73-31-4), NaAsO2(หมายเลข CAS 7784-46-5), Suprapur HNO3 (เมอร์ค, ดาร์มสตัดท์, เยอรมนี) และสารเคมีอื่นๆ ทั้งหมดที่ใช้ในการศึกษานี้ ซื้อมาจาก Sigma-Aldrich(GmbH, มิวนิก , เยอรมนี). ชุดแยกแลคเตทและชุด ELISA สำหรับการวิเคราะห์กลุ่ม box1(HMGB1) ที่มีความคล่องตัวสูงถูกซื้อจาก ZellBio GmbH (อุลม์ มิวนิก เยอรมนี) และได้รับชุดวิเคราะห์ TNF จาก Diaclone (Besancon Cedex ประเทศฝรั่งเศส) ชุดสังเคราะห์ cDNA แบบเกลียวแรกของ Thermo Scientific Revert Aid ได้มาจากเทอร์โมฟิชเชอร์ (วิลนีอุส ลิทัวเนีย)

4.2.การอนุมัติทางจริยธรรม

การจัดการ การดูแล การฆ่า และขั้นตอนอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับสัตว์ได้ดำเนินการตามแนวทางการวิจัยสัตว์: การรายงานผลการทดลองใน Vivo (AR-RIVE) การวิจัยและการทดลองทางชีวเคมีและห้องปฏิบัติการดำเนินการตามแนวทางปฏิบัติที่ดีในห้องปฏิบัติการสารสกัดจากซิสทานเช ทูบูโลซ่าคณะกรรมการวิจัยของสถาบันเพื่อการพัฒนาการวิจัยทางการแพทย์แห่งชาติ (NIMAD) ได้ให้ความเห็นชอบตามหลักจริยธรรมสำหรับการศึกษาวิจัยนี้เกี่ยวกับการใช้และบำบัดสัตว์ภายใต้รหัส: IR.NOMAD.REC.1397.542

4.3.การออกแบบการศึกษา

ในการศึกษานี้ เราใช้หนูเพศผู้ ไม่ใช่หนูเพศเมีย เนื่องจากความแปรผันของระดับฮอร์โมนเพศหญิงอาจส่งผลต่อการศึกษาทางพิษวิทยา ดังนั้น หนู NMRI เพศผู้ที่มีสุขภาพดีและปราศจากโรค 30-35 ก. อายุ 7 ถึง 8 สัปดาห์จึงได้รับจากบ้านสัตว์ของคณะเภสัชศาสตร์มหาวิทยาลัยวิทยาศาสตร์การแพทย์เตหะราน เตหะราน ประเทศอิหร่าน พวกเขาถูกเก็บไว้ภายใต้สภาวะแวดล้อมที่มีการควบคุม รวมทั้งอุณหภูมิห้อง 20 ถึง 25 องศา ความชื้นสัมพัทธ์ 50 ถึง 55 เปอร์เซ็นต์ และช่วงแสงและความมืด 12-ชม. พวกเขาได้รับอาหารและน้ำมาตรฐานฟรี หนูถูกแบ่งออกเป็นแปดกลุ่ม ๆ ละหกหนู กลุ่มที่ 1 ได้รับอาหารปกติมาตรฐาน กลุ่มที่ 2 ได้รับการฉีดในช่องท้อง (IP) จำนวน 10 มก./กก./วัน MLT, กลุ่มที่ 3, 4 และ 5 ได้รับ 1.5(1/10 LD50),5(1/3 LD50) และ 7.5(1/2 LD50) มก./กก. NaAsO2 ตามลำดับ กลุ่ม 6, 7 และ 8 ถูกฉีดในช่องท้องด้วย 1.5(1/10 LD50), 5(1/3 LD50) และ 7.5(1/2LD50) มก./กก. ของ NaAsO ร่วมกับ 10 มก./กก./วัน MLT ตามลำดับในช่วงสิบวันสุดท้ายของการทดสอบ หลังจากการรักษาหนึ่งเดือน การฉีด IP ของคีตามีน 100 มก./กก. และไซลาซีน 10 มก./กก. ถูกใช้เพื่อฆ่าหนู เก็บตัวอย่างเลือดใน EDTA และหลอดแยกซีรัม หัวใจและปอดถูกนำออกทันทีและแช่แข็งที่ -80 องศาสำหรับการวิเคราะห์ทางชีวเคมี เก็บเนื้อเยื่อจากตัวอย่างหัวใจและปอดเพื่อตรวจทางพยาธิวิทยา หลังจากล้างด้วยบัฟเฟอร์ฟอสเฟตปลอดเชื้อ (pH 7.4) พวกมันถูกเก็บไว้ในฟอร์มาลิน 10 เปอร์เซ็นต์ 10 มล. (รูปที่ 6)

