เมตฟอร์มินปกป้องเซลล์เยื่อบุผิวเลนส์จากการเสื่อมสภาพในหนูเมาส์ที่มีอายุตามธรรมชาติ

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

การแนะนำ

เซลล์เยื่อบุผิวเลนส์ (LECs) ก่อตัวเป็นชั้นเดียวของเซลล์ที่บุผิวแคปซูลด้านหน้าของเลนส์และขยายไปยังส่วนโค้งของเลนส์เส้นศูนย์สูตร [1, 2] โครงสร้างและหน้าที่ปกติของ LEC มีความจำเป็นสำหรับการรักษาความโปร่งใสและสภาวะสมดุลเมตาบอลิซึมของเลนส์ทั้งหมด[3] หลักฐานที่เพิ่มขึ้นบ่งชี้ว่าการเสื่อมสภาพของ LEC อาจทำให้เกิดการดัดแปลง การเสื่อมสภาพ และการรวมตัวของโปรตีนเลนส์ ซึ่งรวมถึงเอ็นไซม์และผลึก ซึ่งท้ายที่สุดจะนำไปสู่การทึบแสงหรือแม้แต่ต้อกระจก [3-5] ต้อกระจกที่เกี่ยวข้องกับอายุ (ARC) ยังคงเป็นสาเหตุหลักของความบกพร่องทางสายตาและตาบอด ซึ่งส่งผลกระทบอย่างรุนแรงต่อคุณภาพชีวิตของผู้สูงวัย [6] ปัจจุบันยังไม่มีกลยุทธ์ที่มีประสิทธิภาพในการป้องกันความก้าวหน้าของ ARC ดังนั้นจึงจำเป็นต้องพัฒนาการแทรกแซงทางเภสัชวิทยาที่สามารถปรับปรุงความโปร่งใสของเลนส์และชะลอการลุกลามของ ARC

ในช่วงสองสามทศวรรษที่ผ่านมา นักวิทยาศาสตร์มีความก้าวหน้าอย่างน่าทึ่งในการปรับปรุงสุขภาพและยืดอายุขัยโดยใช้การแทรกแซงทางพันธุกรรม การควบคุมอาหาร และเภสัชวิทยาหลายอย่าง [7] เมตฟอร์มิน (MET) เป็นหนึ่งในสารต่อต้านริ้วรอยที่มีการศึกษาอย่างกว้างขวาง การศึกษาที่สำคัญชี้ให้เห็นว่า MET สามารถบรรเทาความชราภาพและยืดอายุขัยที่มีสุขภาพดีในระบบแบบจำลองสัตว์ต่างๆ MET ไม่เพียงแต่ยืดอายุของ Caenorhabditis elegans เท่านั้น แต่ยังช่วยเสริมสุขภาพและความมีชีวิตชีวา [8] MET สามารถลดการสะสมของความเสียหายของ DNA ที่เกี่ยวข้องกับอายุและความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในเซลล์ต้นกำเนิดจากแมลงหวี่ Drosophila midgut เพื่อยืดอายุขัย [9] การศึกษาก่อนหน้านี้ยังระบุด้วยว่าการให้ MET ในขนาดต่ำแบบเรื้อรังช่วยปรับปรุงสุขภาพและอายุขัยของหนู [10] นอกจากนี้ หลักฐานที่เกิดขึ้นใหม่บ่งชี้ว่าเมื่อผู้ป่วยโรคเบาหวานได้รับการรักษาด้วย MET ผู้ป่วยเบาหวานจะได้รับประโยชน์จากการรอดชีวิต แม้จะเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่ไม่มีโรคเบาหวาน [11]

KSL09

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

นอกเหนือจากกิจกรรมที่ส่งเสริมอายุขัยของ MET ในสิ่งมีชีวิตแบบจำลองต่างๆ แล้ว MET ยังตั้งเป้าหมายเส้นทางการส่งสัญญาณของเซลล์หลายทางเพื่อบรรเทาโรคที่เกี่ยวข้องกับอายุ MET ได้รับการแสดงเพื่อปรับ autophagy ส่วนใหญ่ผ่านการกระตุ้นโปรตีนไคเนส (AMPK) ที่กระตุ้นด้วยอะดีโนซีนโมโนฟอสเฟต (AMP) และป้องกันการเสื่อมของระบบประสาทและการอักเสบของเส้นประสาทเพื่อมีบทบาทในการป้องกันระบบประสาทในโรคพาร์กินสัน [12] ในทำนองเดียวกัน MET ช่วยแก้ไขการเปลี่ยนแปลงที่เกี่ยวข้องกับอายุในเซลล์บุผนังหลอดเลือดไซนัสในตับผ่านทาง AMPK และวิถีไนตริกออกไซด์ที่บุผนังหลอดเลือด [13]ปริมาณ cistanche redditนอกจากนี้ การเปิดใช้งาน AMPK แบบเรื้อรังโดย MET ยังช่วยป้องกันคาร์ดิโอไมโอแพทีด้วยการควบคุม autophagy ในหนู OVE26 ที่เป็นเบาหวาน [14] นอกจากนี้ MET ยังช่วยบรรเทาความเสื่อมของหัวใจและหลอดเลือดที่เกี่ยวข้องกับอายุด้วยการเพิ่มประสิทธิภาพ autophagy และแคลอรี่ [15] นอกจากนี้ การรักษาด้วย MET สามารถยับยั้งการแข็งตัวของหลอดเลือดที่เกี่ยวข้องกับอายุในหนูและกระต่าย ApoE-7-ที่เกิดจากอาหารที่มีไขมันสูง ป้องกันการกลายเป็นหินปูนในหลอดเลือดได้อย่างมีนัยสำคัญ ลดระดับโปรตีน C-reactive ที่มีความไวสูง และยับยั้งการกระตุ้นของ นิวเคลียสแฟกเตอร์คัปปา B(NF-kB)วิถีในหลอดเลือด [16-18]

