การโคลนโมเลกุลและการแสดงลักษณะทางชีวเคมีของ Coumarin Glycosyltransferase CtUGT1 ใหม่จาก Cistanche Tubulosa
Mar 17, 2022
สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:ali.ma@wecistanche.com
Xiping Xu และคณะ
บทคัดย่อ
UDP-glycosyltransferases (UGTs) เป็นเอนไซม์ที่สำคัญและมีความหลากหลายทางหน้าที่ที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ทางเมตาบอไลต์ทุติยภูมิ Coumarin เป็นหนึ่งในโครงกระดูกทั่วไปของผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติที่มีกิจกรรมทางเภสัชวิทยาของผู้สมัคร อย่างไรก็ตาม จนถึงปัจจุบัน GTs ที่รายงานจากพืชส่วนใหญ่รู้จักสารฟลาโวนอยด์เป็นตัวรับน้ำตาล มีเพียง GT ที่จำกัดเท่านั้นที่สามารถกระตุ้นไกลโคซิเลชันของคูมารินได้ ในการศึกษานี้ UGT ใหม่ถูกโคลนจากCistanche tubulosaยาชูกำลังสมุนไพรจีนโบราณอันทรงคุณค่า ซึ่งอุดมไปด้วยไกลโคไซด์ที่หลากหลาย เช่น ฟีนิลทานอยด์ ไกลโคไซด์ ลิกแนน ไกลโคไซด์ และอิริดอยด์ ไกลโคไซด์ การจัดลำดับและการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการพบว่าCtUGT1อยู่ห่างจาก UGTs ฟลาโวนอยด์ส่วนใหญ่ที่รายงานโดยสายวิวัฒนาการและอยู่ติดกับ UGT ฟีนิลโพรพานอยด์ การทดสอบเอนไซม์ในหลอดทดลองอย่างกว้างขวางพบว่าถึงแม้ว่าCtUGT1ไม่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ทางชีวภาพของไกลโคไซด์ที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพในCistanche tubulosaมันสามารถกระตุ้นกลูโคซิเลชั่นของคูมารินส์ อัมเบลลิเฟอโรน 1, เอสคูเลติน 2 และไฮเมโครโมน 3 ได้ในปริมาณมาก จำแนกผลิตภัณฑ์จากไกลโคซิเลตโดยการเปรียบเทียบกับมาตรฐานอ้างอิงหรือ NMR สเปกโทรสโกปี และผลการวิจัยพบว่าCtUGT1สามารถกระตุ้นกลูโคซิเลชันของไฮดรอกซิลคูมารินที่ตำแหน่ง C7- OH ได้ สารตกค้างที่สำคัญที่กำหนดCtUGT1กิจกรรมของถูกกล่าวถึงเพิ่มเติมโดยอิงจากแบบจำลองความคล้ายคลึงกันและการวิเคราะห์การเทียบท่าระดับโมเลกุล เมื่อรวมกับผลการทำให้เกิดการกลายพันธุ์ที่ควบคุมโดยไซต์ พบว่า H19 มีบทบาทที่ไม่สามารถถูกแทนที่ได้ในฐานะพื้นฐานการเร่งปฏิกิริยาที่สำคัญCtUGT1สามารถใช้ในการเตรียมเอนไซม์ของคูมารินไกลโคไซด์ที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพ
คำสำคัญ:ไกลโคซิลทรานส์เฟอเรสจากพืช, คูมาริน ไกลโคไซด์,Cistanche tubulosa, การสร้างแบบจำลองความคล้ายคลึงกัน, การทำให้เกิดการกลายพันธุ์ที่ควบคุมโดยไซต์
Click to cistanche extract ประโยชน์ผลิตภัณฑ์
บทนำ
ไกลโคซิเลชันเป็นผลิตภัณฑ์ธรรมชาติทุติยภูมิประเภทดัดแปลงโครงสร้างที่พบได้บ่อยที่สุดชนิดหนึ่ง ไกลโคซิเลชันสามารถเปลี่ยนความเสถียรและ/หรือความสามารถในการละลายของ aglycon และมีส่วนอย่างมากต่อความหลากหลายของผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ/ที่ไม่เป็นธรรมชาติอันเนื่องมาจากการคอนจูเกตหลายประเภท ในพืช ปฏิกิริยาเหล่านี้มักดำเนินการโดย glycosyltransferases (UGTs) ที่ขึ้นกับยูริดีนไดฟอสเฟต (UDP) ซึ่งเป็นเอนไซม์ชนิดหนึ่งที่กระตุ้นการถ่ายโอนมอยอิตีโมโนแซ็กคาไรด์จากน้ำตาลนิวคลีโอไทด์ที่กระตุ้นไปยังโมเลกุลตัวรับไกลโคซิล ซึ่งสามารถเป็นคาร์โบไฮเดรต ไกลโคไซด์ โอลิโกแซ็กคาไรด์ หรือพอลิแซ็กคาไรด์ [1,2]
จนถึงปัจจุบัน ยีนจำนวนมากที่เข้ารหัส UGT ได้ถูกแยกออกจากพืชหลายชนิด [3] ไกลโคซิเลชันส่วนใหญ่เกิดขึ้นที่กลุ่มไฮดรอกซิลหรือกลุ่มคาร์บอกซิลของผลิตภัณฑ์ทุติยภูมิที่หลากหลาย เช่น ฟลาโวนอยด์ [4], ฟีนิลโพรพานอยด์ [5], เทอร์พีนอยด์ [6], สเตียรอยด์ [7], อัลคาลอยด์ [8] เป็นต้น คูมารินเป็นสารฟีนิลโพรพานอยด์ที่กระจายอยู่ทั่วไปในพืชหลายชนิด คูมารินที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติมักมีอยู่ในรูปของไกลโคคอนจูเกต และอนุพันธ์เหล่านี้แสดงกิจกรรมทางเภสัชวิทยาในวงกว้าง รวมถึงสารต้านอนุมูลอิสระ [9] ต้านไวรัส [10,11] ปกป้องตับ [12] ต้านการอักเสบ [13] ต้านมะเร็ง [14 ] ฤทธิ์ต้านการกลายพันธุ์ [15] และฤทธิ์ยับยั้ง cholinesterase (ChE) และโมโนเอมีนออกซิเดส (MAO) [14,15] เป็นต้น อย่างไรก็ตาม จนถึงปัจจุบัน เมื่อเทียบกับ UGTs ที่มีรายงานบ่อยที่สุดและได้รับการตรวจสอบอย่างกว้างขวาง มีเพียง UGT ที่จำกัดเท่านั้น รายงานว่าสามารถถ่ายโอนมอยอิตีน้ำตาลไปยังคูมารินได้ [16–18]
พืชที่อุดมไปด้วยไกลโคไซด์ที่หลากหลายสามารถทำหน้าที่เป็นแหล่งรวมยีนในอุดมคติของ UGT พร้อมกิจกรรมเร่งปฏิกิริยาแบบใหม่ นอกจากนี้ UGT จำนวนมากได้รับรายงานว่ามีความสำส่อนของตัวรับมากในการเร่งปฏิกิริยาไกลโคซิเลชันของสารตั้งต้นหลายตัว ซึ่งบางตัวไม่ได้แยกจากกันในพืชด้วยซ้ำ [19] ในบทความนี้ นวนิยายเรื่องไกลโคซิลทรานสเฟอเรสCtUGT1ถูกระบุจากCistanche tubulosaสมุนไพรพื้นบ้านที่อุดมไปด้วยไกลโคไซด์หลายชนิด เช่น ฟีนิลทานอยด์ ไกลโคไซด์ (PhGs) ลิกแนน ไกลโคไซด์ และอิริดอยด์ ไกลโคไซด์ การแสดงออกที่แตกต่างกันและลักษณะการทำงานแสดงให้เห็นว่าแม้ว่า recombinantCtUGT1ไม่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ทางชีวภาพของไกลโคไซด์เหล่านี้ในCistanche tubulosaมันสามารถกระตุ้นกลูโคซิเลชันของไฮดรอกซิลคูมาริน และปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นเฉพาะที่ตำแหน่ง 7- OH ของคูมาริน umbelliferone 1 การเพิ่มระดับ 2 และ hymecromone 3 เพื่อผลิตสารออกฤทธิ์ทางเภสัชวิทยาสามชนิด skimming (1a), cichoriin (2a) และ 4-เมทิลลัมเบลลิเฟอริลกลูโคไซด์ (3a) ที่ให้ผลผลิตมากตามลำดับ นอกจากนี้ สารตั้งต้นเบนโซฟีโนน 4,4′-ไดไฮดรอกซี เบนโซฟีโนน (4), เจนิสไตน์ของสารตั้งต้นไอโซฟลาโวน (5) และสารตั้งต้นแอนทราควิโนน ว่านหางจระเข้ (6) ก็สามารถยอมรับได้ด้วยCtUGT1. คุณสมบัติของตัวเร่งปฏิกิริยาและสารตกค้างที่สำคัญที่ขีดเส้นใต้ความสามารถในการเร่งปฏิกิริยาของCtUGT1ยังได้รับการประเมินโดยอิงจากการสร้างแบบจำลองความคล้ายคลึงกัน การวิเคราะห์ AutoDock และการทำให้เกิดการกลายพันธุ์ที่ควบคุมตำแหน่ง
2. ทดลอง
2.1. วัสดุพืชและสารเคมี