4.4. การประเมินสารหนูในเนื้อเยื่อทั้งหมดโดยใช้เครื่องตรวจวัดมวลพลาสม่าคู่แบบเหนี่ยวนำ

สารหนูทั้งหมดในเนื้อเยื่อตัวอย่างถูกกำหนดหาโดยใช้ Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (ICP-MS)(Perkin Elmer ELAN 6100 DRC-e) พารามิเตอร์เครื่องมือถูกกล่าวถึงในตารางเสริม S1 บัฟเฟอร์ฟอสเฟต 2 มิลลิลิตรถูกเติมไปยัง 0.20 กรัมของแต่ละตัวอย่าง และเนื้อเยื่อถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันอย่างทั่วถึงcistanche tubulosa บทวิจารณ์เนื้อเยื่อที่เป็นเนื้อเดียวกันถูกถ่ายโอนไปยังหลอดทดลองที่เป็นแก้วและทำให้แห้งในอ่างทรายที่ 120 องศา (ประมาณข้ามคืน) หลังจากที่ตัวอย่างไปถึงอุณหภูมิห้อง แต่ละหลอดถูกเติมด้วย HNO3 เข้มข้น 0.5 มล. และให้ความร้อนเป็นเวลาสองวัน อุณหภูมิไม่เกิน 120 องศาระหว่างกระบวนการให้ความร้อน จากนั้นเติม HNO3 เข้มข้น 0.5 มล. ลงในหลอดทดลองแต่ละหลอดจนกว่าเถ้าสีขาวจะเหลืออยู่ หลังจากการย่อยเสร็จสิ้นและสารละลายเย็นลงแล้ว 1 มล.10 เปอร์เซ็นต์ HNO: ถูกเติมลงในหลอดแก้วแต่ละหลอดและโซนิเคตเป็นเวลา 30 นาทีที่ 50 องศา เนื้อหาของหลอดแก้วถูกถ่ายโอนไปยังขวดปริมาตร 5 มล. และปรับเทียบไปยังเครื่องหมายด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ HNO3.10 เปอร์เซ็นต์ HNO3 ถูกใช้เพื่อสร้างสารละลายมาตรฐานที่มีความเข้มข้น 1, 5, 10 และ 15 ไมโครกรัม/ลิตรของ As, และสารละลายมาตรฐานเจอร์เมเนียม (5 กรัม/ลิตร) ถูกใช้เป็นสารละลายมาตรฐานภายใน [53]

4.5. การประเมินไบโอมาร์คเกอร์ความเครียดออกซิเดชัน

การทดสอบสารทำปฏิกิริยาของกรด Thiobarbituric (TBARS) ใช้เพื่อวัดกิจกรรมของ lipid peroxidation (LPO) โดยการคำนวณระดับของ malondialdehyde (MDA) ในเนื้อเยื่อหัวใจและปอด ตัวอย่างเนื้อเยื่อหัวใจหรือปอดจำนวน 0.15g แต่ละตัวถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) ผสมกับกรดไตรคลอโรอะซิติก 800 มล. และปั่นแยกเป็นเวลา 40 นาทีที่ 3000g จากนั้น 150 มล. ของกรดไทโอบาร์บิทูริก 1 เปอร์เซ็นต์โดยปริมาตรถูกเติมลงในส่วนลอยเหนือตะกอน 600 มล. และใส่ในน้ำเดือดเป็นเวลา 15 นาที สุดท้าย เติมเอ็น-บิวทานอล 400 มล. และใช้สเปกโตรโฟโตมิเตอร์เพื่อรายงานการดูดกลืนแสงที่ 532 นาโนเมตร [54]