จากข้อสังเกตเหล่านี้ การศึกษาในปัจจุบันได้พยายามสำรวจว่า MET สามารถชะลอการแก่ของ ARC และกลไกระดับโมเลกุลที่อยู่เบื้องล่างได้หรือไม่ การค้นพบของเรามีดังนี้: (i) การรักษาด้วย MET ในขนาดต่ำแบบเรื้อรังชะลอการเสื่อมสภาพของ LEC ในหนูที่มีอายุตามธรรมชาติ ดังนั้นจึงยับยั้งความทึบของเลนส์ (i) วิถีทาง AMPK ถูกปิดใช้งาน และฟลักซ์ autophagic บกพร่องใน LEC ที่ชราภาพ (i) ) การรักษาด้วย MET ในขนาดต่ำแบบเรื้อรังช่วยชะลอความชราของ LEC ในหนูที่มีอายุตามธรรมชาติโดยการเปิดใช้งานเส้นทาง AMPK และเพิ่มประสิทธิภาพ autophagy การค้นพบของเรายืนยันบทบาทสมมุติในการต่อต้านริ้วรอยของ MET และให้หลักฐานเพียงพอว่า MET อาจพิสูจน์ได้ว่าเป็นทางเลือกในการรักษาที่เป็นไปได้สำหรับ ARC

ผลลัพธ์

การเสื่อมสภาพของ LEC สัมพันธ์กับ ARC ในหนูที่มีอายุตามธรรมชาติ

กลไกที่เป็นไปได้หลายอย่างของ ARC รวมถึงผลกระทบของอายุ ได้รับการตรวจสอบอย่างกว้างขวางประโยชน์ของสารสกัดจากซิสแทนเช่อย่างไรก็ตาม ความสัมพันธ์ระหว่างความชราของ LEC และ ARC ในร่างกายยังคงไม่ชัดเจน เราตั้งสมมติฐานว่าการเสื่อมสภาพของ LEC อาจส่งผลให้เกิด ARC ในร่างกาย ดังนั้นเราจึงสร้างแบบจำลองเมาส์ของ ARC ผลลัพธ์ของเราเปิดเผยว่าความโปร่งใสของเลนส์ในหนูที่มีอายุตามธรรมชาติ (หนูที่มีอายุมากกว่า) ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับในกลุ่มควบคุม (หนูอายุน้อย) (รูปที่ 1a) ดังแสดงในรูปที่ 1b อุบัติการณ์ของต้อกระจกในกลุ่มอายุตามธรรมชาติคือ 95.23 เปอร์เซ็นต์ การทดสอบการย้อมสี H&E ระบุว่า LEC ในกลุ่มควบคุมมีรูปร่างกลมและจัดเรียงอย่างสม่ำเสมอ และความหนาแน่นของ LEC ปกติค่อนข้างสูง ในขณะที่ LEC ของหนูที่มีอายุตามธรรมชาติมีรูปร่างแบนและจัดเรียงไม่เท่ากัน และความหนาแน่นของ LEC ที่เสื่อมสภาพลดลงอย่างเห็นได้ชัด (รูปที่ 1c) นอกจากนี้ SA- -การย้อมสี Gal แสดงให้เห็นว่าอัตราส่วนของ LEC ชราภาพสูงขึ้นในหนูเมาส์ที่มีอายุตามธรรมชาติ (รูปที่ 1d) นอกจากนี้ เราวิเคราะห์การแสดงออกของโปรตีนของมาร์กเกอร์ที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพผ่านการย้อมสี IHC และการวิเคราะห์ Western blot การย้อมสี IHC เปิดเผยว่าการแสดงออกของ p21 และ p53 เพิ่มขึ้นใน LEC ของหนูที่มีอายุตามธรรมชาติเมื่อเปรียบเทียบกับหนูตัวเล็ก (รูปที่ 1e, f) ในทำนองเดียวกัน เราค้นพบเพิ่มเติมว่าการแสดงออกของโปรตีนของ p21 และ p53 ในแคปซูลเลนส์ของหนูที่มีอายุตามธรรมชาตินั้นสูงกว่าในแคปซูลเลนส์ของหนูตัวเล็ก (รูปที่ 1g) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการเสื่อมสภาพของ LEC มีความสัมพันธ์กับ ARC ในหนูที่มีอายุตามธรรมชาติ