Cistanche tubulosaที่ใช้ในการศึกษานี้รวบรวมจากพื้นที่ทะเลทรายในเขตปกครองตนเองเหอเทียน ซินเจียง เอกลักษณ์ทางพฤกษศาสตร์ของพวกเขาได้รับการยืนยันโดยศาสตราจารย์ Pengfei Tu ที่มหาวิทยาลัยปักกิ่ง คูมารินที่ทดสอบและพื้นผิวอื่นๆ ในการศึกษานี้ซื้อจาก Sigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์ สหรัฐอเมริกา), Chengdu Push Biotechnology Co., Ltd. (เฉิงตู ประเทศจีน) และ Chengdu Biopurify Phytochemicals Co., Ltd. (เฉิงตู ประเทศจีน) ) เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น มาตรฐานอ้างอิงของ skimming (1a) และ cichoriin (2a) ถูกซื้อจาก Wuhan Chem Faces Biochemical Co., Ltd. (หวู่ฮั่น ประเทศจีน)
2.2. การโคลนโมเลกุลของ CtUGT1 จาก Cistanche tubulosa
RNA ทั้งหมดของCistanche tubulosaสกัดจากก้านเนื้อโดยใช้ OMEGA Plant RNA Kit (GA, USA) และคัดลอกย้อนกลับเป็น cDNA ด้วย PrimeScript™ RT reagent Kit (TaKaRa, Japan) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ไพรเมอร์ที่เสื่อมสภาพได้รับการออกแบบสำหรับ 3′RACE โดยอิงจากลำดับกรดอะมิโนใน PSPG (ผลิตภัณฑ์รองจากพืช Glycosyltransferases) ที่อนุรักษ์ไว้ - กล่องของไกลโคซิลทรานสเฟอเรสจากพืช แอมพลิฟายเออร์ 3′-end และ 5′-end ของCtUGT1ดำเนินการโดยใช้ Smart RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, USA) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิตโดยใช้ไพรเมอร์ (ตาราง S1) cDNA แบบเต็มความยาวของCtUGT1ถูกขยายโดย PCR โดยใช้ KOD-Plus Neo DNA Polymerase (TOYOBO, Japan) กับไพรเมอร์เฉพาะยีน (ตารางที่ S1) ภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้: ขั้นตอนการทำให้เสียสภาพเริ่มต้นที่ 94 ◦C เป็นเวลา 2 นาที ตามด้วย 35 รอบของการเปลี่ยนสภาพที่ 98 ◦C เป็นเวลา 15 วินาที อบอ่อนที่ 55 ◦C เป็นเวลา 30 วินาที และยืดออกที่ 68 ◦C เป็นเวลา 55 วินาที โดยขยายขั้นสุดท้ายที่ 68 ◦C เป็นเวลา 7 นาที ชิ้นส่วน DNA ทั้งหมดที่ได้รับถูกโคลนเป็นเวกเตอร์ pEASY-Blunt (TransGen Biotech, China) และจัดลำดับ
2.3. การจัดลำดับและการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการ
การจัดลำดับของCtUGT1ด้วยไกลโคซิลทรานส์เฟอเรสที่รายงาน (ตาราง S2) ดำเนินการโดยใช้แพ็คเกจซอฟต์แวร์ DNAMAN 40 (Lynnon Biosoft, แคนาดา) ลวดลายและโดเมนได้รับการวิเคราะห์โดยใช้เครื่องมือโดเมนที่สงวนไว้ (http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Structure/cdd/ wrpsb. cgi) แผนผังสายวิวัฒนาการถูกสร้างขึ้นโดยบูตสแตรปปิ้ง MEGA 70.14 ซอฟต์แวร์โดยใช้วิธีการเข้าร่วมเพื่อนบ้านด้วยการจำลองบูตสแตรป 1,000 ครั้ง [20] ลำดับโปรตีนที่แปลแล้วของCtUGT1ถูกจัดให้อยู่ในแนวเดียวกับไกลโคซิลทรานส์เฟอเรสของพืชที่รู้จักที่ฝากไว้ในฐานข้อมูล NCBI GenBank (ตาราง S3) กับ ClustalW
2.4. การแสดงออกที่แตกต่างกันและการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์ของ CtUGT1 ใน Escherichia coli
ขอบเขตการเข้ารหัสของCtUGT1ถูกขยายด้วย BamH I และ Not I เป็นไซต์จำกัดโดยใช้ไพรเมอร์ที่แสดงในตาราง S1 ปฏิกิริยา PCR ดำเนินการโดยใช้ KOD-Plus-Neo DNA Polymerase (TOYOBO, โอซาก้า, ญี่ปุ่น) ลำดับที่ได้รับได้รับการตรวจสอบโดยการโคลนลงในเวกเตอร์ pEASY-Blunt (TransGen Biotech, China) สินค้าขยายสัญญาณที่ยืนยันแล้วของCtUGT1ต่อมาถูกย่อยและโคลนย่อยไปเป็นเวกเตอร์การแสดงออก pET-28a( plus ) (Novagen, USA) โครงสร้างที่ผ่านการตรวจสอบแล้วถูกเปลี่ยนเป็น E. coli Transetta (DE3) เพื่อให้ได้สายพันธุ์ลูกผสม การเพาะเลี้ยงข้ามคืนของสายพันธุ์ลูกผสมถูกฉีดเข้าไปในอาหารเลี้ยงเชื้อ Luria-Bertani (LB) ที่มี 50 ug⋅mL− 1 kanamycin และ 40 ug⋅mL− 1 คลอโรมัยซิตินที่อัตราส่วน 1:1{{ 19}}0. วัฒนธรรมเติบโตที่ 37 ◦C 200 รอบต่อนาทีจนกระทั่งค่า OD600 ถึง 0.4–0.6 ไอโซโพรพิล- -D-thiogalactopyranoside (IPTG) ต่อมาถูกเติมไปยังความเข้มข้นสุดท้ายที่ 0.5 มิลลิโมลาร์ และเซลล์ถูกทำให้โตเป็นเวลา 16 ชั่วโมงที่ 18 ◦C, 180 รอบต่อนาที จากนั้นเม็ดเซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยง (7600 ×g, 10 นาที, 4 ◦C) และแขวนตะกอนอีกครั้งในบัฟเฟอร์ lysis แช่เย็น 3 มล./กรัม (หมายเหตุข้อมูลเสริม 1) และถูกรบกวนโดยโซนิเคชันบนน้ำแข็ง เศษเซลล์ถูกกำจัดออกโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 7600 ×g, 4 ◦C เป็นเวลาประมาณ 30 นาที คอลัมน์ Histrap ที่ปรับสมดุลไว้ล่วงหน้า (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) ถูกใช้สำหรับ affinity chromatography ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โปรตีนลูกผสมถูกชะโดยปริมาตร 10 คอลัมน์ของบัฟเฟอร์สำหรับชะ (หมายเหตุข้อมูลเสริม 1) ที่มีอิมิดาโซล 250 มิลลิโมลาร์ ความบริสุทธิ์ของโปรตีนถูกวิเคราะห์โดย SDS-PAGE 10 เปอร์เซ็นต์ โปรตีนบริสุทธิ์ถูกทำให้เข้มข้นโดยหลอดอัลตราฟิลเตรชั่น 30 kDa (ซิกมา-อัลดริช สหรัฐอเมริกา) และแยกเกลือออกโดยใช้คอลัมน์ PD–10 (GE Healthcare, Uppsala, สวีเดน) ด้วยบัฟเฟอร์แยกเกลือออกจากเกลือ (หมายเหตุข้อมูลเสริม 1) ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยวิธีแบรดฟอร์ดโดยใช้บีเอสเอเป็นมาตรฐาน
2.5. การทดสอบกิจกรรมของเอนไซม์และความจำเพาะของสารตั้งต้นของ CtUGT1
เพื่อตรวจสอบกิจกรรมไกลโคซิเลชันของCtUGT1, การทดสอบเอนไซม์ถูกดำเนินการในของผสมปฏิกิริยา (150 ไมโครลิตร) ประกอบด้วย 0.4 มิลลิโมลาร์ อะไกลโคน, 0.8 มิลลิโมลาร์ UDP-กลูโคส (UDPG) และ 50 ไมโครกรัมของการทำให้บริสุทธิ์CtUGT1โปรตีนในบัฟเฟอร์ desalting ปฏิกิริยาทั้งหมดถูกบ่มที่ 30 ◦C เป็นเวลา 12 ชั่วโมงและสิ้นสุดโดยการเติมเมทานอลเย็น 300 ไมโครลิตร ของผสมถูกหมุนเหวี่ยงที่ 15,000 ×g เป็นเวลา 30 นาทีเพื่อรวบรวมส่วนลอยเหนือตะกอนสำหรับการวิเคราะห์ HPLC-UV/ESI-MS การสอบวิเคราะห์แบบขนานสามครั้งถูกดำเนินการเป็นประจำสำหรับแต่ละปฏิกิริยา HPLC (Agilent 1260, USA) ติดตั้งเครื่องตรวจจับอาร์เรย์ไดโอดและคอลัมน์ CAPCELL PAK C18 (250 มม. × 4.6 มม., 5 ไมโครเมตร; ชิเซโด้ ประเทศญี่ปุ่น) ที่อัตราการไหล 1 มล.⋅นาที− 1 และอุณหภูมิคอลัมน์ รักษาไว้ที่ 30 ◦C เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วย A (กล่าวคือ สารละลายในน้ำกรดฟอร์มิก 0.1 เปอร์เซ็นต์) และ B (กล่าวคือ อะซีโตไนไตรล์) โปรแกรมการไล่ระดับสีแสดงอยู่ในตาราง S4 ข้อมูล HRESI-MS ถูกบันทึกในระบบ LCMS-IT-TOF ซึ่งติดตั้งอินเทอร์เฟซ ESI (Shimadzu, Kyoto, Japan) โดยมี He ที่มีความบริสุทธิ์สูงเป็นพิเศษในฐานะก๊าซชน และ N2 เป็นก๊าซพ่นยา พารามิเตอร์แหล่ง ESI ที่ปรับให้เหมาะสมมีดังนี้: อัตราการไหลของก๊าซในฝัก, 1.5 mL⋅min− 1; อัตราการไหลของก๊าซเสริม 1.5 mL⋅min− 1; แรงดันสเปรย์ 4.5 kV; อุณหภูมิของเส้นเลือดฝอย 200 ◦C สเปกตรัมถูกบันทึกในช่วง 100–1500 m/z สำหรับการวิเคราะห์ MS การสแกนแบบเต็ม