KSL17

4.6. การประเมินชนิดออกซิเจนปฏิกิริยา

ระดับ ROS ในตัวอย่างหัวใจและปอดคำนวณตามโปรโตคอลที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [55]; 100 มก. ของตัวอย่างเนื้อเยื่อหัวใจและปอดสดแต่ละตัวอย่างถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยสารละลายบัฟเฟอร์การสกัดที่มี HEPES (5 mM), KCl (20 mM), EDTA, (1 mM) และซูโครส (0.25 M),pH=7.4 ลงในขวดฟอสเฟตบัฟเฟอร์แต่ละขวดแล้วปั่นเหวี่ยงที่ 10000 g เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 องศาหลังจากเพิ่ม DL-dithiothreitol( DTT,50 uM) ในขั้นตอนถัดไป ส่วนเหนือตะกอนของตัวอย่างเนื้อเยื่อหัวใจและปอดถูกผสมกับบัฟเฟอร์สำหรับการทดสอบ 80 ไมโครลิตรและ 5uLof DCFH-DA(5uM) เป็นเวลา 15 นาทีที่ 37 องศา ;2',7'-ไดคลอโรฟลูออเรสซีน ไดอะซิเตต (DCF-DA) คือสารฟลูออโรเจนิกที่เจาะเซลล์ซึ่งแปลงเป็น 2',7-ไดคลอโรไดไฮโดรฟลูออเรสซีน (DCFH) จากนั้น DCFH ถูกเร่งปฏิกิริยาด้วยเอสเทอเรสภายในเซลล์และออกซิไดซ์ ROS ไปเป็น 2'7'-ไดคลอโรฟลูออเรสซีน (DCF) ในที่สุด การดูดกลืนแสง DCF ถูกวัดทุก 5 นาทีโดยเครื่องอ่านไมโครเพลทสเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบหลายโหมด (BioTek⑧, SynergyM HT, Winooski, VT, USA) เป็นเวลา 60 นาทีด้วยสเปกตรัมการกระตุ้นและการปล่อย 488 นาโนเมตร และ 525 นาโนเมตรตามลำดับ สำหรับข้อมูลที่เป็นมาตรฐานที่ได้จากการทดสอบ ROS ตัวอย่างเนื้อเยื่อที่เจือจางแต่ละกลุ่มถูกใช้เพื่อกำหนดระดับโปรตีน โดยสรุป รีเอเจนต์ของแบรดฟอร์ด 10 ไมโครลิตรถูกเติมลงใน 100 ไมโครลิตร ของตัวอย่างที่เจือจาง และหลังจากการบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที การดูดกลืนแสงของแต่ละตัวอย่างถูกอ่านที่ 595 นาโนเมตร

4.7.การประเมิน Pro-Inflammatory Cytokines

ประเมินระดับไซโตไคน์ที่เกิดจากการอักเสบ เช่น TNF- ในพลาสมาและ HMGB1 ในตัวอย่างหัวใจและปอด สิ่งเหล่านี้ได้รับการยอมรับว่าเป็นสื่อกลางหลักของภาวะติดเชื้อในระยะแรกและระยะหลัง [56] ทำระดับ HMGB1 สำหรับเนื้อเยื่อหัวใจและปอด ซึ่งถูกเก็บไว้ที่ 80 องศา ปริมาณ 100 มก. ของเนื้อเยื่อหัวใจและปอดที่แยกได้ของสัตว์แต่ละตัวถูกแยกออกมาและทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) ระดับ TNF- และ HMGB1 ถูกหาปริมาณตามโปรโตคอลของผู้ผลิต การดูดซับถูกประเมินที่ 450 นาโนเมตรcistanche สหราชอาณาจักรระดับ TNF- และ HMGB1 ถูกบันทึกในโปรตีน pg/mg และโปรตีน ng/mg ตามลำดับ

4.8.การประเมินความเสียหายของดีเอ็นเอ

เอท-ไฮดรอกซี-2-ดีออกซีกัวโนซีน (8OHdG) เป็นผลิตภัณฑ์ที่เกิดจากการทำลายจากปฏิกิริยาออกซิเดชันของดีเอ็นเอ เป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่จำเป็นสำหรับความเสียหายของดีเอ็นเอ ระดับพลาสมาของ 8-ไฮดรอกซี-2-ดีออกซี กัวโนซีน (8OHdG)ถูกกำหนดหาตามชุดเครื่องมือ 8OHdG ELISA (ZellBio GmbH [Ulm, เยอรมนี])

4.9.การประเมินระดับแลคเตท

ระดับแลคเตทของตัวอย่างเนื้อเยื่อถูกวัดโดยใช้ชุดทดสอบสีแลคเตทตามโปรโตคอลที่จัดให้ (ZellBio GmbH[Ulm, Germany]) โดยสรุป กรดเปอร์คลอริก 8 เปอร์เซ็นต์ 10 มล. ถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยตัวอย่างหัวใจและปอด 100 มก. เส้นโค้งมาตรฐานถูกนำมาใช้และบันทึกเป็น mmol/mg ของโปรตีนเนื้อเยื่อเพื่อวัดระดับแลคเตท