KSL10

Cistanche สามารถต่อต้านริ้วรอย

การบริหาร MET ในขนาดต่ำแบบเรื้อรังช่วยปรับปรุงความโปร่งใสของเลนส์และบรรเทาความชราของ LEC ก่อนที่เราจะทดสอบผลของเมตฟอร์มินต่อ ARC เราได้พิจารณาแล้วว่าการให้ MET ในขนาดต่ำแบบเรื้อรังนั้นปลอดภัยสำหรับหนูหรือไม่ หลังการรักษา MET เป็นเวลา 10 เดือน หนู 28 ตัว (18 ในกลุ่มอายุตามธรรมชาติและ 10 ตัวในกลุ่ม MET) เสียชีวิตด้วยสาเหตุตามธรรมชาติ เราพบว่าหนูที่ยังมีชีวิตอยู่ในทั้งสองกลุ่มมีสุขภาพแข็งแรง และไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในน้ำหนักตัวและน้ำหนักอวัยวะระหว่างทั้งสองกลุ่ม (ตารางที่ 1) ดังนั้น ผลลัพธ์เหล่านี้จึงบ่งชี้ว่าปริมาณของเมตฟอร์มินที่ใช้ในการศึกษานั้นปลอดภัยสำหรับสัตว์และสามารถใช้สำหรับการทดลองครั้งต่อไปได้

ต่อจากนั้น ให้ MET ขนาดต่ำเรื้อรังเพื่อประเมินว่า MET สามารถยับยั้งความทึบของเลนส์และบรรเทาความชราภาพที่เกี่ยวข้องกับอายุของ LEC ในหนูที่มีอายุตามธรรมชาติได้หรือไม่ ตามที่คาดไว้ ความโปร่งใสของเลนส์ในกลุ่ม MET ได้รับการปรับปรุงอย่างมากเมื่อเทียบกับความโปร่งใสของเลนส์ในกลุ่มอายุตามธรรมชาติ (รูปที่ 2a) นอกจากนี้ การสังเกตทางสัณฐานวิทยายังยืนยันว่าเลนส์ของกลุ่ม MET แสดงความทึบแสงลดลง อุบัติการณ์ของต้อกระจกในกลุ่มอายุตามธรรมชาติคือ 95.23 เปอร์เซ็นต์ ในขณะที่ในกลุ่ม MET อยู่ที่ 19.00 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 2b) การทดสอบการย้อมสี H&E พบว่าความหนาแน่นของ LEC ในกลุ่ม MET สูงขึ้นอย่างเห็นได้ชัด มากกว่านั้นในหนูที่มีอายุตามธรรมชาติ (รูปที่ 2c) นอกจากนี้ LEC ของกลุ่ม MET ยังมีรูปร่างค่อนข้างกลมเมื่อเทียบกับกลุ่มที่มีอายุตามธรรมชาติ (รูปที่ 2c) SA- -การย้อมด้วย Gal แสดงให้เห็นว่าอัตราส่วนของ LEC ที่เสื่อมสภาพลดลงอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม MET เมื่อเทียบกับในกลุ่มที่มีอายุตามธรรมชาติ (รูปที่ 2d) การวิเคราะห์ IHC เปิดเผยว่าการแสดงออกของ p21 และ p53 ลดลงในกลุ่ม LEC ของกลุ่ม MET มากกว่าในกลุ่มที่มีอายุตามธรรมชาติ (รูปที่ 2e, f) ในทำนองเดียวกัน การวิเคราะห์ western blot เปิดเผยว่าการแสดงออกของโปรตีนของ p21 และ p53 ลดลงอย่างน่าทึ่งในแคปซูลเลนส์ของกลุ่ม MET เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มที่มีอายุตามธรรมชาติ (รูปที่ 2g) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าการบริหาร MET ในขนาดต่ำแบบเรื้อรังสามารถปรับปรุงความโปร่งใสของเลนส์และบรรเทาความชราของ LEC