2.6. ผลของเวลาปฏิกิริยา ค่า pH และอุณหภูมิต่อกิจกรรมของเอนไซม์ และการศึกษาจลนศาสตร์ของ CtUGT1
ผลของเวลาปฏิกิริยา ค่า pH และอุณหภูมิต่อกิจกรรมของเอนไซม์CtUGT1ได้รับการทดสอบโดยใช้ UDPG เป็นผู้ให้น้ำตาลและ 3 เป็นตัวรับน้ำตาลในสภาวะของปฏิกิริยาตามที่บรรยายไว้ข้างต้น สำหรับการหาค่า pH ที่เหมาะสม ให้เปรียบเทียบกิจกรรมของเอนไซม์ในบัฟเฟอร์ 100 mM (กรดซิตริก-โซเดียม ซิเตรต) ที่มีค่า pH อยู่ในช่วง 3.0 ถึง 6.{{ 14}}, 10{{20}} บัฟเฟอร์ mM (KH2PO4-K2HPO4) ที่มีค่า pH ตั้งแต่ 6.0 ถึง 8.{{29} }, 10บัฟเฟอร์ 0 mM (Tris-HCl) ที่มีค่า pH อยู่ในช่วง 7.0 ถึง 9.0, บัฟเฟอร์ 100 mM (Na2CO3-NaHCO3) ที่มีค่า pH อยู่ในช่วง 9.0 ถึง 11.0 เพื่อทดสอบอุณหภูมิปฏิกิริยาที่เหมาะสม ปฏิกิริยาถูกบ่มที่อุณหภูมิต่างๆ ตั้งแต่ 0 ถึง 65 ◦C หลักสูตรเวลาของปฏิกิริยาถูกประเมินที่จุดเวลาที่ต่างกัน 12 จุดระหว่าง 0 ถึง 24 ชั่วโมง การทดลองทั้งหมดดำเนินการเป็นสามเท่า ของผสมของปฏิกิริยาถูกวิเคราะห์โดย HPLC-MS ตามที่บรรยายไว้ข้างต้น สำหรับการศึกษาจลนศาสตร์ของCtUGT1, การสอบวิเคราะห์ด้วยเอนไซม์ถูกดำเนินการในปริมาตรสุดท้าย 100 ไมโครลิตรที่มี 100 มิลลิโมลาร์ KH2PO4-บัฟเฟอร์ K2HPO4 (pH 8.0), 25 ไมโครกรัมของการทำให้บริสุทธิ์CtUGT1, UDPG 3 มิลลิโมลาร์ และความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (50–3000 ไมโครโมลาร์) เท่ากับ 3 ปฏิกิริยาถูกดำเนินการที่ 37 ◦C เป็นเวลา 30 นาที จากนั้นจึงสิ้นสุดด้วยเมทานอลเย็นเยือกแข็ง 100 ไมโครลิตร ปฏิกิริยาทั้งหมดเหล่านี้ดำเนินการเป็นสามเท่า และกิจกรรมของเอนไซม์ได้รับการประเมินผ่านการหาปริมาณของอนุพันธ์กลูโคซิเลตที่สอดคล้องกัน พารามิเตอร์จลนศาสตร์ รวมถึงค่าคงที่ Michaelis–Menten (Km) และ Vmax คำนวณโดยการวิเคราะห์การถดถอยแบบไม่เชิงเส้นโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism 5
2.7. การคัดเลือกสารตั้งต้นและน้ำตาลของ CtUGT1
เพื่อสำรวจการตั้งค่าพื้นผิวของCtUGT1มีการทดสอบซับสเตรตทั้งหมด 27 ซับสเตรตที่เป็นของโครงสร้างประเภทต่างๆ โดยใช้ UDPG เป็นผู้บริจาค ข้อมูลทางเคมีของพวกมันถูกแสดงไว้ในตารางที่ S5 และโครงสร้างของพวกมันถูกแสดงไว้ในรูปที่ S1 และ S2 เพื่อตรวจสอบการคัดเลือกผู้บริจาคน้ำตาลของCtUGT1การทดสอบดำเนินการโดยใช้ umbelliferone (1), esculetin (2), hymecromone (3), 4,4′-dihydroxy benzophenone (4), genistein (5) และ aloe-emodin (6) เป็นสารตั้งต้นที่มี UDPG, UDP- N acetyl galactosamine, UDP-galactose, GDP-mannose, GDP-fucose, UDP galacturonic acid, UDP-rhamnose เป็นผู้บริจาคน้ำตาลตามลำดับ การทดลองทั้งหมดดำเนินการเป็นสามเท่า ของผสมของปฏิกิริยาถูกวิเคราะห์โดย HPLC-MS ตามที่บรรยายไว้ข้างต้น
2.8. การเตรียม 4-เมทิลลัมเบลลิเฟอริลกลูโคไซด์ (สารประกอบ 3a) โดย CtUGT1
ของผสมของปฏิกิริยาเตรียมประกอบด้วย {{0}}.034 มิลลิโมล สารประกอบซับสเตรต 3, 0.04 มิลลิโมล UDPG, 5 มก. ทำให้บริสุทธิ์CtUGT1ในบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา 50 มล. ปฏิกิริยาถูกกวนเบาๆ ที่สภาวะที่เหมาะสมที่สุด (100 มิลลิโมลาร์ KH2PO4-K2HPO4 ที่มี pH 8.0; 37 ◦C) หลังจากการบ่มที่ 37 ◦C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง สารลอยลอยเหนือตะกอนของปฏิกิริยาถูกแยกโดยคอลัมน์โครมาโตกราฟีด้วยแมโครพอรัสเรซิน (MCI GEL CHP) หลังจากการปั่นแยกที่ 12,000 ×g เป็นเวลา 30 นาที เฟสเคลื่อนที่คือการชะเกรเดียนท์ของน้ำ 100 เปอร์เซ็นต์เป็นเมทานอล 100 เปอร์เซ็นต์ เศษส่วนแต่ละส่วนถูกวิเคราะห์โดย HPLC-UV เศษส่วนที่มีเฉพาะผลิตภัณฑ์เป้าหมายเท่านั้นที่ถูกระเหยจนแห้งภายใต้แรงดันที่ลดลง และแสดงคุณลักษณะโดย 1H นิวเคลียสแม่เหล็กเรโซแนนซ์ (NMR) สเปกโทรสโกและ 13C NMR สเปกโทรสโก
2.9. การเทียบท่าระดับโมเลกุลและการทำให้เกิดการกลายพันธุ์ของ CtUGT1
แบบจำลองโปรตีนของCtUGT1ก่อตั้งขึ้นโดยใช้ SWISS-MODEL [21-25] โครงสร้างผลึกของ Medicago truncatula glycosyl transferase UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) ได้รับเลือกให้เป็นโครงสร้างเทมเพลต [26] แบบจำลองที่สร้างขึ้นได้รับการประเมินโดย VERIFY-3D [27,28] Auto-Dock Vina ใช้สำหรับการศึกษาการเทียบท่าระดับโมเลกุล [29] โครงสร้างผลึกของ UGT74F2 [30] ซึ่งเป็นไกลโคซิลทรานสเฟอเรสจาก Arabidopsis thaliana ที่ซับซ้อนด้วยลิแกนด์ UDP และกรดซาลิไซลิก (PDB ID 5U6M) ถูกใช้เป็นโครงสร้างควบคุมสำหรับการวิเคราะห์กระเป๋าผู้บริจาคน้ำตาลและตัวรับน้ำตาลตามลำดับ . Auto-Dock-Tools 1.5.6 จาก MGLTools (เครื่องมือห้องปฏิบัติการกราฟิกระดับโมเลกุล) ถูกใช้เพื่อเตรียม UDPG ผู้บริจาคน้ำตาลและสารตั้งต้น 1, 2 สำหรับการเทียบท่าระดับโมเลกุล สายด้านข้างของสิ่งตกค้างรอบๆ ช่องที่แอคทีฟไซต์ถูกตั้งค่าให้ยืดหยุ่น และพันธะที่หมุนได้ของลิแกนด์ถูกปล่อยให้หมุนได้อย่างอิสระ ท่าที่ติดอันดับสูงสุดซึ่งตัดสินโดยโมเดลการเทียบท่า Vina ที่มีความสัมพันธ์ใกล้ชิดสูงสุด (kcat/ mol) อยู่ภายใต้การวิเคราะห์ด้วยภาพโดยใช้ซอฟต์แวร์ PyMOL 2.0