4.10.PCR การถอดเสียงแบบย้อนกลับตามเวลาจริงเชิงปริมาณสำหรับการแสดงออกของยีน

เพื่อตรวจจับการทำงานของ MLT และ NaAsO2 ในการแสดงออกของยีนที่ระดับ mRNA ได้ใช้ PCR(qRT-PCR) การถอดรหัสแบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ ยีนสามตัวที่เกี่ยวข้องกับวิถีทางโมเลกุลที่แตกต่างกัน, TERT, ตัวรับปัจจัยการตายของเนื้องอกเนื้องอกที่สัมพันธ์กับโดเมนที่ตาย 1 ชนิดที่ 1 (TRADD) และ KL (ที่เกี่ยวข้องกับกิจกรรมของโคลโท) ได้รับการประเมินในแง่นี้ แยก RNA ของเนื้อเยื่อโดยใช้โปรโตคอล RNX-Plus (SinaClon, Iran) จากตัวอย่างหัวใจแช่แข็ง ความบริสุทธิ์ของอาร์เอ็นเอคำนวณด้วยสเปกโตรโฟโตเมตริกโดย Thermo Scientific NanoDrop (Thermo Scientific, Boston, MA, USA) ชุด DNase I ที่ปราศจาก RNase ใช้เพื่อกำจัดจีโนม DNA จากนั้น RNA ที่แยกออกมาหนึ่งไมโครกรัมจะถูกแปลงกลับเป็น cDNA ยีนเป้าหมายได้รับการทำให้เป็นมาตรฐานด้วยยีน Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) ในฐานะการควบคุมภายใน ระบบ LightCycler ③96 (โรช อินเดียแนโพลิส รัฐอินดีแอนา สหรัฐอเมริกา) ใช้สำหรับการวิเคราะห์ qRT-PCR ใช้ส่วนผสมหลัก SYBRgreen และ qRT-PCR ถูกดำเนินการภายใต้สภาวะ กล่าวคือ หนึ่งรอบที่ 94 องศาเป็นเวลา 10 นาที 40 รอบที่ 95 องศาเป็นเวลา 15 วินาที และอุณหภูมิการหลอมเป็นเวลา 30 และ 72 องศาเป็นเวลา 25 วินาที รายงานผลลัพธ์ตามวิธี Pfaffle [57] ไพรเมอร์เฉพาะที่ใช้ในการศึกษานี้แสดงไว้ในตารางที่ 5

4.11.การประเมินทางเนื้อเยื่อวิทยา Ex Viro

ตัวอย่างเนื้อเยื่อหัวใจและปอดถูกเก็บเกี่ยวหลังจากการเสียสละสัตว์ในวันที่ 30 ในขณะที่ตัวอย่างเนื้อเยื่อถูกเก็บไว้ใน 10 มล. ของสารละลาย NaCl 0.9 เปอร์เซ็นต์ ตัวอย่างถูกตรึงในฟอร์มาลินบัฟเฟอร์ที่เป็นกลาง 10 เปอร์เซ็นต์ (NBF, PH.7.26) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ฝังในพาราฟิน และตัดเป็นส่วน 5 ไมโครเมตร ส่วนต่างๆ ถูกย้อมด้วย hematoxylin-eosin และประเมินโดยผู้ตรวจสอบอิสระโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (Olympus BX51; Olympus, Tokyo, Japan)

KSL18

4.12. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ผลลัพธ์ถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย±ข้อผิดพลาดมาตรฐานของค่าเฉลี่ย (SEM) นัยสำคัญทางสถิติได้รับการประเมินโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) ที่มีนัยสำคัญทางสถิติที่ p<>

5. สรุปผลการวิจัย

เราสรุปได้ว่าการบำบัดด้วย MLT สามารถช่วยลด NaAsO2-การเสื่อมสภาพที่เกิดจากความเครียดออกซิเดชันได้ NaAsO2 ทำให้เกิดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน การอักเสบ ความเสียหายของ DNA และการตายของเซลล์ในเนื้อเยื่อปอดและหัวใจโดยการเพิ่มระดับ MDA, ROS, lactate, HMGB1, TNF- x และ 8OHdG ซึ่งอาจนำไปสู่การแก่ของเนื้อเยื่อและการบาดเจ็บตามหลักฐานจาก mRNA ที่ลดลง ระดับการแสดงออกของ KL ที่เกิดจาก NaAsO และเพิ่มการแสดงออกของยีน TERT และ TRADD (รูปที่ 7) ในทางกลับกัน การบำบัดด้วย MLT ลดความเป็นพิษที่ขึ้นกับขนาดยาของ NaAsO2 MLT ได้รับการแสดงเพื่อปกป้องปอดและหัวใจจากการบาดเจ็บของเนื้อเยื่อและการเสื่อมสภาพที่เกิดจาก NaAsO2- โดยการลดความเสี่ยงของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน การอักเสบ ความเสียหายของดีเอ็นเอ และการทำให้ระดับการแสดงออกของ mRNA ของ KL, TERT และ TRADD เป็นปกติ