KSL11

การบริหาร MET ในขนาดต่ำแบบเรื้อรังช่วยลดความชราของ LEC ในหนูที่มีอายุโดยธรรมชาติผ่านการเปิดใช้งาน AMPK ข้อมูลจำนวนมหาศาลสนับสนุนข้อสรุปว่าการเปิดใช้งาน AMPK นั้นเพียงพอที่จะยืดอายุในสิ่งมีชีวิตจำลอง เพิ่มความน่าสนใจเป็นเป้าหมายอายุยืน [19,20] . เมื่อพิจารณาจากทฤษฎีนี้ เราประเมินการแสดงออกของวิถี AMPK ใน LEC ของหนู ระดับ FAS mRNA สัมพัทธ์ลดลงในกลุ่มที่มีอายุตามธรรมชาติและเพิ่มขึ้นในกลุ่ม MET (รูปที่ 3a) ดังแสดงในรูปที่ 3b,c การแสดงออกของ phosphorylated AMPKa (Thr172) และ phosphorylated ACC (Ser79) ลดลงใน LEC ของหนูที่มีอายุตามธรรมชาติเมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่อายุน้อย อย่างไรก็ตาม การแสดงออกของ AMPKa ที่มีฟอสโฟรีเลต (Thr172) และ ACC ฟอสโฟรีเลต (Ser79) ได้รับการยกระดับในกลุ่ม LEC ของกลุ่ม MET เมื่อเทียบกับกลุ่มอายุตามธรรมชาติ นอกจากนี้ การวิเคราะห์ western blot พบว่าการแสดงออกของโปรตีนของ phosphorylated AMPKa(Thr172) และ phosphorylated ACC (Ser79) ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในแคปซูลเลนส์ของคนชราตามธรรมชาติ และระดับการแสดงออกของโปรตีนของ phosphorylated AMPKa (Thr172) และ phosphorylated ACC ( Ser79)ถูกทำให้เพิ่มขึ้นในแคปซูลเลนส์ของกลุ่ม MET (รูปที่ 3d) ข้อมูลเหล่านี้เปิดเผยว่าเส้นทาง AMPK ถูกปิดใช้งานใน LEC ของหนูที่มีอายุตามธรรมชาติ นอกจากนี้ การบริหาร MET ในขนาดต่ำแบบเรื้อรังช่วยลดความชราของ LEC ในหนูที่มีอายุตามธรรมชาติผ่านการกระตุ้น AMPK

การบริหาร MET ในขนาดต่ำแบบเรื้อรังช่วยฟื้นฟู autophagic flux เพื่อบรรเทาความชราของ LEC ในหนูที่มีอายุตามธรรมชาติ การศึกษาก่อนหน้านี้ระบุว่า autophagy อาจมีบทบาทสำคัญในการต่อสู้กับผลข้างเคียงของวัยชรา [21,22] เพื่อวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงระดับโมเลกุลและเซลล์ในเลนส์ภายหลังการรักษาด้วย MET เราได้กำหนดการแสดงออกของ LC3 และ p62 เนื่องจากเป็นที่ยอมรับกันอย่างกว้างขวางว่าเป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของระดับ autophagy ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 4a ระดับการแสดงออกของ p62 mRNA สัมพัทธ์เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มที่มีอายุตามธรรมชาติเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม อย่างไรก็ตาม ระดับการแสดงออกของ mRNA สัมพัทธ์ของ p62 นั้นถูกควบคุมลงอย่างมากในกลุ่ม MET เมื่อเทียบกับระดับในกลุ่มอายุตามธรรมชาติซิสทานเช เจงกีสข่านนอกจากนี้ การย้อม IHC เผยให้เห็นว่าระดับของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไมโครทูบูล 1 สายเบา 3(LC3-II/l) และ p62 เพิ่มขึ้นใน LEC ของหนูเมาส์ที่มีอายุตามธรรมชาติ นอกจากนี้ ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าระดับของ LC3-II/l และ p62 ลดลงอย่างน่าทึ่งใน LEC ของกลุ่ม MET (รูปที่ 4b, c) ระดับโปรตีนของ LC3-ll และ p62 เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดในแคปซูลเลนส์ของกลุ่มที่มีอายุตามธรรมชาติ (รูปที่ 4d) โดยรวมแล้ว เราคาดการณ์ว่า autophagic flux นั้นบกพร่องใน LEC ของหนูที่มีอายุตามธรรมชาติ และสามารถฟื้นฟูได้ด้วยการบริหาร MET ในขนาดต่ำแบบเรื้อรังเพื่อบรรเทาความชราของ LEC ในหนูที่มีอายุตามธรรมชาติ

อภิปรายผล

ต้อกระจกที่ไม่ได้รับการรักษาเป็นสาเหตุสำคัญของการตาบอดทั่วโลกที่มีลักษณะทึบแสงของเลนส์ผลึก [23] การศึกษาทางระบาดวิทยาแสดงให้เห็นว่าอายุเป็นปัจจัยเสี่ยงที่สำคัญสำหรับต้อกระจกที่เรียกว่า ARC และการรักษาเพียงอย่างเดียวคือการผ่าตัดเอาออก [24] การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่า LEC ชราภาพเป็นสาเหตุหลักของ ARC [25] จนถึงปัจจุบัน ยังไม่มียารักษาโรคที่มีประสิทธิภาพในการยับยั้งความขุ่นของเลนส์และลดความชราของ LEC โดยไม่มีผลข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์ จุดเน้นของการศึกษาครั้งนี้คือการประเมินพื้นฐานทางอณูชีววิทยาสำหรับการเสื่อมสภาพของ LEC และกลไกในการปกป้อง LEC ปกติจากการชราภาพ ผลลัพธ์ของเราเปิดเผยว่าการปิดใช้งาน AMPK และการด้อยค่าของ autophagy นั้นสัมพันธ์กับการเสื่อมสภาพของ LEC และ ARC นอกจากนี้ เราพบว่า MET อาจปกป้อง LEC จากความชราภาพและยับยั้งความขุ่นของเลนส์โดยการเปิดใช้งาน AMPK และเพิ่มความสามารถในการ autophagy