สำหรับการตรวจสอบการกลายพันธุ์ ลำดับของยีนที่ปรับให้เหมาะสมที่สุดของCtUGT1(ข้อมูลเสริม หมายเหตุ 2) ถูกสังเคราะห์และทดสอบเป็นชนิดไวด์ การทำให้เกิดการกลายพันธุ์ที่กำกับโดยไซต์ของCtUGT1ดำเนินการโดยใช้ระบบการกลายพันธุ์ที่รวดเร็ว (TransGen Biotech) มิวแทนต์ถูกขยายจากเทมเพลตของยีนที่เหมาะสมที่สุดซึ่งถูกสร้างขึ้นในเวกเตอร์ PET-28 โดยใช้ไพรเมอร์จำเพาะที่แสดงไว้ในตาราง S1 การกลายพันธุ์ที่สร้างขึ้นได้รับการตรวจสอบโดย PCR และการจัดลำดับก่อนที่จะถูกแปลงเป็น E. coli (DE3) สำหรับการแสดงออกที่แตกต่างกัน การทำโปรตีนให้บริสุทธิ์และปฏิกิริยาของเอนไซม์ถูกดำเนินการและวิเคราะห์ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น
3. ผลลัพธ์และการอภิปราย
3.1. การโคลน cDNA แบบเต็มความยาวของยีน CtUGT1 จากCistanche tubulosa
Cistanche tubulosa(L.) (RouCongRong) เป็นสมุนไพรจีนโบราณที่ผลิตไกลโคไซด์ตามธรรมชาติที่หลากหลาย ควรมียีนไกลโคซิลทรานสเฟอเรสใหม่จำนวนมากที่มีอยู่ในจีโนมของมัน ในการค้นหาไกลโคซิลทรานส์เฟอเรสที่มีกิจกรรมเร่งปฏิกิริยาที่น่าสนใจ ไพรเมอร์ที่เสื่อมสภาพสำหรับ 3′-RACE ได้รับการออกแบบโดยอิงจากบรรทัดฐาน PSPG ที่อนุรักษ์ไว้เพื่อโคลน UGT ที่อนุญาตจากCistanche tubulosa. ลำดับสิ้นสุด 3′ ที่ได้รับนั้นได้รับการวิเคราะห์เพิ่มเติมโดย NCBI blast และไพรเมอร์เฉพาะสำหรับ 5′-RACE ได้รับการออกแบบตามลำดับที่ได้รับ ปลาย cDNA ที่ขยาย 5′ และปลาย cDNA 3′ ถูกต่อเข้าด้วยกันและต่อความยาวเต็มของCtUGT1ได้รับลำดับ รวมถึง 1739 นิวคลีโอไทด์ (รูปที่ S3) และระบุไว้ในข้อมูลเสริม หมายเหตุ 3 ต่อจากนั้น กรอบการอ่านแบบเปิด (ORF) ของCtUGT1พบโดยเครื่องมือ NCBI ORF Finder และลำดับการเข้ารหัส 1482 bp ถูกโคลนสำเร็จโดยการขยาย RT-PCR โดยใช้ไพรเมอร์เฉพาะในตาราง S1 ลำดับ cDNA ของ CtUGT1 ถูกส่งไปยัง NCBI แล้ว (ภาคยานุวัติหมายเลข MW629113)
3.2. การวิเคราะห์ลำดับและการแสดงออกที่แตกต่างกันของ CtUGT1
ดิCtUGT1คาดว่ายีนจะเข้ารหัสโปรตีนของเรซิดิวกรดอะมิโน 493 ตัวด้วยมวลโมเลกุลโดยประมาณที่ 55.78 kDa การระเบิดของ NCBI เปิดเผยว่าลำดับโปรตีนอนุมานของCtUGT1แบ่งปันเอกลักษณ์สูงสุด (76.39 เปอร์เซ็นต์ ) ด้วยเอ็นไซม์ที่คล้าย UGT86A1- หน้าที่ทางชีวเคมีของเอนไซม์ชนิดนี้ยังไม่ได้รับการระบุลักษณะที่สมบูรณ์ คาดการณ์ว่าพวกเขาอาจเกี่ยวข้องกับการปรับตัวของพืชให้เข้ากับความเครียดจากสิ่งมีชีวิต การจัดแนวของลำดับกรดอะมิโนของ CtUGT1 และไกลโคซิลทรานสเฟอเรสจากพืชอื่นๆ แสดงไว้ในรูปที่ S4
พบสารตกค้าง 44 ตัวที่อนุรักษ์ไว้อย่างดีของแม่ลาย PSPG ที่ปลาย C ของCtUGT1. ภายในกล่อง PSPG ลำดับเปปไทด์ของ HCGWNS อยู่ที่กรดอะมิโนที่ 373 ซึ่งตรวจพบใน 95 เปอร์เซ็นต์ของไกลโคซิลทรานสเฟอเรสทั้งหมด [31] สารตกค้างสุดท้ายของบรรทัดฐาน PSPG คือกลูตามีน ซึ่งบ่งชี้ว่าเอนไซม์นี้มีแนวโน้มที่จะใช้ UDPG เป็นผู้บริจาคน้ำตาล [32] (รูปที่ S4) ต้นไม้สายวิวัฒนาการถูกสร้างขึ้นบนพื้นฐานของลำดับพอลิเปปไทด์ที่ทำนายไว้ของCtUGT1และไกลโคซิลทรานสเฟอเรสจากพืชชนิดต่าง ๆ ซึ่งเกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ทางชีวเคมีของสารทุติยภูมิต่างๆ จนถึงตอนนี้ ไกลโคซิลทรานส์เฟอเรสที่รายงานส่วนใหญ่จากพืชรู้จักฟลาโวนอยด์เป็นซับสเตรตของพวกมัน เช่น ฟลาโวน 7-O-ไกลโคซิลทรานสเฟอเรส, ฟลาโวนอยด์ 3-O-กลูโคซิลทรานสเฟอเรส, ไอโซฟลาโวน 7-O-ไกลโคซิลทรานสเฟอเรส และ คาลโคน ไกลโคซิลทรานสเฟอเรส ผลการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการพบว่าCtUGT1ไม่ได้จัดอยู่ในกลุ่มของ flavonoid GTs แต่จะอยู่ติดกับ UGT74T1 และ UGT74S1 (lignan glycosyltransferases จาก Linum usitatissimum) และ NtGT2 (a coumarin glycosyltransferase จาก Nicotiana tabacum) ซึ่งบ่งชี้ว่าCtUGT1อาจมีกิจกรรมการเร่งปฏิกิริยาที่แปลกใหม่ต่อสารตั้งต้นฟีนิลโพรพานอยด์ (รูปที่ 1) โดยเฉพาะอย่างยิ่งการพิจารณาว่ามีเพียงสมาชิกที่จำกัดเท่านั้นที่ได้รับการระบุตามหน้าที่ของเคลดเหล่านี้
เพื่อเปิดเผยกิจกรรมการเร่งปฏิกิริยาเพิ่มเติม theCtUGT1ลำดับถูกแสดงออกภายใต้การควบคุมของ T7 lac โปรโมเตอร์ในเซลล์ E. coli Transetta (DE3) เป็นโปรตีนหลอมรวมที่แท็ก6-ของเขา รีคอมบิแนนท์ที่ติดแท็กของพระองค์CtUGT1ถูกทำให้บริสุทธิ์จนเป็นเนื้อเดียวกันได้อย่างมีประสิทธิภาพโดย Ni–NTA แอฟฟินิตี้ โครมาโตกราฟี น้ำหนักโมเลกุลของรีคอมบิแนนท์ CtUGT1 ที่บริสุทธิ์คือประมาณ 55 kDa (รูปที่ S5) ซึ่งสอดคล้องกับมวลโมเลกุลที่คาดการณ์ไว้
3.3. ความจำเพาะของสารตั้งต้นในหลอดทดลองของ CtUGT1
เพื่อทดสอบการทำงานของไกลโคซิเลชันของCtUGT1, การสอบวิเคราะห์ด้วยเอนไซม์ ในหลอดทดลอง ถูกดำเนินการ ใช้ UDPG เป็นผู้บริจาคน้ำตาล ผู้รับน้ำตาลได้รับการคัดเลือกตามข้อกังวลต่างๆ ประการแรกCtUGT1ยีนถูกโคลนจากCistanche tubulosaซึ่งมีองค์ประกอบทางเคมีหลักคือ PhGs เพื่อตรวจสอบว่าCtUGT1มีส่วนร่วมในการสังเคราะห์ทางชีวภาพของ PhGs ซึ่งเป็น aglycones ทั่วไปของ PhGs ในCistanche tubulosaเช่น tyrosol (NP1, รูปที่ S2) และ salidroside (NP2, รูปที่ S2) ถูกเลือกเป็นสารตั้งต้นในตอนแรก น่าเสียดายที่การวิเคราะห์ HPLC และ HRESI-MS ไม่พบผลิตภัณฑ์ไกลโคซิเลต ซึ่งบ่งชี้ว่าCtUGT1อาจไม่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ทางชีวภาพของ PhGs
ประการที่สอง ตามการจัดตำแหน่งลำดับและผลการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการ (รูปที่ 1)CtUGT1มีความสัมพันธ์ทางสายวิวัฒนาการกับลิกนานอยด์และคูมาริน ไกลโคซิลทรานสเฟอเรส ซึ่งเสนอแนะว่าCtUGT1น่าจะเป็น phenylpropanoid glycosyltransferase เพื่อตรวจสอบการทำนายนี้ สามสารตั้งต้นคูมาริน 1, 2 และ 3 ร่วมกับสารตั้งต้นลิกนานอยด์หนึ่งตัว แมกโนลอล NP17 ถูกทดสอบเป็นตัวรับน้ำตาลตามลำดับ เอนไซม์ที่ถูกระงับความร้อน (100 ◦C, 10 นาที) ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ การวิเคราะห์ HPLC-HRESI-MS ของปฏิกิริยาโดยใช้ NP17 เป็นซับสเตรตไม่พบผลิตภัณฑ์ใดๆ ตรงกันข้าม,CtUGT1แสดงความสามารถในการกลูโคซิเลชันอย่างเห็นได้ชัดเมื่อเทียบกับซับสเตรตคูมารินที่ทดสอบ (1,2,3) โดยใช้ซับสเตรต 1 เป็นตัวอย่าง ดังแสดงในรูปที่ 2A พีคใหม่ (1a) ที่มีเวลาการคงอยู่ที่ลดลง (11.46 นาที) เมื่อเทียบกับซับสเตรต 1 (19.75 นาที) ถูกสร้างโดยCtUGT1ที่ให้ผลผลิต 37.78 เปอร์เซ็นต์ สเปกตรัมการดูดกลืนแสง UV สอดคล้องกับ 1 สเปกตรัม HRESI-MS แสดงให้เห็นว่าจุดสูงสุด 1a แสดงค่า [M บวก H] บวกที่ m/z 325.1029 และ [M บวก Na] บวกที่ m/z 347.0710 (calcd. 347.0737 สำหรับ C15H16O8Na ) ด้วยสูตรที่ทำนายไว้ของ C15H16O8 ซึ่งมีค่ามากกว่า 162 amu และสอดคล้องกับสูตรทางทฤษฎีของผลิตภัณฑ์ที่มีกลูโคซิเลต (รูปที่ 2A) ในทำนองเดียวกัน พบผลิตภัณฑ์กลูโคซิเลตของซับสเตรต 2 (14.21 นาที รูปที่ 2B) และ 3 (21.92 นาที รูปที่ 2C) ที่เวลาเก็บรักษา 10.85 นาที และ 13.80 นาที ด้วยอัตราการแปลงที่ 22.03 เปอร์เซ็นต์ และ 68.67 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ มวลโมเลกุลของผลิตภัณฑ์จับคู่กับมวลที่คำนวณได้ของผลิตภัณฑ์กลูโคซิเลตอย่างแน่นอน ซึ่งยืนยันได้ว่าCtUGT1สามารถกระตุ้นกลูโคซิเลชั่นของสารประกอบคูมาริน 1–3 (ตารางที่ 1)