การชราภาพเป็นกระบวนการทางชีววิทยาพื้นฐานพร้อมกับการลดลงของการทำงานของเนื้อเยื่อโดยทั่วไป เมื่ออายุขัยเพิ่มขึ้น ความผิดปกติที่เกี่ยวข้องกับอายุ เช่น ARC จะกลายเป็นสุขภาพที่ร้ายแรง

ปัญหา [26]. มีรายงานว่าความชราของ LECs เกี่ยวข้องกับการเกิดและการพัฒนาของ ARC [5] ผลลัพธ์ของเราพบว่า LEC ของหนูที่มีอายุตามธรรมชาตินั้นมีรูปร่างแบนราบและจัดเรียงไม่เท่ากัน และความหนาแน่นของ LEC ลดลงอย่างเห็นได้ชัด (รูปที่ 1c, d) นอกจากนี้ การแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพ (p21 และ p53) ได้รับการควบคุมใน LEC ของหนูที่มีอายุตามธรรมชาติ (รูปที่ 1e, f, g) ผลลัพธ์ของเราบอกเป็นนัยว่าการเสื่อมสภาพของ LEC นั้นสัมพันธ์กับการเกิดขึ้นและการพัฒนาของ ARC ดังนั้น อาจจำเป็นต้องมีความเข้าใจที่ถูกต้องเกี่ยวกับกลไกระดับโมเลกุลที่อยู่ภายใต้การเสื่อมสภาพของ LEC เพื่อให้เหตุผลสำหรับกลยุทธ์การรักษาแบบใหม่

MET เป็นยาลดน้ำตาลในเลือดทางปากที่แพทย์สั่งมากที่สุดสำหรับผู้ป่วยเบาหวานชนิดที่ 2 ทั่วโลก หลักฐานที่เกิดขึ้นใหม่บ่งชี้ว่า MET มีผลดีต่อสุขภาพมากกว่าที่เกี่ยวข้องกับการเยียวยาในน้ำตาลในเลือด [27] ได้รับการยืนยันแล้วว่ากลไกของ MET มีความสำคัญสำหรับการกำหนดเป้าหมายเส้นทางพื้นฐานในการชราภาพทางชีวภาพ เช่น การกระตุ้น AMPK การเสริม autophagy การยับยั้งการอักเสบ และการออกแรงต้านออกซิเดชัน [28] ในมนุษย์ MET ถูกนำมาใช้ในการปฏิบัติทางคลินิกมานานกว่า 60 ปี; มีความปลอดภัยสูงและอยู่ในตำแหน่งที่ไม่ซ้ำใครที่จะเข้าไปแทรกแซงในเส้นทางที่สำคัญหลายประการที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพและโรคที่เกี่ยวข้องกับอายุ อย่างไรก็ตาม ไม่เคยมีการรายงานผลกระทบของ MET ต่อ ARC และกลไกการกำกับดูแลของผลกระทบเหล่านั้น ดังนั้น ในการศึกษาของเรา การบริหาร MET ในขนาดต่ำแบบเรื้อรังในหนูที่มีอายุตามธรรมชาติได้ปรับปรุงความโปร่งใสของเลนส์ (รูปที่ 2a) และลดทอนความชราของ LEC ในร่างกาย (รูปที่ 2)

KSL12

เป็นที่ยอมรับกันอย่างกว้างขวางว่า MET กระตุ้นเส้นทาง AMPK ซึ่งเป็นกลไกที่เป็นไปได้ของ MET ในการออกฤทธิ์ต่อต้านริ้วรอย [29] AMPK ซึ่งเป็นเซ็นเซอร์พลังงานระดับเซลล์ มีบทบาทสำคัญในการควบคุมสมดุลพลังงานของเซลล์ [30] การศึกษาหลายชิ้นแสดงให้เห็นว่า AMPK ทำหน้าที่เป็นผู้รวบรวมและผู้ไกล่เกลี่ยเส้นทางและกระบวนการต่างๆ ที่เกี่ยวข้องกับพลังงานที่มีอายุยืนยาว ในการศึกษาของเรา เราพบว่าการปิดใช้งาน AMPK เป็นคุณลักษณะของ LEC ที่ชราภาพในหนูที่มีอายุตามธรรมชาติ (รูปที่ 3) ต่อจากนั้น แสดง MET เพื่อกระตุ้นเส้นทาง AMPK เพื่อป้องกันการเสื่อมสภาพของ LEC (รูปที่ 3) ในฐานะที่เป็นตัวกระตุ้น AMPK ที่จัดตั้งขึ้น บทบาทของ MET ในการป้องกันการชราภาพมักเป็นผลมาจากการปรับเส้นทางการส่งสัญญาณดาวน์สตรีม เช่น การฟื้นฟู autophagy การเปิดใช้งาน Sirt1 และ Foxo1 และการปราบปราม mTOR [31,32] การศึกษาของเราได้ให้หลักฐานแนวใหม่ที่เน้นถึงความสำคัญของฟังก์ชัน AMPK ที่เปิดใช้งานโดย MET ในการป้องกันการเกิด ARC