ต่อจากนั้น เมื่อพิจารณาว่าเอ็นไซม์ที่รายงานล่าสุดส่วนใหญ่แสดงความสำส่อนในการเร่งปฏิกิริยา ในหลอดทดลอง เพื่อสำรวจสเปกตรัมซับสเตรตของCtUGT1, การทดสอบเอ็นไซม์แบบขยายได้ดำเนินการกับสารประกอบที่หลากหลายที่เป็นของผลิตภัณฑ์ธรรมชาติประเภทต่างๆ รวมทั้งฟลาโวนอยด์ สารประกอบฟีนอลิก คูมาริน สติลบีน แอนทราควิโนน เบนโซฟีโนน แนฟทาลีน และอิริดอยด์ (รูปที่ S1-S2) โดยใช้ UDPG เป็น ผู้บริจาคน้ำตาล พบว่าสารตั้งต้นเบนโซฟีโนน 4,4′-ไดไฮดรอกซีเบนโซฟีโนน (4), เจนิสไตน์ไอโซฟลาโวน (5) และสารตั้งต้นแอนทราควิโนนเอโลอีโมดิน (6) สามารถเร่งปฏิกิริยาได้ด้วยCtUGT1เพื่อสร้างผลิตภัณฑ์กลูโคซิเลตที่สอดคล้องกัน 4a, 5a, 6a ที่มีขั้วสูงกว่า (รูปที่ 3) การวิเคราะห์ HRESI-MS แสดงให้เห็นว่าพีคไอออนของผลิตภัณฑ์มีค่าทั้งหมด 162 amu มากกว่าของซับสเตรต ซึ่งบ่งชี้ว่าCtUGT1สามารถกระตุ้นกลูโคซิเลชั่นของสารประกอบเหล่านี้เพื่อสร้างผลิตภัณฑ์โมโนกลูโคไซด์ที่สอดคล้องกันของพวกมัน อัตราการแปลง 4, 5 และ 6 เท่ากับ 4.12 เปอร์เซ็นต์ , 14.14 เปอร์เซ็นต์ และ 23.33 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ (ตารางที่ 1)
การคัดเลือกผู้บริจาคน้ำตาลของCtUGT1ยังได้สำรวจ นอกจาก UDPG แล้ว ผู้บริจาคอีกหกราย รวมถึง UDP-N-acetyl galactosamine, UDP galactose, GDP-mannose, GDP-fucose, UDP-galacturonic acid และ UDP rhamnose ได้รับการทดสอบโดยใช้ซับสเตรต 1-6 เป็นตัวรับ ผลปรากฏว่าCtUGT1โดยคัดเลือก UDPG เป็นผู้บริจาคน้ำตาลโดยเฉพาะ ไม่พบผลิตภัณฑ์เมื่อทดสอบน้ำตาลที่เปิดใช้งานอื่น ๆ (ไม่แสดงข้อมูล)
3.4. คุณสมบัติทางชีวเคมีและพารามิเตอร์จลนศาสตร์ของ CtUGT1
คุณสมบัติทางชีวเคมีของCtUGT1ถูกตรวจสอบโดยใช้ 3 เป็นตัวรับน้ำตาล และ UDPG เป็นผู้บริจาคน้ำตาลตามที่แสดงในรูปที่ 4 การเร่งปฏิกิริยาCtUGT1ได้รับการทดสอบในช่วงอุณหภูมิ 4–60 ◦C ตรวจพบกิจกรรมที่เหมาะสมที่ 37 ◦C (รูปที่ 4A) การวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์ระหว่าง pH 30 และ 90 แสดงให้เห็นว่าค่า pH ที่เหมาะสมที่สุดถูกสังเกตพบที่ pH 8.0 (บัฟเฟอร์ 100 mM KH2PO4-K2HPO4, รูปที่ 4C) ผลผลิตของผลิตภัณฑ์กลูโคซิเลชั่น 3a เพิ่มขึ้นเป็นเส้นตรงภายใน 1 ชั่วโมงและอัตราการเติบโตถูกปรับระดับหลังจาก 5 ชั่วโมง (รูปที่ 4B) ค่า Km ที่ชัดเจนของCtUGT1สำหรับ 3 คือ 218.7 ± 7.176 μM และ Vmax คือ 0.02255 ± 0.0001796 nmol⋅min− 1⋅ug− 1
3.5. การเตรียมเอนไซม์และการระบุโครงสร้างของผลิตภัณฑ์กลูโคซิเลต
จากผลการตรวจเอนไซม์CtUGT1มีแนวโน้มที่จะเป็นกลูโคซิลทรานสเฟอเรสจำเพาะที่สามารถกระตุ้นกลูโคซิเลชั่นของผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติประเภทต่างๆ ข้อมูล HPLC-HR-MS ของผลิตภัณฑ์ถูกสรุปไว้ในตารางที่ 1 ในหมู่พวกเขา ซับสเตรตคูมารินมีอัตราการแปลงที่มาก กิจกรรมของเอนไซม์ที่ต่อต้านคูมารินถูกวิเคราะห์เพิ่มเติม ควรสังเกตว่าสารตั้งต้นคูมารินที่ทดสอบทั้งสามชนิดยอมรับโดยCtUGT1มีหมู่ไฮดรอกซิลที่ตำแหน่ง C-7 ในขณะที่เอสคิวเลติน (2) มีหมู่ไฮดรอกซิลพิเศษที่ตำแหน่ง C-6 โพรไฟล์ HPLC ของผลิตภัณฑ์กลูโคซิเลตของเอสคูเลตินแสดงไว้ในรูปที่ 2 สังเกตพบเพียงผลิตภัณฑ์เดียว ซึ่งบ่งชี้ว่าปฏิกิริยากลูโคซิเลชันเกิดขึ้นที่ตำแหน่ง C-6 หรือ C-7 เพื่อยืนยันตำแหน่งไกลโคซิเลชัน ผลิตภัณฑ์ 2a ถูกระบุโดยการเปรียบเทียบกับกลูโคไซด์แท้โดยการวิเคราะห์ HPLC-UV/HRESI-MS เมื่อเพิ่มกลูโคไซด์ cichoriin แท้ (กลูโคซิเลตที่ตำแหน่ง 7-OH ของ 2) ในระบบปฏิกิริยา พีคทับซ้อนกับ 2a โพรไฟล์ co-HPLC ยืนยันเพิ่มเติมว่าผลิตภัณฑ์ไกลโคซิเลต 2 ตัวเร่งปฏิกิริยาด้วยCtUGT1คือ cichoriin [33] ซึ่งพิสูจน์ว่ากลูโคซิลมอยอิตีถูกถ่ายโอนอย่างจำเพาะบนตำแหน่ง C7-OH ผลิตภัณฑ์ 1a ยังถูกระบุด้วยการเปรียบเทียบกับมาตรฐานอ้างอิง สเปกตรัม UV-HPLC ร่วมกับการวิเคราะห์ co-HPLC (รูปที่ 2) เปิดเผยว่าโครงสร้างทางเคมีของ 1a ถูกนำมาประกอบเป็น skimming [34] ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ที่มีกลูโคซิเลตของ 1 บนตำแหน่ง C7-OH
ผลิตภัณฑ์ 3a ถูกเตรียมจากปฏิกิริยาที่ขยายขนาดและแสดงคุณลักษณะเชิงโครงสร้างโดย HRESI-MS, 1H NMR และ 13C NMR สเปกโทรสโกปี (รูปที่ S13, S14 และหมายเหตุ 4) ในสัญญาณ 1H NMR เมื่อเปรียบเทียบกับสารตั้งต้น 3 สัญญาณฟีนอลิกไฮดรอกซิลที่ตำแหน่ง C{{10}} หายไป และสัญญาณคาร์บอนของ C-7 เลื่อน δ 1{{25} } ppm ไปยังสนามสูง ในขณะที่สัญญาณ C-6 และ C-8 เปลี่ยนไปที่สนามต่ำใน 13C NMR การค้นพบนี้ยืนยันว่าเรซิดิวกลูโคราโนซิลติดอยู่กับหมู่ฟีนอลิกไฮดรอกซิลที่ตำแหน่ง C-7 ที่ 3 [35] นอกจากนี้ สเปกตรัม 1H NMR แสดงสัญญาณโปรตอนอะโนเมอร์ที่ δH 5.00 (1H, d, J=7.0 Hz); ส่วนประกอบน้ำตาลถูกระบุว่าเป็น -D-glucopyranose ผลลัพธ์นี้แสดงให้เห็นCtUGT1เป็นคูมาริน O-กลูโคซิลทรานสเฟอเรสที่เร่งปฏิกิริยากลูโคซิเลชันของไฮดรอกซิลคูมารินที่ตำแหน่ง 7-OH
3.6. แบบจำลองความคล้ายคลึง การเทียบเคียงของโมเลกุล และการทำให้เกิดการกลายพันธุ์ที่ควบคุมตำแหน่งของโปรตีน CtUGT1
ปฏิกิริยาของเอนไซม์อย่างกว้างขวางพบว่าCtUGT1สามารถกระตุ้นกลูโคซิเลชันของคูมารินสามตัวให้เป็นผลิตภัณฑ์ที่มีกลูโคซิเลตที่สอดคล้องกัน และตำแหน่งกลูโคซิเลตเกิดขึ้นอย่างจำเพาะที่ตำแหน่ง 7- OH เพื่อระบุสารตกค้างที่สำคัญที่กำหนดกิจกรรมการเร่งปฏิกิริยาของCtUGT1, การทำแบบจำลองโฮโมโลยี, การเชื่อมต่อระดับโมเลกุล และการตรวจสอบการกลายพันธุ์ที่มุ่งเป้าไปที่ CtUGT1 ถูกดำเนินการ การสร้างแบบจำลองโมเลกุลที่คล้ายคลึงกันสำหรับ CtUGT1 ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ SWISS-MODEL [21-25] โครงสร้างผลึกของ Medicago truncatula glycosyl transferase UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) ซึ่งกำหนดหาที่ความละเอียด 2.1 Å แสดงคะแนนรวมสูงสุดที่มีความเหมือนกันของลำดับสูงสุดและค่า E ต่ำ ถูกเลือกให้เป็นโครงสร้างเทมเพลต [26] การประเมินความสมเหตุสมผลของแบบจำลองที่กำหนดได้แสดงไว้ในแผนภาพรามจันทรา (รูปที่ S6) โดยร้อยละ 88.5 ของสิ่งตกค้างในแบบจำลองที่จัดตั้งขึ้นนั้นอยู่ในพื้นที่ที่ได้รับความนิยมมากที่สุด แบบจำลองความคล้ายคลึงกันของ CtUGT1 ประกอบด้วยลวดลายการพับแบบรอสมันน์สองแบบที่คล้ายกันที่ขั้ว N และ C ตามลำดับ (รูปที่ 5A) โดเมนปลาย N มีแผ่นคู่ขนานเจ็ดเกลียวรอบ ๆ สิบเฮลิ โดเมนปลาย C มีแผ่นกระดาษหกเกลียวขนาบข้างด้วยเกลียวเกลียวเก้าเส้น (รูปที่ 5A, S7)
เพื่อชี้แจงเพิ่มเติมเกี่ยวกับกระเป๋าที่ใช้งานของCtUGT1ได้ทำการเทียบท่าโมเลกุล เนื่องจาก UGT85H2 มีโครงสร้างรูปแบบ apo เท่านั้น โฮโมล็อก UGT74F2 อีกตัวที่มีทั้ง UDP และกรดซาลิไซลิกเป็นลิแกนด์สองตัวจึงถูกเลือกเป็นแม่แบบควบคุม UDPG จัดทำขึ้นในฐานะผู้บริจาคน้ำตาล เตรียมสารตั้งต้นคูมาริน 1 และ 2 สองตัวเป็นตัวรับน้ำตาลตามลำดับ ตำแหน่งการจับของผู้ให้ไกลโคซิลและตัวรับถูกคำนวณและเทียบชิดขอบแยกกันดังแสดงในรูปที่ 5 ผลลัพธ์บ่งชี้ว่าช่องจับทั้งสองช่องตั้งอยู่ภายในร่องลึกในพื้นที่ปฏิสัมพันธ์ของโดเมนปลาย N ที่อัดแน่นและ C -terminus โดเมนของCtUGT1และเชิงพื้นที่ใกล้กัน (รูปที่ 5A) C-terminus ของCtUGT1ส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับการสัมผัสกับผู้ให้ไกลโคซิลตามที่อธิบายไว้ใน UGT ของพืชชนิดอื่น และส่วนที่เหลืออยู่โดยรอบจะชอบน้ำและอนุรักษ์ไว้อย่างสูง เช่น กล่อง PSPG ทั่วไป เรซิดิว W377 ในบรรทัดฐานนี้สามารถสร้างพันธะไฮโดรเจนกับกลุ่มกลูโคสของ UDPG (รูปที่ 5B); N378 และ S379 ในบรรทัดฐานนี้สามารถก่อรูปพันธะไฮโดรเจนกับหมู่ไดฟอสเฟตของ UDPG (รูปที่ 5B) นอกจากนี้ ตามผลการเทียบท่า สารตกค้างของ W356 และ Q359 อาจโต้ตอบกับหมู่ยูริดีนผ่านอันตรกิริยาของพันธะไฮโดรเจนเพื่อทำให้ผู้บริจาคมีเสถียรภาพในกระเป๋าที่ใช้งานอยู่ เพื่อตรวจสอบการทำงานของเรซิดิวหลักที่คาดการณ์ไว้เหล่านี้ ตำแหน่งทั้งหมด 16 ตำแหน่งถูกเลือกและอยู่ภายใต้การทำให้เกิดการกลายพันธุ์ด้วยการส่องกราดอะลานีน กิจกรรมการเร่งปฏิกิริยาของการกลายพันธุ์เหล่านี้ได้รับการทดสอบโดยใช้ซับสเตรตที่เป็นบวกทั้งหมดหกชนิดที่กล่าวถึงข้างต้น การวิเคราะห์ด้วย HPLC แสดงให้เห็นว่าเมื่อเรซิดิวของ G18, H19, S295, F296, W356, C357, Q359, H374, G376, W377, N378, S379, E382, Y397 และ D398 กลายพันธุ์ไปเป็นอะลานีน การออกฤทธิ์ของไกลโคซิเลชันของโปรตีนคือ สูญเสียไปโดยสิ้นเชิงกับพื้นผิวที่ทดสอบทั้งหมด ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าเรซิดิว 16 ตัวข้างต้นเป็นเรซิดิวหลักที่กำหนดการจับของผู้ให้ UDPG และกิจกรรมไกลโคซิเลชันของCtUGT1.
To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44 เปอร์เซ็นต์ ) เช่น V14, V132, E153, T212 และ I209 (รูปที่ S8) มีการคาดการณ์ว่าสารตกค้างที่ไม่ชอบน้ำเหล่านี้รอบๆ วงแหวนอะโรมาติกอาจก่อให้เกิดปฏิกิริยา Van der Waals กับสารตั้งต้นในกระเป๋าที่ผูกไว้
4. การอภิปราย
ไกลโคซิเลชันเป็นหนึ่งในขั้นตอนการปรับเปลี่ยนที่สำคัญที่สุดในวิถีการสังเคราะห์ทางชีวสังเคราะห์ของเมตาโบไลต์ทุติยภูมิจำนวนมาก ไกลโคซิเลชันสามารถเพิ่มการดูดซึมของผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติโดยการปรับปรุงความสามารถในการละลายน้ำและลดความเป็นพิษของผลิตภัณฑ์ Coumarin ถือเป็นรูปแบบที่ง่ายที่สุดในกลุ่มฟีนอลย่อยที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติซึ่งสร้างจากวงแหวน -pyrone ที่หลอมรวมกับวงแหวนเบนซิน ทั้งสารประกอบธรรมชาติและสารสังเคราะห์ที่มีคูมารินเป็นส่วนประกอบหลักได้รับความสนใจอย่างมากจากนักเคมีด้านยาและนักวิทยาศาสตร์ด้านการออกแบบยา อันเป็นผลมาจากคุณสมบัติทางเภสัชวิทยาและชีวภาพที่หลากหลาย [36] การดัดแปลงไกลโคซิเลตเพิ่มเติมของคูมารินสามารถช่วยเพิ่มความหลากหลายทางโครงสร้างของสารประกอบเหล่านี้ และปรับปรุงความสามารถในการละลายและการดูดซึมของพวกมัน ในพืช กระบวนการไกลโคซิเลชันดังกล่าวถูกเร่งโดย UDP-glycosyltransferase แม้ว่าจะมีการระบุ UGT หลายตัวจากพืชที่แตกต่างกัน แต่จนถึงปัจจุบัน UGT ที่รายงานส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับการดัดแปลงไกลโคซิเลตของฟลาโวนอยด์ มีรายงานเพียง UGT ที่จำกัดเท่านั้นที่สามารถรับคูมารินเป็นสารตั้งต้นได้ ในการศึกษานี้ ยีนใหม่ของไกลโคซิลทรานสเฟอเรสCtUGT1ถูกลอกแบบมาจากสมุนไพรจีนโบราณCistanche tubulosa. การจัดลำดับและผลการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการพบว่าCtUGT1อยู่ห่างไกลจาก UGTs ฟลาโวนอยด์ส่วนใหญ่ที่รายงานโดยสายวิวัฒนาการ และใกล้กับ UGT ฟีนิลโพรพานอยด์มาก การทดสอบเอ็นไซม์อย่างกว้างขวางพบว่า CtUGT1 ไม่สามารถเร่งปฏิกิริยาไกลโคซิเลชันของสารประกอบฟีนิลเอทานอลเพื่อสร้าง PhGs ซึ่งเป็นองค์ประกอบทางเคมีหลักของCistanche tubulosa. แต่มันสามารถรับรู้คูมารินเป็นซับสเตรตของมัน และทำปฏิกิริยาไกลโคซิเลชันได้ การอธิบายโครงสร้างของผลิตภัณฑ์พบว่าตำแหน่งไกลโคซิเลชั่นเร่งปฏิกิริยาด้วยCtUGT1เกิดขึ้นเฉพาะที่ตำแหน่ง C7-OH ของคูมาริน โดยการใช้ CtUGT1 คูมารินไกลโคไซด์สามชนิดซึ่งรวมถึง skimming (1a), cichoriin (2a) และ 4-methylumbelliferyl glucoside (3a) ถูกสังเคราะห์ด้วยเอนไซม์อย่างประสบความสำเร็จและระบุโครงสร้าง สารประกอบทั้งสามนี้ถูกรายงานว่าเป็นโมเลกุลที่ออกฤทธิ์ทางเภสัชกรรม ตัวอย่างเช่น 1a ได้รับการพิจารณาว่ามีฤทธิ์ทางเภสัชวิทยาต่างๆ ซึ่งรวมถึงฤทธิ์ป้องกันเซลล์ประสาท ต้านการอักเสบ ต้านมะเร็ง และคุณสมบัติต้านอะมีบา [37] 2a แสดงฤทธิ์ต้านแบคทีเรียในระดับสูงต่อแบคทีเรียแกรมบวกบางชนิด เช่น Bacillus cereus และ Staphylococcus aureus [38] 3a สามารถช่วยให้พืชปรับปรุงความสามารถในการตอบสนองต่อสารเคมีและสารพิษ [39]