ดังที่กล่าวไว้ข้างต้น AMPK สื่อสารกับวิถีทางและโปรตีนมากมายเพื่อออกแรงต้านการชราภาพ รวมถึงการเสริม autophagy Autophagy ซึ่งเป็นกระบวนการหลักสำหรับการประกันอายุยืน ได้รับความสนใจอย่างกว้างขวางว่าเป็นเป้าหมายในการรักษาโรคที่เกี่ยวข้องกับอายุ Autophagy เป็นของเหลว กระบวนการทางชีววิทยาที่ซับซ้อนหลายขั้นตอน กระบวนการที่สมบูรณ์ของ autophagy เรียกว่า autophagic flux ซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายเพื่อสะท้อนระดับของ autophagy ในฐานะตัวบ่งชี้ของ autophagy LC3-Il ถูกผูกมัดอย่างแน่นหนากับเยื่อหุ้มเซลล์ autophagosomal ที่ถูกย่อยสลายโดยเอนไซม์ไลโซโซมcistanche การยืดอายุในทำนองเดียวกัน p62 ซึ่งเป็นซับสเตรตเฉพาะ autophagy มักจะเสื่อมโทรมใน autophagolysosome และการแสดงออกของมันจะสะท้อนถึงระดับของ autophagy ทางอ้อม ในการศึกษานี้ การค้นพบของเราบอกเป็นนัยว่าระดับของ autophagy ลดลงอย่างเห็นได้ชัดใน LECs ชราภาพ (รูปที่ 4) ในขณะที่ MET กลับการด้อยค่าของ autophagy ที่เกี่ยวข้องกับอายุ (รูปที่ 4) กลไกระดับโมเลกุลต่อต้านวัยของ MET เกิดจากหน้าที่หลักของ AMPK ในเซลล์ เนื่องจากโดยทั่วไปแล้วจะช่วยเพิ่มการย่อยอัตโนมัติผ่านการกระตุ้น AMPK [33] นอกจากนี้ MET ยังแสดงให้เห็นถึงการเสริม autophagy โดยตรง ซึ่งมีส่วนช่วยในการป้องกันการชราภาพ [34] อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องมีการศึกษาอย่างละเอียดมากขึ้นเพื่ออธิบายกลไกที่อยู่ภายใต้ ซึ่งพิสูจน์ว่า MET ช่วยเพิ่ม autophagy ผ่านเส้นทาง AMPK ที่เป็นอิสระหรือขึ้นต่อกัน

มีการแสดงให้เห็นว่าความชุกของ ARC ไม่เกี่ยวข้องกับเพศในประชากรที่มาจากเอเชีย [35, 36] ดังนั้นเราจึงไม่ได้พิจารณาเรื่องเพศเป็นปัจจัยที่อาจส่งผลต่อ ARC การศึกษาของเราควรได้รับการตีความโดยพิจารณาจากข้อจำกัดที่กล่าวถึงข้างต้น

บทสรุป

โดยสรุป เราได้พิสูจน์แล้วว่าการปิดใช้งานเส้นทาง AMPK และการด้อยค่าของ autophagy ที่เกี่ยวข้องกับอายุอาจส่งผลต่อการเสื่อมสภาพของ LEC และการเกิด ARC นอกจากนี้ ข้อมูลจากการทดลองของเราเปิดเผยว่า MET ชะลอความชราของ LEC และการก่อตัวของ ARC ได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยการเปิดใช้งานเส้นทาง AMPK และการเพิ่ม autophagy การค้นพบของเราเป็นแนวทางพื้นฐานสำหรับการตรวจสอบเพิ่มเติมเกี่ยวกับกลไกระดับโมเลกุลที่เป็นประโยชน์ในบทบาทของ MET ในระหว่างกระบวนการชราภาพของ ARC และจะเป็นข้อมูลสำหรับการศึกษาอย่างเข้มข้นมากขึ้นเกี่ยวกับการพัฒนากลยุทธ์ใหม่ในการต่อต้านการเกิดขึ้นและการพัฒนาของ ARC

วัสดุและวิธีการ รีเอเจนต์

MET ถูกซื้อจากบริษัท Bristol-Myers Squibb (จีน) แอนติบอดีต่อ p21 (ab188224), p53 (ab131442), phosphorylated AMPKa(p-AMPK)(Thr172)(ab133448), AMPKa1(ab32047), -actin (ab8226) และ SQSTM1/p62 (3340-1) ได้มาจาก Abcam(MA, USA) แอนติบอดีที่ต้าน LC3 (12741)และฟอสโฟ-อะซีติล CoA คาร์บอกซิเลส (p-ACC)(Ser79)(3661) ถูกซื้อมาจากเทคโนโลยีการส่งสัญญาณของเซลล์ ( แมสซาชูเซตส์สหรัฐอเมริกา)

สัตว์และการรักษา

หนู C57BL6J เพศผู้ที่มีอายุ 3 และ 8 เดือนถูกซื้อจาก Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd.(ปักกิ่ง ประเทศจีน) หนูถูกเลี้ยงในสภาวะที่ควบคุมอุณหภูมิ (อุณหภูมิ 20-25 องศาและความชื้นสัมพัทธ์ 55±15 เปอร์เซ็นต์ ) โดยมีวัฏจักรแสง/ความมืด 12 ชั่วโมง โดยสามารถเข้าถึงอาหารและน้ำได้ฟรี ขั้นตอนและโปรโตคอลทั้งหมดที่ดำเนินการกับสัตว์ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของมหาวิทยาลัยการแพทย์ฮาร์บิน

หนูถูกแบ่งออกเป็นสามกลุ่มต่อไปนี้:(i) กลุ่มควบคุมที่มีหนูตัวเล็ก (อายุ 3 เดือน, น้ำหนักตัว=29.72± 1.66 ก., n =40)ได้รับอาหารและน้ำสำหรับหนูที่บริสุทธิ์มาตรฐาน โฆษณาจำกัด; เมื่อหนูอายุ 10 เดือน หนู 120 ตัวถูกสุ่มแบ่งออกเป็นสองกลุ่ม: กลุ่มอายุตามธรรมชาติและกลุ่ม MET (i) กลุ่มอายุตามธรรมชาติ (หนูที่มีอายุมากกว่า, 20 เดือน, น้ำหนักตัว=32.98±1.93g, n=60) ได้รับอาหารหนูที่บริสุทธิ์มาตรฐานและน้ำ ad libitum; (ii) กลุ่ม MET ( อายุ 20 เดือน น้ำหนักตัว=31.21±2.81 ก. n=60) ถูกคงไว้โดยอาหารหนูและน้ำบริสุทธิ์มาตรฐานจนกว่าหนูจะอายุครบ 10 เดือน; หลังจากนั้นก็เริ่มการรักษา หนูในกลุ่ม MET ได้รับอาหารเสริมด้วย MET 0.1 เปอร์เซ็นต์ (บริสตอล ไมเยอร์ส สควิบบ์ ประเทศจีน) และให้น้ำเปล่าเป็นเวลา 10 เดือน

การแยกเลนส์และแคปซูลเลนส์

หนูถูกทำการุณยฆาตผ่านทางปากมดลูกคลาดเคลื่อน ตาทั้งหมดถูกตัดออกทันทีจากสัตว์ทดลองทั้งหมดและวางในน้ำเกลือที่ปราศจากเชื้อ เส้นประสาทตาถูกวางไว้ด้านบนและยึดด้วยแหนบ จากนั้นจึงทำการกรีดที่เส้นประสาทตาที่เข้าตา และลูกตาถูกดึงกลับเพื่อให้เลนส์มองเห็นซิสแทนเช่ต่อจากนั้น เราใช้แหนบค่อยๆ ถอดชิ้นส่วนเลนส์ปรับเลนส์ที่ติดอยู่กับระนาบเส้นศูนย์สูตรของเลนส์ออก ภาพถ่ายของเลนส์สดถูกถ่ายทันที และเลนส์ได้รับการแก้ไขอย่างรวดเร็วด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% ที่อุณหภูมิห้อง แคปซูลเลนส์ทั้งหมดถูกลอกออกจากเลนส์ที่เหลืออย่างรวดเร็ว แช่แข็งสแน็ปช็อตในไนโตรเจนเหลว และเก็บไว้ที่ 80 องศาเซลเซียสสำหรับการทดลองครั้งต่อไป

ฮีมาทอกซิลินและอีโอซิน (H&E)

เลนส์ใหม่ได้รับการแก้ไขทันทีด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ที่อุณหภูมิห้องและฝังในพาราฟิน สำหรับการตรวจเนื้อเยื่อ เนื้อเยื่อถูกตัดเป็นชิ้น 4-μm หลังจากการดีพาราฟินไลเซชันและการให้น้ำอีกครั้ง ส่วนของพาราฟินที่เตรียมไว้จะถูกย้อมด้วยสารละลายฮีมาทอกซิลิน (H) เป็นเวลา 8 นาที ตามด้วย 5 หยดในเอทานอลที่เป็นกรด 1 เปอร์เซ็นต์ (HCI 1 เปอร์เซ็นต์ในเอทานอล 70 เปอร์เซ็นต์)

และล้างด้วยน้ำกลั่น ต่อจากนั้น ส่วนต่างๆ ถูกย้อมด้วยสารละลายอีโอซิน (E) เป็นเวลา 3 นาที ตามด้วยการทำให้แห้งด้วยแอลกอฮอล์อย่างช้าๆ และการล้างด้วยไซลีน สังเกตการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาภายใต้กล้องจุลทรรศน์ (Nikon, Eclipse, Japan)

การทดสอบ -galactosidase ที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพ (SA- -Gal) ที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพ กิจกรรม -galactosidase ที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพ (SA- -Gal) ถูกวัดโดยใช้ SA- -ชุดย้อมสี Gal (Sigma, CS{ {12}}030). ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ล้างส่วนเนื้อเยื่อหลังการรักษาหลายครั้งด้วยน้ำเกลือที่มีบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) เป็นเวลา 5 นาที (สามครั้ง) แล้วฟักใน SA- -gal staining solution (pH 6.0) ที่ 37 องศา ไม่มี CO2 นาน 24 ชม. ภาพถูกถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (Nikon, Eclipse, Japan) เปอร์เซ็นต์ของเซลล์บวก SA- -เซลล์กัล-บวกถูกประมาณเป็นจำนวนเฉลี่ยของเซลล์บวก/จำนวนเฉลี่ยของเซลล์ทั้งหมด