นอกจากคูมารินแล้ว การทดสอบเอ็นไซม์อย่างกว้างขวางยังพบว่าCtUGT1ยังแสดงให้เห็นกิจกรรมของกลูโคซิเลชันที่สังเกตได้ต่อซับสเตรตเบนโซฟีโนน 4, ซับสเตรตไอโซฟลาโวน 5 และซับสเตรตแอนทราควิโนน 6 ซึ่งบ่งชี้ว่า CtUGT1 มีความทนทานต่อซับสเตรตที่แน่นอน แต่ถึงอย่างไร,CtUGT1ไม่สามารถกระตุ้นการสังเคราะห์ทางชีวภาพของส่วนประกอบไกลโคไซด์ในCistanche tubulosaเช่น phenylethanoid glycosides (PhGs), lignanoid glycosides และ iridoid glycosides นอกจากนี้ จากการสอบสวนครั้งก่อน ไม่มีการแยกคูมารินไกลโคไซด์ออกจากCistanche tubulosa. ดังนั้น ฟังก์ชันในร่างกายของCtUGT1ยังคงต้องสำรวจเพิ่มเติม กิจกรรมของกลูโคซิเลชันของ CtUGT1 ต่อสารตั้งต้นคูมารินทำให้เอนไซม์นี้เป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์สำหรับการปรับเปลี่ยนไกลโคซิเลชันของเอนไซม์ของคูมาริน และยังบ่งชี้ด้วยว่าเอ็นไซม์เมตาบอลิซึมทุติยภูมิของพืชสามารถดำเนินกิจกรรมเร่งปฏิกิริยาที่ประเมินค่าไม่ได้ซึ่งอยู่ไกลเกินกว่าหน้าที่ดั้งเดิมของพวกมัน
การประกาศผลประโยชน์ที่แข่งขันกัน
ผู้เขียนประกาศว่าไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์
การรับทราบ
งานนี้ได้รับการสนับสนุนทางการเงินจากมูลนิธิวิทยาศาสตร์ธรรมชาติปักกิ่ง (หมายเลขแกรนต์ 7192112); โครงการผู้สนับสนุนนักวิทยาศาสตร์รุ่นเยาว์โดย CAST (Grant No. CACM− 2018− QNRC1− 02); มูลนิธิวิทยาศาสตร์ธรรมชาติแห่งชาติของจีน (หมายเลข 81402809) กองทุนทุนการศึกษาแห่งสภาทุนการศึกษาแห่งประเทศจีน (หมายเลขแกรนท์ 201906555010) และมูลนิธิวิทยาศาสตร์เพื่อนักวิชาการรุ่นเยาว์แห่งมหาวิทยาลัยปักกิ่งแห่งการแพทย์แผนจีน (หมายเลขแกรนต์ 2018-JYB-XJQ006)
ภาคผนวก ก. ข้อมูลเสริม
สามารถดูข้อมูลเพิ่มเติมของบทความนี้ได้ทางออนไลน์ที่ https://doi org/10.1016/j.fitote.2021.104995.
จาก: ' การโคลนโมเลกุลและลักษณะทางชีวเคมีของคูมารินไกลโคซิลทรานสเฟอเรสCtUGT1จากCistanche tubulosa' โดยXiping Xu และคณะ
---Fitoterapia 153 (2021) 104995 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2021.104995
อ้างอิง
[1] Y. Li, S. Baldauf, EK Lim, DJ Bowles, การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการของตระกูล UDPglycosyltransferase multigene ของ Arabidopsis thaliana, J. Biol เคมี. 276 (2001) 4338–4343, https://doi.org/10.1074/jbc.M007447200.
[2] LF Mackenzie, Q. Wang, RAJ Warren, SG Withers, Glycosynthases: glycosidases กลายพันธุ์สำหรับการสังเคราะห์โอลิโกแซ็กคาไรด์, J. Am. เคมี. ซ. 120 (1998) 5583–5584, https://doi.org/10.1021/ja980833d.
[3] CJ Thibodeaux, CE Melancon, HW Liu, การสังเคราะห์น้ำตาลที่ผิดปกติและไกลโคไดเวอร์ซิฟิเคชั่นของผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ, Nature 446 (2007) 1008–1016, https://doi.org/ 10.1038/nature05814
[4] Y. Ji, B. Li, M. Qiao, J. Li, H. Xu, L. Zhang, X. Zhang, ความก้าวหน้าในร่างกายและในหลอดทดลองของฟลาโวนอยด์, Appl. ไมโครไบโอล เทคโนโลยีชีวภาพ 104 (2020) 6587–6600, https://doi.org/10.1007/s00253-020-10667-z.
[5] T. Koeduka, Y. Ueyama, S. Kitajima, T. Ohnishi, K. Matsui, การโคลนโมเลกุลและการกำหนดลักษณะของ UDP-glucose: benzenoid/phenylpropanoid glucosyltransferase ที่ระเหยได้ในดอกพิทูเนีย, J. Plant Physiol 252 (2020) 153245, https://doi.org/10.1016/j.jplph.2020.153245.
[6] S. Rahimi, J. Kim, I. Mijakovic, KH Jung, G. Choi, SC Kim, YJ Kim, Triterpenoid-biosynthetic UDP-glycosyltransferases จากพืช, เทคโนโลยีชีวภาพ โฆษณา 37 (2019) 107394, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.04.016.
[7] G. Singh, YV Dhar, MH Asif, P. Misra, การสำรวจความสำคัญเชิงหน้าที่ของเอนไซม์สเตอรอลไกลโคซิลทรานสเฟอเรส, Prog. ลิปิด Res. 69 (2018) 1–10, https://doi. org/10.1016/j.plipres.2017.11.001.
[8] KF McCue, PV Allen, LV Shepherd, A. Blake, J. Whitworth, MM Maccree, DR Rockhold, D. Stewart, HV Davies, WR Belknap, กลูโคซิลทรานสเฟอเรส steroidal alkaloid ในร่างกายจากมันฝรั่ง Phytochemistry 67 (2006) 1590–1597, https://doi.org/10.1016/j.phytochem.
[9] J. Yu, L. Wang, RL Walzem, EG Miller, LM Pike, BS Patil, ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของซิตรัส limonoids, flavonoids และ coumarins, J. Agric เคมีอาหาร. 53 (2005) 2009–2014, https://doi.org/10.1021/jf0484632.
[10] HJ Cho, SG Jeong, JE Park, JA Han, HR Kang, D. Lee, MJ Song, ฤทธิ์ต้านไวรัสของ angelicin ต่อ gammaherpesviruses, Antivir ความละเอียด 100 (2013) 75–83, https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2013.07.009.
[11] Z. Xu, Q. Chen, Y. Zhang, C. Liang, อนุพันธ์ของ Coumarin ที่มีฤทธิ์ต้าน HIV, Fitoterapia 150 (2021) 104863, https://doi.org/10.1016/j. fitote.2021.104863.
[12] AT Mossa, TM Heikal, M. Belaiba, EG Raoelison, H. Ferhout, J. Bouajila, ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและศักยภาพในการป้องกันตับของ Cedrelopsis grevei ต่อ cypermethrin ทำให้เกิดความเครียดออกซิเดชันและความเสียหายของตับในหนูเพศผู้ BMC Complement ทางเลือก เมดิ. 15 (2015) 251, https://doi.org/10.1186/s12906-015-0740-2.
[13] Y. Bansal, P. Sethi, G. Bansal, Coumarin: นิวเคลียสที่มีศักยภาพสำหรับโมเลกุลต้านการอักเสบ, Med. เคมี. ความละเอียด 22 (2013) 3049–3060, https://doi.org/10.1007/s00044-012-0321-6.
[14] M. Kumar, R. Singla, J. Dandriyal, V. Jaitak, อนุพันธ์ของ Coumarin เป็นสารต้านมะเร็งสำหรับการรักษามะเร็งปอด: บทวิจารณ์, Anti Cancer Agents Med เคมี. 18 (2018) 964–984, https://doi.org/10.2174/1871520618666171229185926.
[15] A. Stefanachi, F. Leonetti, L. Pisani, M. Catto, A. Carotti, Coumarin: โครงนั่งร้านจากธรรมชาติที่มีสิทธิพิเศษและหลากหลายสำหรับสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพ Molecules 23 (2018) 250, https://doi.org /10.3390/โมเลกุล23020250.
[16] T. Taguchi, N. Ubukata, H. Hayashida, M. Yamamoto, Okazaki, การโคลนและการกำหนดลักษณะของกลูโคซิลทรานส์เฟอเรสที่ทำปฏิกิริยากับ 7-กลุ่มไฮดรอกซิลของฟลาโวนอลและ 3-กลุ่มไฮดรอกซิลของคูมารินจาก เซลล์ยาสูบ, อาร์ค. ไบโอเคมี. ชีวฟิสิกส์ 420 (2003) 95–102, https://doi.org/10.1016/j.abb.2003.09.027.
[17] L. Zhou, T. Tian, B. Xue, L. Song, L. Liu, R. Yu, การสังเคราะห์ทางชีวสังเคราะห์ของคูมารินไกลโคไซด์โดยรากขนดัดแปรพันธุกรรมของ Polygonum multiflorum, Biosci เทคโนโลยีชีวภาพ ไบโอเคมี. 76 (2012) 1008–1010, https://doi.org/10.1271/bbb.110347.
[18] H. Kanoh, M. Kawauchi, M. Kuroyanagi, T. Arima, การโคลนโมเลกุลและการกำหนดลักษณะของ coumarin glucosyltransferase ในรากขนของ Pharbitis nil (Ipomoea nil), ลัทธิเนื้อเยื่อพืช เลตต์. 31 (2014) 21–28, https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.13.1203a.
[19] JB He, P. Zhao, ZM Hu, S. Liu, Y. Kuang, M. Zhang, B. Li, CH Yun, X. Qiao, M. Ye, ลักษณะโมเลกุลและโครงสร้างของ Cglycosyltransferase ที่หลากหลายจาก Trollius ชิเนนซิส, แองเจิ้ล. เคมี. อินเตอร์ เอ็ด. อังกฤษ 58 (2019) 11513–11520, https://doi.org/10.1002/anie.201905505.
[20] S. Kumar, G. Stecher, K. Tamura, MEGA7: การวิเคราะห์พันธุกรรมเชิงวิวัฒนาการระดับโมเลกุล เวอร์ชัน 7.0 สำหรับชุดข้อมูลที่ใหญ่กว่า Mol. ไบโอล. วิวัฒนาการ 33 (2559) 2413-2417 https://doi. org/10.1093/molbev/msw054.
[21] A. Waterhouse, M. Bertoni, S. Bienert, G. Studer, G. Tauriello, R. Gumienny, FT Heer, TAP de Beer, C. Rempfer, L. Bordoli, R. Lepore, T. Schwede, SWISS-MODEL: การสร้างแบบจำลองความคล้ายคลึงกันของโครงสร้างโปรตีนและสารเชิงซ้อน, กรดนิวคลีอิกความละเอียด 46 (2018) W296–W303, https://doi.org/10.1093/nar/gky427.
[22] N. Guex, MC Peitsch, T. Schwede, การสร้างแบบจำลองโครงสร้างโปรตีนเปรียบเทียบอัตโนมัติด้วย SWISS-MODEL และโปรแกรมแสดง Swiss-Pdb: มุมมองทางประวัติศาสตร์, Electrophoresis 30 (2009) S162–S173, https://doi.org/ 10.1002/elps.200900140.
[23] S. Bienert, A. Waterhouse, TAP de Beer, G. Tauriello, G. Studer, L. Bordoli, T. Schwede, ที่เก็บ SWISS-MODEL คุณสมบัติและฟังก์ชันการทำงานใหม่, ความละเอียดของกรดนิวคลีอิก 45 (2017) D313–D319, https://doi.org/10.1093/nar/gkw1132.
[24] G. Studer, C. Rempfer, AM Waterhouse, G. Gumienny, J. Haas, T. Schwede, ข้อจำกัด QMEANDisCo-distance ที่ใช้กับการประมาณคุณภาพแบบจำลอง, ชีวสารสนเทศ 36 (2020) 1765–1771, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/ btz828.
[25] M. Bertoni, F. Kiefer, M. Biasini, L. Bordoli, T. Schwede, การสร้างแบบจำลองโครงสร้างควอเทอร์นารีโปรตีนของ homo- และ hetero-oligomers นอกเหนือจากปฏิสัมพันธ์แบบไบนารีโดย homology, Sci ตัวแทน 7 (2017) 10480, https://doi.org/10.1038/s41598-017-09654-8
[26] L. Li, LV Modolo, LL Escamilla-Trevino, L. Achnine, RA Dixon, X. Wang, the Crystal structure of Medicago truncatula UGT85H2-ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับโครงสร้างพื้นฐานของฟลาโวนอยด์มัลติฟังก์ชั่น (iso) ไกลโคซิลทรานสเฟอเรส, เจ. โมล. ไบโอล. 370 (2007) 951–963, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2007.05.036.
[27] R. Lüthy, JU Bowie, D. Eisenberg, การประเมินแบบจำลองโปรตีนที่มีโปรไฟล์สามมิติ, Nature 356 (1992) 83–85, https://doi.org/10.1038/ 356083a0.
[28] RA Laskowski, MW MacArthur, DS Moss, JM Thornton, PROCHECK: โปรแกรมตรวจสอบคุณภาพทางสเตอริโอเคมีของโครงสร้างโปรตีน, J. Appl. คริสตัลล็อก 26 (1993) 283–291, https://doi.org/10.1107/S0907444998006684.
[29] O. Trott, AJ Olson, AutoDock Vina: ปรับปรุงความเร็วและความแม่นยำของการเทียบท่าด้วยฟังก์ชันการให้คะแนนแบบใหม่ การเพิ่มประสิทธิภาพอย่างมีประสิทธิภาพ และมัลติเธรด J. Comput เคมี. 31 (2010) 455–461, https://doi.org/10.1002/jcc.21334.
[30] AM George Thompson, CV Iancu, KE Neet, JV Dean, JY Choe, ความแตกต่างในการผันกลูโคสของกรดซาลิไซลิกโดย UGT74F1 และ UGT74F2 จาก Arabidopsis thaliana, Sci ตัวแทน 7 (2017) 46629, https://doi.org/10.1038/srep46629.
[31] T. Vogt, P. Jones, Glycosyltransferases ในการสังเคราะห์ผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติของพืช: ลักษณะของตระกูล supergene, Trends Plant Sci 5 (2000) 380–386, https://doi.org/10.1016/s1360-1385(00)01720-9
[32] A. Kubo, Y. Arai, S. Nagashima, T. Yoshikawa, การเปลี่ยนแปลงความจำเพาะของผู้บริจาคน้ำตาลของ glycosyltransferases ของพืชโดยการกลายพันธุ์จุดเดียว, Arch. ไบโอเคมี. ชีวฟิสิกส์ 429 (2004) 198–203, https://doi.org/10.1016/j. abb.2004.06.021.
[33] H. Kanho, S. Yaoya, T. Itani, T. Nakane, N. Kawahara, Y. Takase, K. Masuda, M. Kuroyanagi, Glucosylation ของสารประกอบฟีนอลิกโดย Pharbitis ไม่มีรากมีขน: I. Glucosylation of coumarin และอนุพันธ์ฟลาโวน Biosci เทคโนโลยีชีวภาพ ไบโอเคมี. 68 (2004) 2032–2039, https://doi.org/10.1271/bbb.68.2032.
[34] J. Bjerre, EH Nielsen, M. Bols, ไฮโดรไลซิสของกลูโคไซด์ธรรมชาติที่เป็นพิษซึ่งเร่งปฏิกิริยาโดย cyclodextrin dicyanohydrins, Eur. เจ. องค์กร. เคมี. 2008 (2010) 745–752, HTTPS:// doi.org/10.1002/ejoc.200700954
[35] B. Xue, LB Zhou, JW Liu, RM Yu, การเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพของอนุพันธ์ไฮดรอกซีคูมารินโดยเซลล์แขวนลอยที่เพาะเลี้ยงของ Catharanthus roseus, Pharmazie 67 (2012) 467–471, https://doi.org/10.1691/ph.2012.1741 .
[36] T. Al-Warhi, A. Sabt, EB Elkaeed, WM Eldehna, ความก้าวหน้าล่าสุดของสารต้านมะเร็งที่ใช้คูมาริน: บทวิจารณ์ล่าสุด, Bioorg. เคมี. 103 (2020) 104163, https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2020.104163.
[37] X. Li, MY Gruber, DD Hegedus, DJ Lydiate, MJ Gao, ผลกระทบของอนุพันธ์ coumarin, 4-methylumbelliferone ต่อการงอกของเมล็ดและการสร้างต้นกล้าใน Arabidopsis, J. Chem อีโคล. 37 (2011) 880–890, https://doi.org/10.1007/s10886-011-9987-3
[38] K. Xu, ZM Feng, YN Yang, JS Jiang, PC Zhang, sesquiterpenoids ประเภท eudesmane- และ eremophilane ใหม่แปดชนิดจาก Atractylodes lancea, Fitoterapia 114 (2016) 115–121, https://doi.org/10.1016/j.fitote.2016.08.017.
[39] Y. Lou, H. Wu, J. Zheng, X. He, Z. Wu, X. Lu, Y. Qiu, ความมุ่งมั่นและการศึกษาเภสัชจลนศาสตร์ของการ skimming โดย UHPLC-MS/MS ในพลาสมาของหนู, J. Pharm . ไบโอเมด ก้น 179 (2020) 112969, https://doi.org/10.1016/j.jpba.2019.112969.