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (gRT-PCR) RNA ทั้งหมดจากแคปซูลเลนส์ของหนูเมาส์ถูกสกัดโดยใช้รีเอเจนต์ TRlzol ทำการถอดความแบบย้อนกลับด้วย ExScript RT Reagent Kit (Invitrogen) การวิเคราะห์ปฏิกิริยาลูกโซ่การถอดรหัสย้อนกลับเชิงปริมาณ-โพลีเมอเรส (qRT-PCR) ถูกดำเนินการโดยใช้ SYBR Green Supermix

ชุดคิท (Takara, Tokyo, Japan) โดยมี -actin เป็นตัวควบคุมภายใน การถอดรหัสได้รับการตรวจสอบสำหรับยีนเป้าหมายหลายตัว รวมทั้ง FAS (ไปข้างหน้า, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3'และย้อนกลับ, 5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62 (ไปข้างหน้า,5'-GCGGCACTACCGCGATGAGGA{{ 10}} และย้อนกลับ 5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') และ -actin (ไปข้างหน้า 5 '-TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3' และย้อนกลับ 5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG-3' ญาติ ระดับของการแสดงออกของยีนแต่ละตัวคือ

กระบวนการ. ทำให้เป็น -actin และคำนวณโดยใช้การย้อมสี 2-△△ct r Immunohistochemical (IHC) ส่วนที่เป็นตัวแทนทั้งหมด 5 ส่วนจากแต่ละเลนส์ที่เลือก 10 รายการต่อกลุ่มถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมี (IHC) เพื่อประเมินการแสดงออกของ p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3 และ p62 หลังจากที่ตัวอย่างที่เตรียมไว้ถูกบ่มที่ 60 องศาเป็นเวลา 2 ชั่วโมง พวกมันถูกส่งผ่านชุดไซลีนและแอลกอฮอล์ที่จัดลำดับสำหรับการแยกพาราฟฟิไนเซชัน ต่อจากนั้น ตัวอย่างถูกต้มในกรดซิตริก 0.1 โมลาร์ (pH 6.1) เป็นเวลา 30 นาที และทำให้เย็นลงจนถึงอุณหภูมิห้อง หลังจากล้างด้วย PBS สามครั้ง ตัวอย่างถูกแช่ด้วย 0.3 เปอร์เซ็นต์ H2O เพื่อยับยั้งการออกฤทธิ์ของเปอร์ออกซิเดสภายใน ต่อมา แอนติบอดีปฐมภูมิถูกเติมและทำให้เย็นที่ 4 องศาเซลเซียส ค้างคืน แอนติบอดีทุติยภูมิที่สอดคล้องกันถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศาเซลเซียส หลังจากล้างด้วย PBS ตัวอย่างถูกบ่มในไดอะมิโนเบนซิดีน (DAB) จนกระทั่งความเข้มข้นของรอยเปื้อนที่ต้องการพัฒนาขึ้น ภาพของเซลล์ที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่องถูกจับโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Nikon Eclipse (Nikon, Eclipse, Japan)

การวิเคราะห์ Western blot

โปรตีนทั้งหมดจากแคปซูลเลนส์ของหนูทดลองสกัดโดยใช้บัฟเฟอร์ radio-immunoprecipitation assay (RIPA) กับค็อกเทลตัวยับยั้งโปรตีเอส (Pierce, USA) และใช้ชุดกรด bicinchoninic (BCA) (Thermo Fisher Scientific, USA) เพื่อหาปริมาณความเข้มข้นของโปรตีน . วิเคราะห์โปรตีนทั้งหมด (40 ไมโครกรัม) โดยใช้โซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์ เจล อิเล็กโทรโฟรีซิส (SDS-PAGE) และถ่ายโอนอิเล็กโตรโฟเรติกไปยังเยื่อกรองโพลีไวนิลลิดีน ไดฟลูออไรด์ (PVDF) (มิลลิพอร์ ประเทศเยอรมนี) เยื่อหุ้มเซลล์ถูกฟักในชั่วข้ามคืนด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ในวันรุ่งขึ้น เยื่อหุ้มเซลล์ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่สอดคล้องกันเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศาเซลเซียส แถบอิมมูโนรีแอคทีฟถูกแสดงภาพโดยใช้วิธีซับสเตรตเคมีด้วย Super Signal West Pico ชุดคิท (Pierce Biotechnology, USA). ทำการทดลองอิสระสามครั้ง

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism 70 และ Microsoft Excel หาปริมาณโปรตีนโดยใช้ซอฟต์แวร์ Image J การทดสอบ t-test และการวิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA) ของนักเรียนถูกนำมาใช้ในการคำนวณนัยสำคัญทางสถิติของข้อมูลการทดลอง ความแตกต่างด้วยค่า P<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">